JPS6317435B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPS6317435B2 JPS6317435B2 JP1479478A JP1479478A JPS6317435B2 JP S6317435 B2 JPS6317435 B2 JP S6317435B2 JP 1479478 A JP1479478 A JP 1479478A JP 1479478 A JP1479478 A JP 1479478A JP S6317435 B2 JPS6317435 B2 JP S6317435B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- thioesterase
- pseudomonas aeruginosa
- strain
- activity
- membrane fraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明はチオエステラーゼの調製法に関する。
更に詳しくは、緑膿菌から新規なチオエステラー
ゼを調製する方法に関する。 チオエステラーゼはアシルコエンチームＡの定
量に利用されるなど、試薬として用いられてい
る。 本発明者等は緑膿菌のリン脂質合成経路をイン
ビトロで研究の途上、従来知られていなかつたチ
オエステラーゼ活性が菌体の細胞膜分画に存在す
ることを見出し、本発明を達成した。 すなわち、本発明の要旨は、緑膿菌を破砕し、
遠心分画法により細胞膜分画と共にチオエステラ
ーゼを分離することを特徴とするチオエステラー
ゼの調製法に存する。 本発明を更に詳細に説明すると、緑膿菌として
は、とくに限定なく、いずれの株でもよい。例え
ば緑膿菌P15−40株（緑膿菌株P15株より由来の
株で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。受託番号微工研菌寄第4387号）、緑膿菌
M12−E5株（緑膿菌M12株由来の株で工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている。受託
番号微工研菌寄第4386号）、緑膿菌NIH23株（緑
膿菌型別標準菌セツトの株で、Applied、
Microbiology18、760〜765（1967）に記載されて
いる。）等が挙げられる。 緑膿菌からチオエステラーゼを分離するには、
緑膿菌を破砕する工程、次いで遠心分画する工程
の２工程がとられる。破砕手段は、公知の方法で
よく、フレンチプレス、超音波、リゾチームによ
る溶解等が挙げられ、遠心分画法としては、例え
ば、5000×ｇ、10分間で未破砕菌体を沈降除去後
に、通常の超遠心器にて30000×ｇ30分間遠心し、
沈澱を採取すればよい。本発明方法おいては、緑
膿菌を破砕して遠心分画し、細胞膜分画を採取す
れば、該分画中にチオエステラーゼが同時に含ま
れるので、容易にチオエステラーゼを得ることが
できる。 このようにして得られたチオエステラーゼを含
む細胞膜分画は、パルミトイルコエンチームＡ、
オレオイルコエンチームＡなどの炭素数12〜18程
度の長鎖アシルコエンチームＡを速やかに加水分
解する強いチオエステラーゼ活性を有している。
またこのチオエステラーゼは、熱に強く、100℃
10分でも約50％の活性を有し、トリプシンやSDS
等各種界面活性剤及び有機溶媒処理にも耐性であ
る。 なお、本発明方法で得られるチオエステラーゼ
を含む膜分画は、そのまゝ使用しても十分チオエ
ステラーゼの高い活性を有し活性試験等に有用で
あるが、これを更に処理してチオエステラーゼを
可溶化して用いてもよいし、カラムクロマトグラ
フイー、密度勾配遠心、ゲル電気泳動などにより
精製して用いてもよい。 以下、本発明方法を実施例により詳細に説明す
る。 実施例 １ (1) チオエステラーゼを含む膜分画の分離 緑膿菌P15−40株を、下記倍地20を用いて
37℃で振とう培養した。 培地組成（１中） ソジウムグルタメート 20ｇ グルコース ５ｇ Na2HPO4・12H2O 5.63ｇ KH2PO4 0.25ｇ 下記組成の塩混合物 20ml 脱イオン水 残部 塩混合物組成（100ml中） ニトリロ三酢酸 0.75ｇ 1N KOH 12.4ml MgSO4・7H2O 1.5ｇ CaCl2・2H2O 0.3ｇ FeSO4・7H2O 10mg 脱イオン水 残部 培養液から得られた湿重量73ｇの菌体を洗浄
後、10mMトリス塩酸−2mM 塩化マグネシ
ウム緩衝液（PH7.2）に懸濁し、超音波破砕処
理をおこなつた。次いで5000×ｇで遠心して沈
澱を除き、上澄を超遠心器で4000×ｇで40分間
遠心し、細胞膜分画を分離した。得られた細胞
膜分画をホモジナイザーを用いて10mMトリス
塩酸（PH7.5）に懸濁した。これに2mM Mg2+
と２％Triton×100（商標）を添加し、室温で
１時間処理して可溶な成分を除去した。次いで
5mM EDTAと２％Triton×100（商標）を含
む同緩衝液中でホモジナイズし、先と同様に超
遠心をおこない、可溶化された蛋白質を含む上
澄を得た。これにエタノールを添加して、最終
濃度80％とし、蛋白質の沈澱を集めた。沈澱を
0.1Mトリス塩酸、２％SDS及び5mM EDTA
からなる緩衝液（PH8.5）少量に溶解して可溶
化酵素液を得た。 (2) チオエステラーゼ活性の測定 (1)で得られた分画からの可溶化酵素液につい
