JPS6272669A - γ−グルタミルトランスフエラ−ゼの定量用基質およびその定量方法 - Google Patents
γ−グルタミルトランスフエラ−ゼの定量用基質およびその定量方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、酵素γ−グルタミルトランスフェラーゼの比
色定量用の新規の基質および方法に関する。
色定量用の新規の基質および方法に関する。
ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（以下、γ−Ｇ
Ｔと称することがある）の活性は、臨床評価において最
も日常的に測定される血清酵素活性の１つである。血清
中のγ−ＧＴ活性の測定は、肝臓疾患を検出する有用な
試験方法である。この酵素はがンマーダルタミル基の転
移を触媒する。
Ｔと称することがある）の活性は、臨床評価において最
も日常的に測定される血清酵素活性の１つである。血清
中のγ−ＧＴ活性の測定は、肝臓疾患を検出する有用な
試験方法である。この酵素はがンマーダルタミル基の転
移を触媒する。
一般に、ｒ−ＧＴの定量には基本的な方法が２種類ある
。第１の方法は直接法であり、γ−ＧＴ酵素による検出
可能種の直接解放を含むものである。この型の最も普通
の方法には、基質γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド
の使用が含まれる。
。第１の方法は直接法であり、γ−ＧＴ酵素による検出
可能種の直接解放を含むものである。この型の最も普通
の方法には、基質γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド
の使用が含まれる。
この基質を含む試薬組成物を、γ−〇Ｔを含有するもの
と疑われる血清試料と混合する。試料中にｒ−ｃ’ｒが
存在する場合には、検出可能なｐ−二トロアニリンを放
出する基質からグルタミル基が開裂する。この基質につ
いてはいくつかの問題点が指摘されてきた。例えば、前
記の基質は望ましい水準よりも溶解性が俸り９、で、こ
の基質を使用する分析において反応混合物は通常、゛・
基質限定的である。明らかなとおり、酵素量を測定する
ことが望ましい場合には、基質を過剰にすることが重要
である。従って、この問題を解決するいくつかの提案が
行われてきた。例えば、界面活性剤を使用して、あるい
は可溶化基を加えることによって基質を変性して反応混
合物中での基質の溶解性を病くすることが行われてきた
。この型の変性を開示した代表的な特許文献は米国特許
第３，７０３，４４１号および３，９７９，４４７号各
明細書である。
と疑われる血清試料と混合する。試料中にｒ−ｃ’ｒが
存在する場合には、検出可能なｐ−二トロアニリンを放
出する基質からグルタミル基が開裂する。この基質につ
いてはいくつかの問題点が指摘されてきた。例えば、前
記の基質は望ましい水準よりも溶解性が俸り９、で、こ
の基質を使用する分析において反応混合物は通常、゛・
基質限定的である。明らかなとおり、酵素量を測定する
ことが望ましい場合には、基質を過剰にすることが重要
である。従って、この問題を解決するいくつかの提案が
行われてきた。例えば、界面活性剤を使用して、あるい
は可溶化基を加えることによって基質を変性して反応混
合物中での基質の溶解性を病くすることが行われてきた
。この型の変性を開示した代表的な特許文献は米国特許
第３，７０３，４４１号および３，９７９，４４７号各
明細書である。
この直接法に関して指摘されてきた第２の問題は、解放
される検出可能な種が４００ｎｍ範囲に極大吸収をもつ
点である。残念なことに、多くの血液成分例えばヘモグ
ロビンおよびビリルビンもこの範囲に吸収をもち、従っ
てｐ−ニトロアニリンを他の血液成分の存在下で検出す
ることは困難である。その結果、各試料についてブラン
ク実験を実施する必要がある。このために、γ−ＧＴの
測定が複雑になり、不正確になり、そして費用のかかる
ものになる。
される検出可能な種が４００ｎｍ範囲に極大吸収をもつ
点である。残念なことに、多くの血液成分例えばヘモグ
ロビンおよびビリルビンもこの範囲に吸収をもち、従っ
てｐ−ニトロアニリンを他の血液成分の存在下で検出す
ることは困難である。その結果、各試料についてブラン
ク実験を実施する必要がある。このために、γ−ＧＴの
測定が複雑になり、不正確になり、そして費用のかかる
ものになる。
主にはこの第２の問題の結果として、間接法が開発され
てきた。この方法では、ｒ−ｃ’ｒは基質からのグルタ
ミル基の解放を触媒する。この基質の残部（グルタミル
基を除いた部分）は別の試薬と反応して、４０’Ｏｎｍ
範囲のスペクトルから離れて吸収する染料を生成するこ
とができる。提案されてきた池の試薬には、酸化剤およ
びカップラーが含まれる。しかしながら、これらの他の
試薬を加えることによって更に複雑にそして高価なもの
になるだけでなく、別の妨害反応を起こす機会を提供す
ることになる。この後者の型の方法は、米国特許第４．
１７７．１０９号明細曹に実施例が記載されている。す
なわち、ｒ−ＧＴが基質上で反応するとｐ−フ夏二レン
ジアミンが解放され、続いてｐ−７エニレンソアミンは
ジアゾカップリング化合物、アルデヒド誘導体または同
様の試薬と反応し、そして色原体を形成し、これを検出
する。
てきた。この方法では、ｒ−ｃ’ｒは基質からのグルタ
ミル基の解放を触媒する。この基質の残部（グルタミル
基を除いた部分）は別の試薬と反応して、４０’Ｏｎｍ
範囲のスペクトルから離れて吸収する染料を生成するこ
とができる。提案されてきた池の試薬には、酸化剤およ
びカップラーが含まれる。しかしながら、これらの他の
試薬を加えることによって更に複雑にそして高価なもの
になるだけでなく、別の妨害反応を起こす機会を提供す
ることになる。この後者の型の方法は、米国特許第４．
１７７．１０９号明細曹に実施例が記載されている。す
なわち、ｒ−ＧＴが基質上で反応するとｐ−フ夏二レン
