JPS62501957A - 優れた哺乳動物での発現系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 優れた哺乳動物での発現系 孜血負分団 本発明は、哺乳動物の発現系での所望の遺伝子の発現に関する。部分的には１人 のメクロチオネインー■プロモーター。 無タンパク培地で生育できるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の宿主 、および銅イオンつような比較的無毒性の金属を用いて誘導媒介体の存在下での 誘導を用いる系に関する。 哺乳動物細胞に基づいた発現における付加的な改良は、カドミウム耐性での形質 転換した宿主細胞の選抜、および／あるいは遺伝子増幅技術を用いることや遺伝 子の発現のための制発現系は１種々のＤＮＡ配列にコードされている遺伝子産物 となる。遺伝子産物は、自然の源に由来するものと類似している。この類似性は １人の成長ホルモン（ｈＧＨ）　、人の肺胞表面活性体（ｈＡＳＰ）　、および アポリポタンパクＡ　Ｉ　（ａｐｏＡ　Ｉ　）に関して最も劇的に示されている 。 宣景生技■ 哺乳動物の宿主を用いた外来遺伝子配列の発現は、今まで当該技術でよく知られ ている。哺乳動物での発現系はしばしば好まれる。というのは細菌、あるいは酵 母系でさえもないような９例えばグルコシル化、あるいはヒドロキシル化による 遺伝子産物の修飾を行わせるような処理能力を持っているからである。 また培地に効率よくある遺伝子産物を分泌させる哺乳動物の系の能力は、より簡 単に集積でき、精製できる。分泌した産物は培地中の他のタンパクより精製しな ければならないので、決まった培地、つまり付加したタンパクのない培地中で成 長できる宿主を用いることが明らかに望ましい。はとんどの哺乳動物の細胞系は 血清タンパクのような追加物を要求するが、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ） １０）細胞は決まった。 無血清および無タンパクの培地で維持できる（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　ｉ〜。 Ｇ−ａｎｄ　）ｌａｍ、　Ｒ，Ｇ、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ（１９７７）１３　：　 ５３７−５４７）を見よ）。 ＣＨＯ細胞は、成長も速く、よく特徴がわかっており、認識できる危険はな（、 それゆえに無血清で維持できる能力に加えて１組み換えタンパクの生産には理想 的な宿主である。 もちろん哺乳動物での発現は、矛盾のないコントロール配列を必要とする。最も ふつうに用いるコントロール配列、特にプロモーターは、ウィルスのプロモータ ー、最も顕著なのがＳＶ４０プロモーター（例えばＥＰＯＰｕｂｌｉｃａｔｉｏ ｎ　１０８＋　６６７＋公開日　１６　！１ａｙ１９８４　；　ＭｃＣｏｒｍｉ ｃｋ、　ｅｔ　ａｌ、　１ｌｏｌｅｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ）　（１９８４）↓： 　１６６−１７２を見よ）や、もし矛盾なければ遺伝子自身のプロモーターであ る（Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｌ３９９＋２１６　ｔｏ　Ａｘｅｌ＋ｅｔ　ａｌ） 。一般的にはそのようなプロモーターはあまり満足できない、というのはそれる は環境因子により制御できないからである。そのようなコントロールが無いと、 連関したコードしている配列が宿主生物中で非常に高いか、あるいは非常に低い レベルで、あるいは不適当な時期に発現することがあり、当業者は１発現のこの ような特徴をコントロールすることには無力である。それゆえに、環境因子に感 受性の哺乳動物で矛盾のないプロモーターを用いる試みがなされている。 このようなプロモーターの中で有名なのは１重金属に強固に結合するタンパクの 、メタロチオネインタンパクの発現を本来コントロールしているメタロチオネイ ンのプロモーターである。その本来の状態では、メタロチオネインのプロモータ ーは９例えばカドミウムあるいは水銀のような重金属の存在により、あるいはデ キサメタシンあるいは他のグルココルチコイドのようなステロイドホルモンや関 連物質によっても。 誘導される。しかしながら、タンパク追加培地の非存在下では誘導が行われ得す 、それゆえ、そのようなプロモーターの使用は、生産したタンパクの精製が多量 の付加的な汚染物の存在により複雑になるという状態に制限される。 メタロチオネインプロモーター族の種々のメンバーが哺乳動物系での発現をコン トロールするのに用いられている。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ３４１０２５３４、 公開日Ｊｕｌｙ　５．１９８４．　ｔ。 Ｈａｍｅｒ、　ｅｔ　ａｌ＋　はマウスの腎［Ｃ１２７細胞でのヒトの成長ホル モンの発現をコントロールするために、マウスのメタロチオネイン−１（ｍＭＴ −１）プロモーターの使用を開示している。 Ｂｒ１ｎｓｔｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）　２９６　： 　３９−４２＋は、ネズミのＭＴ−１７’ロモーターのコントロール下で、注入 したマウスの胎児中で、チミジンキナーゼ生産を得た。Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、、　 ｅｔ　ａｌ。 ＤＮＡ’（１９８４）　３　：　３１９−３２５　；　Ｎａｔｕｒｅ（１９８４ ）　３０８　：　５１３−５１９．は。 ’　Ｎ１１ｌ−３Ｔ３　Ｅ！胞でヒトのメタロチオネイン−■１システム（ｈＭ Ｔ−■Ａ）のコントロール下で一時的な発現を、　ｈＭＴ−ＴＫキメラ遺伝子を 生成するべくチミジンキナーゼのコードしている配列にｈＭＴ−ＩＩヶプロモー ターを融合しプロモーター配列の欠失後のＴＫの発現を追跡することにより、研 究した。誘導は、カドミウムイオンが、数例ではデキサメタシンのどちらかを用 いることにより得た。そしてこれらの制御部位の位置は欠失研究により決定した 。 ある型のＭＴプロモーターを用いているものを含む開示された発現系のどれもが 、満足な培養や、連続した高収率で、加えた血清あるいは他のタンパクのない容 易に回収できる形状で、希望する遺伝子産物を生産するための宿主の誘導を１行 えなかった。本発明の発現系は、無血清培地で成育した宿主で、高レベルの連続 的な誘導をもたらし、高レベルのタンパク生産および分泌したタンパクの容易な 精製を可能にする。 無毒性の誘導や培地から希望するタンパクを精製するのに好ましい培養条件を供 給するのに加えて、このタンパクの生産レベルを高めることが好ましい。ここで の発明に関係する２つの一瓜的な研究方法、つまり発現系でのウィルスのエンハ ンサ−の包含とコピー数を増やすための発現系の増幅、が過去にタンパク生産を 高めるために用いられてきた。 エンハンサ−は、転写を促進させる。２スに働（ＤＮＡ要素である。その活性は 、その５”−３°の方向に比較的無関係であり、またある程度は位置に依存する が、数千ヌクレオチドもの距離を越えて保持されている。エンハンサ−は多数の ウィルスゲノムや、免疫グロブリンの生産に関するもののような特殊化した細胞 の遺伝子で、同定されている。以下の例示で用いられるエンハンサ−は、サルの ウィルスＳＶ４０に由来するもので、ある程度詳細に特徴付けられている（Ｇｒ ｕｓｓ、Ｐ＋ｅｔａｌ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）（ １９８１）７８：９４３−９４７；Ｂｅｎｏｉｓｔ、Ｃｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ 　（１９６１）’２９０：３０４−３１０；Ｍａｔｈｉｓ。 ＤＪｅｔａｌ、１ｂｉｄ、３１０−３１５）。Ｗａｓｙｌｙｋ＋Ｂ、＋ｅｔａｌ 、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９８４）１２：５５８９−５６０８は 、ＳＶ４０エンハンサ−に必須な要素であると考えられている？２ｂｐの繰り返 しは、転写を高めるために特徴として用いられている初期Ｔ抗原をコードしてい る配列に連関している縦列のコンアルブミンプロモーターからの距離に二面性の 依存を有することを示した。ここでの発明は、その特徴のうちのい（つかにおい て、生産レベルを増加させるエンハンサ−配列の促進効果を利用している。 形質転換の選抜に、また共に形質転換する発現系によるタンパク生産における増 加に影響を与えるある薬剤に応答して増幅させるために、ＤＨＰＲの能力を用い ることが、数年間実践されてきた。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ、Ｒ，Ｊ、、ａｔａ ｌ、ｏｌＣｅＢｉｏｌ（１９８５）、Ｌ：１７５０−１７５９を参照。ＤＩ（Ｐ Ｒと共に希望する遺伝子の協調増幅により得られた増加した薬剤抵抗性の選抜を 通じて希望するタンパクの関連した高い生産が起こる。その理由はＤＨＰＲ遺伝 子や同時に形質転換した遺伝子は宿主の染色体の近接した位置に組み込まれるか らである。さらに、薬剤に応答した増幅は約２００ｋｂという距離にわたって起 こり、それゆえ、多コピーを行うのに、　ＤＨＰＲと共に同時に形質転換する遺 伝子を保持する。 ＭＴ遺伝子はには用いられたことがない。カドミウムイオンに応答して増幅する ＭＴ遺伝子の能力は既知であるが。 これは、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）という自己複製する形質転換系を用いて 研究され、それゆえに希望する発現系を協調増幅させるこの増幅を用いることは 示唆されていなかったＫａｒｉｎ、Ｍ、、ｅｔａｌ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃ ａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８３）　４０４０−４０４４）。 成功した形質転換体だけでなく、高発現体をも同定するために、染色体に組み込 まれるとき２選択マーカーとして、ＭＴ遺伝子も他の遺伝子も使われたことがな かった。カドミウムは非常に有毒なので、カドミウム耐性でＭＴ遺伝子に関して 高レベルの発現体だけが生き残ることができる。同時に形質転換した配列の高レ ベル発現体はこの耐性に関係している。その理由は、その染色体内での近接性の ために両遺伝子は発現を好ましくする局部的な状態により影響を受けるからであ る。いくつかの状況では本発明は、希望する配列の高レベル発現能を有する形質 転換体を選抜するために、あるいは肘および発現配列を同時に増幅させるための いれか、あるいは両方とものために発現系で同時に形質転換したＭＴ遺伝子を利 用する発揮系を用いている。 ＣＯＯ細胞宿主における発現の質と量を改善するという本発明の様々な特徴を、 様々なタンパクの生産に対して以下で説明している。１つのある例示では５人の 成長ホルモンの遺伝子を用いている。その理由はこの物質は実践的に興味深く。 医療上有益であり、現行の方法によって天然型では生産されていないからである 。普通に行われてはいるが、ｈＧＨの組み換え生産は、脳下垂体により生産され る物質の混合物と変わらない産物とはならない。天然のｈＧＨは、９０％の多数 の２２ｋＤ種に加えて約１０％の少数の型、２０ｋＤ　ｈＧＨを含む混合物であ る。 両種は単一遺伝子にコードされており、第１転写物より第２のイントロンが異な るスプライシングにより生産される２つの異なるｍＲＮＡの翻訳により生じる（ ＤｅＮｏｔｅ、ｅｔａｌ＋ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ（１９８１）９： ３７１９）、それゆえにｈＧＨのｃＤＮ／ｊを用いた生産（ＥＰＯ出１９１０８ ．６６７　（前出））あるいはｃＤＮＡやゲノム配列の組合せを用いた生産（ｌ ａｍｅｒ、ＷＯ３４１０２５３４ＨＰａｖｌａｋｉｓ。 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（前出））はこの点からは満足できる ものではないというのは２２ｋＤだけが生産されるからである。細菌により生産 された組み換えｈＧＩＩ調製物（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、　Ｖ、＋ｅａｌ、Ｎａ ｔｕｒｅ　（１９７９）　２８１　：　５４４−５４８　；　Ｍａｒｔｉａｌ　 Ｊ、　Ａ、１ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９７９）　２０５　：　６０２ −６０７）はほとんど満足できない。というのは！このように生産されたｈＧＨ は培地に分泌されないし、生産されたｈＧＨの少なくとも大部分は１組み換え体 構築の結果としてＮ末端のメチオニンを含んでおり。 生じたタンパクをさらにプロセッシングする宿主細胞の能力がないからである。 例えば、細菌による発現を越えた意味のある利点がｈＡＳＰにも見られる。肺胞 ｐｒｏｔｅｉｎｏｓｉｓ病患者よりのｈＡＳＰを単離すると、多数種が３２ｋｄ のタンパクである混合物を得る。このことは、推定されている天然型がグリコジ ル化されているを示している（Ｗｈｉｔｅ、　Ｒ，Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔ ｕｒｅ　（１９８５）　３１７　：　３６１−３６３）。これは、同様の多様性 （２８ｋｄ〜３６ｋｄ）が見出されているイヌのＡＳＰ　ｖもあてはまる。ヒト のｃＤＮＡは２４８アミノ酸をコードしている開放読み取り枠を示す。このｃＤ ＮＡにコードされているアミノ酸２１で始まる配列は、胃洗浄液より単離した３ ２ｋｄのタンパクの２２Ｎ末端アミノ酸に相当する。ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは遺伝子の エキソン領域の位置もあった。ｃＤＮＡ配列は、プロリン残基を含むｃｔｙ−χ −Ｙの繰り返し様のい（らかのコラーゲンをコードしている。天然の配列でヒド ロキシプロリンが存在することは、これらはヒドロキシル化されていることを示 す。このように“天然”のＡＳＰの再構成には、哺乳動物系でだけ利用できる少 なくとも２つの翻訳後の段階、プロリン残基のヒドロキシル化とグリコジル化、 が必要である。 血流中で担体として脂質に関連して見出されるアポリポタンパクＡＩやＡＩＩは 、プレプロタンパクとしてコードされ。 “プロ”型として分泌される。しかし、リポタンパク画分の積み重なった円板構 造を産むようにホスホリピドと関連しているタンパクは、はとんどが成熟型タン パクである（Ｂｏｇａｎｏｕｓｋｉ。 Ｄ、、　ｅｔａｌ、ＪＬｉ　ｉｄ　Ｒｅｓ　（１９８５）　２６　：　１８５） 　、このような場合も、＠乳動物細胞だけができる翻訳後の修飾は、天然の機能 のある形を産むことが望まれる。 本発明は、脳下垂体で生産されるものと類似のヒトの成長ホルモン調製物、肺の 洗浄液に見られるものと類似のヒトのａｓｐ調製物、およびホスホリピドに機能 的に関連したアポリポタンパクだけでなく、効率の良い生産および好ましく高生 産で容易な精製条件下でのあらゆる所望の外来タンパクを回収する手段をも提供 する。 木光里■Ｍ丞 本発現系は、天然に作られている物質と事実上同一な物質を高い収率で得るため に、遺伝子産物をプロセッシングでき。 る哺乳動物宿主で、外来遺伝子配列の発現の環境コントロールを可能にするよう な系である。採用した宿主系は、イントロン配列のプロセッシングができる。そ のため遺伝コードユニットが直接使える。また、翻訳後、グリコシレージョン。 ヒドロキシプロリン、“プロ”配列の切断、または他のタンパク修飾ができる。 そして１通常シグナル配列が関連するプロセッシングができる。従って、必要に 応じて、混在タンパクが実質的に培地にない条件で、物質は培地へ分泌される。 制御配列は、非タンパクメディエータ−の存在下で低毒性のインデューサーに応 答する。さらに、いくつかの実施態様における本発現系は、高発現の選択、増幅 が可能であり、また。 生産レベルを上げるためエンハンサ−でさらに修飾してもよい。従って１本発明 の発現系は、翻訳後プロセッシング、発現コントロール、高レベルでの発現、生 産されるタンパクの容易な精製が可能な宿主を提供する。この有用な組み合わせ 。 およびその一部でさえ、以前から知られている発現系では入手不可能なものであ る。 １つの見方において２本発明は、所望のコード配列すべての発現系に関する。こ の系は、コード配列と動作可能なように連関し、タンパクの存在しない限定培地 に維持されだ哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）へ形質転換される哺乳動物メタロ チオネインＩＩ　（ｈＭＴ−Ｉｆ）のプロモーターを含む。場合によっては、こ の系はさらに、生産物のレベルを上昇させ得る動作可能なように連関したエンハ ンサ−を含み、そして／または系全体の増幅を行い得る耐性遺伝子を含む。木兄 は、鉄イオンまたはトランスフェリンのような誘導メディエータ−と組み合わせ た。非毒性金属イオンの混合物によって誘導される。 本発明はまた。このような発現系を用いた。＠乳動物宿主細胞における遺伝子発 現の方法にも関する。そして、その生産するタンパクに関する。また、高レベル の発現が可能な組み換え細胞の選択法、所望の発現系とＭＴ遺伝子との共同形質 転換の利用および重金属イオンでの処理により増幅する方法に関する。重金属イ オン耐性で選択した細胞は、誘導メディエータ−の付加なしに、無血清培地中で そのような系を発現できる。 もう一つの見方では、タンパクがそれら本来の機能を持った形で作られたタンパ クに関する。特に、これらタンパクには、天然に脳下垂体から得られるものに似 た形で組み換えにより得られたヒト成長ホルモン、洗浄液より得たもののように ヒドロキシル化およびグリコジル化されたｈＡＳＰ、プロ配列を含まない成熟し た形で得られるアポリポタンパクが含まれる。