JPS62501647A - 抗体または抗原の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体または抗原の測定方法 本発明は、固相としてポリマーの粒子を使用する螢光撞たけ燐光免疫測定方法に 関する。本発明による方法は、通常の免疫測定方法のほか、血液型の検査のため にも使用しうる。

従来技術において、予じめ固相に固定した抗原または抗体に抗体ｉたは抗原を固 定すること、トレーサーで標識した抗体または抗原を使用することに基づく方法 が知られている。その様な方法は、例えばＲＩ　Ａ　（Ｒａｄｉｏｔｍｍｕ−ｎ ｏａｓｓａｙ　）及び５Ｐ−ＦＩＡ（固相螢光免疫分析法）等である。これらの 方法の全てにおいて、免疫学的反応が起こる固相表面と反応溶液は、反応溶液中 に過剰に存在するトレーサーが固相に固定された抗体寸たは抗原に存在するトレ ーサーのシグナルを遮蔽することがないように、トレーサーのシグナルを測定す る前に互いに分離されねばならない。関連するシグナルは、例えば放射能（ＲＩ Ａ）、螢光シグナル（ＦＩＡ）または酵素活性（Ｅ　Ｉ　Ａ、即ち酵素免疫測定 法）でありうる。

反応溶液からの固相の分離は、常に、現在のところ自動化が困難な操作を必要と する固相の洗浄を含んでいる。

従って、これらの操作は通常手動で行なっている。小さなポリマー粒子を使用す る場合は、操作に遠心分離寸たは磁性沈Ｎ　（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｄｅｐｏｓｉ ｔｉｏｎ　）が含１れる。

本発明の主な目的は、不便な分離操作が避けられ、細胞や他の有機起Ｄλの粒子 の表面に固定されたよう久抗体着たけ抗原について使用されるためにも適してい る抗体または抗原の測定方法を提供することである。

本発明による分析方法においては、螢光（甘たは燐光）トレーサーで処理した粒 子は、磁性材料で処理した粒子と共に、抗原−抗体結合により抗体（または抗原 ）上に固定される。粒子を固定した後、細胞並びにそれに付けられた磁性及び螢 光性粒子を磁場により反応層から分離層に引き寄せ、分離層またけ反応層からの 螢光を測定する。螢光は励起光が螢光粒子に当てられた時にのみ発する。磁性粒 子は単独ではほとんど螢光を発しない。抗体が、関連する抗原で覆われたポリマ ー粒子で標識されていない場合、磁性粒子のみが分か層に到達し、螢光非磁性粒 子及び非標識細胞は分離層の後方に残る。

該方法は直接的方法として、及び非直接的方法としての両方に使用するのに適し ている。そのために、細胞側から、及び血清側からの両方から血液型の検査を行 なうことができる。血清側からの検査は非直接的方法として行なわれる。

本発明による方法は、溶液が容器から除去される必要がないため、且つ分離洗浄 が実施される必要がないため容易に実施できる。

本発明のいくつかの好ましい実施態様は添付された略図１ないし１０により説明 されるであろう。

第１図ないし第４図は溶解された抗体の測定を説明し、第５図ないし第８図は細 胞の表面に固定された抗原の測定を説明し、そして第９図及び第１０図はいくつ かの抗体を同時に測定する方法を示す。

第１図ないし第４図は溶解された抗体の測定方法を示す。

測定容器中に、２つの液層、反応層１及びいわゆる分離層２がある（第１図）。

反応層１の中には、測定すべき抗体３が溶解した状態で存在する。さらに、反応 層１中には、抗体３の抗原４で覆われたポリマー粒子が存在し、そのポリマー粒 子のうち粒子５は磁性材料を含み、粒子６は螢光トレーサーを含む。ポリマー粒 子はある適当な材料でできた真珠状の粒であり、その大きさはｌ１１１ないし１ ０μ？ｎである。

