JPS6251427B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は体液中、殊に尿中のケトン体を検出す
るための改良された試験用組成物に関する。

炭水化物の代謝が低下し、脂質代謝が亢進した
時、尿中にケトン体が出現する。このような状態
は、飢餓、脱水症、消化器癌、甲状腺機能亢進
症、妊娠時に観察されるが、糖尿病性アシドーシ
スの場合、特に顕著なケトン体の排泄増加が認め
られる。従つて尿中ケトン体の測定は種々の疾病
の診断に重要な指針を与えるとともに、病状の経
過判定に役立つ。近年、ケトン体殊にアセト酢酸
を検出するために、いわゆる試験紙法が迅速、簡
便な方法として賞用されてきている。

従来、ケント体の測定には、アセト酢酸をニト
ロプルシツド塩とアルカリ媒体中で反応させるレ
ガル法（Legal法）が用いられ、試験紙にも応用
されてきた。しかしながら、周知のように、ニト
ロプルシツド塩はアルカリ媒体中で速やかに分解
するため、試験を著しく困難なものとしており、
このようにして得られた結果は常に不正確さを伴
なう。

安定な試験用具を得るため、種々の工夫がなさ
れた。これらは、吸収性担体にアルカリ性緩衝剤
とアミノ酸を含浸せしめ乾燥後、ニトロプルシツ
ド塩及び酸性PHを有する有機フイルム形成性重合
体を含浸せしめる方法（特公昭41−12439）であ
り、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウムとアミ
ノ酸を含浸せしめ乾燥後、ニトロプルシツド塩の
低級アルコール―ジメチルホルムアミド混合溶液
を含浸せしめる方法（特公昭53−21319）であ
る。これらは、被検液に含浸した時、アルカリ性
を与えるように調節されるが、大気中の微量の
水分によつても感度が低下する、２段階の含浸
工程をとるため、一定の割合で担体に試薬を含有
せしめるのに著しい困難をともなうなどの欠点を
有する。

吸収性担体にニトロプルシツド塩及び比重５以
上の重金属塩を一段階で含浸せしめる方法が開示
されている。（特公昭51−43796）この場合はニト
ロプルシツド塩、重金属塩、アセト酢酸の間に錯
体が形成され呈色するものと考えられる。しかし
ながら、重金属塩とニトロプルシツド塩は水に難
溶性の塩を生成するため、均一な含浸液を調製す
るのが困難である。ジメチルスルホキシド、ジメ
チルホルムアミド等の不揮発性溶媒を混合するこ
とにより、若干改善されうるが、このような含浸
液より得られる試験用具は、最早鋭敏な感度を有
していない。

均一な含浸液による一段階含浸法が明らかにさ
れた（特開昭54−109899）。これは、マグネシウ
ム塩又はカルシウム塩の存在下、アルカリ媒体中
のニトロプルシツド塩とアセト酢酸とを反応させ
る方法である。この場合、微量のアセト酢酸を検
出する感度を得るために、比較的高濃度のニトロ
プルシツド塩を用いる必要があり、このためニト
ロプルシツド塩自体のもつ色が、微量のアセト酢
酸との反応色を著しく妨害する。その上、含浸液
の安定性は従来の技術に基づく方法よりも改善さ
れているけれども、アルカリ媒体中におけるニト
ロプルシツド塩の分解を完全に免れることはでき
ない。

本発明者は、ニトロプルシツド塩によるアセト
酢酸の検出に際して、金属塩の影響の研究中に、
全く偶然にも、イツトリウム塩の存在する時、酸
性PH領域で極めて強い鮮明な発色が観察されるこ
とを見い出した。

イツトリウムは希土類元素と呼ばれる比重
4.472の金属である（ザ・メルク・インデツク
ス、第９版、1305頁、1976年）。比重５未満の金
属が、酸性PH領域で、ニトロプルシツド塩と均一
かつ安定な溶液を形成し、アセト酢酸と非常に鋭
敏に反応することは全く知られていなかつた。

本発明によれば、ニトロプルシツド塩及びイツ
トリウム塩は水に溶解し易く、しかも非常に安定
であるため、今や体液中のケトン体を定量的に測
定することも可能になつた。これは均一かつ安定
な溶液を得ることが不可能であつた従来の技術で
は達成され得なかつたことである。

本発明に用いられるイツトリウム塩としては、
YCl₃、YCl₃・6H₂O、YBr₃・9H₂O、Ｙ（NO₃）₃・
6H₂O、Y₂（SO₄）₃・8H₂O等があげられる。イツ
トリウム塩は0.1〜2M／濃度で使用される。