天然タンパクに従ったこれらおよ び他の調製物は９本発明の方法および発現系を用いて作る事ができる。 図面の簡単な説明 第１図は、　ＣＢＩ−３７細胞によるヒト成長ホルモンの生産を。 様々な亜鉛イオン誘導レベルで３時間の関数として示している。 第２図は、　ｐＨ５１（ｈｌｌＴ−１１プロモーターの支配下でコード配列の挿 入が可能な宿主発現ベクター）および２つの付加的な宿主ベクター、　ｐＨｓｌ −ＭＴ（増幅のため１発現可能なメタロチオネイン遺伝子を含む）およびｐＨ５ ｌ−ＳＶ４０（動作可能な状態で連関しているＳＶ４０エンハンサ−を含む）の 構築を示している。 第３図は、　ｐＭＴ−ｈＧ）ｌ（ヒト成長ホルモンの発現プラスミド）および対 応する発現ベクター（発現可能なメタロチオネイン遺伝子を含むもの（ｐｈＧＨ −ＭＴ）とＳＶ４０エンハンサ−を含むもの（ｐｈＧ）ｌ−ＳＶ４０を含む）の 構築を示している。 第４図は、ヒト肺胞表面活性剤タンパク（ｈＡＳＰ）をコードするゲノム配列を 含む構築物のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。 第５図は、　ｈＡＳＰをコードするｃＤＮＡを含む構築物のＤＮＡ配列および推 定アミノ酸配列を示す。 第６図は、　ｐＡＳＰｃｇ−５ν（１０）を得るために使われたｈＡＳＰコード 配列を含む挿入物を示す。 第７図は、ヒト心房ナトリウム排泄増加因子（ｈａＮＦ）をコードするゲノム配 列を示す。 第８図は、修飾したＥｐｏ遺伝子の構築を示す。 第９図は、プレプロレニンをコードするＤＮＡ配列を示す。 第１０図は、　ｐＭＴ−ｈＧＨ，ｐｈＧＨ−ＭＴおよびｐｈＧＨ−５Ｖ４０　テ 形質転換されたＣ８０ｗ３胞のプール由来の多種のコロニーのｈＧ）Ｉ生産能の 分布を示す。 第１１図は、　ＣＢＩ−２５およびＣＢＩ−３７より分泌された放射能ラベルし たタンパクのポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。 第１２図は、　ＣＢＩ−３７細胞からのｈＧＨ調製物脳下垂体から分泌されたｈ ＧＨとの５Ｏ５−ＰＡＧＥによる比較を示す。 第１３図は、　ＡＳＰを生産する形質転換体Ａ−３８からの上澄液をＥｎｄｏ− Ｆ処理したものとしないものとの５ＤＳ−ゲルの結果を示す。 第１４図は、　ＡＳＰを生産する形質転換体Ｄ−４からの上澄液をＥｎｄｏ−Ｆ 処理したものとしないものとの５ＤＳ−ゲルの結果を示す。 第１５図は、多種のアポリポタンパクＡｌ（ＡｐｏＡＩ）発現ベクターにより形 質転換されたＣＩＯ細胞からの抽出物のポリアクリルアミドゲルを示す。 第１６図は、形質転換体からのａｐｏＡＩにより形成された外部脂質との複合体 の電子顕微鏡写真を示す。 第１７図は、形質転換体からのａｐｏＡ男より形成されたホスファチジルコリン との複合体の電子顕微鏡写真を示す。 第１８図は、　ｐＭＴ−ＰＰＰＲｅｎでトランスフェクションされたＣＩＯ細胞 とＡＬＴ−２０細胞の上澄液のＳＯＳゲルを示す。 主皿皇実血…様 Ａ、■ ここで用いる場合、“動作可能なように連関した”は、動作可能なように連関し た材料の普通の機能が実行され得るような並置状態をさす。従って、コード配列 に“動作可能なように連関した”プロモーターとは、コード配列が、和合可能な 宿主中でプロモーターの支配下で発現され得るような構成をさす。 “発現系”とは１次に記したような構成要素の集合をさし。 記述されるように、制御配列と動作可能なように連関したコード配列のみ、さら にエンハンサ−と動作可能なように連関したこれらの配列、これらを含むベクタ ー、そのベクターで形質転換された細胞、または培地成分を含む形質転換体含有 培養を意味する。 “限定培地”は、タンパクを含む材料を補給されていない培養培地の事をさす。 はとんどの哺乳動物細胞培養は、そのような補給を必要とする。ウシ胎児血清の ような血清調製物は、普通１０％オーダーの濃度で用いられる。 “誘導メディエータ−”は、　ＭＴプロモーターを誘導する金属イオンに加えて 、さらに加えられる物質である。その存在により、限定培地中で、誘導がおこる 。本発明の発現系に関しては、鉄（イオン）１〜３　Ｘｌ０−５Ｍまたはトラン スフェリン５μｇ７ｍ１以上が、誘導メディエータ−として働く事を見出した。 鉄イオンは、鉄（ｎ）として使うのが最も便利である。 なぜなら、鉄（ＩＩＩ）は、沈澱する傾向にあるからである。しかし鉄（ＩＩＩ ）も誘導メディエータ−として機能する。トランスフェリンは鉄を含むタンパク であるが、誘導メディエータ−として機能するために要求される量は、タンパク 補給に使用される量よりずっと少ない。従って、トランスフェリンは。 精製を妨げず、また培地を“限定された”と言えない状態にするための１タンパ ク補給物”とは考えられない。また、誘導を始めるまで加える必要がない。“ヒ トメタロチオネイン■”プロモーター（ｈｌｌＴ−Ｉ［”）は、ヒトＭＴ−ＩＩ 遺伝子またはそれと機能的に同等のものに由来する制御配列をさす。この遺伝子 の制御配列は、Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、、　ｅｔ　ａｌにより、　Ｎａｔｕｒｅ　（ １９８２）２９９　：　７９７−８０２に詳細に記述されている。 “宿主細胞”、“形質転換細胞”、“細胞培養”、“細胞系”などは、ここでは 、互いに交換して使える。そのことは。 文脈より明らかになる。組み換え形質転換に適した宿主細胞は、新しいＤＮＡ配 列、最も一般的にはプラスミドＤＮＡだが他の形質転換能をもつＤＮＡでもよい 、の受容体になるよう意図されるかまたは意図された細胞をさす。この点に関し ては。 それらの用語は、直接の受容体だけでなく、その子孫もさしている。子孫は２ｗ Ｊ胞分裂により作られた細胞を含み、他の再生産機構により作られた細胞も含む 。子孫は、実質的に同一のＤＮＡ配列を含む細胞を含み、またＤＮＡが、偶然ま たは故意の突然変異により変化させられている細胞も含む。そのような突然変異 は、子孫の生産において当然おこってもよいと理解されている。最初の形質転換 体の機能、最も一般的には。 特定の所望タンパクを作る能力、を維持する子孫は、この定義に含まれる。 “チャイニーズハムスター卵巣”　（ＣＨＯ）細胞は、標準細胞系ＡＴＣＣＣＣ Ｌ−６１および同じ起源組織から単離されたその類縁物そしてその誘導体をも含 む。誘導体は、遺伝子型または表現型が本来の系統と違ってもよいが、意図的に または偶然におこった突然変異によりそこから得られた系統の突然変異体である 。 同様にＡＬＴ−２０細胞は、　ＡＴＣＣ細胞系統ＣＣＬ−８９およびその類縁物 および上に記述したような誘導体を含む“〜から由来する”とは、たとえばＤＮ Ａまたはタンパクの配列に適用する場合、構造的な類似性の事を言っており、必 ずしも物理的な由来をさしていない。 “増幅可能な毒素耐性付与遺伝子”とは、宿主の環境中にある毒物に対し宿主に 耐性を与え、その遺伝子がその毒物の存在下で多コピー作られるような、タンパ クを（適当な宿主で）作る事のできるＤＮＡ配列をさす。 “毒素”は、ここでは、供給されている濃度で宿主に対して有害な物質すべてを さす。適当な代表的な毒素は、メトトレキセート（ＤＨＰＲが耐性を与える）お よびＣｄ”　（ＭＴタンパクが耐性を与える）のような薬剤である。ＤＨＰＲ遺 伝子およびＭＴ遺伝子は１両方とも、適当な毒素に対し、増幅（すなわち多コピ ーの生産）によって応答できる。 Ｂ、二瓜煎星記述 本発明は、哺乳動物細胞中での発現において特に有利な条件を組み合わせること によって９組み換えタンパクの生産でムイオンによる誘導が必要であるのに対し 、メタロチオネイン−■制御配列は、亜鉛イオンにより誘導可能であることによ り有利に用いられる。後者の金属は細胞に対しより高い毒性を示し、よって誘導 イオンの濃度レベルの調節にもとづく発現の精密に調整された調節が可能でない 。後述のｈＭＴ　Ｉｆってもよい。ｂＭＴ−ｎが好ましいが１例えばウシ、ウマ 、サル、ハムスター、ブタまたはネズミ由来のＭＴ−ｎで充分である。マウス、 ハムスター、およびサル由来のＭＴ−ＩＩ遺伝子カ単離されている。例えば５ｅ ａｒｌｅ、　Ｐ、　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏｌ　ａｎｄＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　 （１９８４）　４　：　１２２１−１２３０を参照の事。 本発明の発現系では、これらの制御配列が限定培地で維持された細胞中で用いら れる。この系に必要な特色は、誘導メディエータ−として限定培地中への１−３ 　ｘｌＯ−’Ｍの鉄塩または５μｇ／ｍ１以上のトランスフェリンの添加である 。これらの添加により、限定培地下で制御配列が誘導され得る。限定培地の使用 は、培地が通常は血清により供給される外部タンパクを含まない培養条件を供す る能力により所望タンパクが混入物なしの環境に分泌されることを可能とする点 で、所望のタンパクの生産においてすばらしく有利である。 発現系の構成要素として有用な宿主発現ベクターは、ＭＴ−■制御配列の下流に 所望のコード配列の挿入を可能とする制限部位を含むものである。ｐＨ５１と後 述されるそのようなベクターは、宿主ベクターとコード配列挿入断片の増幅を可 能とするように細菌中で動作可能な複製部位を含む。制限部位に連結されるコー ド配列は、ｃＤＮＡ配列か、もしくは佳したベクターがイントロンのプロセッシ ング可能な宿主と和合性であるような、イントロンを含むゲノム断片のどちらで もよい。 効率的な発現の選択と関連配列の増幅促進が可能な、動作可能的に連関したエン ハンサ−および／もしくは毒素耐性付与遺伝子を含むことにより１発現系に付加 的な改良を行ってもよい。 エンハンサ−は“シスの”様式で作用し、よって発現系の残りと同じＤＮＡ上に 含まれる必要がある。ウィルスまたは高等生物の特殊細胞由来のどのようなエン ハンサ−配列を後述のＳＶ４０と同ｌに用いてもよい。レトロウィルスの長末端 反復。 ポリオーマウィルス、　ＢＫウィルスおよびアデノウィルスから得られたウィル スのエンハンサ−が開示されている。オバルミンおよび免疫グロブリンについて のような、ある特殊な細胞性発現系も、エンハンサ−配列を含んでいるかも知れ ない。 これらのエンハンサ−は、比較的弱いプロモーターに対し最も劇的な効果を発揮 するようであ６１強力なＭＴ−ｎプロモーターにより制御された発現に影響を与 えるそれらの能力は。 驚くべきことである。本発明の系で使われているように、エンハンサ−配列は、 所望のコード配列の発現を調節するプロモーターから数ｋｂ中に、そしてそれに 対していずれかの方向で連結される。ＳＶ４０のエンハンサ−について好ましい 方向性と距離が、記述された系に関連して以後開示される；これらの望まれるこ とは９選択したエンハンサ−および調節された系により変えうる。はとんどの系 において、　ＳＶ４０のエンハンサ−は転写開始の上流２５０〜４００ｂｐに置 かれるのが最も有利であると考えられている。 毒素に対する耐性を付与する遺伝子を、外来の形質転換ＤＮＡの発現で効率的で ある形質転換体を選択するのに用いることができる。耐性遺伝子を同じ転移ベク ター中に連結することにより、もちろん所望タンパクの発現系のＤＮＡをその耐 性遺伝子結合することができるが、これはすべての場合において必要であるとい うわけではない。多数のベクター由来であっても、形質転換ＤＮＡは近位の位置 に入って哺乳動物宿主のゲノム中に組み込まれることがよ（あるので、共同形質 転換プラスミド上に導入された耐性遺伝子も、所望遺伝子の増加しベクターで形 質転換した細胞では、ベクターは哺乳動物宿主中で自己複製しないので１組み込 みが必要である。ＤＨＰＲまたはＭＴをコードする遺伝子のようにどんな毒素耐 性付与遺伝子を用いてもよい。改良された本発現系で好ましい耐性遺伝子は、カ ドミウムなどの重金属の毒性効果に対する耐性を付与するメタロチオネイン遺伝 子である。低レベルの、すなわち約５μＮまでのカドミウムを含む培地で形質転 換体を選択することにより、たぶん多コピーのＭＴ遺伝子を合成することにより 、しかしいずれにしろメクロチオネインタンパクの生産においてより効果的とな ることにより、この毒素の濃度に対する耐性を獲得した個々のクローンを選択す ることができる。 そのようなりローンでは、共同形質転換された配列が増幅さ　。 れているか、さらにもっと好都合な発現の環境中に置かれ。 よってそれらによりコードされたタンパクを生産する。増大した能力を得るとい う高い可能性がある。この原理により選択された細胞系統は、後述するように、 実質的に選択圧が無くても毒素耐性を保持しているようである。 ＭＴ遺伝子を含む、ある耐性付与遺伝子は、それ自身および結合したＤＮＡの両 方の多コピーを生産することにより、毒素の存在に応答する。よって、　ＭＴ配 列を選択に用いることに加え９選択された細胞中で遺伝子の増幅をさせる能力が 利用される。概要を述べたように９例えばＫａｕｆｍａｎら（前出）においては 、この手順は、増加した高レベルの遺伝子のコピー数を得るために、増加させた 高レベルの毒素物質中で長時間さらに継代培養することから成る。形質転換体中 での肘遺伝子と所望発現系との結合のために、この技法を用いることにより多コ ピーの発現系が得られる。 本発明によれば１発現ベクターを限定培地上で維持可能な宿主細胞中へ形質転換 するが、しかしそれらは血清が存在しても増殖するであろう。適当な細胞にはＣ ＨＯ細胞とその派生物が含まれるが、しかしそのような無血清で維持可能などん な細胞系統を用いてもよい。マーカーとしても用いられ同時に所望のより高い発 現細胞を選択できる増幅可能な毒素耐性付与遺伝子とともに、もしくはその代わ りに、共同形質転換される抗生物質耐性マーカープラスミドを用いて、形質転換 を行ってもよい。宿主での複製は後述中の宿主ゲノム中への適当な配列の組み込 みに依存するが、自己複製ベクターも用いてよい。 共同形質転換する抗生物質耐性もしくは共同形質転換する増幅可能な毒素耐性付 与遺伝子により付与される毒素耐性。 もしくはその両方により、形質転換された細胞を選択する。 選択された細胞は適した培地中で増殖させ、必要に応じて誘導の前にこの増殖培 地に血清もしくは他のタンパク供給物が含まれてよい。（この系に増幅可能な耐 性付与遺伝子が含まれるならば、前述のように増加させた毒素濃度中で形質転換 体を増殖させることにより、形質転換された細胞を高コピー数にまで増幅しても よい。）ＭＴ−ｎプロモーターの誘導は制御可能なので、誘導時に培地は限定培 地と交換可能であり。 交換される。簡易化した分泌タンパク精製の有利性を保持しながらこのようにし て効率的な増殖が可能である。 亜鉛イオンを約１−５　Ｘｌ０−’Ｈの濃度範囲で用いて、増殖させる培地中で 直接細胞を誘導することはもちろん可能である。（この濃度範囲には明確な限度 はないが、前述の任意に決めた制限内の量が活用可能であり、明らかに３Ｘ１０ −’Ｍあたりの亜鉛イオン濃度が最適である。）しかし、このような直接の誘導 はその後のタンパク精製の観点からすれば、不利であり、従って血清含有培地を タンパク供給物の無い基礎培地に替えることが好ましい。 よって、好ましい手順では、ここでの本発明と区別されるが、培地の交換が行わ れる。鉄イオンおよび鉄含有タンパクであるトランスフェリンからなるグループ から選んだＦ’ｌｌ！メディエータ−と共に、　（約２　Ｘｌ０−’−２Ｘｌ０ −’Ｈの範囲で）誘導亜鉛イオンを加える。誘導メディエータ−がトランスフェ リンである場合、加える量は約５μｇ７ｍｌにすべきである。 もっと多量を用いることができるが、もちろんそれらは、タンパク精製が行われ る時に培地に混入物を加えることになるので不利である。必要な鉄イオンの量は 、好ましくは鉄（Ｕ）として、１−３　Ｘｌ０−’Ｍの間の鉄である。基礎培地 はそれ自身約３　Ｘ１０−’Ｍの鉄を含む：しかしこれは無血清下で誘導を起こ させるためには不充分である。３ｘｌＯ−３Ｍの鉄以上の濃度では、細胞を増殖 させるｐｉｔにおいて鉄が沈澱する。ＭＴ遺伝子による形質転換およびそれに続 く重金属耐性による選択により、添加誘導メディエータ−を必要としない培養物 が得られる。 適当な範囲の亜鉛イオン濃度を示す関連したデータは第１図に示され、それは後 記・の実施例り、５．ａのプロトコールに従ったｈＧＨ生産に対する種々の濃度 レベルの効果を説明している。 誘導後に、ＭＴ−ｎプロモーターの支配下で所望のコード配列が大量に発現され 、もし哺乳動物細胞中に成熟クンバク配列と動作可能なリーダー配列があるなら 、それらは培地中に分泌される。本発明の発現系を用いて細胞環境の内側にタン パクを生産させることが可能であるが、そうすることには特別な有利さは無く、 そしてほとんどの哺乳動物分泌タンパクに通常結合しているリーダー配列は普通 所望のコード配列に含まれる。それに加えて、　ｃＤＮＡ配列も発現系に用いて もよいが、この宿主がイントロンを含むゲノム配列を利用しそして発現する能力 は有利であり、天然に生産されるものに似ているタンパクを生産させることにお いて時には特別に重要でありうる。 よって本発明の系を用いてどんな所望のコード配列を発現させでもよい。天然の リーダー配列を含む天然に分泌されるタンパクを組み換え型の分泌をもたらすよ うに生産させてもよい：しかじ組み換え技術を用いて１通常は分泌されないタン パクを、哺乳動物細胞宿主に和合性のリーダー配列およびそれ自身のアミノ酸配 列を付けた形で供給してもよく、あるいは細胞内に産生させ得る。 本発明の方法を用いて産生されるタンパクの典型は８代謝欠陥を矯正するのに有 用な、ヒト成長ホルモンもしくは他の哺乳動物成長ホルモン、インシュリン、オ ーリキュリンなどのようなホルモン；ワクチンの生産に有用な、肝炎または口蹄 疫ウィルスのキャブジッドタンパクをコードするようなウィルスタンパク；治療 に有用なリンホトキシン、インターロイキンまたはインターフェロンのようなリ ンホカイン；特殊な状態の処置に有用な、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン アクチベーター、または肺胞表面活性剤タンパクのような他の種々のタンパク、 である。 前述のものはもちろん、単に説明的な非常に部分的なリストである。どんな所望 タンパクのコード配列でも本発明の系で使用可能である。 （以下余白） 逅−Ｍ１汰 ｃＤＮＡまたは遺伝子ライブラリーから、コード配列を得る方法は、当業者に公 知であり、その詳細は標準的な参考文献から得られる。これらの手法は、所望の コード配列を１本発明のベクターに挿入するために用いられる。加えて、多くの 所望のコード配列がすでにクローニングされており、これらはオリゴヌクレオチ ド合成法より、または既存のベクターから得られる。それゆえ、適当でない配列 に対しては、０．１節およびＣ，２節の方法が使用され得る。 Ｃ，１，ｃＤＮＡあるいは゛イ云　ライフ゛う１−のヒト遺伝子ライブラリーは 、当業者に知られるごとく、λファージで構築される。例えば、　Ｍａｎｉａｔ ｉｓ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃｅ１ｌ（１９７８）　ＩＦ１６８７−７０１ を参照せよ。他方、標準法を用いて単離されたｍ　ＲＮ　Ａから２重鎖ｃ　Ｄ　 ＮＡが合成され得る。この２木ｔＪｃＤＮＡ　゛は、カークサイマス　ターミナ ルトランスフェラーゼ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ。 Ｊ、Ｇ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ　（１９７８）　５　：　２７ ２１−２７３２）によるホモポリマー尾部を付与し、　ｐ１３Ｒ３２２などのプ ラスミドベクターに挿入できるように調製してもよい。まず、５μｇ　ｍＲＸＡ に。 オリゴ（ｄＴ）を１２〜１８付与し、プライマーとして、アビアンミニロブラス トシス　ウィルス由来のＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼで、−末鎖ｃＤＮＡ を合成する。次に、１００℃で５分融解し、氷で急冷して、鋳型ＲＮＡを、ＤＮ Ａから引き離す。そして。 −ジフラグメントを用いて、最初の一本鎖分子の３”末端を自己プライマー合成 することにより、ヘアピン状の二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａが形成され、第２の一本鎖ＤＮ Ａが合成される。これらの分子は、開いた末端で平滑末端にされ、このヘアピン 構造が。 Ａｓ　ｅｒ　１ｌｅｕｓ　ｏｒ　ｚａｅ由来のＳ、ヌクレアーゼで開裂される。 この２木鎖ｃＤＮＡのＳｌヌクレアーゼ処理は、３００ｍＭ塩化ナトリウム、　 ３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）　、３　ｒｎＦＩ塩化亜鉛の溶液で。 ６００ユニツトの酵素を加えて、３７℃で３０分間行われる。このｃＤＮＡはフ ェノール−クロロホルムで抽出され、酢酸アンモニウムの存在下で３回エタノー ル沈澱することにより、小さなオリゴヌクレオチドが除去される。これは次のよ うにして行われる。２容量の７．５ＦＩ酢酸アンモニウムおよび２容量のエタノ ールがｃＤＮＡ溶液に加えられ、−７０℃で沈澱させる。この平滑末端にされた ２木鎖ｃＤＮＡは９次いで、セファロース４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎ ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）のゲル濾過力、　 ラム（０，３Ｘ　１０ｃｍ　＞を通して、大きさで分画されるかあるいは。 超遠心分離によって、５〜２０％のグリセロール濃度勾配をかけることで、濃度 勾配によって分画される。およそ所望の長さよりも長いｃＤＮＡ、例えば３００ ｂｐのｃＤＮＡは、カラムに保持され、これは、　７０％エタノール沈澱で回収 された。０．２Ｍカコジル酸、２５ｍＭ）リス（ｐＨ６，９）　、２　ｍＭジチ オスレイトール、０．５ｍＭ塩化カルシウム、　２００ｍＭ　ｃＤＴＰ、４００ １１ｇ７ｍｌ　ＢＳＡを含む溶液に、４０ユニツトのカーフサイマス　ターミナ ルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを加え、２２℃で５分間反応させ。 デオキシシトシンの短い（１０〜３０ヌクレオチド）ポリマー尾部が付与される 。この反応物が、フェノール：クロロホルムで抽出され、そして酢酸アンモニウ ム存在下で３回エタノール沈澱させて小さいオリゴヌクレオチドが除去される。 このテールを付与したｃＤＮＡは、　ｐＢＲ３２２のような宿主ベクターにアニ ールされる。この宿主ベクターは１例えばＰｓｔ　Ｉに癒着され、オリゴｄＧで テールが付与される。ある使用可能な実施態様では、２．５μｇのｐＢＲ３２２ −ｄＧ　ＤＮ八がベクター？農度５μｇ７ｍｌｌでｃＤＮＡにアニールされ、こ のハイ、ブリッドが、　Ｃａ５ａｄａｂａｎ、　Ｍ、＋ｅｔ　ａｌ、Ｍｏｌ　Ｂ ｉｏｌ（１９８０）　１３８　：１７９−２０７に記述の塩化カルシウム処理に よりエセリシア・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＭＣ１０６１に形質転換される。 Ｃ，２，ｃＤＮＡまたは伝　ライブラリーのブロービングｃＤＮＡか遺伝子ライ ブラリーは、コロニーハイブリダイゼーション法でスクリーニングされる。各マ イクロタイタープレートは、ニトロセルロースフィルター（Ｓ　＆Ｓ　ｔｙｐｅ 　ＢＡ−８５）に移され、１５μｇ７ｍｌテトラサイクリンを含むし寒天培地に て３７℃で１４〜１６時間コロニーを生育させた。このコロニーは１０％ＳＤＳ に溶解され１次いで、　５００ｍＭ水酸化ナトリウム／１．５Ｍ塩化ナトリウム で５分間、０．５１リス−塩酸（ｐ）１８．０）　／１．５Ｍ塩化ナトリウム、 続いて２×標準クエン酸サリンで連続処理することにより、このＤＮＡがフィル ムに固定される。フィルターは、空気乾燥され、８０℃で２時間焼きつけられる 。 ニックトランスレーションしたプローブでは、この二重フィルターは、　５０％ ホルムアミド（還元が激しいならば４０％ホルムアミド）　、５　ｘＳＳＣ（ｐ Ｈ７，０）、５　Ｘアンハード溶液（ポリビニルピロリドンと、牛血清アルブミ ン　各０．０２％加えたもの、１×）、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７，０）　、　０．２％ＳＤＳ。 ５０μｇ／ｍｅ酵母ｔＲＮＡ、そして５０μｇ／ｍＩｌの融解し分断したサケ精 子ＤＮＡを含むＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液１０−で、４２℃にて１６ 〜１８時間プレハイブリダイゼーションされる。 サンプルは、この同じＤＮＡハイブリダイゼーション緩衝液５　ｍｌ中に含まれ る種のうち、同種のものなら４２℃で１２〜３６時間、異種のものなら３７℃に て、ニックトランスレーションしたＤＮＡプローブとハイブリダイズされる。こ のフィルターは。 同種のもののハイブリダイゼーションでは、５０℃で０．２　Ｘ　ＳＳＣと０． １％ＳＤＳでそれぞれ３０分間、異種のもののハイブリダイゼーションノときに は、　５０℃で３ＸＳＳＣと、０．１％ＳＯＳ　テ。 ２回洗浄される。フィルターは空気乾燥され、−７０ｔで１〜３日オートラジオ グラフされる。 合成（１５〜３０塩基対）オリゴヌクレオチドプローブでは。 二重層フィルターは、４２℃で２〜８時間フィルター一枚につき、ｌＱｍＩ！の オリゴ−ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＣ。 ０．１　％ＳＤＳ、　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５　Ｘテンハート０．０５％ピロ リン酸ナトリウム、および５０μｇ／ｍＥ変性および切断されたサケ精子ＤＮＡ ）でプレハイブリダイゼーションされる。 このサンプルは１合成された１５〜３０塩基対からなるオリゴヌクレオチドプロ ーブと、オリゴヌクレオチドの組成に適した条件下でハイブリダイズされる。典 型的な条件は、温度が３０〜４２°Ｃで２４〜３６時間フィルター一枚につき５ １ｎ１のプローブを含む上記と同様のオリゴ−ハイブリダイゼーション緩衝液で ある。 このフィルターは、まず、６　Ｘ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳを含む５０１リン酸ナ トリウム緩衝液（ｐＨ７，０）２３℃で１５分間にて２回洗浄される。そして、 算出されたハイブリダイゼーション温度で。 ６ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳで２分間で１回洗浄され、空気乾燥されて一７０℃ で２〜３日間オートラジオグラフされる。 もし、所望のタンパクのアミノ酸配列や、それをコードするｍＲＮＡ中のヌクレ オチド配列がわかっているのなら２合成法か、もしそのような配列をもったベク ターが寄託されているかまたは入手可能であれば、このようなベクターをクロー ニングするかいずれかにより１本発明の宿主ベクターに挿入するＤＮＡが得られ る。このコードしている配列を合成するためには２代わりのセンスおよびアンチ センスがオーバーラツプしている一本鎖オリゴヌクレオチドが調製され、この代 わりのセンスおよびアンチセンスの一本鎖は、ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰで 処理することにより発現的に満たされる。このオリゴマーは、　Ｅｆｉｍｏｖ、 　Ｖ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ’　Ｒｅ５（１９８２ ）６８７５〜６８９４）の方法により調製される。あるいは、これは。 市販のオリゴヌクレオチド合成機で調製され得る。アニーリング、あるいは放射 能ラベルのために、−末鎖をキナージン竹ＦＯ１６２−５０１９５７（９） グは、過剰の（例えば１ｎＭの基質に対して約１０ユニツト）ポリヌクレオチド キナーゼを用いて、５０ｍＭ）リス（ｐＨ７，６）、　１０ｍＭ塩化マグネシウ ム＋　５ｍＭジチオ、２．Ｌｚイト−）Ｌｔ、１〜２　ｍＭ　ＡＴＰ。 １．７ｐＭ　γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（２，９ｍＣ１／ｍＭ）　０．１ｍＭ　スバル ミシン、　０．１ｍＭＥＤＴＡの存在下で行われる。 Ｃ０３，′　可２なコード配置のか ｃＤＮＡや、ゲノムＤＮＡから得た配列は、所望の変異タンパクを得るために９ 例えば、サイト特異的プライマーによる変異処理を行い修飾することが必要であ る。これは、プライマーとして、−末鎖ファージＤＮＡを、所望な変異がおこり 、制限されたミスマツチしかおこらないように、相補する合成オリゴヌクレオチ ドを使うことによる。換言すれば、この合成オリゴヌクレオチドはファージと相 補的な一本鎖を直接合成するためのプライマーとして用いられる。得られたＤＮ Ａは、ファージ介入による宿主細菌を形質導入される。形質導入細菌の株は、寒 天プレートに拡げられ、ファージがはいったー細胞がプラークを形成するように される。 理論的には、新プラークの５０％が一本鎖として変異型のファージを含み、５０ ％が野生型配列である。この得られたプラークは、正しいハイブリダイズだけが 可能であり、野生型によるミスマツチはおこらないような温度でキナージされた 合　゛成プライマーとハイブリダイゼーションされた。次いで、プローブとハイ ブリダイズするプラークが取り出され、培養されそしてＤＮＡが得られた。 Ｃ０４，丘久久二■揚築 所望にレコードされた配列や制御配列を含んだ適切なベクターの構築は、常法の ライゲーションや制限発現切断をつかさどる。この方法は当業者には、よく知ら れている。単離されたプラスミド、ＤＮ頒己列または合成されたオリゴヌクレオ チドは開裂され、テーリングされ、そして所望の形に再度つながれる。 サイト特異的なりＮＡの開裂は、適切な制限発現（または発現群）を、市販の制 限発現業者の指定する条件下で処理することにより２行われる。例えばＮｅｗ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓのカタログを見よ。一般的には、約ｌｐｇのプ ラスミドかＤＮＡ配列は、ここでの実施例に述べるような緩衝溶液約２０μβ中 で。 １ユニツトの発現により開裂される。代表的には、過剰の制限発現は、このＤＮ Ａ基質の完全な消化を保証するべく用いられる。インキュベーションは、変化が あってもかまわないものの、３７℃で１〜２時間がよい。それぞれのインキュベ ーション後、タンパクは、フェノール／クロロホルムを用いた抽出により除去さ れる。そして、エーテル抽出が施される。そして、エタノールによる沈澱で、水 層から核酸が回収される。 もし必要なら、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルの常法による電気 泳動により、切断された断片のサイズ分ｈｎ剋ｎ■（１９８０）　６５　：　４ ９９−５６０に見出される。 制限酵素処理された断片は、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸塩（ｄＮＴＰ ｓ）存在下で、５０＋＋＋Ｍ）リス（ｐＨ７，６）、　５０ｍＭ塩化ナトリウム 、６畦塩化マグネシウム、５ｍＭ　ｄＴ７．　５〜１０μ１ｄＮＴＰｓ中にて、 ２０〜２５℃で１５〜２５分間、エセリシア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＤＮＡポ リメラーゼＩ　（クレノー）のラージフラグメントで処理することにより、平滑 末端され得る。このクレノーフラグメントは、５゛末姑の突出末端を埋めるが、 たとえ４種のｄＮＴＰが存在していても、３”末端のはみ出た一本鎖は。 削る。もし必要なら、突出末端の性質にあわせて、１種か。 選択されたｄＮＴＰｓだけを加えれば１選択的な修復が遂行され得る。クレノー で処理した後この混合液は、フェノール／クロロホルムおよびエタノール沈澱で 抽出される。適切な条件下で５１ヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼＢａ１ −３１で処理すると、どんな一本鎖部分も加水分解される。 ライゲーションは、１５〜５０μＥ容量中で１次のような標準条件および温度で 行われる。２０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、　１０１塩化マグネシウム 、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、　３３μｇ／ｄ　ＢＳＡ、　１０ｍＭ〜５０ｍＭ塩化ナ トリウム、そして４０μＭ　ＡＴＰ　、　０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）　 −ＬニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼを０℃で（“突出末端１のライゲーションの 場合）、あるいは１ｍＭ　ＡＴＰ、　０．３〜０．６　（Ｗｅｉｓｓ）ユニット のＴ４　ＤＮＡリガーゼを１４℃で、　（“平滑末端”のライゲーションの場合 ）。分子間の“突出末端゛ライゲーションは。 通常、全Ｄ　ＮＡ濃度が３３〜１１００ｐ／ｍｌ　（５〜１１００ｎ全末端濃度 ）で行われる９分子間の平滑末端ライゲーションは、　（通常１０〜３０倍モル 過剰のリンカ−を入れる）全末端濃度１μＨで行われる。 ベクター構築の際には“ベクター断片”が使用される。このベクター断片は、一 般にベクター自身の再結合を妨げ、５”末端のリン酸塩基を除去するために、バ クチリアル　アルカリ　ホスファターゼ（ＢＡＰ）またはｐ−フィンテスチナル 　アルカリ　ホスファターゼ（ＣＩＰ）処理がなされる。消化は、約１５０ｍＭ 　）リス中、　Ｎａ“をＭｇ”の存在下でｐＨ８にて、ベクター１μｇに対して 約１ユニツトのＢＡＰまたはＣＩＰを用いて、６０℃で約１時間行われる。この 核酸断片を回収するために、この調製物は、フェノール／クロロホルムおよびエ タノール沈澱により抽出される。あるいは、不必要な断片を消化するために、他 の制限発現で２段消化したベクターを使えば、ベクター自身の再消化が妨げられ 得る。それゆえ、この所望の配列は、プローブに対応するコロニーから回収され る。 Ｃ９５，構築■且所 以下に述べられた構築において、プラスミド構築のための正しいライゲーション は、まず、　Ｄｌ、　Ｍ、Ｃ１５ａｄａｂａｎ　（Ｃａｓａｄａｂａｎ。 Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ（１９８０）　１３８　：　１７９ −２０７）から得られた。 エセリシア・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＭＣ１０６１株を形質転換するか。 あるいは他の適切な宿主を、ライゲーション液で形質転換することにより、確認 される。所望の形質転換株は、当業者に知られているように、アンピシリン、テ トラサイクリン、または他の抗生物質耐性もしくはプラスミド構築の際のモード に依存する他のマーカーを用いて選択される。この形質転換株からのプラスミド は１次いで、　Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａ ｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）（１９６９）６２　：　１１５９の方法に 従い。 必要に応じてクロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ、　Ｄ、Ｂ、、　ＪＢ ａｃｔｅｒｉｏｌ　（１９７２）　１１０　：　６６７）に従って調製される。 この単離されたＤＮＡは、制限発現パターンにより分析されるがおよび／もしく は、　Ｓａｎｇｅｒ＋　Ｆ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ 　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）（１９７７）７４　：　５４６３と、さらにはＭｅｓｓｉ ｎｇ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓ　（１９８１）　９　 ：３０９に記述のグイデオキシ法による配列決定か、あるいは’ｒ’Ｉａｘａｒ ｎ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｅｅｔｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　（１９８０） ６５　：　４９９の方法により配列決定される。 