分離層２は容器中の反応層１の下方に入れられる。これは反応層１より前に容器 中に入れるか、または後から反応層の下方に入れられる。

分離液２は好ましくは、反応溶液１より高密度であり、反応溶液中の螢光が測定 中に検出されるのを防ぐような色である。適する反応溶液は、例えばサッカロー ス溶液（ｍ度は典型的に１０ないし６０チ）及びフィコール−パーク（Ｆｉｃｏ ｌｌ　−Ｐａｑｕｅ　）密度勾配遠心溶液等である。分離溶液が自然の状態では 適する色でない場合は、螢光の励起光もしくは発光の波長またはその両方の波長 の光を強く吸収する着色剤を添加することにより適当な色を得る。特に黒色が適 する色である。

反応層及びサンプル層を測定容器に量り入れた後、続いて慣用のインキュページ ｍｙ段階（１ｎｃｕｂａｔｔｏｎ　ｓｔａｇｅ　）を行ない、そこで免疫反応が おこる（第２図）。これにより、測定すべき抗体５が磁性粒子５及び螢光粒子６ の表面に置かれた抗原４の両方に結合する。これにより、抗体５は磁場により移 動されること及び螢光により測定されることの両方が可能になる。サンプル中に 抗体３がない場合、磁性粒子５のみが磁場により移動しうる。

反応が完結した後、磁場７により、磁性粒子５は分離層２を通して測定容器の底 に引き寄せられる（第３図）。

抗体３の介在により磁性粒子と結合した螢光粒子６もこれらについて行く。それ と同時に分離層２は物理化学的洗浄層としても作用する。本方法で使用される螢 光計中には、特別な磁性分離装置が設けられている。測定すべき抗体３がサンプ ル中に多く存在する程、容器の底にはより多くの螢光トレーサーで覆われた粒子 ６が存在する。

測定は、励起光８を６１１］定容器の底プで壁を通して通り抜けさせ、発光９も 同じルートを通って検出のために集めるようにして行なわれる（第４図）。

本発明においては、着色された分離層２が反応層１の螢光の検出を妨げるための 光遮蔽層として作用する。これにより、放射された螢光は反応層１から検出器系 へ接近することはなく、容器の底に置かれた螢光粒子のみが検出される。

第５図ないし第８図は、細胞の表面に固定された抗原を測定する場合を説明する 。

この場合、測定容器中には同様に、上方の反応層１と、下方の分離層２とがある 。反応ＪＶ１１には、表面に抗原１１を有するね１胞１０がある。さらに、反応 １弗には、該抗原の抗体１２で積われたポリマー粒子が存在し、該ポリマー粒子 のいくつかＰま磁性粒子５であり、いくつかは螢光粒子６である。

投与段階（第５Ｍ）の後、インキーベーション段階（第６図）があり、分離段階 （第７図）、及び測定段階（第８図）があり、これらは上記の、反応溶液中に抗 体が溶解した状態で存在する場合に対応する方法により行なわれる。

この方法は、例えば下記に示すように血液型検査に適用しうる。

調べるべき血液細胞の中に、公知の抗体で羨われた磁性及び螢光粒子を測り入れ る。（各々のタイプの粒子の表面には同じ抗体がある。）測定容器Ａ中に、抗Ａ 抗体で梼われだ磁性及び螢光粒子が存在し、測定容器Ｂ中に、抗Ｂ抗体で株われ た磁性及び螢光粒子が存在すると思われる。インギュペーシ舊ンにより、陽性の 場合には、磁性及び螢光の両方のタイプの粒子が同じ細胞につく。陰性の場合に は、細胞表面にはどのタイプの粒子もつかず、従って、磁性粒子のみが磁場に応 答する。磁性粒子及び標識細胞は、存在する場合には測定容器の底に向かって引 き寄せられる。螢光が測定容器の底から測定される場合には、血液細胞の表面に ついた螢光粒子のみが認められる。反応容器Ａのみが陽性のシグナルを示しだ場 合、細胞側からの血液型はＡであり、反応容器Ｂのみが陽性のシグナルを与えた 場合、細胞側からのＩＩＩ液型はＢ型である。両方の反応容器が陽性のシグナル を示した場合、細胞側からの血液型はＡＢ型である。反応容器の両方が陰性のシ グナルを示した場合、細胞側からの血液型はＯ型である。