ジアミンが解放され、続いてｐ−７エニレンソアミンは
ジアゾカップリング化合物、アルデヒド誘導体または同
様の試薬と反応し、そして色原体を形成し、これを検出
する。
前記の点から既に明らかなとおり、ｒ−ＧＴ分析に使用
することのできる基質の必要性は依然として存在する。
することのできる基質の必要性は依然として存在する。
その基質および方法は、前記の直接法および別の試薬を
必要とする方法の問題点を解決するものであるべきであ
る。使用するγ−ＧＴ基質は溶解度が高く、ｒ−ＧＴＴ
定用の反応が基質限定的でなく、そして４００ｎｍ領域
から離れた領域で吸収する種を生成するものであるべき
である。
必要とする方法の問題点を解決するものであるべきであ
る。使用するγ−ＧＴ基質は溶解度が高く、ｒ−ＧＴＴ
定用の反応が基質限定的でなく、そして４００ｎｍ領域
から離れた領域で吸収する種を生成するものであるべき
である。
本発明者は、成る種のγ−グルタミド置換スチリルキノ
ＩＪ ニウム塩がｒ−ＧＴ定定量用優れた基質であるこ
とを見出し念。有用な塩は構造式％式％ 〔式中、Ｒお工びＲ１はそれぞれ独立に水素原子、アル
キル基お工びアルコキシ基から選んだものであり、そし
てＱは式 （式中、Ｒ２は炭素原子１〜４個のアルキル基であり、
Ｒ５およびＲ４はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基
、アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基および八ツｒ〕原
子から選んだものであり、セしてＸ はアニオ／である
） で表される基である〕 で表される。
ＩＪ ニウム塩がｒ−ＧＴ定定量用優れた基質であるこ
とを見出し念。有用な塩は構造式％式％ 〔式中、Ｒお工びＲ１はそれぞれ独立に水素原子、アル
キル基お工びアルコキシ基から選んだものであり、そし
てＱは式 （式中、Ｒ２は炭素原子１〜４個のアルキル基であり、
Ｒ５およびＲ４はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基
、アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基および八ツｒ〕原
子から選んだものであり、セしてＸ はアニオ／である
） で表される基である〕 で表される。
本発明によれば、前記の基質お工びｒ−グルメミル受容
体を含む試薬組成物と、γ−ＧＴを含有する疑いのある
試料とを接触させる工程、およびアミノスチリルキノリ
ニウム染料の生成する速度を測定する工程によってγ−
グルタミルトランスフェラーゼを定量することができる
。
体を含む試薬組成物と、γ−ＧＴを含有する疑いのある
試料とを接触させる工程、およびアミノスチリルキノリ
ニウム染料の生成する速度を測定する工程によってγ−
グルタミルトランスフェラーゼを定量することができる
。
本発明によるγ−ＧＴ基質は構造式
〔式中、ＲおＬびＲ１はそれぞれ独立に水素原子、アル
キル基（置換されたアルキル基を含む）好ましくは炭素
原子に１〜１０個のもの例えばメチル基、エチル基、デ
シル基およびクロロメチル基。
キル基（置換されたアルキル基を含む）好ましくは炭素
原子に１〜１０個のもの例えばメチル基、エチル基、デ
シル基およびクロロメチル基。
ならびにアルコキシ基（置換されたアルコキシ基を含む
）好ましくは炭素原子１〜１０個のもの例えばメトキシ
基、エトキシ基およびデシルオキシ基から選んだもので
あり、そしてＱは式（式中、Ｒ２は炭素原子１〜４個の
アルキル基（置換されたアルキル基を含む）例えばメチ
ル基、イソグロビル基およびクロロブチル基であり、Ｒ
３お工びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基お
工びアルコキシ基（置換されたアルキル基およびアルコ
キシ基を含む：例えばＲお工びＲ４と同様のもの）、ニ
トロ基、シアノ基ならびにハロダン原子から選んだもの
であり、そしてＸ はアニオンである〕 で表される基である〕 で表される。
）好ましくは炭素原子１〜１０個のもの例えばメトキシ
基、エトキシ基およびデシルオキシ基から選んだもので
あり、そしてＱは式（式中、Ｒ２は炭素原子１〜４個の
アルキル基（置換されたアルキル基を含む）例えばメチ
ル基、イソグロビル基およびクロロブチル基であり、Ｒ
３お工びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基お
工びアルコキシ基（置換されたアルキル基およびアルコ
キシ基を含む：例えばＲお工びＲ４と同様のもの）、ニ
トロ基、シアノ基ならびにハロダン原子から選んだもの
であり、そしてＸ はアニオンである〕 で表される基である〕 で表される。
本発明による好ましい化合物はＮ−メチル−４−（４’
−（γ−グルタミド）−スチリル）キノリニウムテトラ
フルオロぎレートである。この化合物の調製は、本発明
の範囲内の他の化合物の調製の実例となるので、詳細を
後述する。
−（γ−グルタミド）−スチリル）キノリニウムテトラ
フルオロぎレートである。この化合物の調製は、本発明
の範囲内の他の化合物の調製の実例となるので、詳細を
後述する。
前記の構造式において、Ｘ はアニオンである。
アニオンの性質はγ−ＧＴ用の基質となる化合物の能力
に影響を与えないので、任意のアニオン例、ｔＪ−１’
八ログン例えばフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨード
、アリールスルホネート例えばｐ−）ルエンスルホネー
ト、ベルクロレート等を使用することができる。ハロダ
ン化アニオン例えばテトラフルオロ？レート、ヘキサフ
ルオロホスフェート、クロロソンケートおよびヘキサフ
ルオロホスフェ−トは、例えば高可溶性クロロ化合物よ
りはわずかに可溶性が低く、従って単離がより容易であ
る。
に影響を与えないので、任意のアニオン例、ｔＪ−１’