Ｃ９６，宣工夏桝 ここで、クローニングおよび発現に用いられる宿主株は以下のようである； クローニングと配列決定には、エセリシア・コ’Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）ストレイ ンＭＣ１０６１またはＨＢＩＯＩが用いられた。 発現に使用される細胞は、チャイニーズハムスターオバリ−（ＣＨＯ）細胞であ り、これは、ここに述べた条件で、限定された培地で維持され得る。 Ｄ、ス」１医 次の実施例は本発明を説明するものであるが２本発明はそれに限定されない。 プラスミドｐＨ５１は、　ｐ８４Ｈ（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、＋ら、　Ｎａｔｕｒｅ 　（１９８２）２９９　：　２９７〜３０２）由来のｂＭＴ−ＩＩの８４０ｂｐ の配列、これは。 ｈ！’ＩＴ−Ｉｔ遺伝子の−７６５の旧ｎｄＩＩ［部位から塩基＋７０のＢａｍ ＨＩ切断部位までに跨がっている。を含有する。Ｐ８４ＨプラスミドをＢａｍＨ Ｉで完全に分解し、末端のヌクレオチドを取り除くためにエキソヌクレアーゼＢ ａ１−３１で処理し、そして、　ＨｉｎｄＩ［［で分解した。分解された８４０ ｂｐ　ＨｉｎｄＩｆｆ／平滑断片をＨｉｎｄｎＩおよび旧ｎｃｌｌにする分解で 開いたｐＵＣ８（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、、　らＧｅｎｅ（１９８２０９：２５９ 〜２６８）に連結した。連結混合物をエセリシア・コリ　（Ｅ、Ｃｏ１１）　Ｈ ＢＩＯＩにＡ　ｍ　ｐ　Ｒで形質転換し、　ｐＨ５１と称するある候補となるプ ラスミドを分離し、ジデオキシ　シーフェンス法で配列決定を行った。ｐＨ５１ は、第２図に示すように１便利な制限酵素部位を含むポリリンカーの上流にｈＭ Ｔ−ｎの制御配列を含んでいる。 匹■」■虹 ＭＴ−ｎプロモーターに対して動作可能な連結の中に、　５Ｖ−４０のエンハン サ−を含む一組の宿主発現ベクターを、　ｐＨ５ｌ中のＭＴ−ＩＩプロモーター 配列に先行する旧ｎｄｎ［部位に１１２０ｂｐのＳＶ４０のＤＮＡ断片を挿入す ることにより構築した。ＳＶ４０　ＤＮＡ断片はＳＶ４０の複製開始点にまたが り、ヌクレオチド５１７１からヌクレオチド５２４３　（開始点）、ヌクレオチ ド１０７〜２５０からの２対の７２ｂｐの繰り返し配列を含み、そして、後期ウ イ′ルスｍＲＮＡの５°末端を含む開始点の側止ヌクレオチド１０４６まで続い ている。 この旧ｎｄ　ｍ　１１２０ｂｐ断片は、　ＳＶ４０　ＯＮＡ　（Ｂｕｃｈｍａｎ 、　Ａ、Ｒ，、ら韮Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ　、第２版（Ｊ、Ｔｏｏｚｅ、 編）　ｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８１）＋　ｐｐ、　７９９〜８４１）の旧ｎｄＩＩ［分 解から得、増幅のためｐＢＲ３２２にクローニングした。このクローニングベク ターは旧ｎｄＩ［［で切断し、そして、　１１００ｂｐの５Ｖ４０ＤＮＡ断片は ゲル電気泳動により分離し、　Ｉ（ｉｎｄＩ［ｒで分解しＣＴＰ処理したｐＨ３ １ニ連結した。得られたｐＨＳ　１−　Ｓ　Ｖ　（９）およびｐ！（Ｓｌ−ＳＶ ａωと称子るベクターは、第２図に示すように、ＭＴ−Ｉｆジブロモーターに先 行して、逆方向に断片を含んでいる。ｐ　ＨＳ　１−　Ｓ　Ｖ　（９）中では、 エンハンサ−は５′末端のｍＲＮＡ開始点から約１６００ｂｐ離れている。逆方 向のものは、５゛末端のｍＲＮＡ開始点から約９８０ｂｐである。両方向とも動 作可能であるが、エンハンサ−配列が開始点に近い方向が高発現を与えた。転写 開始点の上流２５０〜４００ｂｐにエンハンサ−をもつ欠失が最適であると考え られる。 追加のベクターを、　ＴＡＴＡボックスの５“末端から上流にそれぞれ１９０ｂ ｐ、２５０ｂｐ、および３６０ｂｐニ５Ｖ４０（７）　Ｘ　７　ハンサーの３′ 末端をもつように構築した。この構築は＋　Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、＋ら。 Ｎａｔｕｒｅ　（１９８４）　３０８　：　５１３〜５１９に示されているヒト ＭＴプロモーターの上流の制御領域のマツピングに基づいている。構築物のすべ ては１重金属による制御に対する２対の部位を含む配列を保持しているが、１９ ０ｂｐおよび２５０ｂｐで分離した構築物は、これらの部位からさらに上流にあ るグルココルチコイド制御に対する配列は保持していない。 ｐＨ５’−５Ｖ１９０．　ｐＨＳ’−５Ｖ２５０．およびｐｕｓ’−５Ｖ３６０ と称するこれらのベクターは９次のように調製される：構築物のすべては。 メタロチオネイン　プロモーターとｐＨ５１から切り出される断片として与えら れる上流領域とを含む配列の長さを除いては同一である。 ｐＨＳ’−３Ｖ１９０ニ対しては、　ｐＨ５１をＳａｃ　ＩＩで分解し、平滑末 端にして、Ｋｐｎｌリンカ−に連結した。次に、ＤＮＡをｌ’ｌＴ−ＩＩの制御 配列の適当な部分を遊離するためにＥｃｏＲＩおよびＫｐｎ　Ｉで分解した。同 様に、　ｐｕｓ’−５Ｖ２５０ニ対しては、　ｐ）ＩＳＩをＨｇａ　１で分解し 、平滑末端にして、ＫｐｎＩリンカ−を連結し、　ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎ　Ｉ で分解した。ｐ）Ｉｓ’−５Ｖ３６０に対しては、Ｄｄｅｌを最初の分解の際に 使用した。 ＳＶ４０エンハンサ−を含む中間ベクターは、　ｐＵｃ−ＳＶを得るためにＳＶ ４０の旧ｎｄ　ｍ　／　Ｋｐｎ　Ｉ断片（５１７１位置がら２９４位置までを含 み、ＫｐｎＩ部位から５０ｂｐのエンハンサ−エレメントを含む）をＫｐｎ　Ｉ 　／Ｈｉｎｄ　ｍで分解したｐＵｃ１９に挿入することによりｔＷａｌＪされる 。　（ｐＵｃ１９は、ポリリンカー領域に）ｌｉｎｄｌ［Ｉ。 Ｋｐｎ　Ｉ　、およびＥｃｏＲＩの順で、３ケ所の便利な制限部位を含んでいる 。）最終的なベクターは、上記のように調製されたＫｐｎ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ 断片をＫｐｎ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ断片で分解したｐＶＣ−ＳＶに挿入すること により得られる。 ｌΣ１−ＭＴ− ＭＴ−ｆｆプロモーター（所望のコード配列に連結される）と。 ＭＴ遺伝子すべてとの両方を含む宿主発現ベクターは、ヒトメタロチオネイン■ 全遺伝子（Ｋａｒｉ、ｎ、　、Ｍ、、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）２９９ 　：　２！Ｅ７〜８０２）を含む３ｋｂ　Ｈｉｎｄｎ［断片を旧ｎｄｎ［で分解 したｐＨ５ｌに挿入することにより構築した。得られるプラスミドであるｐＨ５ １−ＭＴ（９）およびｐＨｓｌ−ＭＴ（１（ｆｌは、２つの可能な各方向でプロ モーターを５゛としてメタロチオネイン全遺伝子を含んでいた。第２図を参照さ れたい。 これらのベクターは、あらゆる適当な遺伝子に対する発現ベクターを構築するた めの宿主ベクターとして有用である。 しかしながら、下記のように、所望の発現ベクターの他の構築にも利用されうる 。例えば、ｈＧＨをコードしている配列に利用される。 Ｄ−２−西Ｉ３　転　のためのＭＴベクターの　忙発現゛系の異なる開始レベル とカドミウム耐性を付与するＭＴ遺伝子を使用して選別または増幅を許容するた めに、　ｐＵｃ９／ＭＴと称される一般的なシャトル・ベクターを構築した。こ のシャトル・ベクターは、　ｐｓ４ｏ　（前出）がらの旧ｎｄＩ［［断片として 得られるＭＴ−ＩＩｌ遺伝子、　Ｈｉｎｄｌｌ［で分解し、アルカリ　ホスファ ターゼで処理したｐＵｃ９に連結することにより構築された。 Ｄ、３．、　ベタ　−の ＭＴ−ｎプロモーターの制御下でのＸタンパクをコードしているＤＮＡに対する 基礎の発現ベクターは、ｐＭＴ−Ｘと称される。 動作可能なように結合したＳＶ４０エンハンサ−を含むようにも。 ｐＭＴ−Ｘを修飾したそれらのベクターは９通常、　ｐＸ−ＳＶ４０と称される 。エンハンサ−配列がｐ　ＨＳ　１−　Ｓ　Ｖ　（９）およびｐＨ５ｌ−５Ｖ　 Ｑ＠中のエンハンサ−と位置が一致するとき、すなわち、転写開始点からそれぞ れ１６００ｂｐまたは９８０ｂｐの位置であるとき、そのベクターはｐ　Ｘ　− Ｓ　Ｖ　（９）またはｐＸ−ＳＶＱＯ）と称される。ｐＭＴ−ＸをＭＴ全遺伝子 を含むように修飾した。それらのベクターは、総称しテｐＸ−ＭＴ、さらニ、ｐ Ｘ−ＭＴ（９）　、　ｐＸ−ＭＴ（ＩＩと称され、ｐＨ５ｌ−ＩＴ（９）および ｐＨｓｌ−ＭＴＱのと類似性を示す。 すべての場合において２名称の中の“Ｘ”の後に置かれている時の“Ｃ”はｃＤ ＮＡ挿入を指し、“ｇ”は遺伝子を指す。 Ｄ、３．ａ、　ホルモンの　ベタ　− 飢り剋ム ｈＧＨをコードしている染色体配列は、　ｐ２＋６−３　（ＤｅＮｏｔｏ、ら。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１）　１９　：　３７１９）を ＢａｍＨＩ　（これは第１エキソンの５°末端で切断する）およびＥｃｏＲＩ　 （これは構造遺伝子の３”末端で切断する）で分解したものから分離し、ｖｔい て、ポリアクリルアミドゲルにより精製した０分離した断片はＢａｍＨＩ／Ｅｃ ｏＲＩ分解したｐＨ３１に連結し、連結混合物でエセリシア・コリ　（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）　ＭＣ１０６１をＡｍｐ　”に形質転換した。 プラスミドを含有するｐＨＴ−ｈＧＨｇ　（第３図参照）は、プラスミドＤＮＡ を充分な量で調製するために増殖させた。 執ｕＬ針並 ｐＨ５ｌ−ＳＶ（９）またはｐＨ５ｌ−ＳＶＱＯ）を構築するために、上記と同 じ方法で、しかし、　ｐＨ５１の代わりに、　ｐＭＴ−ｈＧＨｇを用い、　ＭＴ プロモーターの制御下でｈＧ）ｌ遺伝子を含みＳＶ４０エンハンサ−に対して動 作可能に連関した１組のベクター（それぞれｐｈＧ）Ｉｇ−Ｓ　Ｖ　（９）およ びｐｈＧＨｇ−５ＶＱωと称されるベクター）、が得られた。 連結混合物でエセリシア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１０６１をＡｍｐ”に形質転 換し、正確な構築物を確認した。 誂用Ｌ■ 選択および増幅のために有用なｈＭＴ全遺伝子を含む発現ベクターは、上記調製 したｐＭＴ−ｈＧＨｇベクターを旧ｎｄｌ［［で分解しアルカリ　ホスファター ゼで処理し、そして、ｈＭＴ遺伝子を含む３　ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ断片を挿入す ることにより、ｐＨｓｌ−ＭＴを構築した時に用いたのと類似した方法で、得た 。この構築物も第３図に示す。 Ｄ、３．ｂ、′″　５　ンパク（ＡＳＰ　）の　ベクターβ仄」μｒ 染色体ＡＳＰベクターｐＭＴ−ＡＳＰｇに関しては、コード配列を。 ファージベクターλ：　ｇＨＳ−１５（１９８４年１２月７日にＡＴＣＣに寄託 され、受理番号ＡＴＣＣ４０１４６を与えられた）から得た。λ：　ｇ）ｌｓ１ ５を得るために、バクテリオファージＣｈａｒｏｎ　２８　（Ｒｉｍｍ、　Ｄ、 　Ｌ、。 らＧｅｎｅ　（１９８０）　１２　：　３０１〜３１０）にクローニングされた ヒト染色体ライブラリーを、バーバード大学のＤｒ、　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ から得た。約１．５　Ｘ　１０６のファージをエセリシア・コリ　（Ｅ、ｃｃ： １）Ｋ２Ｏ２上で増殖させ、プラーク　ライゼートを、　Ｂｅｎｔｏｎ　Ｗ、　 Ｄ、。 ら５ｃｉｅｎｃｅ　（１９７７）　１９６　：　１８０〜１８２に記載されてい るようにニトロセルロース　フィルターに移した。このフィルターはＲｕｇｂｙ 、　ｐ、　Ｗ、　Ｊ、、らＪ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９７７）　１旦：２３７ 〜２５１のニック　トランスレーション法により放射能ラベルしたＤＳ−１ｃＤ ＮＡで検出した。フィルターは、ハイブリダイゼーションバッフｙ　−（０，７ ５Ｍ　ＮａＣ１，０，７５Ｍ硝酸ナトリウム、４０％ホルムアミド、　０．０５ ％ＳＯ５、０，０２％牛血清アルブミン、　０．０２％フィコール−４００，０ ００，０，０２％ポリビニルピロリドン、０．１％ビロリン酸ナトリウム１．５ ０μｇ　／　ｍｅ酵母ｔＲＮＡ、　５０μｇ　／ｄ変性し切断したサケ精子ＤＮ Ａ　）中で４２℃で１時間にわたり前洗浄した。新たなハイブリダイゼーション 　バッファー１−にそれらを０．４５Ｍ　ＮａＣ１および０．’０４５Ｍクエン 酸ナトリウムおよび０．１％ＳＯＳ中で５０℃にて２度洗浄し、−晩オートラジ オグラフィーにかけた。ＤＳ−１ｃＤＮＡとハイブリダイズする配列を含む６つ の潜在クローンを精製した。最も強くハイブリダイズするクローン、　ｇＨＳ− １５の特性を調べた。 ＤＳ−１プローブとハイブリダイズしたｇＨＳ−１５から得た７００ｂｐのＥｃ ｏＲＩ断片を配列分析のために選択した。このＥｃｏＲＩ断片を精製し、　Ｍ１ ３ｍｐ９に挿入し、配列決定し、そして、相当するイヌの配列と広（ホモロジー があることが見い出された。 ヒトのコードしている全領域は、２つの連続しているＢａｍＨＩ断片：５゛側１ ．２ｋｂおよび３′側３．５ｋｂ断片、中に含まれていた。 両方のＢａｍＨＩ断片をＭ１３ｍｐ８のＢａｍＨ１部位中に個々にサブクローニ ングし、配列決定した。付加的な断片は第３図に示す要領に従って同様に配列決 定した。この配列の情報は１種々のＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｐａｌ ｏ、八ｌｔｏ、　ＣＡ）コンピューター　プログラムを使用し、製造業者の指示 に従い、解析された。シグナル　ペプチド、前駆体配列および成熟アポタンパク を含む領域がイヌのＡＳＰ　ｃＤＮＡと比較して同定された。配列解析から。 この遺伝子の５′末端は１．２ｋｂのＢａｍＨＩ断片内に、そして３゛末端は３ ．５ｋｂのＢａｍ旧断片内にコードされていた。この遺伝子は＋　１．２ｋｂ　 Ｂａｍ旧断片の最初の塩基対を１として、　１２１８ｂｐ。 １６５１ｂｐおよび２４８２ｂｐの位置の３つのイントロンにより中断していた 。 ＡＳＰをコードしている全配列は、ＢａｍＨＩで分解されて生じたλ：　ｇＨＳ −１５から２つの断片（それぞれ、１．２ｋｂおよび３．５ｋｂ）として切り取 られる。ｐＨ５−１をＢａｍＨＩで切断し、そして。 λ：　ｇａｓ−１５からの前記２つのＢａｍ）ＩＩ断片をその部位に連結した。 この連結混合物で、エセリシア・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＭＣ１０６１をＡｍ ｐ”に形質転換し、成功した形質転写体を制限酵素解析で選択した。ｈＭＴ−Ｉ Ｉプロモーター制御下でＡＳＰをコードしている配列を持つ所望の構築物を含む 株をｐＭＴ−ＡＳＰｇとし、大量のプラスミドＤＮＡを調製するため、増殖させ た。 （以下余白） ＭＴ−ＡＳＰ　−Ａ　。 下流にＡｐｏ配列を有しゲノムＤＮＡを含むベクター、　ｐＭＴ−ＡＳＰｇ−Ａ ｐｏについては、そのコード配列を、エキソン２．３および４゜そしてエキソン ５の一部分を含むヌクレオチド９５０からヌクレオチド３４３２までにおよぶ遺 伝子の）ｌｉｎｆＩ／ＥｃｏＲＩ断片として得た（Ｗｈｉｔｅ、　Ｒ，Ｔ、　ｅ ｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８５）　３１７　：　３６１〜３６３）。 この断片を、ポリアデニンシグナルとポリアデニン部位とを含むヒトＡｐｏＡＩ 遺伝子（Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ、　Ｃ，Ｃ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５（１９８３）　１１　：　２８２７〜２８３７）　（７）３’末端から５００ ｂｐ断片に結合した。この構築は次のとおりである。 Ｃ末端の制御シグナルを含むｐＭＴ誘導体、　ｐＭＴ−Ａｐｏを調製した。ｐＭ Ｔ−Ａｐｏは、３“末端制御シグナルを含むヒト肝臓タンパクＡｐｏＡ、遺伝子 （Ｓｏｕｌｄｅｒｓ、　Ｃ，Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、（上述））の一部分を持ってい る。ＡｐｏＡ、遺伝子のＰｓｔＩ／Ｐｓｔｌ　２．２ｋｂ断片（平滑末端にしで ある）をｐＭＴのポリリンカー領域のＳｍａ　Ｉ部位にクローン化し、そしてＡ ｐｏＡ、遺伝子の大部分を除去した。 このＡｐｏＡ　、遺伝子の大部分は、ＢａｍＨで分解し、クレノーで平滑末端に して、Ｓｔｕ！で分解し、再結合することによって除去された。その結集体じた ベクターは、ジデオキシ配列分析によって確かめられたように、３゛末端からＡ ｐｏＡ、遺伝子をおよそ５ｏｏｂｐ含有している。 ３．５ｋｂのＢａｍ旧断片（上述）を、ＥｃｏＲＩでの分解（３４３４の位置） によって３゛末端を切り縮め、クレノーで埋めた。この切り縮めた断片を、）Ｉ ｉｎｆｌで切り縮められた１、２ｋｂ断片（上述）と−緒にｐＭＴ−ＡｐｏのＢ ａｍ旧部位へクローン化し、　ｐＭＴ−ＡＳＰｇ−ＡｐＯを得た。ｋｐｏによっ て終結される。完全なＡＳＰコーディングゲノム挿入断片をＭＴ−ｎプロモータ ーに結合するのが第４図に示されている。 このベクターは、野生型のプレタンパク（シグナル配列を含む）よりアミノ酸が ２３個長いタンパクを生産するであろうことが予想された。その構築物はエキソ ン１を欠如しており。 それゆえ、翻訳はおそらく、野生型のプレタンパクｍＲＮＡと相；補するゲノム 配列のヌクレオチド９８７のＡＴＧで始まる。