これに対応して、血清側７＼らの血液型の検査は、公知の対照細胞（Ａ及びＢ細 胞）に基づいて調べるべき血清サンプル並びに対応する磁性抗Ａ粒子及び抗Ｂ粒 子を加、ｔてインキュベージ舊ンすることにより実施される。反応容器Ａ中、抗 Ａ粒子の接着が妨けられており、シグナルが陰性である場合、血清中に抗Ａ抗体 が存在し、これが競合に基づいて作用し、抗Ａ粒子の接着を妨げている。

反応が、反応容器Ｂ中の抗Ｂ粒子の存在について陽性である場合、血清側からの 血液型はＢである。他方、反応容器Ａ内に陽性のシグナルがあるが、反応容器Ｂ 内には陰性のシグナルがある場合、血清側からの血液型はＡである。反応容器Ａ 内及び反応容器Ｂ内の両方でシグナルが陽性である場合、血清側からの血液型は ＡＢである。

また、両方の反応容器でシグナルが陰性である場合、血液型はＯ型である。

当然ながら、該方法においては、全ての公知の血液細胞及び血清のタイプをそれ らの副群とともに使用することができる。プログラム技術としては、血液型分析 において確実な上限及び下限を考慮することができる。さらに、血清側からの血 液型は、粒子を対応する市販品としても得られる血液細胞抗原で覆うことにより 調べることができる。抗体の決定において、赤血球の抗原で株われた粒子を使用 する場合は、試験細胞は全く必要ではない。

細胞を使用する場合、抑制により、例えば人の分泌能を確定することができる。

この方法けまた、同じ反応容器中で、同じ抗原で徨われた磁性及び螢光粒子を使 用することにより、競合を利用して行なうこともできる。対応する抗体（ＩｇＭ クラス）が血清中にある場合には、螢光粒子は、抗体により結合した磁性粒子の 作用により沈殿する。

該方法において、Ｒｈ因子ｆ′ｉｍべるべき細胞を抗り血清と共にインキュベー トし、それによって抗体を赤血球の表面に接着することにより確証しうる。関連 する抗体はＩｇＧ型であり、抗ヒトＩｇＧにより検出しうる。抗体は螢光粒子に 付けられていてもよく、または、螢光抱合体として存在していてもよい。その方 法を下記に示す。赤血球細胞を抗り血清中でインキュベートした後、抗ヒト赤血 球抗体で傍われた磁性粒子を、感作赤血球細胞の中に加え、インキュベート時間 の後、赤血球細胞を引き降ろす。ここで、磁場を一定に保ちながら、測定容器か ら過剰の血清及び未付着の粒子を吸い出すことが可能である。

磁場を解除すると、細胞は適当な媒体中で洗浄することができ、そして最終的に 、磁場により細胞を沈殿させる。

洗浄した感作細胞の中に、抗ヒ）　ＩｇＧで〜われだ螢光粒子を添却するのが可 能になり、そして細胞と粒子の混合物の下方に、高密度で、有色で適当な分離物 質を加えることが可能になる。インキュベートが完了したら、磁場により細胞を 再び引き降ろし、それにより螢光の検出が可能になる。当然ながら、螢光粒子の 前に着色高密度物質を加えることもでき、その場合は螢光汚染の危険は減少する 。螢光粒子の代わりに螢光抗ヒ）　ＩｇＧ抱合体を使用してもよい。Ｒｈ−陽性 細胞を標識するための１つの方法は、細胞を抗りにより感作することである。こ れにより、細胞は磁性抗ヒト−赤血球粒子により非常に大量の抗ヒト１ｇＧで榎 われた螢光粒子！たけ螢光抗ヒトＩｇＧ抱合体が存在する第１の分離物質層中に 引っ張られる。磁力による吸引はインキュページ四ン時間の間にこの層で　“止 まり、インキュページ菖ンの完了時に細胞はもう１つの高密度着色層を通して測 定容器の底に引っ張られ、螢光が検出される。