て下記検定液でチオエステラーゼ活性を測定し
た。 検定液 トリス塩酸（PH8.5） 0.1M ５，5′ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
0.5mM パルミトイルコエンチームＡ 25μM (1)で得られた膜分画からの可溶化酵素液
５〜50μｇProtein／ml 計 1.0ml 遊離されるコエンチームＡの濃度をEllman
反応による412nmの吸収により測定して、チオ
エステラーゼによる加水分解反応（パルミトイ
ルコエンチームＡのチオエステル結合を加水分
解して、コエンチームＡを遊離させる反応）の
反応速度（ｎ moles／min）を測定した。反
応速度は次式によつて求められる。 反応速度（ｎ moles／min）＝
△A412nm／min／13600×10-6 △A412nm／min：412nmの吸収の１分間当
りの増加分 チオエステラーゼ活性（109セル当りの反応
速度）は約13であつた。 このチオエステラーゼは、上記のチオエステ
ラーゼ活性を示す外、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレート（Tween80）、モノアシル
サツカロース（炭素数：C12、C16、C18）、アシ
ルｐ−ニトロフノール（炭素数：C10、C12、
C14、C16、C18）及びアシルカルニチン（炭素
数16）のようなオキシエステル類に対しても加
水分解活性を示した。また、その他の理化学的
性質は以下の通りであつた。 SDS−ポリアクリルアミドケル電気泳動に
よる分子量：約55000 安定PH：４以上（特に６−11） 至適PH：8.5−9.0 熱安定性：100℃で10分間加熱後の活性低
下1/2 コフアクターを要求せず 実施例 ２ 実施例１において、緑膿菌P15−40株のかわり
に、緑膿菌M12−E5株又は緑膿菌NIH23を用い
た外は、実施例１と同様にして、膜分画からの可
溶化酵素液を得、チオエステラーゼ活性を測定し
たところ、第１表のような結果を得た。
更に詳しくは、緑膿菌から新規なチオエステラー
ゼを調製する方法に関する。 チオエステラーゼはアシルコエンチームＡの定
量に利用されるなど、試薬として用いられてい
る。 本発明者等は緑膿菌のリン脂質合成経路をイン
ビトロで研究の途上、従来知られていなかつたチ
オエステラーゼ活性が菌体の細胞膜分画に存在す
ることを見出し、本発明を達成した。 すなわち、本発明の要旨は、緑膿菌を破砕し、
遠心分画法により細胞膜分画と共にチオエステラ
ーゼを分離することを特徴とするチオエステラー
ゼの調製法に存する。 本発明を更に詳細に説明すると、緑膿菌として
は、とくに限定なく、いずれの株でもよい。例え
ば緑膿菌P15−40株（緑膿菌株P15株より由来の
株で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。受託番号微工研菌寄第4387号）、緑膿菌
M12−E5株（緑膿菌M12株由来の株で工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託されている。受託
番号微工研菌寄第4386号）、緑膿菌NIH23株（緑
膿菌型別標準菌セツトの株で、Applied、
Microbiology18、760〜765（1967）に記載されて
いる。）等が挙げられる。 緑膿菌からチオエステラーゼを分離するには、
緑膿菌を破砕する工程、次いで遠心分画する工程
の２工程がとられる。破砕手段は、公知の方法で
よく、フレンチプレス、超音波、リゾチームによ
る溶解等が挙げられ、遠心分画法としては、例え
ば、5000×ｇ、10分間で未破砕菌体を沈降除去後
に、通常の超遠心器にて30000×ｇ30分間遠心し、
沈澱を採取すればよい。本発明方法おいては、緑
膿菌を破砕して遠心分画し、細胞膜分画を採取す
れば、該分画中にチオエステラーゼが同時に含ま
れるので、容易にチオエステラーゼを得ることが
できる。 このようにして得られたチオエステラーゼを含
む細胞膜分画は、パルミトイルコエンチームＡ、
オレオイルコエンチームＡなどの炭素数12〜18程
度の長鎖アシルコエンチームＡを速やかに加水分
解する強いチオエステラーゼ活性を有している。
またこのチオエステラーゼは、熱に強く、100℃
10分でも約50％の活性を有し、トリプシンやSDS
等各種界面活性剤及び有機溶媒処理にも耐性であ
る。 なお、本発明方法で得られるチオエステラーゼ
を含む膜分画は、そのまゝ使用しても十分チオエ
ステラーゼの高い活性を有し活性試験等に有用で
あるが、これを更に処理してチオエステラーゼを
可溶化して用いてもよいし、カラムクロマトグラ
フイー、密度勾配遠心、ゲル電気泳動などにより
精製して用いてもよい。 以下、本発明方法を実施例により詳細に説明す
る。 実施例 １ (1) チオエステラーゼを含む膜分画の分離 緑膿菌P15−40株を、下記倍地20を用いて
37℃で振とう培養した。 培地組成（１中） ソジウムグルタメート 20ｇ グルコース ５ｇ Na2HPO4・12H2O 5.63ｇ KH2PO4 0.25ｇ 下記組成の塩混合物 20ml 脱イオン水 残部 塩混合物組成（100ml中） ニトリロ三酢酸 0.75ｇ 1N KOH 12.4ml MgSO4・7H2O 1.5ｇ CaCl2・2H2O 0.3ｇ FeSO4・7H2O 10mg 脱イオン水 残部 培養液から得られた湿重量73ｇの菌体を洗浄