そのヌクレオチドは１通常、第１ イントロン中にある。野生型のプレタンパクの生産においては、エキソン１はヌ クレオチド１０２２でエキソン２にスプライシングされ、この開始コドンを欠い ており、ヌクレオチド１０４６で翻訳が開始されている。しかしながら、付加さ れた残基が分泌を妨げることは見られず。 通常の成熟したタンパクがその断片からのこの修飾された形で発現され、細胞か ら分泌される。 門と虹践旦仙 ＡＳＰのコード配列は、ＭＴ−ｎプロモーター領域に近位のエンハンサ−要素を 含む宿主ベクターｐ）ＩｓＩ−９Ｖ（１０）の修飾された形へ挿入された。まず 、５００ｂｐのａｐｏＡ１断片を、この断片を単離することによって、　ｐＨ５ ｌ−５Ｖ（１０）に挿入した。このａｐｏＡＩ断片は、　ｐＭＴ−Ａｐｏ（上述 ）の分解およびＥｃｏＲＩ／　ＢａｍＨで分解したｐＨ５ｌ−５Ｖ（１０）へそ の単離物を結合することによって得た。 ｐＭＴ−ＡｐｏをＢａｍＨで分解し平滑末端にして、平滑末端にしたＥｃｏＲＩ 分解物として、ｐＨ５１０−５（Ｗｈｉｔｅ、　Ｒ，Ｔ−＋　ｅｔ　ａｌ、　Ｎ ａｔｕｒｅ（１９８５）　３１７　：　３６１〜３６３）から得たｃＤＮＡ配列 へ結合した。このｃＤＮＡ断片は、５゛の翻訳されていない領域につないだＥｃ ｏＲＩリンカ−から、３゛の翻訳されていない領域（９００ｂｐ）中の。 ちとからあるＥＣｏＲＩ部位までおよんでいる。関連したヌクレオチド配列を第 ５図に示す。そこでは、星印をつけたアミノ酸は、　ｐＭＴ−ＡＳＰｇ−Ａｐｏ から得たタンパクの配列からの一次アミノ酸配列における相違を表している（そ の相違は、ヒトのｃＤＮＡとゲノムの配列との間の塩基変化の結果である）。翻 訳の開始は、ヌクレオチド５６であり、“野生型の配列中と同様である。 ＡＳＰｃ　−３Ｖ（１０） 付加的な修飾がｐＡｓＰｃ−ＳＶ（１０）およびＩ）ＭＴ−ＡＳＰｇ−Ａｐｏ配 列の組み込みによって調製された。プラスミドｐＡＳＰｃ−ＳＶ（１０）をＢａ ｍＨ１およびＥｃｏＲＩで分解し、単離した大きい方の断片を、　ｐＭＴ−ＡＳ Ｐｇ−ＡｐｏのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ　’　（部分的）分解によって得られた ＾ｓｐ遺伝子の３”部分と結合した。これは、ヌクレオチド１１５４で始まり、 ヌクレオチド３４３２におよぶヒトのＡＳＰ遺伝子の部分を表し、上記のように ＡｐｏＡＩ遺伝子断片に結合されている。この構築物は、　ｐＭＴ−ＡＳＰｇ− Ａｐｏから得たものと同一のタンパクをＩ　作るが、　ｐＡＳＰｃ−５Ｖ（１０ ）から得たものとはアミノ酸位置２５．３０および３４が異なる。その関連した 挿入のヌクレオチド配列を第６図に示す。 Ｄ、３．Ｃ，ヱヱ１並久Ｚバクの　のためのベタ　−１−ＡＩおよびＨ丁−ＡＩ Ｉｃ アポリポタンパクＡＴ　（ａｐｏＡＩ　）遺伝子は、ｐＰｓＡｌ、２から単一シ た。それは、　ａｐｏＡＩ遺伝子の完全なコード配列を、　ＰｓｔＩでの分解と それに続くポリアクリルアミドゲル精製によってｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位へ 入った挿入物として、含んでいる。この断片は、もともと１組み換えファージ、 λＡｌ−１２から、２．２ｋｂのＰｓｔＴ断片として得られており　（Ｓｅｉｌ ｈａｍｅｒ、　Ｊ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ。 匣紅（１９８４）　３　：　３０９）　、　５°の翻訳されない領域からイント ロンを含む完全なコード配列におよび、そして、ポリＡ付加部位を越えて終結し ている。このＰｓｔｌ挿入物は、　ｄＣＴＰの存在下でＴ４０Ｎ＾ポリメラーゼ の処理によって平滑末端にして、　ＳｍａＩで分解してＢＡＰ処理をしたｐＨ５ １へ結合し、そしてその連結混合物をエセリシア・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）　１ ０６１へ形質転換しＡｍｐ”とした。得られたベクター、　ｐＭＴ−ＡＩｇ、の 正確な構築は、制限酵素４分解分析法により確かめられた。 同様の手法で、ヒトのａｐｏＡＩＩをコードしているｃＤＮＡ配列を。 ｐＭＴ−ＡＩＩｃと名付けられたａｐｏＡＩＩの発現ベクターを得るために。 ＥＣ０ＲＩで分解したｐ）ＩＳＩへクローン化した。ａｐｏＡｌｌをコードして いるＥｃｏ旧挿入物は＋　Ｈｕｙｎｈ、　ｖ、　Ｔ、＋　ら、　ＤＮＡ　Ｃ１ｏ ｎｉｎ　Ｔｅｃｉ紅虹照：　Ａ　Ｐｒａｃ旦ｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ　（ＩＲＬ 　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　１９８４）に記載された方法で鋼製されたλ ｇｔｌｏ中のヒト胎児肝１１ＱｃＤＮＡライブラリーから得られた。それは、ヒ トａｐｏＡＩＩのアミノ酸残基１４０〜１６４をコードしている４５ｂＰのオリ ゴヌクレオチドをプローブとして調べられたものである（Ｓｈａｒｐｅ、　Ｃ０ Ｒ−＋ら。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８４）　１２　：　３９１７〜３ ９３２）。７５０．０００の組み換え体のうち、　１０のポジティブコロニーが 得られた。 これらのうちの１つは、λＡｌｌと名付けられ、完全な配列のａｐｏＡＩＩｃＤ ＮＡに対応する４４０塩基のＥｃｏＲＩ挿入物と、加えて約２０塩基の５′の翻 訳されていない領域を持っている。このＥｃｏＲ１挿入物は、ｐＭＴ−ＡＩＩを 得るために、　ｐＨ３１への挿入物として用いられた。 」ｌｖづ１捜 ａｐｏＡＩをコードしているゲノム配列に両方向に動作可能なように結合したＳ Ｖ４０エンハンサ−を含む発現ベクターは、　ＳｍａＩ分解しアルカリフォスフ ァターゼ処理したｐ）ＩＳＩ−５Ｖ（９）および築された（Ｓｅｉｌｈａｍｅｒ ら、ＤＮＡ　（１９８４）　３　：　３０９　：およびＰｒｏｔｔｅｒ。 Ａｏ、ら、」訪（１９８４）　３　：　４４９に記載）。分解物から得られた２ 、２Ｐｓｔｌ断片を単離し、　Ｓ＋ｎａｌで切断した宿主ベクターへ挿入するた めに、クレノーを用いて平滑末端にした。得られた二連結混合物をエセリシア・ コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）へ形質転換し、　Ａｍｐ”とした。そして、　ｐＡＩｇ −ＳＶ（９）およびｐＡＩｇ−５Ｖ（１０）　（７）正確な構築を確かめた。 Ｄ、３．ｄ、心　の　トｉウム　’　（ＡＮＦ　）　のため心房のナトリウム排 泄性因子は、腎臓のナトリウムの排泄を制御するタンパクであり、このように、 適切な液体バランスの維持の責任を負う因子の１つを制御する。それは、心臓の 心房細胞中でプレプロタンパクとして生産され、そして分泌され、プロセッシン グされる。 ヒトのプレプロ−ＡＮＦをコードしているゲノム配列の挿入のために、　ｐＨｓ １はまず、　ＡｃｃＩ部位を含む便利な制限部位を有するＭ１３ｍｐ７から単離 された２４塩基のＢａｍ）ＩＩリンカ−断片をＢａｍＨＩ部位へ挿入することに よって修飾された。この修飾されたｐＨ５１（ｐＨｓｌ”　と名付ける）は、そ れゆえ、ＡＮＦコード配列の挿入の助けとなるこの便利なＡｃｃＩ部位を含んで いる。 所望の発現ベクター（ｐＭＴ”−ＡＮＦと名付ける）を、　ｐｓＨｓｌｏをＡｃ ｃ　ｒおよびＥｃｏＲＩで処理し２次にアルカリフォスファターゼで処理し、ｐ ）ＩＧＲＢ−１から精製した２０１６ｂｐのＡｃｙＩ　（部分的、平滑末端にし た）　／　ＥｃｏＲＩ断片を挿入することによって、構築した。それは、米国特 許第６２２，６３９号（１９８４年６月２０日出願）に開示され９本出願人に譲 渡されており、その内容はここに示されている。この挿入物は完全なＡＮＦ断片 を含んでいる。 関連したＤＮＡ配列を第７図に示す。 Ｄ、３．ｅ、工１スロポエチン　のためのベタ　−エリスロボエチン（Ｅｐｏ） をコードしている遺伝子配列は。 次のように調製された：　Ｌａｗｎ、　Ｒ，Ｍ、ら領旦（１９７８）　１５　： 　１１５７−１１７４の方法で、λ−Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ中に調製されたように 、ヒトゲノムライブラリーを２つの２４ｍｅｒ　（Ｅｐｏ遺伝子（Ｊａｃｏｂｓ 。 らＮａｔｕｒｅ　（１９８５）　３１３　：８０６−８１０による）のエキソン に相補的であるようにデザインされた）　：　５’　−ＴＣＴＧＴＣＣＣＣＴＧ ＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＣ−３“および５”−ＣＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＡＧ ＣＣＣＧＡＡＧＣＡＧ−３’をプローブとして用いて調べた。１５ｋｂの挿入物 を含むハイブリダイズするファージをこのようにして得た。そして、５″の翻訳 されない領域の２ｏｏｂｐと完全な３゛の翻訳されない領域とに加えて。 Ｅｐｏ遺伝子の完全なコード領域を含む４．８ｋｂ断片を得るために、ＢａｍＨ およびＥｃｏＲＩで分解した。この断片を、ポリアクリルアミドゲルで単離し、 平滑末端にして、ＳｍａＩで分解してＣＩＰで処理されたｐＵｃ９へ、増幅のた めに結合させた。このクローニングベクターからのＢａｍＨＩ／　ＥｃｏＲＩ挿 入物を単離し２次のベクター中で、　Ｅｐｏコード配列を供給するために用いた ： 飢り屁虹 ｐＭＴ−Ｅｐｏは、　ｐＨ５１をＢａｍＨおよびＥｃｏＲＩで切断しＥｐｏコー ド配列を、上記のＢａｍＨＩ／　ＥｃｏＲＩ断片として挿入することにより８間 装された。 Ｅｏ−３ｖ（１０） 同様の手法で、　ｐＨ５ｌ−ＳＶ（１０）をＢａｍＨおよびＥｃｏＲＩで分解し 、　Ｅｐｏをコードしている断片をＭＴプロモーターへの動作可能な近位連結に ＳＶ４０エンハンサ−を供給するために挿入した。 ル匹」Ｌ 同様ニ、シかしｐＨ５ｌ−ＳＶ（１０）　、　ｐ）ＩＳＩ−ＭＴに代えて、完全 なメタロチオネイン遺伝子を増幅制御部位として含む、所望のベクターｐＥｐｏ −ＭＴを得た。 Ｅｏ″−８ｖ（１０） ｐＥｐｏ−５Ｖ　（１０）は、所望のコード配列に許容される限りにおいて、　 Ｋｏｚａｋのコンセンサス配列を５′末端に持ち、ポリアデニン部位を３”末端 に持つ遺伝子を供給するために修飾された。 上記Ｅｐｏ遺伝子は、効率のよい転写に必要と考えられている。 コンセンサスなポリアデニン部位を欠いている。 ｐＥｐｏ−ＳＶ　（１０）は、第一のイントロン中のエキソン■に続く７塩基を 切るＳｃａ　Ｉで分解した。その結果生じた平滑末端部位を、遺伝子のＮ末端の 誤っている部分と代えるため、コンセンサス配列を供給するため、そして上流の 末端にＢａｍＨ１部位を供給するために１次のオリゴマー ５’　−ＧＡＴＣＣＡＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＧＡＧＴ−３’ＧＴ ＴＣＴＡＣＣＣＣＣＡＣＧＴＧＣＣＡＣＴＣＡと結合させた。連結混合物は、Ｂ ａｍＨで処理し、　（そのことによりベクターの末端から遺伝子の５”の翻訳さ れない領域を取り除り）、そして、修飾された５゛末端を持つＥｐｏ遺伝子を含 む中間のベクターを得るために再結合した。 ３゛末端の修飾のために、　ｐｈＧＨｇ−ＳＶ（１０）をＢａｍＨとＳｍａ　Ｉ とで分解し、　ｈＧ）ｌのためのコード配列を欠いている宿主ベクターを供給す るためにＣＩＰで処理した。この線状化したベクターを、所望の修飾遺伝子を含 むｐＥｐｏ“−８ν（１０）を供給するために、３”の翻訳されない領域のほと んどを欠き５゛を修飾されたＥｐｏ遺伝子を含む上記にて調製された中間のベク ターから０．３．ｆ、レニン　■ベクター プレプロレニン配列がＭＴ−Ｉ［プロモーターの制御下にあるプレプロレニン発 現ベクターの調製法は、米国特許出願階７１９．４１４’（１９８５年４月３日 出願）に記述されている。この記載は以下のごとく完全に示されている：プレプ ロレニンをコードするこのＤＮＡおよびその最終生成物は、腎臓細胞のｍＲＮＡ から構築されるｃＤＮＡライブラリーをプローブすることにより得られる。しか し、現在、この配列は明らかであるため（第９図番・照）、この操作をくりかえ し行う必要はない。修飾されたヒトシグナル配列を付加したヒトプロレーンの完 全な配列をコードするあるベクターを有する細胞は、アメリカンタイプカルチャ ーコレクションにより寄託されている。ｐＰＰ１４を有するＣＢＩ−２８５は、 　ＡＴＣＣ２６により保管されていた（１９８５年３月２６日）目録Ｎ［ＬＣＲ Ｌ８７５’８゜以前所望の配列が知られていたちののうち、完全な遺伝子配列を 得る方法は、いまでは利用されている。（参照）　Ｅｄｇｅ、　Ｍ、　Ｄ、、ら 、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２９２　ニア５５　；　Ｎａｍｂｉａｒ、　 Ｋ、　ｐ、ｌ　ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８４）　２２３　：　１２９９； Ｊａｙ、　Ｅ、、ら、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８４）　２５９　：　 ６３１１゜ｃＤＮＡライブラリーは、不慮の犠牲者の腎臓から精製され。 オリゴｄＴカラムをとおして得られたｐｏｌｙＡ″ＲＮＡから調製された。この ｃＤＮＡライブラリーは、バタテリオファージベクターλｇｔｌｏを中で構築さ れた。さらに、マウス下顎腺しニンｃＤＮＡフラグメントをプロ・−ブすること によりヒトゲノムライブラリーから得られたＣｈａｒｏｎ−４ヒトレニンゲノム クローンの適当なフラグメントを用いてプローブされた。このライブラリーは、 　ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを得るための標準的な方法により調製された。　 ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー）でｃ［ｊＮＡを平滑末端とし、市販のＥｃ ｏＲＩリンカ−を加えた後、ＥｃｏＲＩで切断し、そしてＥｃｏＲ１で切断され たλｇｔｌｏベクターとフラグメントをライゲーションした。サンガーのジデオ キシ法（上記）を用いて配列される際、２つのポジティブな対応するｃＤＮＡク ローンは、ともに、完全なレニンをコードする配列を含み。 さらにシグナル配列の５゛側で７ベース対がない以外は、３゛側の翻訳されない 領域も含むことが示された。この２つのクローンは、　１２１１ｂｐのコード領 域を含んでおり、その下流３゛側に１９８ｂｐＯ未翻訳領域、さらにｐｏｌｙＡ ｔａｉｌが順に続く。適当なプレプロレニンコドンに対する配列の割当てならび に読みわくは、公表されたＩｍａｉ　ら（参照第９図）の配列との比較により１ 作製された。２つのクローン化された断片には、第９図に示すように、７４２番 目の位置にＥｃｏＲＩサイトがある。 このプレプロレニンタンパクをコードするｃＤＮＡ配列は、この２つのＥｃｏＲ Ｉ断片としてｐｕｃ９に組み込まれ、　ｐＨＲ１およびｐＨＲ２を得るべく翻訳 された。ｐＨＲＩはこの５゛側の位置を含みｐＨＲ２はこの３°側の位置を含ん でいる。ｐＨＲ１およびｐＨＲ２は、ＥｃｏＲＩを使いλｇｔｌｏからｃＤＮＡ を切り出し、そして得られたフラグメントのそれぞれを、ＥｃｏＲＩ処理された ｐｔｌｃ９に導入することにより、調製された。 ｐＰＰ１４を構築するために、　ｐＭＴ、ＰＲＯは宿主発現ベクターとして用い られた。ｐＦ１’ｒ、ｐＲｏはｐＨ５Ｉと同様に、　ｐ８４Ｈ由来の８４０ｂｐ を含んでいる（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、＋ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）　２９ ９：２９７−８０２　”）　、このｐ８４）１は、ｈＭＴ−ＩＩ遺伝子のＨｉｎ ｄｌＩ［サイト−７６５から＋７０までの広がりをもつ。ｐＭＴ、ＰＲＯは、こ のｈＭＴ−ＩＩフラグメントを含んでいるが、　ｐＵＣ８に導入するさい、この ＡＴＧの開始コドンもさらに含んでいる。（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、Ｉ　ら、傾匣 （１９８２）旦：　２５９−２６８　）。それゆえ、　ＰＭＴ、ＰＲＯを構築す るために、このｈ？ｌＴ−ｎ配列は、ｐＭＴ　ＩＩ−ＢＰＶから、ＨｉｎｄＩＩ Ｉ／　Ｈｉｎｄｌｎフラグメントとして切り出された。次いで、このプロモータ ーおよび５゛転写分を得るために、ＢａｍＨＩで切断された。このｈＭＴ−ｎ配 列を含む旧ｎｄＩＩ［−Ｂａｍ旧フラグメントは、Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｂａｍ旧で 切断したｐＵＣ８ヘ挿入され、　ｐＭＴ、ＰＲＯが得られた（Ｍａｒｉｎ＋　Ｍ 、＋ら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）　（１９８３） 　８０　：　４０４０−４０４４）。 ｐＰＰ１４を構築するために、　ｐＭＴ、ＰＲｏはＢａｍ旧で切断され。 この４種のｄＮＴＰの存在下で、　ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー）を用いてう められた。さらに、このｐＭＴ、ＰＲｏは、ＥｃｏＲＩで切断された。ＥｃｏＲ Ｉは、このＡＴＧ開始コドンに続（唯一のＢａｍＨＩサイトのすぐ下流を切断す る。プレプロレニン遺伝子のこの５°部分は、ＥｃｏＲ１分解によりｐ）ＩＲＩ から切り出された。この部分は、開いたｐＭＴ、ＰＲｏベクターのＥｃｏＲＩ付 着末端と粘性末端条件下でライゲーションされた。この挿入のおよそ５０％は正 しい方向に向いているであろう。未区応で残っているＥｃｏＲＩサイトをうめる ために、ライゲーション混合物は、４種のｄＮＴＰ存在下でＤＮＡポリメラーゼ ■　（クレノー）を用いて処理された。最終的には、このベクターは、ライゲー ションにより再ｑ環状化された。この混合物はエセリ長ア・コリ　（ε、ｃｏｌ ｉ）ＭＣ１０６１に導入され、Ａｍｐ”とされた。