好ましいニトロプルシツド塩としては、ニトロ
プルシツドのアルカリ金属塩、殊にナトリウム
塩、カリウム塩が例示される。ニトロプルシツド
塩は0.005〜0.6M／濃度で使用される。

本発明に従えば、アセト酢酸の検出はPH４〜７
で実施するのが望ましく、この目的のために緩衝
剤を使用することも可能である。適当な緩衝剤と
しては、Ｎ―２―ヒドロキシエチルピペラジン―
N′―２―エタンスルホン酸（HEPES）、２―（Ｎ
―モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、Ｎ，
Ｎ―ビス（２―ヒドロキシエチル）―２―アミノ
エタンスルホン酸（BES）、ピペラジン―Ｎ，
N′―ビス（２―エタンスルホン酸）（PIPES）、３
―（Ｎ―モルホリノ）プロパンスルホン酸
（MOPS）、酢酸塩、リン酸塩等があげられ、これ
らは０〜2M／濃度で使用される。水溶性のイ
ツトリウム塩の多くは弱酸性のPHを与えるため、
緩衝剤を用いなくても良い。

本発明の試薬組成物を吸収性担体に乾燥状態で
保有せしめ、いわゆる試験片として使用する場
合、特に有用な試験用具を与える。このような吸
収性担体としては、紙、綿、木片、不織布等が
あげられ、紙が有利である。

試験片として使用する場合、被検液に浸した際
の試薬成分の移動を防止するために、一定の粘度
を有する水溶性の高分子化合物を使用することも
可能である。いかなる天然の、あるいは合成の高
分子化合物を用いても、目的は達せられる。

又、界面活性剤の使用も可能であり、特に、非
イオン性界面活性剤は、試験片に湿潤性を付与す
るとともに、試薬組成物を一層安定化せしめる。

アミノ酸の使用も可能であり、ニトロプルシツ
ド塩を用いたアセト酢酸の検出反応においては公
知である。望ましいアミノ酸としては、グリシ
ン、アラニン、Ｌ―グルタミン酸、グリシルグリ
シン、Ｌ―ヒスチジン等があげられる。

本発明に基づく試験片の製造は例えば次のよう
にして実施される。

イツトリウム塩、ニトロプルシツド塩、緩衝剤
及び必要に応じて水溶性高分子化合物、界面活性
剤、アミノ酸を水又は水と混和しうる溶媒との混
合溶液に溶解し、この溶液を紙の如き吸収性担
体に含浸させた後、乾燥する。得られた担体を接
着テープを用いてプラスチツク等の支持体に貼り
つけ、適当な大きさに切断して使用の便に供す
る。

本発明の試薬組成物を用いて、錠剤、顆粒、粉
剤を製することも可能である。

体液中のアセト酢酸を定量する場合には、例え
ば次のように実施される。

ニトロプルシツド塩、イツトリウム塩及び緩衝
剤を水に溶解せしめて発色試液とする。被検液に
発色試液を加えて混和し、一定時間後に分光光度
計を用いて適当な波長で水を対照として吸光度を
測定する。被検液のかわりに水又はアセト酢酸標
準液を用いて同様の操作を行い、それぞれ発色試
液の吸光度、標準液の吸光度を求める。次式から
被検液中のアセト酢酸濃度が求められる。

検体中のアセト酢酸濃度（mg／dl） ＝（検体の吸光度）−（発色試液の吸光度）／（標準液の吸光度）−（発色試液の吸光度）×標準液の濃度
（mg／dl） 本発明を詳細に説明するために、以下に実施例
を掲げるが、これにより本発明の範囲が制限させ
るものではなく、本発明の思想に従つて、条件、
成分等をいかようにも変化させ得ることは当業者
にとつて明らかである。

実施例 １ YCl₃・6H₂O ９ｇ、ニトロプルシツドナトリ
ウム0.5ｇを水100mlに溶解し、0.1NのNaOHでPH
を6.5に調整した。この溶液に紙（ワツトマン
3MM）を含浸せしめ、80℃のオーブン中で15分
間乾燥した。

得られた白色の試験紙を接着テープを用いて
0.5cm×8.0cmのプラスチツクの支持体に貼りつ
け、試験に供した。

この試験紙を、０，５，20，40，100mg／dl濃
度のアセト酢酸標準液に浸した時、それぞれの濃
度に対応して、30秒以内に白色〜淡赤紫色〜紫色
の鮮明な発色が観察された。