八ログン例えばフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨード
、アリールスルホネート例えばｐ−）ルエンスルホネー
ト、ベルクロレート等を使用することができる。ハロダ
ン化アニオン例えばテトラフルオロ？レート、ヘキサフ
ルオロホスフェート、クロロソンケートおよびヘキサフ
ルオロホスフェ−トは、例えば高可溶性クロロ化合物よ
りはわずかに可溶性が低く、従って単離がより容易であ
る。
γ−ＧＴの定量にはγ−グルタミル受容体が含まれる。
グリシルグリシンは緩衝剤としても機能するので、好ま
しい受容体である。本発明の基質からのグルタミル基量
の他の受容体としては、アメ／９ラギン酸、メチオニン
およびＬ−７エニルアラニンが含まれる。
しい受容体である。本発明の基質からのグルタミル基量
の他の受容体としては、アメ／９ラギン酸、メチオニン
およびＬ−７エニルアラニンが含まれる。
本発明の基質およびグルタミル受容体の他に、ｒ−ＧＴ
定量用の試薬は場合により緩衝液を含有している。反応
混合物をｐＨ６〜９好ましくは８．０〜８５に緩衝する
。この−を提供する好ましい緩衝液としては、グリシル
グリシン（これは受容体および緩衝液の両機能を示す）
、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔トリスと
しても知られている〕またはその塩、Ｎ−２−ヒドロキ
シピベラノンーＮ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、１．４−ピベラソンジエタンスルホン酸（ＰＩＰ
ＥＳ）、ならびに当業界において公知の池の緩衝液が含
まれる。
定量用の試薬は場合により緩衝液を含有している。反応
混合物をｐＨ６〜９好ましくは８．０〜８５に緩衝する
。この−を提供する好ましい緩衝液としては、グリシル
グリシン（これは受容体および緩衝液の両機能を示す）
、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〔トリスと
しても知られている〕またはその塩、Ｎ−２−ヒドロキ
シピベラノンーＮ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）、１．４−ピベラソンジエタンスルホン酸（ＰＩＰ
ＥＳ）、ならびに当業界において公知の池の緩衝液が含
まれる。
本発明の基質全室む試薬組成物は、通常の量で反応体を
含有している。例えば、最終反応混合物中において、本
発明の基質は約０．１〜約５ｍＭ好”ましくば０．３〜
１．５ｍＭの量で、グルタミル受容体は約１０〜約５０
０−好ましくは５０〜１５０ｍＭの量で、そして緩衝液
は約５０〜約２５０ｍＭ好ましくは７５〜１５０ｍｈｌ
ｌの量で存在することができる。
含有している。例えば、最終反応混合物中において、本
発明の基質は約０．１〜約５ｍＭ好”ましくば０．３〜
１．５ｍＭの量で、グルタミル受容体は約１０〜約５０
０−好ましくは５０〜１５０ｍＭの量で、そして緩衝液
は約５０〜約２５０ｍＭ好ましくは７５〜１５０ｍｈｌ
ｌの量で存在することができる。
試薬組成物は各種の形で調製する。例えば、試薬を場合
により凍結乾燥粉末または錠剤として調製し、これを水
で再構成して試薬溶液を生成する。
により凍結乾燥粉末または錠剤として調製し、これを水
で再構成して試薬溶液を生成する。
前記の形の試薬組成物を生成する技術および材料例えば
充填剤、結合剤等に当業界において周知である。
充填剤、結合剤等に当業界において周知である。
本発明のγ−ＧＴ基質は通常の溶液分析および乾式分析
要素において有用である。溶液分析は、前記γ−ＧＴ基
質とγ−グルタミル受容体とを含有する試薬組成物中に
、γ−ＧＴを含有する疑いのある試料を加えることによ
って実施する。得られた溶液を設定温度で一定時間■表
的には４０℃までの温度で３０分間まで）放置する。得
られた反応混合物中でのγ−ＧＴの存在は、混合物の色
彩の変化によって示される。色彩の変化は、通常の分光
光度技術を使い、５００ｎｍ以上の波長を使用して検出
することができる。染料生成の速度はｒ−ＧＴ酵素濃度
に比例する。乾式分析要素が望ましい場合には、試薬組
成物を適当な支持体上に塗布し、得られた層を乾燥する
。その要素と試料とを接触させると試薬が溶解し、そし
て再び、ｒ−ＧＴの存在下で、得られた色彩変化を測定
することができる。
要素において有用である。溶液分析は、前記γ−ＧＴ基
質とγ−グルタミル受容体とを含有する試薬組成物中に
、γ−ＧＴを含有する疑いのある試料を加えることによ
って実施する。得られた溶液を設定温度で一定時間■表
的には４０℃までの温度で３０分間まで）放置する。得
られた反応混合物中でのγ−ＧＴの存在は、混合物の色
彩の変化によって示される。色彩の変化は、通常の分光
光度技術を使い、５００ｎｍ以上の波長を使用して検出
することができる。染料生成の速度はｒ−ＧＴ酵素濃度
に比例する。乾式分析要素が望ましい場合には、試薬組
成物を適当な支持体上に塗布し、得られた層を乾燥する
。その要素と試料とを接触させると試薬が溶解し、そし
て再び、ｒ−ＧＴの存在下で、得られた色彩変化を測定
することができる。
最も簡単な形において、本発明の乾式分析要素は、前記
の試薬組成物で含浸したキャリアマ） ＩＪクスからな
る。有用なキャリアマトリクスは不溶性であり、水また
は生理液体例えば血清もしくは尿に露した場合にその構
造一体性を維持するものである。有用なキャリアマトリ
クスとしては、紙、セルロース、木材、ガラス繊維、織
布お工び不織布が含まれる。有用な乾式分析要素は、試
薬組成物を含む溶液をマトリクス中に膨潤し、乾燥する
ことによって製造する。
の試薬組成物で含浸したキャリアマ） ＩＪクスからな
る。有用なキャリアマトリクスは不溶性であり、水また
は生理液体例えば血清もしくは尿に露した場合にその構
造一体性を維持するものである。有用なキャリアマトリ
クスとしては、紙、セルロース、木材、ガラス繊維、織