後、10mMトリス塩酸−2mM 塩化マグネシ
ウム緩衝液（PH7.2）に懸濁し、超音波破砕処
理をおこなつた。次いで5000×ｇで遠心して沈
澱を除き、上澄を超遠心器で4000×ｇで40分間
遠心し、細胞膜分画を分離した。得られた細胞
膜分画をホモジナイザーを用いて10mMトリス
塩酸（PH7.5）に懸濁した。これに2mM Mg2+
と２％Triton×100（商標）を添加し、室温で
１時間処理して可溶な成分を除去した。次いで
5mM EDTAと２％Triton×100（商標）を含
む同緩衝液中でホモジナイズし、先と同様に超
遠心をおこない、可溶化された蛋白質を含む上
澄を得た。これにエタノールを添加して、最終
濃度80％とし、蛋白質の沈澱を集めた。沈澱を
0.1Mトリス塩酸、２％SDS及び5mM EDTA
からなる緩衝液（PH8.5）少量に溶解して可溶
化酵素液を得た。 (2) チオエステラーゼ活性の測定 (1)で得られた分画からの可溶化酵素液につい
て下記検定液でチオエステラーゼ活性を測定し
た。 検定液 トリス塩酸（PH8.5） 0.1M ５，5′ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）
0.5mM パルミトイルコエンチームＡ 25μM (1)で得られた膜分画からの可溶化酵素液
５〜50μｇProtein／ml 計 1.0ml 遊離されるコエンチームＡの濃度をEllman
反応による412nmの吸収により測定して、チオ
エステラーゼによる加水分解反応（パルミトイ
ルコエンチームＡのチオエステル結合を加水分
解して、コエンチームＡを遊離させる反応）の
反応速度（ｎ moles／min）を測定した。反
応速度は次式によつて求められる。 反応速度（ｎ moles／min）＝
△A412nm／min／13600×10-6 △A412nm／min：412nmの吸収の１分間当
りの増加分 チオエステラーゼ活性（109セル当りの反応
速度）は約13であつた。 このチオエステラーゼは、上記のチオエステ
ラーゼ活性を示す外、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレート（Tween80）、モノアシル
サツカロース（炭素数：C12、C16、C18）、アシ
ルｐ−ニトロフノール（炭素数：C10、C12、
C14、C16、C18）及びアシルカルニチン（炭素
数16）のようなオキシエステル類に対しても加
水分解活性を示した。また、その他の理化学的
性質は以下の通りであつた。 SDS−ポリアクリルアミドケル電気泳動に
よる分子量：約55000 安定PH：４以上（特に６−11） 至適PH：8.5−9.0 熱安定性：100℃で10分間加熱後の活性低
下1/2 コフアクターを要求せず 実施例 ２ 実施例１において、緑膿菌P15−40株のかわり
に、緑膿菌M12−E5株又は緑膿菌NIH23を用い
た外は、実施例１と同様にして、膜分画からの可
溶化酵素液を得、チオエステラーゼ活性を測定し
たところ、第１表のような結果を得た。
【表】
比較例 １
実施例１において大腸菌W3110株を使用した外
は、同様に処理して膜画分を得、チオエステラー
ゼ活性を測定したところ、活性は０であつた。
は、同様に処理して膜画分を得、チオエステラー
ゼ活性を測定したところ、活性は０であつた。
Claims (1)
- １ 緑膿菌を破砕し、遠心分画法により細胞膜分
画と共にチオエステラーゼを分離することを特徴
とするチオエステラーゼの調製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1479478A JPS54107591A (en) | 1978-02-10 | 1978-02-10 | Preparation of thioesterase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1479478A JPS54107591A (en) | 1978-02-10 | 1978-02-10 | Preparation of thioesterase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS54107591A JPS54107591A (en) | 1979-08-23 |
| JPS6317435B2 true JPS6317435B2 (ja) | 1988-04-13 |
Family
ID=11870951
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1479478A Granted JPS54107591A (en) | 1978-02-10 | 1978-02-10 | Preparation of thioesterase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS54107591A (ja) |
-
1978
- 1978-02-10 JP JP1479478A patent/JPS54107591A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS54107591A (en) | 1979-08-23 |
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