調製後、６時間を経過した含浸液についても同
様の方法で試験紙を作製し、試験したところ、含
浸液調製直後の試験紙と全く同等の感度を有して
いた。

実施例 ２ この実験の目的は特公昭51−43796及び特開昭
54−109899（それぞれ試験紙Ａ及びＢ）に基づく
方法と本発明に基づく方法（試験紙Ｃ）とを比較
することにある。

試験紙 Ａ NiCl₂・6H₂Oの５％水溶液30mlに、５％ニトロ
プルシツドナトリウム―ジメチルスルホキシド溶
液９mlをかくはんしながら加え、淡黄緑色の混濁
液を得た。この液に紙を浸した後、暗所で減圧
乾燥した。

試験紙 Ｂ MgSO₄・7H₂O 15.0ｇ及びアミノメタンスルホ
ン酸1.17ｇを１モルのトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン水溶液50mlに溶解後、ニトロプ
ルシツドナトリウム3.0ｇを溶解し、0.1N HClで
PHを7.6に調整した。得られた赤褐色の含浸液に
紙を浸し、50℃で15分間乾燥した。

試験紙 Ｃ YCl₃・6H₂O 15.0ｇを１モルのMES水溶液50
mlに溶解後、ニトロプルシツドナトリウム0.74ｇ
を溶解し、0.1N NaOHでPH6.5に調整した。得ら
れた淡クリーム色の含浸液に紙を浸し、80℃で
10分間乾燥した。

このようにして得られた試験紙を０，１，20，
40，100mg／dlのアセト酢酸を含む尿試料に浸
し、生ずる色調を観察した。

試験紙Ａは０と100mg／dlを30秒間で識別し得
たが、０と１mg／dlの識別は60秒でも不可能であ
つた。

試験紙Ｂは０と100mg／dlを５〜10秒で識別し
たが、０mg／dlと１mg／dlの識別は、試験紙自体
が強く赤褐色に着色しているため、60秒で辛うじ
て可能な程度であつた。

試験紙Ｃは０と100mg／dlを瞬時に識別するこ
とができ、０，１，20，40，100mg／dlを20〜30
秒で完全に識別し得た。

実施例 ３ この実験は実施例２で得られた３種類の試験紙
の湿潤状態での安定性を比較したものである。

25℃で水を飽和させた密閉容器中に各試験紙を
放置し、６時間後に取り出して直ちに直空乾燥
し、実施例２と同様の方法で試験した。

試験紙Ａは０mg／dlと100mg／dlを60秒で辛う
じて識別し得た。試験紙Ｂは０，20，40，100
mg／dlを60秒で識別し得たが０と１mg／dlの識別
は下可能であつた。試験紙Ｃは０，１，20，40，
100mg／dlを60秒で完全に識別することができ、
乾燥容器中に保存した標準品とほゞ同等の感度を
有していた。

実施例 ４ この実験は尿中アセト酢酸の定量を試たもので
ある。YCl₃・6H₂O 10.0ｇ及びニトロプルシツド
ナトリウム0.3ｇを水酸化ナトリウムでPH6.5に調
製した１モルのMES緩衝液100mlに溶解後、過
して発色試液とする。２本の試験管を用意し、一
方に尿0.1ml他方に水0.1mlを分注し、発色試液3.0
mlを加え混和する。25℃で10分間放置後、分光光
度計（島津UV―300）を用いて波長525nmで吸光
度を測定する。０，20，40，80mg／dl濃度のアセ
ト酢酸標準液についても同様の操作で吸光度を求
め、発色試液の吸光度を差し引いて検量線を作成
する。得られた検量線から尿中アセト酢酸濃度を
求めることができる。

第１図は本実験で得られた、アセト酢酸とニト
ロプルシツドの反応の吸収曲線であり、第２図は
波長525nmで作製した検量線である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による試薬を用い、尿中のアセ
ト酢酸の定量を行つた時のアセト酢酸（濃度50
mg／dl）とニトロプルシツドの反応の吸収曲線を
示し、第２図はアセト酢酸標準液を用いて作成し
た検量線であり、縦軸に波長525nmでの吸光度、
横軸にアセト酢酸濃度を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ニトロプロシツド塩及びイツトリウム塩を必
   須成分として含有することを特徴とする体液中の
   ケトン体測定用試薬組成物。