布お工び不織布が含まれる。有用な乾式分析要素は、試
薬組成物を含む溶液をマトリクス中に膨潤し、乾燥する
ことによって製造する。
前記の要素は、層中にまたは層中に試薬をもつ層状また
は帯状構造からなることもできる。１つの型の構造には
、等方多孔性ポリマーまたは織布であることのできる拡
散性層が含される。前記の試薬組成物を使用せることの
できる有用な材料および要素は、例えば米国特許第３，
０９２，４６５号、第３，４１８，０９９号、第３，４
１８，０８３号、第２．８９３，８４３号、第２．８９
３，８４４号、第２．９１２，３０９号、第３，００８
，８７９号、第３．８０２，８４２号、第３，７９８，
０６４号、第３．２９８，７３９号、第３，９１５，６
４７号、第３．９１７，４５３号、第３，９９３，５９
４号、第３．９３６，３５７号、第４，２７０，９２０
号、第４．２４８，８２９号、第４，２５５，３８４号
、第４．２５６，６９３号、および英国特許第２，０５
２，０５７号各明細書に記載されている。
は帯状構造からなることもできる。１つの型の構造には
、等方多孔性ポリマーまたは織布であることのできる拡
散性層が含される。前記の試薬組成物を使用せることの
できる有用な材料および要素は、例えば米国特許第３，
０９２，４６５号、第３，４１８，０９９号、第３，４
１８，０８３号、第２．８９３，８４３号、第２．８９
３，８４４号、第２．９１２，３０９号、第３，００８
，８７９号、第３．８０２，８４２号、第３，７９８，
０６４号、第３．２９８，７３９号、第３，９１５，６
４７号、第３．９１７，４５３号、第３，９９３，５９
４号、第３．９３６，３５７号、第４，２７０，９２０
号、第４．２４８，８２９号、第４，２５５，３８４号
、第４．２５６，６９３号、および英国特許第２，０５
２，０５７号各明細書に記載されている。
好ましい乾式分析要素において、その要素は非繊維性等
方性多孔質拡散性層を担持する支持体を含んでいる。そ
の拡散性層はその中に前記試薬組成物をもっている。試
薬組成物を前記のような多孔質拡散性層に含ませるのが
望ましい。なぜなら、ｒ−ＧＴは比較的大きいタン／母
り質であり、多孔質層がｒ−ＧＴと試薬組成物とのより
良好な接触を提供するからである。あるいは、試薬組成
物の試薬の一部を拡散性層に存在させ、他の試薬を他の
層例えば通常試薬層と称する層に存在させることができ
る。すべての試薬をこれらの他の層に存在させることが
できる。
方性多孔質拡散性層を担持する支持体を含んでいる。そ
の拡散性層はその中に前記試薬組成物をもっている。試
薬組成物を前記のような多孔質拡散性層に含ませるのが
望ましい。なぜなら、ｒ−ＧＴは比較的大きいタン／母
り質であり、多孔質層がｒ−ＧＴと試薬組成物とのより
良好な接触を提供するからである。あるいは、試薬組成
物の試薬の一部を拡散性層に存在させ、他の試薬を他の
層例えば通常試薬層と称する層に存在させることができ
る。すべての試薬をこれらの他の層に存在させることが
できる。
有用な等方性多孔質拡散性層は米国特許第３．９９２，
１５８号明細書に記載されている。１つの態様において
は１粒状材料を使用して層を形成し、粒子間の連続空隙
によって等方性多孔性を生成する。あるいは、等方性多
孔質ポリマー例えば「ブラシ」ポリマーを使用して前記
のような層を調製する。
１５８号明細書に記載されている。１つの態様において
は１粒状材料を使用して層を形成し、粒子間の連続空隙
によって等方性多孔性を生成する。あるいは、等方性多
孔質ポリマー例えば「ブラシ」ポリマーを使用して前記
のような層を調製する。
好ましい等方性多孔質拡散性層は粒状材料例えば二酸化
チタンを含有する。本発明で使用する好ましい材料の別
の例としては、微結晶セルロース（ＦＭＣ社から商品名
Ａｖｌｃａｌとして市販されている）がある。特に好ま
しい材料は硫酸バリウムである。
チタンを含有する。本発明で使用する好ましい材料の別
の例としては、微結晶セルロース（ＦＭＣ社から商品名
Ａｖｌｃａｌとして市販されている）がある。特に好ま
しい材料は硫酸バリウムである。
別の有用な多孔質拡散性層は米国特許第４．２５８，０
０１号明細書に記載のビーズ拡散性層である。この特許
明細書のビーズ拡散性層は、粒子が最も接近した場所で
隣接粒子間に位置する少量の接着剤によって一緒になっ
たポリマー粒子を含有する。
０１号明細書に記載のビーズ拡散性層である。この特許
明細書のビーズ拡散性層は、粒子が最も接近した場所で
隣接粒子間に位置する少量の接着剤によって一緒になっ
たポリマー粒子を含有する。
以下に記載するＮ−メチル−４−（４’−（ｒ−グルタ
ミド）スチリル）キノリニウムフルオロ−レートの調製
は、本発明の化合物の調製を例示するものである。中間
生成物および最終生成物は、赤外線分光分析および核磁
気共鳴分析によって特徴付けした。
ミド）スチリル）キノリニウムフルオロ−レートの調製
は、本発明の化合物の調製を例示するものである。中間
生成物および最終生成物は、赤外線分光分析および核磁
気共鳴分析によって特徴付けした。
製
工程（１）：中間生成物（Ａ）の調製
Ｎ−メチルレピソニウムヨーソド（２８５ｇ。
１モル）とｐ−アセトアミドベンズアルデヒド（１６３
ｇ、１モル）とをメタノール（１２００ゴ）中において
、その混合物を沸点まで加熱することによりて溶解させ
た。ピ（リソン（１０ゴ）を攪拌下で加え、その溶液を
５５℃の水浴中で３時間加熱した。混合物を水浴中で冷
却し、赤さび色の固体を炉別し、冷メタノール少量およ
びエーテルで洗浄し、最後にスチームキャビネット中で
乾燥して、中間生成物（Ａ）３３５．９（７８チ）を得
た。
ｇ、１モル）とをメタノール（１２００ゴ）中において
、その混合物を沸点まで加熱することによりて溶解させ
た。ピ（リソン（１０ゴ）を攪拌下で加え、その溶液を
５５℃の水浴中で３時間加熱した。混合物を水浴中で冷
却し、赤さび色の固体を炉別し、冷メタノール少量およ
びエーテルで洗浄し、最後にスチームキャビネット中で