ｂＭＴ−ＩＩのプロモーター 領域および５°転写部分により与えられたＡＴＧを有する読みわく内に、プレプ ロレニンのコーディング配列の５°部分をもつ正しい構築物・を含むコロニーは １選び出され、培養された。 この中間体のプラスミド構造は、制限酵素切断分析およびシーフェンシングによ り確認された。 この得られた中間体プラスミドは、　ｐＨＲ−２由来のＥｃｏＲＩ切応する配列 に変えることにより、解決された。こうするためには、この中間体ベクターは、 Ｈｉｎｄｌ［ＩおよびＥｃｏＲＩで処理され、そしてｈＭＴ−ＩＩプロモーター ／プレプロレニンの５１部分を含む断片は、Ｈｉｎｄ　ｍ　、ＥｃｏＲｌで切断 したｐｕＣ９へ挿入された。この得られた修飾中間体は１次いでＥｃｏＲＩで切 断され。 ｐＨＲ２から単離されたＥｃｏＲＩ／　ＥｃｏＲＩフラグメントとライゲーショ ンされ、ｐＰＰ１４が生じた。このｐＰＰ１４は、完全なプレプロレニンをコー トする配列を含む。 このｐｌ’ｌＴ、ＰＲｏのＡＴＧ開始コドンとプレプロレニンをコートする配列 の５゛末端分との間の結合部位は＊　Ｂａ　ｍ旧およびＥｃｏＲ１切断部位を修 復し°た後、平滑末端ライゲーションにより結合たＡＴＧ開始コドンは、コーテ ィング配列の残りの部分を示し端のシグナル配列に対応するコーテング配列は、 　Ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ−ｐｈｅ−ａｒｇ−Ａｒｇであり１本来の対応するＮ −末端配列Ｍｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ−ｔｒｐと比較すると、付加されたアミノ酸 を２つ含んでいる。 ここで、ｐＰＰ１４と呼ばれているこのベクターは５本出願においては、一貫性 をもたせるため、ｐＭＴ−ＰＰＲｅｎと新たに名づけられる。 入される。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＯ）−Ｋｌ細胞が、１０％仔牛血 清を含むＣｏｏｎ’ｓ　Ｆ１２媒質およびＤＭＥ２１媒質の１＝１混合物からな る媒質で培養された。このコンペテント細胞は。 目的のベクターおよびｐＳＶ２　：　ＮＥＯとともに同時形質転換された（Ｓｏ ｕｔｈｅｒｎ、　Ｐ、ら、　Ｊ、　Ｍｏｌ　Ａ　Ｉ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８２） 　１　：　３２７−３４１）。 ｐＳＶ２　：　ＮＥＯは、このネオマイシン類似体であるＧ４１８に対して耐性 を示す機能性遺伝子を含む。典型的な形質転換では、０．５μｇ　ｐＳＶ２−Ｎ ＥＯおよび５μｇもしくはそれ以上の発現ベクターＤＮＡが、１００ｍｍディツ シュの細胞に加えられる。Ｗｉｇｌｅｒのプロトコールに従って、このリン酸カ ルシウム−ＤＮＡ共沈体は。 ４時間ＤＮＡと接触させた後、１５％グリセロールを含むＰＢＳ中で２分間°シ ョック”を与えた細胞とともに使用された（Ｍ、。 簡単に言うと、この細胞は１／１０の塊でシードされ、−昼夜培養されて、　２ Ｘ　ＰＢＳで洗浄された。さらに、リン酸カルシウム共沈体を含むヘペスー緩衝 化したザリン０．５−中に１５分間放置され９次いで１０ｍ１培地で培養された 。この培地はアスピレータ−で除去され、ＰＢＳ中にて１５％グリセロールで１ ．５〜３分間置換される。このショックを与えた細胞は洗浄され。 そして培養培地で培養される。ＭＴ−ｆｆ制御発現の誘導がおこるまで、この培 地は、１０％ＦＢＳとともにｐｔ２，１０μｌＭ２１　（１：１）を含んでいる 。１日後、この細胞は、Ｇ４１Ｂ−耐性コロニーのプールを得るべく、１■／ｍ ｌＧ４１Ｂが加えられる。所望のプラスミドの安定な遺伝形質を有する好ましい 形質転換体は２次いでクローナルを単離する精製のために、低密度でプレートに まかれる。 Ｄ、５．　２　の　ンパクの　レベルの渉所望のタンパクの産出量を測定するた めに、形質転換体が調べられる。この形質転換体は、まずプールとして、さらに マルチプレート中で単離されたクローンとして、検出された。 このプレートアッセイレベルは、穴の大きさに多少依存する。 例えば、２４穴のプレートでの結果は、９６大のプレートから得られる結果と直 接比較できない。満足できるレベルでこのタンパクを産生ずるべくプレートアッ セイで確認されるクローンは１次いでローラーボール中の生成操作で生育され得 る。 典型的には、この産生レベルは、スケールアップされるときにより高くなる。し かしながら、プレートアッセイでの性能とローラーボールでの性能との間には絶 対的な相関はない。 すなわち、プレートアッセイで最も良い産生株は、スケールアンプして培養する 必要はない。このようなわけで２代表的には、１００−２００もしくはそれ以上 の個々のクローンは、プレート上の種々のスクリーニング法で測定され、産生条 件（ローラーボール）下で５〜１０の高産生株が測定される。 Ｄ、５．ａ、ｈ用産生 ブ之二上貫定 このｈＧＨをコードするプラスミドで形質転換された細胞か。 法として、　１０−’Ｍ塩化亜鉛に接触された後、マルチウェルプレート上で培 養された。市販の試薬（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ）を用いて、標準的なラ ジオイムノアッセイ法により、成長ホルモンの定量を行った。ｐＭＴ−ｈＧＴ形 質転換体から得られた６０のクローン単離体のうち２つ（ＣＲＴ−２５およびＣ ＲＴ−３７）が、多量の所望ｈＧ）１を産生じた。ＣＢＩ−３７はＡＴＣＣに寄 託させた（１９８５年２月７日、受は入れナンバーＣＲＬ−８７２１）。 して、適当な形質転換体を選択するために、カドミウム耐性選択に対する付加的 なステップが使用された。６４１８耐性細胞のプールが、　１／１０の塊でシー ドされ、５Ｘ１０−Ｓ塩化亜鉛、さらに各量の塩化カドミウムの存在下で培養さ れた。ｐｈｒ−ｈｃｎをもつ同じ形質転換体プールが、制御として使用された。 ｐＭＴ−ｈＧＨプールをシードに対して使用した場合、２．５μｉ程度の低いｃ ｄ”濃度では、コロニーは現れなかった。しかし、２．５μＨＣｄ”でｐｈＧ） Ｉ−ＭＴで形質転換した場合、シードされた培地中には、５００以上のコロニー が得られた。５μＭ　Ｃｄ”では、約１００個のコロニーが、そして１０μＭ　 Ｃｄ”では２個のコロニーが得られた。２０μＭ　Ｃｄ”あるいは５０μＭ　Ｃ ｄ”では、コロニーは得られなかった。この１０μＭ　Ｃｄ”ｆｉｌ性コロニー は除外された。 何故なら、形態的に異常が認められたからである。しかし。 ２．５μＭ　Ｃｄ”および５μＭ　Ｃｄ″２から得られたコロニーは集合体に成 育され、アンプリファイされていない形質転換体のｈＧＨエンハンサ−あるいは Ｃｄ”選択の有無で、ｈＧＨ産生レベルの比較を行うために、ｈＧＨ産生に対し 形質転換体が誘導された。この細胞は、集合体の１０（ｈｍプレートから２５μ ｌの細胞を用いて、６大のプレート中の６４１８を含む５％血清中にシードされ た。２日後、この細胞はＰＢＳで洗浄され、３　Ｘｌ０−’ＭＦｅＳＯａと７× １０４Ｍ　Ｚｕ”を含む血清フリーのバッファーで再シードされた。 ｐＭＴ−ｈＧＨｇでの形質転換体は、１．４μｇ／−の産生レベルを示した。ｐ ｈＧｌ（ｇ−ＭＴで形質転換されたクローンは、カドミウムイオン耐性に対し選 択されない。しかし、２．５μＭ　Ｃｄ”あるいは５μＭ　Ｃｄ”で選択された ｐｈＧＨｇ−ＭＴ形質転換体では、それぞれ６．５μｇ／−および１７．５μｇ 　／−のｈＧＨを産生しζｐｈＧＨｇ−ＳＶ（９）あるいはｐｈＧＨｇ−５Ｖ（ １０）で形質転換された細胞は、それぞれ７．０μｇ／−および１７．０μｇ／ −のｈＧＨを産生した。第１０図に。 各々のプール中の個々のクローンに対するｈＧＨ産生レベルの分布を図示する。 ｐｈＧＨｇ−ＳＶ４０形質転換体は、　ｐＭＴ−ｈＧＨｇを用いた形質転換体あ るいはカドミウムイオンの非存在下でｐｈＧＨｇ−ＭＴを用いた形質転換体より も優れた特性を示すことは明らかである。こ゛のエンハンサ−成分が転写開始部 位に近接している場合の構築では、明らかに高収率を示す。 ５μｉカドミウムイオンに耐性を示すプールからクローンが単離され、この３つ のベストクローンが単離された。産生条件下（以下参照）で培養した場合、　Ｃ ｄ−５−４，Ｃｄ−５−１２およびＣｄ−５−１５は、およそ１２０μｇ／−の ｈＧ）ｌを産生じた。プレートアッセイ条件下で測定した場合、　Ｃｄ−５−１ ２は、　２１．５μｇ／　ｍｌ、そしてＣｄ−５−１５は２７．８μｇ　／ｗｄ のｈＧＨを産生した。他のクローンは、満足すべき量より少なく、産生条件下で ５０〜７０μｇ／ｙｒ１．のｈＧＨを産生した。５μｈカドミウムイオン耐性で 選択した細胞は、約２０コピーの発現を保持していることが。 サザンプロットにより確認された。これに対して、カドミウムで選択できなかっ たプールでは、平均１−３コピーを保持このＣｄ−５−１５クローンが培養され 、さらにより高濃度のカドミウムに対して耐性を示すクローンが選択された。Ｄ ＭＥ２１／Ｃｏｏｎ’ｓ　Ｆ１２．１０％ＦＣＳ　、ｐｅｎ／５ｔｒｅｐ　、　 Ｇ４１Ｂ＋　５ＯＬＩＭ亜鉛イオンおよび２５μｎカドミウムイオンを含む１５ −培地中で。 Ｔ−７５フラスコ中においてこの細胞がシードされ、塊状になるまで培養された 。次いで、細胞は、ｌＯ−の同じ培地を含む１０備プレートに低密度でシードす るために用いられ、そして。 ２８間後、同様の培地を含む６穴プレートの個々の穴に取り出された。２４穴プ レートの１０００集合体でシードすることにより、６つのコロニーのｈＧＨ産生 能が測定された。このコロニーは、トランスファー後２．３日、アッセイのため に培養された。６つのコロニーのうちの１つ（これはＣＢ５１５−２５Ａと名づ けた）は正常に成長し、２日後には１３μｇ／ｄ、そして３日後には２２μｇ／ −のｈＧＨを産生した。ＣＢ５１５−２Ａは、以下に示すように、ローラーボト ルを使ったｈＧＨの産生に使用された。 ＣＢ５１５−２５へは、産生レベルを維持するために、培地中にはカドミウムを 必要としないことも示された。凍結されたＣＢ５１５−２５Ａ細胞を５つに分け 、以下に示す培地修飾条件下で、１：２０゜次いで１ニア、さらに１：５の細胞 をローラーボトル中にプレーディングすることにより、この細胞が拡張された（ ７００倍希釈にあたる、産生に必要なレベル）。下記のごとく、血清フリーの培 地に変えて、さらに亜鉛により誘導した後、１５０ＭＥ１２１　／Ｆ１２　、１ ０％ＦＣ５＋１５ｍＩＨｅｐｅｓおよびｐｅｎ／５ｔｒｅｐを含んでいた。 （以下余白） １日　２日　１日　２日 １　なし　８１　１３３　１１６　８９４　Ｇ４１８　６９　１２７　１１０　 ８５（以下余白） これらのデータは、ｈＧＨを高レベルで産生させるために。 細胞の能力を維持するのに選択圧が必要でないことを示している。 カドミウム選択およびＳＶ４０断片のエンハンサ−活性を利用する結果を同時に 得るために、１　ｐｇ　Ｐｓｖ　ＩＩ−Ｎｅｔ、　１０＃ｇ　ＰｈＧＨｇ−ＳＶ （１０）および１０　ｐ　ｇ　ｐＵｃ９／ＭＴを含むＤＮＡ混合物を使ッテコノ 細胞を処理することにより、付加的な１セントの形質転換体が得られた。２０μ ｉカドミウム中でこの形質転換体が選択さく以下余白） 且１目（狡 孫１星 適当な条件下でｈＧＨを生産するべく示されたＣＢＩ−２５およびＣＢＩ−３７ 細胞を９回転ビン中に１０％牛脂児血清を加えた基本培地に１７１０量シードし ９次いで、−晩培養し、そして塩化亜鉛をｌＸｌ０−’Ｆから３　Ｘｌ０−’Ｈ の範囲の濃度で加え、成長ホルモン生産を誘導した。２　Ｘｌ０−’Ｍ　ＺｎＣ ｌ２の最適誘導条件下でｈＧＩＩ　レベルは７〜１０日間上昇し、最終的に３５ ■／ｌの濃度で蓄積した（第１図参照）。 第１１図はＣＢＩ−２５およびＣＢＩ−３７により分泌されかつ３５３−メチオ ニンでラベルされたタンパクのゲル上での挙動を示す。 Ｉ　Ｘｌ０−’Ｍ塩化亜鉛で６時間培養後、３５Ｓ−メチオニンを培地に加え、 培地に分泌されたタンパクを１５％５Ｏ５−アクリルアミドゲル上での電気泳動 １次いでオートラジオグラフィーにより分析した。第９図のレイン１．２および ３は順にＣＢＩ−３７、ＣＢＩ−２５および非形質転換ＣＨＯ−Ｋｌ細胞により 分泌された全タンパクを示す。形質転換細胞での培地は非形質転換細胞では存在 しない約２２ｋＤの主バンドの存在を示す。レイン４゜５および６は、ｈＧＨに 対するウサギ抗血清で免疫沈降されたタンパクの対応する結果を示す。この免疫 沈降の結果から。 ２２ｋＤと２０ｋＤに相当する２つの主タンパクバンドの存在が特に明らかであ る。この２０ｋＤバンドの割合は全体の約１０％で、ヒト脳下垂体で生産される 成長ホルモンに見られる第２　、　（２０ｋＤ）の変種に相当する。 このオートラジオグラフィーを長く行うと、プレ成長ホルモンおよびプレ２０ｋ Ｄ成長ホルモンに一致する。高分子量の２つのわずかな関連種がまた見られる。 この２２ｋＤ種と成熟ｈＧＨとの同一性は、さらに、還元ゲルおよび非還元ゲル 電気泳動での脳下垂体ｈＧＨとの比較により、またＩＭ９ヒトリンパ球上の成長 リセプターに対する放射能ラベルｈＧＨとの拮抗により確認された（Ｒｏｓｅｎ ｆｅｌｄ、　Ｒ，Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ−顔 Ｌ　並凹（１９８２）韮：　２０２）。 里り椿培並ヱΩ生童 ＣＢＩ−３７細胞もまた。パイロット生産条件下で培養され、血清の無い状態で 誘導された。１０％ウシ胎児血清と１５ｍＭヘペスを補ったターンのＦ１２／Ｄ ＭＥ２１．１／１培地の入った４９０ｄの回転びんに、その細胞がシードされた 。この細胞が固まりの近くまで達するとぐ３．４日）　＋　Ｃａ”とＭｇ“２を 含むＰＢＳで細胞を２回洗浄し、そしてウシ胎児血清のかわりに６〜８　Ｘｌ０ −’Ｍ塩化亜鉛および３Ｘ１０−ＳＭ鉄（ＩＩ）イオンを含む同じ基本培地（無 血清で１５ｎ＋Ｐヘペスを含む）でこの培地が置換された。 （５μｇ　／　ｍ１以上のヒトのトランスフェリンが、この鉄イオンの代用とな りうろことが見出された。）−週間に２．３回培地を回収して、新しい無血清を 補充することにより、これらの条件下で増殖が続けられた。この分泌されたｈＧ Ｈは、２．５■／日の割合で収穫された。この大きさの２〜４倍の生産ビた。生 産は無制限に延長されてもよく、これは８週間ぐらいまで継続されている。 第１２図は、上記で得られた培地からのタンパクのクマシーブルーで染色された ＳＯＳ　−ＰＡＧＥの結果を示す。このＣＢＩ−３７細胞の培地は、対照では存 在しないｈＧＨ種の存在を示し、そこに示されるように１ステツプのゲル濾過カ ラムを用いた培地タンパクの精製の結果、約９０％純粋なｈＧＨが得られること を示す。 ｐｈＧ）Ｉｇ　−ＭＴを含むカドミウム耐性形質転換体（ｃｄ−５−１５）およ びｐｈＧＨｇ　−ＳＶ　（１０）を含む形質転換体（Ｖ−１８）を使用する付加 的な同様の生産操作が比較のために行われた。その結果を以下の表１に表にしで ある。前誘渾培地を捨て再び細胞に６−８　ＸＩＯ’　Ｍの亜鉛イオン、３Ｘ１ ０−’Ｈの鉄（ＩＩ）および１５ｍＭのヘペスを含む培地を加えるときを０日と 数える。 （以下余白） 表１ １４　３１．６　４０．５　２２．６　５２．２１６　３３．３　２６．８ １８　３５．６　３１．４ ２０　３０．４　３７．５ ＊各々の回転びんは２５０ｍｆの培地を含む。 上記のように、この回転びんに１日に蓄積される平均のｈＧＨは、　ＣＢＩ−３ ７で１．９■／日（７，６μｇ／−／日）　、　Ｃｄ−５−１５で。 ４　、４　ｍｇ　／日　（１７，６ｐ　ｇ　／　ｍｌ／日）、そしてｖ−１８で ４．１ｍｇ／日（１６，４μｇ／−／日）である。 このＣｄ−５−１５細胞では、誘導媒介体の付加が不必要であることを示す付加 的な生産操作が行われた。このＣｄ−５−１５細胞は、２つの１７５０ｃｆｆｌ 、そして１つは４９０ｃＪの３つの別々のびんにシードされ、固まりになるまで 増殖させ１次いで、４９Ｍのびんと１７５０ｃ＋Ｊのびんの１つについて誘導培 地中に鉄を含まないこと以外は前述と全く同様に誘導させた。全てが、誘導後１ １日間はぼ同様の割合でｈＧＨの定常直線生産を示した。１１日後の蓄積された 全てのｈＧＨの比較量（１７５０ＣＩ＋！びんに標準化された）は、鉄を含むび んで９３■、そして鉄を含まない１７５０ｄと４９０Ｃｄのびんでは、それぞれ ７０■と９５■のｈＧＨであった。 これらのデータは、全てのメタロチオネイン遺伝子が存在すれば、誘導媒介体の 必要性が除かれることを示す。 Ｄ、５．ｂ、Ｍ　タンパク プ±＝二１覧定 種々の＾ＳＰをコードするプラスミドで形質転換された細胞のプールは、マルチ −ウェルプレートで増殖され９次いで。 ＡＳＰの生産を誘導するために、５Ｘ１０−’からＩ　Ｘｌ０−’の亜鉛イオン 濃度にさらされた。ウサギの抗ヒトＡＳＰボリクロニナル抗血清による免疫沈降 を用いたウェスタンプロット、続いて＋ｚｓｌプロティンＡとオートラジオグラ フィーを用いて、　ＡＳＰアッセイを行なった。 さらに詳細には、　１０％ＦＢＳを含むマツコイの５Ａ培地で増殖させた個々の 細胞系統の半凝集単一層がリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、再び１０％ ＦＢＳ、　Ｉ　Ｘｌ０−’の塩化亜鉛と０．２５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウ ムを含むマツコイの培地を加えた。 （アスコルビン酸塩はプロリン残基の水酸化の促進に有用であろう。）誘導後２ ４時間でこの細胞がＰＢＳで洗浄され、再び塩化亜鉛とアスコルビン酸を含む無 血清マンコイの培地を加えた。１２時間後、この調整された培地が回収され、ト リスｐＨ８中で２０ｍＭとし、そしてＢＲＬのドツト−プロット装置のニトロセ ルロースで濾過された。このニトロセルロースが、５％の脱脂粉乳を含む５０ｍ Ｍ　）リスｐｎ　７．５．　１５０ｍＭ　ＮａＣ１（）リス／食塩）で固定され １次いでこの固定溶液中の１：５０００に希釈のウサギ抗−ヒ）　ＡＳＰポリク ローナル抗血清を加えて保持され、前出のトリス／食塩で数回洗浄された。そし てこれは。 固定溶液中の２５μＣｉα１２５　ＴプロティンＡを加えて保持し。 洗浄されてオートラジオグラフィーがともれた。 このＡＳＰをコードするベクターで形質転換されたほとんどのプールは、この検 定で検出可能なＡＳＰを生産しなかった。 