乾燥して、中間生成物（Ａ）３３５．９（７８チ）を得
た。
工程（２）：中間生成物（Ｂ）の調製
Ｎ−メチル−４−（４’−アセトアミドスチリル）キノ
リニウムヨーノド〔中間体（Ａ） ： ２００ ｇ、０
．４７モル〕を氷酢酸ｌｌ中の４８％ＨＢｒ ２００−
の溶液と共に１時間還流加熱した。混合物を冷却し、生
成物を濾過によって収集し、少量のエーテルで洗い、ス
チームキャビネット中で乾がした。
リニウムヨーノド〔中間体（Ａ） ： ２００ ｇ、０
．４７モル〕を氷酢酸ｌｌ中の４８％ＨＢｒ ２００−
の溶液と共に１時間還流加熱した。混合物を冷却し、生
成物を濾過によって収集し、少量のエーテルで洗い、ス
チームキャビネット中で乾がした。
アミン臭化水素塩１６６．９が得られた。遊離のアミン
を以下の方法で得た。４８チＨＢｒ２〜３１１Ｌｌを含
有する沸とう水２１中に臭化水素塩を溶解し、続いてこ
の熱溶液中にピリジン１００１１ｔｌを加えた。
を以下の方法で得た。４８チＨＢｒ２〜３１１Ｌｌを含
有する沸とう水２１中に臭化水素塩を溶解し、続いてこ
の熱溶液中にピリジン１００１１ｔｌを加えた。
混合物を水浴中で冷却し、染料をマゼンタ板として戸別
し、これをスチームキャビネット中で一晩乾かした。中
間生成物（Ｂ） １３１ ｊｉ （ｓ ３％）が得られ
た。
し、これをスチームキャビネット中で一晩乾かした。中
間生成物（Ｂ） １３１ ｊｉ （ｓ ３％）が得られ
た。
工程（３）：中間生成物（Ｃ）の調製
−トリフルオロ酢酸無水物（５００ｇ、２．３８モル）
を水浴中の２１フラスコに装入した。この冷却、攪拌し
た無水物中に、Ｌ（＋）−グルタミン酸（１６６Ｌ１．
１３モル）を１度に全部加えた。
を水浴中の２１フラスコに装入した。この冷却、攪拌し
た無水物中に、Ｌ（＋）−グルタミン酸（１６６Ｌ１．
１３モル）を１度に全部加えた。
２〜３分後に、スラリーがほとんど固体になり、続いて
固体を溶解させながら加熱した。固体が溶液になるにつ
れて、反応はほとんど沸点に達しな。
固体を溶解させながら加熱した。固体が溶液になるにつ
れて、反応はほとんど沸点に達しな。
溶液を室温に冷却した。この２つのパッチを一緒にし、
トリフルオロ酢酸を真空蒸発によって除去した。残留物
に乾燥エーテル１１を加えた。シロップ状物が最初に溶
解し、次に、光沢のある白色板として析出し始めた。混
合物を一晩冷却した。
トリフルオロ酢酸を真空蒸発によって除去した。残留物
に乾燥エーテル１１を加えた。シロップ状物が最初に溶
解し、次に、光沢のある白色板として析出し始めた。混
合物を一晩冷却した。
生成物を戸別し、乾燥エーテルで洗い、そして真空オー
プン中で室温で乾燥させ念、中間生成物（０３２０ｙ（
６３％）が得られ念。
プン中で室温で乾燥させ念、中間生成物（０３２０ｙ（
６３％）が得られ念。
工程（４）：中間生成物（ロ）の調製
Ｎ−メチル４− （４’ニアミノスチリル）キノリニウ
ムプロミド〔中間生成物（ロ）〕７７０ｇ０．２１モル
）とトリフルオロアセチルグルタミン酸無水物〔中間生
成物（Ｃ）：１６０１０．２７モル）と乾燥Ｎ ＋ Ｎ
−’） メｆ ／ｌ／ ホＡ／ Ａ ７ミド（ＤＭＦ
） ３５０ ｍｌとの混合物を、出発材料が薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）で観察されなくなるまで攪拌下
でスチームパス上で加熱した。真空蒸発によりてほとん
どすべてのＤＭＰ“を除去すると残留物が固化し始めた
。
ムプロミド〔中間生成物（ロ）〕７７０ｇ０．２１モル
）とトリフルオロアセチルグルタミン酸無水物〔中間生
成物（Ｃ）：１６０１０．２７モル）と乾燥Ｎ ＋ Ｎ
−’） メｆ ／ｌ／ ホＡ／ Ａ ７ミド（ＤＭＦ
） ３５０ ｍｌとの混合物を、出発材料が薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）で観察されなくなるまで攪拌下
でスチームパス上で加熱した。真空蒸発によりてほとん
どすべてのＤＭＰ“を除去すると残留物が固化し始めた
。
残留物をアルコールと共に１時間攪拌し、続いて一晩冷
却した。オレンジ色の固体を戸別し、アルコールで洗い
、スチームキャビネット中で乾かした。中間生成物０）
）８２ｇ（７１％）が得られた。
却した。オレンジ色の固体を戸別し、アルコールで洗い
、スチームキャビネット中で乾かした。中間生成物０）
）８２ｇ（７１％）が得られた。
ＴＬＣ（シリカ、９：１酢酸： Ｈ２Ｏ）、１スポツト
、Ｒ，＝０．７５゜ 工程（５） ： Ｎ−メチル−４−（４’−（γ−グル
タミドスチリル））キノリニウムフルオ ロがレートの調製 氷および氷水で８００１ＬＬ７！に希釈した５ ０ ％
ＮａＣｋＩ２５９の溶液に、中間生成物（至）（８２
ｇ、０．１４モル）を攪拌下に加えた。冷溶液を約１時
間攪拌し、氷酢酸で酸性にした。混合物をわずかに暖た
めて、分離していた若干の固体を再溶解させた。
、Ｒ，＝０．７５゜ 工程（５） ： Ｎ−メチル−４−（４’−（γ−グル
タミドスチリル））キノリニウムフルオ ロがレートの調製 氷および氷水で８００１ＬＬ７！に希釈した５ ０ ％
ＮａＣｋＩ２５９の溶液に、中間生成物（至）（８２
ｇ、０．１４モル）を攪拌下に加えた。冷溶液を約１時
間攪拌し、氷酢酸で酸性にした。混合物をわずかに暖た
めて、分離していた若干の固体を再溶解させた。
Ｈ２Ｏ１００ｆｆ＋７中のナトリウムフルオロ？レート
（３２ｇ、０．２９モル）の溶液を濾過したものを攪拌
下に加えた。混合物を水浴中で冷却し、濾過したほとん
どの水を除去した。残留した粘性固体をアルコール１１
と一晩攪拌した。生成物を戸別し、アセトンそして次に
エーテルで洗い、空気中で室温で乾かしｆｃ、遊離アミ
ン６８ｇが得られた。
（３２ｇ、０．２９モル）の溶液を濾過したものを攪拌
下に加えた。混合物を水浴中で冷却し、濾過したほとん
どの水を除去した。残留した粘性固体をアルコール１１
と一晩攪拌した。生成物を戸別し、アセトンそして次に
エーテルで洗い、空気中で室温で乾かしｆｃ、遊離アミ
ン６８ｇが得られた。
テトラフルオロボレート塩は以下の方法で精製した。
ナトリウムフルオロがレート（２５ｇ、０．２３モル）
と氷酢酸（５０ＷＬｌ）とを含む沸とう水ｌｌ中に、前
記工程で得られた生成物１００ｇを溶解した。脱色カー
？ン（１０ｇ）を加え、溶液を熱間濾過した。放置して
室温に冷却し、続いて一晩冷却した。固Ｉｔ−Ｆ別し、
氷水および次にアルコールそして最後にエーテルで洗り
た。生成物をスチームオープン中で約５０℃で乾かした
。Ｎ−メチル−４−（４’−（ｒ−グルタミドスチリル
））キノリニウムフルオロデレー）（ｒ−ＧＡＳＱ）９
７ｇが得られた。ＴＬＣ（シリカ、１：９Ｈ２０：ＣＨ
３ＣＯ０Ｈ）、１スポツト、Ｒｆ ユ０．４゜例２：
好ましいγ−ＧＴ基質および相当する染料のスペクトル グリシルグリシリン０．０７５モルを含有する０、 １
Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ８，５）中に、基質とアミノ
スチリルキノリニウム染料（ｒ−グルタミル基なし）を
別々に溶解した。これ、らのスペクトルを分光光度計で
記録した。キノＩＪ ニウム染料は、基質よりも５０％
ｍの実質的な深色シフトを示すだけでなく、吸収極大の
大幅な増加を示した。
と氷酢酸（５０ＷＬｌ）とを含む沸とう水ｌｌ中に、前
記工程で得られた生成物１００ｇを溶解した。脱色カー
？ン（１０ｇ）を加え、溶液を熱間濾過した。放置して
室温に冷却し、続いて一晩冷却した。固Ｉｔ−Ｆ別し、
氷水および次にアルコールそして最後にエーテルで洗り
た。生成物をスチームオープン中で約５０℃で乾かした
。Ｎ−メチル−４−（４’−（ｒ−グルタミドスチリル
））キノリニウムフルオロデレー）（ｒ−ＧＡＳＱ）９
７ｇが得られた。ＴＬＣ（シリカ、１：９Ｈ２０：ＣＨ
３ＣＯ０Ｈ）、１スポツト、Ｒｆ ユ０．４゜例２：
好ましいγ−ＧＴ基質および相当する染料のスペクトル グリシルグリシリン０．０７５モルを含有する０、 １
Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ８，５）中に、基質とアミノ
スチリルキノリニウム染料（ｒ−グルタミル基なし）を
別々に溶解した。これ、らのスペクトルを分光光度計で
記録した。キノＩＪ ニウム染料は、基質よりも５０％
ｍの実質的な深色シフトを示すだけでなく、吸収極大の
大幅な増加を示した。
例３：生成物形成対酵素水準の比
γ−ＧＡＳＱを基質として使用した場合にｒ−ＧＴによ
って触媒される反応は以下のとおりである。
って触媒される反応は以下のとおりである。
以下仝白
０＝（Ｊ
アミノスチリルキノリニウム染料の生成速度ヲ、ｒ−Ｇ
Ｔの種々のレベル（酵素４４．５単位／ｌを含有する貯
蔵溶液から調製）で測定した。グリシルグリシ７（０，
０７５モル）とｒ−ＧＡＳＱ（０，５ミリモル）とトリ
スクロライド緩衝液（０，１モル）との混合物に、７−
ＧＴｆｃ３７℃、ｐｌ（８，５で加えた。吸収の変化を
分光光度計により５１０ ｎｍで測定し九。吸収が変化
する速度をγ−ＧＴ活性に対してプロットした。直線が
得られ、これは生成物の形成速度が添加した酵素量に正
比例したことを示している。
Ｔの種々のレベル（酵素４４．５単位／ｌを含有する貯
蔵溶液から調製）で測定した。グリシルグリシ７（０，
０７５モル）とｒ−ＧＡＳＱ（０，５ミリモル）とトリ
スクロライド緩衝液（０，１モル）との混合物に、７−
ＧＴｆｃ３７℃、ｐｌ（８，５で加えた。吸収の変化を
分光光度計により５１０ ｎｍで測定し九。吸収が変化
する速度をγ−ＧＴ活性に対してプロットした。直線が
得られ、これは生成物の形成速度が添加した酵素量に正
比例したことを示している。
例４：ＰＨ活性のプロフィル
ｒ−ＧＡＳＱを基質として使用し、−値６〜９でγ−Ｇ
Ｔ活性を測定した。グリシルグリシンヲ受容体基質およ
び分析緩衝液として使用した。各種の水準のｒ−ＧＴｋ
グリシルグリシン（０，１モル）およびγ−ＧＡＳＱ
（１，５ミ１モル）に加えた。反応を５１０ｎｍで監視
した。反応直後の各反応混合物の−を測定することによ
って各μ値を決定した。
Ｔ活性を測定した。グリシルグリシンヲ受容体基質およ
び分析緩衝液として使用した。各種の水準のｒ−ＧＴｋ
グリシルグリシン（０，１モル）およびγ−ＧＡＳＱ
（１，５ミ１モル）に加えた。反応を５１０ｎｍで監視
した。反応直後の各反応混合物の−を測定することによ
って各μ値を決定した。
ｒ−ＧＴは分析−値８．０〜８．５において最も活性で
あシ、ｐ）１６およびｐＨ９において若干の活性を示し
た。
あシ、ｐ）１６およびｐＨ９において若干の活性を示し
た。
例５：γ−ＧＴおよび好ましい基質の速度論的研究
本発明による基質（γ−ＧＡＳＱ ）を濃度範囲０．３
７５〜１，５０ミリモルでそしてグリシルグリシンを濃
度１００ミリモルで使用し、ブタの腎臓のγ−ＧＴに関
し、反応初速度および速度論的パラメータｉ５１０ｎｍ
において測定した。グリシルグリシンを緩衝液（ｐＨ８
，４）および受答体として使用した。得られたデータか
ら、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｆロットを作成
した。このプロットからＭｉ ｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎ
ｔｏｎ定数（ｋｍ）を計算したところ、本発明の新規基
質については０．５６ミＩ７モルの値が得られた。これ
は、酵素・基質の有意の親和性を示している。反応の全
速度（Ｖｍａｘ）を酵素０．５μモル／ ｍｉ ｎ／ｍ
ｅとなるように計算した。本発明の新規基質に関する酵
素活性は酵素０．３６μモル／ ｍ ｉ ｎ ／−であ
った。このデータは、γ−ＧＡＳＱがγ−ＧＴに対する
有効な基質であることを示している。
７５〜１，５０ミリモルでそしてグリシルグリシンを濃
度１００ミリモルで使用し、ブタの腎臓のγ−ＧＴに関
し、反応初速度および速度論的パラメータｉ５１０ｎｍ