しかし、Ａ−３８と名付けた陽性の、ＡＳＰを分泌する細胞系統がｐＭＴ−ＡＳ Ｐｇ−Ａｐｏ形質転換体から選択された。それに加えて。 ＡＳＰ−１と名付けられたｐＡＳＰｃ−３Ｖ　（１０）で形質転換した細胞から のあるプール、もしくはＡＳＰ−ＦおよびＡＳＰ−Ｇと名付けられたｐＡＳＰｃ ｇ−５Ｖ（１０）で形質転換した細胞からのあるプールは、後述のＤ−４と名付 けられた細胞系統により生産されるＡＳＰに匹敵する量の＾ｓｐを生産した（　 〜２−５μｇ／−）。 ＡＳＰ　ンバクの　゛ このＡ−３８細胞（前出）が、　１０％ＦＢＳを含むマツコイの５Ａ培地中で２ ５％の凝集度まで増殖され１次いで、　１０％ＦＢＳおよび０．２５ｍＭのアス コルビン酸ナトリウムを含むマツコイの培地中の１０−’Ｍの塩化亜鉛で誘導さ れた。（この細胞の半分は１０−’Ｈのデキサメタシンも処理された。）２４時 間後にこの細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％の透析されたＦＢＳ、１　ｘｌＯ−’ Ｈの塩化亜鉛、　０．２５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムおよび０．５ｍＣ１ ／ｍｌの３Ｓ３−メチオニンを含むＲＰＭＩ培地を加えた。 １８時間後に、この細胞上澄液が１’ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオサ ドとされ、プロティンＡを担体として用いるウサギの抗イヌＡＳＰで免疫沈降さ れた。沈降したタンパクの半分は、　５ＯＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で煮沸され 、他の半分は、　０．７５％のトリドアＸ　−１００，０，０７５％（７）ＳＯ Ｓ、　０．７５％（７）２−メ）Ｌｔカプトエタノール、　３０ｍＭのＥＤＴＡ 、　７５ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ１゜中に溶出され０．５単位のエンドグリ コシダーゼＦ（エンド−Ｆ）を加えて３７℃で１時間保温された。エンド−Ｆ処 理されたタンパク画分および非処理のタンパク画分を５ＯＳ−ＰＡＧＥにかけ、 その結果を第１３図に示す。このエンド−Ｆ処理された画分は、非処理の両分の ３８ｋＤのタンパク（レーンＥ）に比べ。 ３０ｋＤのタンパク（レーンＦ）を示した。（レーンＭはサイズマーカーを含み 、レーンＡとＢは非形質転換ＣＨＯ細胞からの上澄液を含み、そしてレーンＣと Ｄは、それぞれデキサメタシンで非処理および処理されたＡ−３８Ｉｊｌ胞から の上澄液を含む。）Ｄ−４ｔ、＋＋のための゛・　のトランスフェクションｐＭ Ｔ−ＡＳＰｙ−Ａｐｏ　（２０＃　ｇ　）とｐｓＶ２　：　ＧＰＴ（１ｕ　ｇ　 ）との混合物でＡ−３８を過剰にトランスフェクションさせることにより、Ｄ− ４と名付けられた付加的な細胞系統が得られた。１０％のＦＢＳを含むＦ１２／ ＤＭＥＭ２１で増殖するＡ−３８の半凝集単層は、前述のように共感染させた。 ４８時間後に、　１０％のＦＢＳおよびＨＡＴ選択薬剤を含むＦ１２／ＤＭＥＭ ２１へ細胞を１：５で分けた。ＨＡＴ選択の１７日後に、生残する耐性クローン のプールがＭｃＣｒａｃｋｅｎ、　Ａ、Ａ。 ｅｔ　ａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　（Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ　１９８ ４）８２−８７の免疫フィルタースクリーン法により、高レベルのＡＳＰを生産 する個々のクローンに対し選択された。簡単に言えば、１００ｕ＋の皿あたり１ ００個の細胞でプレート上のＦ１２／ＤＭＥＭ２１．１０％ＰＢＳにシードされ た。５日後に（コロニーが５０−２００個の細胞を含むとき）、この細胞は、Ｐ ＢＳで洗浄され、再び無血清Ｆ１２／ＤＭＥＭ２１が加えられ、無菌のテフロン ・メツシュがかぶせられた。 このメツシュの上に、ニトロセルロースフィルターを置いた。 このフィルターは８時間そこに置いていた。このニトロセルロースが取り除かれ 、イミュノプロットとして、まずウサギの抗イヌＡＳＰポリクローナル抗血清で 処理され９次いで　＋２ＪプロテインＡで処理され、続いてオートラジオグラフ ィーを行った。選択したおよそ２０００個のコロニーのうち、２個が検出可能な シグナルを出し、そしてＤ−４と名付けた１個はＡ−３８の１０−２０倍のレベ ルで、または概算で２２−５ｐ／ｍｌのＡＳＰに相当する量で、ＡＳＰ遺伝子の 発現が示された。 牲ｙ＝丸に このＤ−４細胞系統から分泌されたＡＳＰは、アフィニティークロマトグラフィ ーにより無血清培地から単離され、気相マイクロシークエンサーによりＮ末端で 配列決定された。決定した１６アミノ酸の配列は、肺の洗浄液から単離されたタ ンパクのＮ末端部分と完全な相同性を示した：この全体の７０％がＮ末端のＧｌ ｕ残基を含んでいた：この残りの３０％はＮ末端にＶａｌ　（Ｇｌｕに対して２ 番目）を含むように切取られていた。これは、この単離された肺の洗浄液のタン パクと同じ組成である。１０．１３および１６番目の位置にヒドロキシプロリン が存在し、これはこの細胞の翻訳後のプロセッシングを示す能力を表した。 それに加え、Ｄ−４により部分されたタンパクが、保持ＡＳＰ−１（前出）と保 持ＡＳＰ−Ｇ（前出）からの分泌タンパク画分とともに、ウェスタンプロットを 用いてヒトのプロティノシス°の肺洗浄液の夕、ンパクと比較した。誘導した細 胞からの無血清培地がＴＣＡ沈澱され、−エンド−Ｆで処理され（または処理せ ずに）、そして１２．５％ゲルの５ＯＳ−ＰＡＧＥにかけられた。このゲルはエ レクトロプロットされ、ウサギ抗ヒトＡＳＰポリクローナル抗血清で、続いて＋ ２５１プロテインＡでドットインキュベートされた。この結果を第１４図に示す 。 レーンＡとＦは、エンド−Ｆ分解前と後の１μｇのタンパク増加肺の洗浄液を含 む：レーンＢ、ＣとＤは、エンド−Ｆで非処理の、それぞれＤ−４，ＡＳＰ−１ のプールおよびＡＳＰ−Ｇのプールからの培地を表す；レーンＧ、　ＨとＩはエ ンド−Ｆで処理されたこれらの上澄液からのタンパクを表す。エンド−Ｆ処理が 、全てのタンパクの見かけの分子量を減少させ、そしてもっと分離したバンドと なることが明らかである。−生主寵作 多コピーのｐＭＴ−ＡＳＰｇ−Ａｐｏを含む、過剰にトランスフェクションされ た細胞系（細胞系Ｄ−４）が１回転瓶での生産レベル操作で用いられた。８５０ ｄの回転瓶が、１０％ＦＣ３，１５ｍＭヘペス、ペン／ストレップ、およびグル タミン中２Ｘ１０’の細胞を含む１０■皿でシードされた。この細胞が群集に到 達後（２−３日）、それらが２ｘＰＢＳで洗浄され、ＦＣＳの無い２５０ｍｆｆ １のＦ１２／ＤＭＥＭ２１．１０ｍＭヘペスで置換された。後日、この細胞に。 ２５０−のＦ１２／ＤＭＥＭ２１．１０ｍＭヘペス、５Ｘ１０−’塩化亜鉛、　 １Ｏ−ｂＨデキサメタシン、および０．２５ｍＭアスコルビン酸が再供給された 。この細胞は２日毎に集められ、　ＩＧＯＯｒｐｍで１０分間回転され、−２０ ℃で凍結された。生産は１−５μｇ／ｍｌ／日で。 上記のように１：５０００希釈でポリクローナルの抗イヌＡＳＰの抗血清を用い てドツトプロットウェスタンによりアッセイされた。生産は約１４−１７日後に 低下した。 Ｄ、５．ｃ、アポリボ　ンパク ブ±：二目１定 アポリポタンパク発現ベクターで形質転換された細胞は。 この細胞に２５８メチオニンを取込ませた時に、正確な分子量のタンパクを検出 することにより、アポリポタンパクの生産で確認された。 ｐ）ＩｓＩ”　（対照として）かｐＭＴ−ＡＩのどちらかでの形質転換体は、標 準的な培地（ＲＰＭＩと１０％の透析したＦＢＳ）中で９．５ｃＪのウェル中に て７０％の群集となるまで成育した。この細胞は。 １．５ｘｌＯ−’Ｍ塩化亜鉛で７時間、再誘導され、その時０．１５μｇ／ｍｌ のＬ−［”Ｓ）メチオニンが加えられた。細胞はラベル存在下で一晩インキユベ ートされ、この培地が集められた。ＩＸ　１１０５ｃｐを含むこの培地の部分は 、　５Ｏ５−ゲルサンプルバッファーに加えられ、１００℃で２分間インキュベ ートされた：第２の部分（５Ｘ　１０１０５ｃｐが、５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　 （ｐＨ６，８）、　０．１５ＭＮａＣ１，Ｏ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、および２％（ ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いて。 ｌ　ｒｎｌの最終容量にされた。２−のウサギの抗ヒ）ａｐｏＡＩを。 インキュベートされた上澄液に加えられ、プロティンＡセファロースとの反応に 供され、そして洗浄された。 ｐＨ５１’形質転換体と比較したように、　ｐＭＴ−ＡＩで形質転換された細胞 のプールは、ゲル上で泳動すると、天然の成熟型ａｐｏＡＩに特徴的な、予期さ れた２５ｋｄのバンドを示し、そのバンドは。 ヒ）ａｐｏＡＩに対して特異的に免疫反応する。 同様に、ＣＨＯ細胞は、ｐｌＩＴ−Ａ　ＩＩで形質転換され、　ａｐｏＡＩ［タ ンパクの生産を確認した。 ＡＩ−生産プールから個々のコロニーを得るために、この細胞は、３７℃で４〜 ７日後番ご個々のコロニーを産むように、１０％ＦＢＳを含むＦ１２／ＤｆＩＥ １１２１中に低濃度（１００−２００細胞／ｍ１）でプレート化された。このコ ロニーは選択され、約１０’細胞／−の細胞濃度にまで成育され１次いで、　Ｊ ａｈｎら、　Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＵＳＡ）（１９８４）８ １　：　１６８４−１６８７の方法を用いて、ドツトプロットウェスタンにより ａｐｏＡＩの発現に対して個々にアッセイされた。 ａｐｏＡＩ生産に対して、この個々のコロニーは、１．５−のＦ１２／ＤＭＥＭ ２１と１０％ＦＢＳ中で１２ウエルの皿に２５％の群集でシードされた。２４時 間後、この細胞はｌ　ｍｌ　ＰＢＳで洗浄され、ｌＸｌ０−’Ｍ硫酸亜鉛を含む 新鮮な培地が、前保温を始めるために加えられた。１６時間後、この細胞はｌ　 ｍｌ　ＰＢＳで２度洗浄され、３×１０−５Ｍ硫酸亜鉛および３　Ｘｌ０−’Ｍ 硫酸第一鉄（ｎ）を含む０．６５ｍ２の無血清培地で再供給された。無血清誘導 の４８時間後、この培地が集め・られ、全不要物を除去するために１１０００ｒ ｐで５分間遠心分離されて、　Ｊａｈｎら（前出）に記述のように、アッセイの ため−にニトロセル口、−スフイルターに対し上ｆｉｏ、ｓ−が適用された。　 ゛ クローン１０４と称する高生産ａｐｏＡＩ細胞系が　ｆｆ５３メチオニンを取り 込んでいる。ａｐｏＡＩを生産するべく、さらに確認された。これらの細胞由来 のａｐｏＡＩが、プールされた細胞より３０倍以上の高いレベルで生産され、免 疫沈降なしでも全分泌培地タンパクで同定されうる。クローン１０４はＡｍｅｒ ｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに１９８５年１０月 ３日に供託された。 また、これはＡＴＣＣ番号８９１１を有する。 ェＺ力」り枇シ死汰果 形質転換された細胞のプールが選択され、ｐＡＩｇ−ＳＶ（９）やｐＡＩｇ−Ｓ Ｖ（１０）で形質転換された細胞を用いて、　ａｐｏＡＩの生産に対し選抜され た。個々のコロニーは、上記で述べたように。 これらプールされたコロニーから取得され、培養され、そしてａｐｏＡ　Ｉを生 産するために誘導された。 対照（ｐＨｓ１’およびｐＭＴ−ＡＩ）のコロニーと発現レベルを比較するため に９個々のコロニーが以下の培地でのａｐｏＡＩの分析に供された：無血清誘導 の４８時間後でかつ細胞不要物を除去するために遠心分離した後、　ＴＣＡを１ ０％となるように加え。 そして担体タンパクとして２０μｌのウシインシュリンを加えることにより、こ の培地の０．４ｍＪ！のサンプルからタンパクを沈澱させた。サンプルは、氷上 で３０分間インキュベートされ。 ４℃、　３０００ｒｐｍにて３０分間遠心分離された。このペレットは０．５ｍ ｆの氷冷したアセトンで１度洗浄され、４０ｐＨの５ＤＳ−ゲルサンプルバフフ ァー １９７０）　２２７：６８０）による１０−２０％の勾配のＳＯＳ−ＰＡＧＥゲ ルに適用された。このゲルをコマジープルで染色すると．第１５図で示した結果 を得た。 レーン１は，　ｐＨｓｌ”の対照を示す。レーン１１はｐＭＴ−ＡＩで形質転換 された細胞を示す。レーン１８およびレーン１９はｐＭＴ−ＡＩで形質転換され たが，回転瓶での培養で成長した（より高生産となる）細胞を示す。そしてレー ン２０は分子量マーカーを含んでいる。レーン２〜１０はｐＡＩｇ−ＳＶ（９） 形質転換体の種々の単一コロニーを示す。レーン１２〜１７は．　ＰＡＩｇ−Ｓ Ｖ（１０）形質転換体の個々のコロニーを示す。レーン２およびレーン１２はそ れぞれｐＡＩｇ−　ＳＶ（９）およびｐＡＩｇ−ＳＶ（１０）を有するプールを 示す。 個々のコロニーのほとんどが，高められていないベクターでの形質転換体より高 レベルのａｐｏＡＩを生産することは，第１５図から明らかである。この生産レ ベルは，およそ３０μｌｇ／ｍｌと見積もられる。 生産行程 ｐＭＴ−ＡＩで形質転換したクローン１０４と表される細胞を，上記１Ｍ丁−Ａ ＳＰｇ−Ａｐｏについて述べたように８５０ｃｍ四方の回転瓶中で増殖させた。 ３７℃で最初の血清含有培地で２日保温後，硫酸亜鉛をＩ　ＸＩＯ−’Ｈの濃度 となるように加え，１日後細胞を。 ａｐｏＡＩ産生誘導するように６　ＸＩＯ−’Ｍ硫酸亜鉛を含む無血清Ｆ１２／ ＤＭＥＭ２１培地に移した。２日後．細胞に７　ＸＩＯ−’Ｈの硫酸亜鉛を含む 同じ無タンパク培地を再供給した。これを“０日“と表す。θ日後，細胞破片を 分離する為に培地の一部を遠心分離し，続いてＳＯＳ−ゲル電気泳動で培地を分 画し．コマジ−ブルーで染色することにより，培地のａｐｏＡ！産生を定期的に アッセイした。染色したゲルを，　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ． ＣＡ）より得た精製ａｐｏＡＩ標品を用いてａｐｏＡ　Ｉタンパク量を定量する ため走査した。細胞に上記のように定期的に再供給した。 ａｐｏＡＩ発現は，最初の６日を通して，２日目の約１０μｇ／ｍｌ／日より５ 日目の２０μｇ／ｄ／日へと増力口し．約３０μｇ／ｙｎｌｌ／日で落ち着いた 。 ＡｏＡＩの，・・番と４人　ノ 前節の生産行程からの培養上澄液は．正確にプロセッシングされており，天然に 見られるものと同様のりボタンバク複合体を形成することが示された。 ＣＨＯ細胞で内生の脂質と複合体と形成するａｐｏＡＩの能力を以下に示す：培 地に固体の臭化カリウムを加えて１，１２５ｇ／ｍｌ！の濃度に調整し，スイン グパケットローターで１８時間，　３３ｋｒｐｍで遠心した。上部画分を従来の スライス法により除去し，生理食塩水で徹底的に透析した。ＳＯＳゲル電気泳動 で調べると。 物質はａｐｏＡＩに相当する２５ｋｄの範囲の主要なバンドを呈した。 全ａｐｏＡＩの約１０−２０％は，　ＳＯＳゲル上の２５ｋｄのバンドの相対的 な染色強度から判断して．上層画分にあった。 上記画分の物質の電子顕微鏡写真は，第１６図で示すように。 ａｐｏＡＩ　／ホスホリピド複合体の血清に特徴的な多数の円板型の構造（）Ｉ ａｍｉｌｔｏｎ，　Ｒ．Ｌ．、　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　 （１９７６）５８：６６７−６８０に記載）の存在を示す。 ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（Ｃｕｔｔｅｒ　Ｌａｂｓ，　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，　ＣＡ ）と複合体を作る。 ａｐｏＡＩの能力を，追加プロトコールで示した。ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤは。 大豆のトリアミルグリセロールと卵のレシチンより成る人工的な脂質のエマルジ ョンである。中間相．すなわちエマルジョンのホスホリピドに冨む部分を不連続 蔗糖勾配中で超遠心浮揚により除去した。下層に，最終容量４ｄで，　１．０６ ｇ７ｍｌの密度となるように，２−のエマルジョン、　０．６ｇ蔗糖および生理 食塩水で含ませた。ベックマン鉢４１０ーターのポリアロマチューブに，この層 を，ｄ　＝１．０２ｇ／ｍｊ！のＮａＣｌ溶液６−で重層より成った。遠心は， ６０分間，１０℃，　２８．００Ｏｒｐｍであった。 遠心後．勾配の上部のトリグリセリドに富むエマルジョンを，ベックマンスライ サーを用いてチューブスライス技術により，下部浮動溶液より分離した。 培養した培地を，アミコンＹＭＩＯメンプランを用いて限外濾過で１００倍濃縮 した。濃縮した培地を，精製ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤと保温し，一段階の遠心だけ を用いたこと以外は，上記のＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤで述べたように遠心した。Ｉ ＮＴＲＡＬＩＰＩＤ　１　ａｄ！あたりの濃縮した培地の脂質対タンパクの比は ０．１．　０．３．あるいは０．６１Ｒ１のいずれかを用いた。 各上部画分のサンプルを脱脂し，　ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し．ゲルをコマジ− ブルーで染色した。ａｐｏＡＩは．より強度の少なイＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ画分 で分離される唯一の主要なタンパクで．増加量の培地により増加量の精製ａｐｏ ＡＩ量が産出される。ａｐｏＡＩＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤで処理しない画分は，あ るａｐｏＡＩとＣＨＯ細胞より分泌された他の汚染タンパクを含む。 上記の生産行程よりのａｐｏＡＩを以下の追加の複合体形成の研究用にさらに精 製した。ａｐｏＡ　Ｉに冨み，脱脂したタンパク沈澱物を、　６Ｍ尿素中で作成 した０、ＯＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，３緩衝液に溶解した。５０μｌ 分を、２０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢９（ＴＦＡ）溶液で平衡 化したＣＩＩＩカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー系（ｌ（ＰＬ；Ｃ） に注入した。注入後。 ０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル２０％から７０％までの勾配で。 ２−／。ｉｎの流速で、サンプルを溶出し、単一の主要ピークを得た。このピー クに相当する画分を集め、アセトニトリルを真空により除去した。乾燥したベレ ットをリン酸緩衝液に溶解し、　５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析して単一の２５ｋｄの バンドを得た。 精製したタンパクの３９アミノＩＮ末端部分の配列を分析し。 全タンパクの９５％が成熟タンパクであることを示した。残りの５％はプロａｐ ｏＡＩ配列の付加的な６アミノ酸を含む。 精製したａｐｏＡＩを用いて、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ、（Ｓ ｔ、　Ｌｏｕｔｓ。 間）より得た再精製後の卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）と複合体形成させた。 ＰＣをエタノールに溶かした（４■／艷）の脂質溶液（４−）を真空下で乾燥し て薄膜にして、２−のＰＢＳ。 ｐ）１７．４で水和した。濁った懸濁液を、窒素気流下で１５℃、１時間超音波 破砕した。超音波破砕した懸濁液を３８ｋｒｐｍ、１時間で遠心し、単一薄層や 多薄層のリポソームを含む上澄液を注意深く除いた。 ａｐｏＡＩをｐｃリポソームと１：５の重量比で、１時間、３７℃で保温した。 保温後、　１０％アガロースカラムのゲル濾過により、リポソームに結合したａ ｐｏＡＩを遊離したａｐｏＡＩから分離した。この物質を次に、ネガティブ染色 電子顕微鏡で分析した。 第１７図は、　（ａｌＡｌ存在下で形成された多くの円板様の構造。 および（ｂｌ同定できる薄層の小胞構造の欠失、を示す。円板様構造は、肝臓潅 流体より単離した初期の１（ＤＬ様粒子に見かけ上似ている（Ｈａｍｉｌｔｏｎ 、　Ｒ，Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、前出、を参照）。 血清中のエマルジョンを安定化する精製のａｐｏＡＩの能力を以下の様にして確 認した。エマルジョンを、上記のように精製したタンパクＡＩと、１００：２ｍ ｇエマルジョン脂質／■Ａｌの重量比で混ぎた。混合液を１時間、３７℃で振盪 して保温し。 ａｐｏＡＩをエマルジョンに結合させた。未結合のａｐｏＡＩは遠心分離により 除去した。 トルペンチン（５ｍｌ　／　ｋｇ　）で処理したラット、あるいは生理食塩水で 処理した対照のう・ノド、由来の血清を用いた。各試験で、１８０μｌの血清を ２０μｌの脂質エマルジョンと、ゆっくり振盪させて、３７℃、２時間保温した 。保温後、脂質粒子の直径を、オプショナルサイズディストリビューションプロ セッサーアナリシス（ｏｐｔｉｏｎａｌ　５ｉｚｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ 　ｐｒｏｃｅｓｓｏｒａｎａｌｙｓｉｓ）とマルチブルスキャタリングアングル ディテクション（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ａｎｇｌｅ　ｄｅ ｔｅｃｔｉｏｎ）付きのサブ−ミクロンパーティクルアナライザー（ｓｕｂ−ｍ ｉｃｒｏｎ　ｐａｒｔｉｃｌｅａｎａｌｙｚｅｒ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｍｏｄｅ ｌ　Ｎ４＋　Ｈｉａｌｅａｈ、　ＰＬ）を用いて、レーザー光走査により決定し た。 ａｐｏＡＩ無しの脂質エマルジョンは、トルペンチン処理したう７）由来の血清 中では不安定で、２００と５００ｎｍあたりに中心のある大きさの２様式の分布 を示した。対照的に、　ａｐｏＡＩを含むエマルジョンは、トルペンチン処理し た動物より得た血清にさらしても、顕著な大きさの変化は示さなかった。両エマ ルジョンは、対照のラット由来の血清では大きさが安定だった。 Ｄ、５．ｄ、■Ｌ 上に述べたのと同様な方法によりｐＭＴ”−八ＮＦで形質転換したＣ）ｔｏ細胞 は、１０％ウシ胎児血清を加えたＨａｒｒｉｓＦ−１２培地中で培養するとＡＮ Ｆを産生ずることが、ラジオイムノアッセイおよび３ＳＳ−メチオニンによる放 射能ラベルで確かめられた。 ３５３−メチオニンアッセイでは、　１８ｋｄおよび１０ｋｄの位置にｐｒｏ− ＡＮＦおよびその断片を示すバンドがあられれた。この産生を示し、　ＣＨＯ− ８／２−８１と名付けられた単離コロニーは、　１９８５年４月９日付でＡＴＣ Ｃに寄託され、その受理番号はＣＲＬ−８７８２である。 ＡＮＦそれ自身は、　１８ｋｄのｐｒｏ−ＡＮＦから、　Ｃｕｒｒｉｅ　ｅｔ　 ａｌ　（Ｐｒｏｃたようにして、トリプシンまたはカリクレインによる限定タン パク分解により作られる。 ｐｔＩＴ−Ｅｐｏ、　ｐＥｐｏ−ＳＶ　（１０）　、　ｐＥｐｏ’　−ＳＶ　（ １０）およびｐＥｐｏ−ＭＴそれぞれのプラスミドを用いて、前節で他の構築物 について記載したようにしてＣＩ（Ｏ細胞を形質転換した。Ｅｐｏ産生のレベル は。 Ｋｒｙｓｔａｌ、　Ｇ、、Ｅｘ　）Ｉｅｍａｔｏｌ　（１９８３）１１　：　６ ４９−６６０の方法に従って、検定培地により評価した。その方法は、フェニル ヒドラジン処理したマウスの肺臓細胞へのトリチウムラベルしたチミジンの取り 込みで調べる方法である（１■の精製した標準エリスロポエチンは、　７０．０ ００国際単位の活性を与えると信じられている）。 ｐＥｐｏ−５Ｖ　（１０）形質転換体を含むプールは、　ｐＭＴ−Ｅｐｏによる 形質転換体のプールに比べ、同じ条件下で、約１０倍のレベルのＥｐｏ産生じた 。しかし９両者とも低生産者であった＝０．５１０／　ｍＡ　（０，０１／ｊ　 ｇ　／　ｍｅ）　に対して８　ＩＵ／ｍＡ（０，１μｇ　／１ｎｌ）　”）。 改造された遺伝子を含むプラスミドｐＥｐｏ“−５Ｖ（１０）による形質転換細 胞のプールは、　２０８０ＩＩＪ／　ｍｌ！　（３０μｇ／−）産生じた。 ｐＥｐｏ−ＭＴで形質転換されたが、しかじカドニウム耐性で選択されていない 細胞は、　ｐＭＴ−Ｅｐｏで形質転換された細胞と同じレベルのＥｐｏを産生じ た。しかし、５μＭＣｄ　”であらかじめ選択された場合（ｈＧＨに対して第５ 節ａで記述したように）。 ５倍の発現の増加が得られた。さらに、　ｐＳＶ２−ＮＥＯに関しても。 Ｃｄ″２耐性は、良い形質転換体を選択するのに使えた。１５μｇのｐＥｐｏ− ５Ｖ（１０）および１．５　ｐ　ｇ　ｐＳＶ２−ＮＥＯと一緒ニ、ソれぞれ２μ ｇあるいは１０μｇのｐＬｉＣ９−ＭＴで処理した細胞は、　Ｃｄ”耐性クロー ンで直接選択できた。 往ＪＩＬ程 特にエリスロボエチン産生に効果的なりローンである。　Ｅｐｏ−Ｅと名付けら れたｐＥｐｏ’−５ＶＩＯ形質転換体は、　Ｅｐｏ’−５ＶＩＯプールから、９ ６ウエルプレート中でのイムノプロットによりスクリーニングし、１２の最も良 いクローンを拾い、これらクローンを１２ウエルプレートに移し、エリスロポエ チン産生を誘導し、イムノプロットで検定して９回転瓶中での増殖および誘導に より約１０，０００単位／−を産生ずるクローン４つの中から１つを拾うことに より１選択した。Ｅｐｏ−Ｅと名付けられたこのクローンを用いて、それぞれ５ ００−の培地を含む１７５０　ｒｄ回転瓶に１７１０量植えた。その細胞を４日 間増殖させ、ＰＢＳで２回洗浄し、所望タンパクの産生を誘導するため、６０μ ｈの亜鉛および３０μＨのＦｅ”を含む無血清培地を与えた。誘導の４の培養で 、　７５，０００，０００単位のエリスロボエチンが産生された。 Ｄ、５．ｆ、レニン １と二上災定 ｐＭＴ−ＰＰＲｅｎで形質転換後、　Ｇ４１８耐性で選択したＣＨＯ細胞のプー ルは、５Ｘ１０−’Ｍ硫酸亜鉛および１０−’Ｍデキサメタシンで誘導すると、 　０．０２〜０．２μｇ／ｗｉｔのレベルでレニンを産生じた。このようにして 産生されたレニンは、３５Ｓメチオニンでラベルした分泌レニンを、　ｅｎｄｏ Ｆ処理したものとしないものとで、ＳＤＳゲルで流して比較したところ、グルコ シル化されていることがわかった。 適切な選択をすると、より高いレベルのレニン産生が得られた。１つの試みは、 形質転換体のプール由来の細胞を、無血清培地に、５Ｘ１０−’Ｍ硫酸亜鉛存在 下でまき、この条件下で増殖したコロニーをひろいあげ、血清含有培地に拡げ、 そして上に述べたような標準の誘導条件でレニン産生をアッセイした。この工程 の後得られた最も高いレニン産生量を示すクローンは、平均０．８μｇ／−のレ ニン産生を示した。ＣＢＩ−２Ｂ５（前出）と名付けられた。このクラスの１つ のクローン第二の試みとしては、プールからの細胞をまき、ポリニス　−チルシ ート上にレプリカした。そしてこのレプリカシートを。 分泌された細胞タンパクが結合できるように、ニトロセルロースフィルターに対 して置いた。フィルターは、抗ブロレニ　゛ン抗血清と反応させた後　１２５１ タンパクＡで処理した。このアッセイで最も高いレニン分泌量を示すと思われる クローンをとり、血清含有培地に拡げ、標準条件下で活性を再びアッセイした。 １〜４μｇ／ｍｌ！のレニンを産生するクローンが得られ、このようなりローン の中から任意に選択した唯一のクローンＣＢＩ−ＡＡ２を、下に述べるように、 生産条件下の研究用に選んだ。 生皮工■ ＣＢＩ−ＡＡ２と名付けられたＣＨＯの形質転換細胞を、　１０１Ｒ１の完全培 地（Ｆ１２／ＤＦＩＥＦ１２１中ｌＯ％ＦＣＳおよび５００／ｄＧ４１Ｂを含む ）１００１組織培養皿での回転皿培養増殖用に、調製した。細胞は付着するまで （３０分）増殖させ、培地を除去し、そして、細胞は新しい完全培地にうえつい だ。細胞はコンフルエントな状態まで増殖させ、拡げるための標準プロトコール に従って。 トリプシンで処理した。８５０ｃｍ四方の回転皿に、ひとつのコンフルエントな フラスコからの細胞（４Ｘ１０’細胞）を１０ｍＭヘペス（ｐＨ７，２）を含む 完全培地２０ＯＳにまいた。細胞は２回転させながら３７℃で、コンフルエント になるまで増殖させた。 無血清培地でレニン産生を誘導するために１回転瓶から完全培地を吸い出し、細 胞を２００−のＤＭＥＭ２１で洗った。次に。 約１００−２００艷の無血清誘導培地（ＳＦＩＭ）を細胞に添加した。ＳＦＩＭ は、　Ｆ１２／ＤＭＥＭ２１　（１：　１　）から成り、１ｍＭヘペス、３Ｘ１ ０−’ＭＦｅＳＯ４＋　５　Ｘ　１０−　’Ｍ　ＺｎＳＯｓ　＋および１０−　 ’Ｍデキサメタシンを含んでいる一６細胞には２分泌タンパクの量で決めたサイ クルで。 ＳＦ　ＩＭを追加していった。つまり、ブラフドホードアッセイで。 約１００μｇ　／　ｙｒｌの全タンパク量が分泌されたときとした。一般に、こ のレベルの全タンパク産生は、約２日でおこった。 Ｃａ１−ＡＡ２は、ｌｐｇ／ｍｌまたは約０．５μｇ／ｍｌ／日のレニン産生を 示した。 旦り別ゑ亘転換体 ＡＬＴ−２０細胞は、上でＣＨＯ細胞でについて形質転換用の調製で述べたよう な方法で、増殖させた。ただし、５％ＣＯ２大気よりむしろ１５％ＣＯ□大気を 用いた。形質転換および６４１８耐性での良い形質転換体の選択は、ＣＨＯ細胞 で述べた方法で行った。選択された細胞は、上記のレニン産生ＣＨＯ細胞で述べ たプレートアッセイ法を使って、上澄液で、レニン産生でスクリーニングした。 ただし、血清含有培地だけを使った。 高生産系統は、レニンとプロレニンの両方を培地中に分泌した。ヒトのレニン抗 血清で沈澱し得る分泌物質の比較を第１８図に示した。第１８図は　３５３−メ チオニンでラベルした細胞上澄液の免疫沈降したタンパクのＳＯＳゲルを示して いる：トランスフェクションされていないＡｔＴ−２０，ｐＭＴ−ＰＰＲｅｎで トランスフェクションされたＡＬＴ−２０，およびこのプラスミドで形質転換し たＣＨＯ細胞。細胞は、上に述べたように、誘導後。 ３ＳＳ−メチオニンで１５時間ラベルした。培地を集め、上澄液を免疫沈降し、 　５Ｏ５−ＰＡＧＥにかけた。 レーン１は未形質転換細胞の最初の上澄液からの免疫沈降を、レーン２は形質転 換したＡＬＴ−２０細胞を、レーン３は形質転換したＣＨＯ細胞をあられす。こ れかられかるように、トランスフェクションされたＡＬＴ−２０細胞は、プロレ ニンとレニンの両方を分泌する；トランスフェクションされたＣＨＯ細胞はプロ レニン型だけを分泌する。 良い形質転換体を含む培養液を、無血清条件下で細胞が維持できるかどうかで選 択した。培養液を、　１０％ＦＣ５中で、〃コンフルエンスまで増殖させ、続い て無血清培地に移した。 培養プレートに、全部でないがほとんどの細胞が死ぬまで。 無血清培地を加えた。その後、１０％ＦＣＳを含む培地を加え。 生き残った細胞を分けた。生残細胞をとり、再びプレートし。 そして１０％ＦＣＳ上に１日おいた後再び無血清培地に移した。 ２週間生き残った細胞を、１０％ＦＣＳを含む培地上に拡げ、制限稀釈でクロー ニングし、亜鉛イオンと鉄を上記のように誘導メディエータ−として使って誘導 後、レニン産生をアッセイした。 ：ｉ！−０２＋堤シロ掩−日歌 第　１　図 第　ｒｔ　ｒｆＪ 第１３圀 ｍａｂ−ｃｄ　ｆ　Ｓ　ｈ　ｉ 第１４０ １　２３４５６７８９１０＋　１１２１３１４１５１６１７１８１９２０射１７ 劉 ＡｔＴ−２０ＣＨＯ 第１８０ 手続補正書（方式） 昭和６２年５月２６日 、、１□８う　四 １、事件の表示 ＰＣＴ／υ５８６１００２９６ ２、発明の名称 優れた哺乳動物での発現系 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４０４３マウンテン　ビュー、ベイ ショアー パークウェイ　２４５０ 名称　バイオテクノロジー　リサーチ　パートナーズ。 リミテッド 代表者　ニューマン、ジョン　エイチ。 国籍　アメリカ合衆国 ４、代理人 住所　〒５３０大阪府大阪市北区西天満６丁目１番２号５、補正命令の日付（発 送日） 昭和６２年５月１９日 ６、補正の対象 特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出願人の代表者の欄、明細 書の翻訳文、請求の範囲の翻訳文、および委任状および翻訳文 ７、補正の内容 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出願人の代表者の欄 、および委任状および翻訳文については、別紙のとおり。 タイプ印書により浄書した全頁を差し出します（内容に変更なし）。 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．望ましいコード配列に作動できるように結合させたメタロチオネインＩＩ（ ＭＴ−ＩＩ）プロモーターを含むＤＮＡ配列で形質転換された哺乳類宿主細胞を 有する，前記コード配列の制御可能発現系であって，前記哺乳類宿主細胞は無血 清培地で維持され，有効量の誘導仲介物と有効量の無毒性金属イオンとで誘導さ れる制御可能発現系。
2. ２．前記誘導仲介物が５μｇ／ｍｌ以上のヒト・トランスフェリン，または１− ３×１０−５Ｍの鉄イオンであり，そして無毒性金属イオンが２×１０−５〜２ ×１０−４Ｍの濃度範囲の亜鉛イオンである請求の範囲第１項に記載の系。
3. ３．前記ＤＮＡ配列がさらに該プロモーターに作動できるように結合したエンハ ンサーを含む請求の範囲第１項に記載の系。
4. ４．前記細胞が増幅可能な毒素耐性を荷なう遺伝子で同時に形質転換された，請 求の範囲第１項，第２項，または第３項に記載の系。
5. ５．前記毒素耐性を荷なう遺伝子がＭＴ遺伝子である請求の範囲第４項に記載の 系。
6. ６．前記コード配列が胞状表面活性タンパク（ＡＳＰ），ヒト成長ホルモン（ｈ ＧＨ），アポリボタンパクＡＩおよびＡＩＩ（ａｐｏＡＩおよびａｐｏＡＩＩ） ，心房ナトリウム排泄増加因子（ＡＮＦ），エリスロポイエチン（Ｅｐｏ），お よびレニンから成る群から選ばれたタンパクをコードする請求の範囲第１項〜第 ５項に記載の系。
7. ７．請求の範囲第１項〜第６項に記載の細胞を含むことを含有する哺乳類細胞に おいて望ましいコード配列の発現をもたらす方法。
8. ８．請求の範囲第７項に記載の方法により生産されるタンパク。
9. ９．胞状表面活性タンパク（ＡＳＰ），ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ），アポリボ タンパクＡＩおよびＡＩＩ（ａｐｏＡＩおよびａｐｏＡＩＩ），心房ナトリウム 排泄増加因子（ＡＮＦ），エリスロポイエチン（Ｅｐｏ），およびレニンからな る群から選択された請求の範囲第８項に記載のタンパク。
10. １０．約２０ｋＤタンパクが重量で約１０％，約２２ｋＤタンパクが重量で約９ ０％を含有する請求の範囲第９項に記載の該ｈＧＨ。
11. １１．プロモーターに作動可能なように結合させた前記タンパクをコードする配 列を含む第１のＤＮＡ配列で形質転換され，そしてＭＴタンパクを発現できる第 ２のＤＮＡ配列で同時に形質転換された哺乳類宿主細胞を含有する，望ましいタ ンパクの生産を増大させる発現系。
12. １２．前記形質転換細胞がカドミウムイオン耐性で選択され，該第１ＤＮＡ配列 が該コード配列に作動可能に結合したＭＴ−ＩＩプロモーターを含有する請求の 範囲第１１項に記載の発現系。
13. １３．前記細胞が無血清培地で維持され，そして有効量の無毒性金属イオンで誘 導される請求の範囲第１１項または第１２項に記載の発現系。
14. １４．前記無毒性金属イオンが２×１０−５〜２×１０−４Ｍの濃度範囲の亜鉛 イオンである請求の範囲第１３項に記載の発現系。
15. １５．約２０ｋＤタンパクが重量で約１０％，そして約２２ｋＤタンパクが重量 で約９０％を含有する，組み換えＤＮＡにより生産されるｈＧＨ標品。
16. １６．Ｎ末端がグルタミン酸のタンパクが重量で約７０％，そしてＮ末端がバリ ンのタンパクが重量で約３０％を含有する，組み換えＤＮＡにより生産されるｈ ＡＳＰ標品。