において測定した。グリシルグリシンを緩衝液（ｐＨ８
，４）および受答体として使用した。得られたデータか
ら、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｆロットを作成
した。このプロットからＭｉ ｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎ
ｔｏｎ定数（ｋｍ）を計算したところ、本発明の新規基
質については０．５６ミＩ７モルの値が得られた。これ
は、酵素・基質の有意の親和性を示している。反応の全
速度（Ｖｍａｘ）を酵素０．５μモル／ ｍｉ ｎ／ｍ
ｅとなるように計算した。本発明の新規基質に関する酵
素活性は酵素０．３６μモル／ ｍ ｉ ｎ ／−であ
った。このデータは、γ−ＧＡＳＱがγ−ＧＴに対する
有効な基質であることを示している。
前記の基質に対するｒ−ＧＴの作用により、γ−グルタ
ミル基のγ−グルタミル受容体への転移がもたらされる
と共に、アミノスチリルキノリニウム染料が生成される
。γ−グルタミル基の除去により、染料上にアミ７基が
残る。γ−グルタミル基を含有する基質と得られるアミ
ノスチリルキノＩＪ ニウム染料は吸収特性が著しく異
なっており、従って両者を容易に区別することができる
。更に、アミノスチリルキノリニウム染料は４４８ ｎ
ｍに吸収極大をもっており、５１０ｎｍから非常に離れ
て有意量の吸収を示す。従って、染料形成’ｉ５００ｎ
ｍ より上で監視することができる。この波長は、血中
の成る妨害物質の吸収からも離れている。基質開裂の生
成物と反応する補助試薬を必要とせずに前記の吸収シフ
トが達成される。従って、γ−グルタミルトランスフェ
ラーゼの定量用試薬組成物は、γ−グルタミド置換スチ
リルキノリニウム塩およびγ−グルタミル受容体だけを
含有すればよい。前記の基質はγ−ＧＴの良好な試験を
提供するのに充分な溶解性をもっている。
ミル基のγ−グルタミル受容体への転移がもたらされる
と共に、アミノスチリルキノリニウム染料が生成される
。γ−グルタミル基の除去により、染料上にアミ７基が
残る。γ−グルタミル基を含有する基質と得られるアミ
ノスチリルキノＩＪ ニウム染料は吸収特性が著しく異
なっており、従って両者を容易に区別することができる
。更に、アミノスチリルキノリニウム染料は４４８ ｎ
ｍに吸収極大をもっており、５１０ｎｍから非常に離れ
て有意量の吸収を示す。従って、染料形成’ｉ５００ｎ
ｍ より上で監視することができる。この波長は、血中
の成る妨害物質の吸収からも離れている。基質開裂の生
成物と反応する補助試薬を必要とせずに前記の吸収シフ
トが達成される。従って、γ−グルタミルトランスフェ
ラーゼの定量用試薬組成物は、γ−グルタミド置換スチ
リルキノリニウム塩およびγ−グルタミル受容体だけを
含有すればよい。前記の基質はγ−ＧＴの良好な試験を
提供するのに充分な溶解性をもっている。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＲおよびＲ＿１はそれぞれ独立に水素原子、ア
ルキル基およびアルコキシ基から選んだものであり、そ
してＱは式 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿２は炭素原子１〜４個のアルキル基であり
、Ｒ＿３およびＲ＿４はそれぞれ独立に水素原子、アル
キル基、アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基およびハロ
ゲン原子から選んだものであり、そしてＸ＾■はアニオ
ンである） で表される基である〕 で表される化合物。 ２、（１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ＲおよびＲ＿１はそれぞれ独立に水素原子、ア
ルキル基およびアルコキシ基から選んだものであり、そ
してＱは式 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿２は炭素原子１〜４個のアルキル基であり
、Ｒ＿３およびＲ＿４はそれぞれ独立に水素原子、アル
キル基、アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基およびハロ
ゲン原子から選んだものであり、そしてＸ＾■はアニオ
ンである） で表される基である〕 で表されるγ−グルタミルトランスフェラーゼおよびγ
−グルタミル受容体を含む試薬組成物と、γ−グルタミ
ルトランスフェラーゼを含有する疑いのある試料とを接
触させる工程、および （２）アミノスチリルキノリニウム染料の生成速度を測
定する工程 を含んでなるγ−グルタミルトランスフェラーゼの定量
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/780,508 US4751178A (en) | 1985-09-26 | 1985-09-26 | Substrates, compositions, elements and methods for the determination of gamma-glutamyltransferase |
| US780508 | 1997-01-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6272669A true JPS6272669A (ja) | 1987-04-03 |
| JPH059428B2 JPH059428B2 (ja) | 1993-02-04 |
Family
ID=25119784
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61226311A Granted JPS6272669A (ja) | 1985-09-26 | 1986-09-26 | γ−グルタミルトランスフエラ−ゼの定量用基質およびその定量方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4751178A (ja) |
| EP (1) | EP0218140B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6272669A (ja) |
| CA (1) | CA1269386A (ja) |
| DE (1) | DE3683580D1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2501801B2 (ja) * | 1986-10-07 | 1996-05-29 | ユニチカ株式会社 | γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ定量用試薬 |
| US5116730A (en) * | 1988-06-15 | 1992-05-26 | Board Of Governors Of Wayne State University | Amino acid substituted 4-aminophenazones for measuring enzyme activity |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4910718B1 (ja) * | 1969-06-23 | 1974-03-12 | ||
| AT331994B (de) * | 1972-12-05 | 1976-09-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von delta-glutamyltranspeptidase |
| US4167449A (en) * | 1976-07-29 | 1979-09-11 | American Hospital Supply Corporation | Composition and method for determining transferase and protease activity |
| US4087331A (en) * | 1977-01-12 | 1978-05-02 | Coulter Electronics, Inc. | Colorimetric method for determining gamma-glutamyl transpeptidase and compositions useful therein |
| JPS53147034A (en) * | 1977-05-30 | 1978-12-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Gamma-glutamyl-p-aminoanilide derivatives and process for their preparation |
| US4567138A (en) * | 1982-08-30 | 1986-01-28 | Beckman Instruments, Inc. | Method for determining γ-glutamyltransferase activity and kits containing a novel substrate solution for use therein |
| DE3234478A1 (de) * | 1982-09-17 | 1984-03-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Reagenz und verfahren zur bestimmung von (gamma)-glutamyltransferase |
| US4560650A (en) * | 1983-06-08 | 1985-12-24 | Coulter Electronics, Inc. | Method and compositions for determination of gamma glutamyl transpeptidase |
| JPS6097260A (ja) * | 1983-11-02 | 1985-05-31 | Olympus Optical Co Ltd | 超音波ヘツドの走査装置 |
-
1985
- 1985-09-26 US US06/780,508 patent/US4751178A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-11-20 CA CA000495757A patent/CA1269386A/en not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-09-23 EP EP86113075A patent/EP0218140B1/en not_active Expired
- 1986-09-23 DE DE8686113075T patent/DE3683580D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-09-26 JP JP61226311A patent/JPS6272669A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH059428B2 (ja) | 1993-02-04 |
| US4751178A (en) | 1988-06-14 |
| EP0218140A2 (en) | 1987-04-15 |
| CA1269386A (en) | 1990-05-22 |
| EP0218140A3 (en) | 1989-03-29 |
| EP0218140B1 (en) | 1992-01-22 |
| DE3683580D1 (de) | 1992-03-05 |
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