これに関連する技術は、抗体のスクリーニング及びクロステストにも利用できる 。第９図は全ての抗体の抗原が一槙の磁性粒子の表面に付けれている場合のいく つかの抗体の同時の測定方法を説明する。

反応溶液中には磁性粒子１２と、それらの各表面に付けられた抗原４．４′及び ４“が存在する。さらに、反応溶液中には、表面に４．４’４たＶ′ｉ４“の１ 棟の抗原のみが存在し、その各々にそれ自体の特徴的な螢光トレーサーを備えて いる螢光粒子６．６′及び６“が存在する。

インキュページ目ン及び分離段階を行なった後、測定を、各螢光粒子６．６’、 　６“に特有の励起波長またけ発光波長を用いて行なう。この方法により、所望 の抗体３，３′及び３“を測定することができる。

第１０図は、各抗体の抗原が、それ自体の粒子のグループの粒子の表面に付いて いる場合の、いくつかの抗体の同時測定方法を説明する。

反応溶液中には、粒子の表面に、それぞれ４．４’−ｊたは４“のうちの１つの 抗原を付けた磁性粒子５．５′及び５“が存在する。溶液中には、各々それ自体 の典型的なトレーサーを備えた螢光粒子６，６′及び６“も存在する。

インキユベーシヨン及び分離段階の後、抗体５．５′及び３“を測定するために 各々の関連波長で螢光測定を行なう。

上記の方法は、当然ながら燐光を使用して行なう場合にも適用できる。

該方法において、固相には抗原と全く同様に抗体が存在していてもよい。

所望によル、分離層は反応層の上にあってもよい。その場合、測定はより不便に なるが、これによって容器壁より起こされるパックグラウンド螢光を避けること ができる。所望により、インキユベーシヨンの後で容器内に分離層を形成させて もよい。

当然ながら、所望によっては６１す定を反応層から行なってもよい。

国際調査報告 １□１７．１−１ＡＢｌｌｅ＋１ｌｅｓ　）Ｉａ、　ＦＣＴ／　Ｆｌ、８６／　 ｏｏｏｔｉ＋

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．測定容器中の層（１）または反応溶液中に、各粒子の各々の表面に測定すべ き抗体の抗原が設けられている、螢光または燐光トレーサーを含む粒子（６）並 びに磁性粒子（５）を添加すること；測定容器中の反応層の下方または上方に、 反応層と混合されない分離溶液層を形成すること；免疫反応の後、抗体を仲立ち として螢光または燐光粒子と結合された磁性粒子を磁場により分離層内に引き寄 せること；並びに螢光または燐光粒子を分離層から、または反応層から螢光定量 法的に、または燐光定量法的に測定することを特徴とする、免疫反応により試料 から抗体または抗原を測定するための螢光分析法または燐光分析法。
2. ２．測定容器中に、反応層（１）より高密度の分離層（２）が反応層（１）の下 方に形成され、そして螢光または燐光を分離層から測定容器の壁を通して測定す ることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．測定容器中に、トレーサーの螢光または燐光の励起または発光波長を強く吸 収する分離層（２）が形成され、磁性粒子（５）が反応層（１）から分離層（２ ）を通って分離層の反対側の端に引き寄せられることを特徴とする請求の範囲第 １項記載の方法。
4. ４．トレーサーの励起波長と発光波長の両方を強力に吸収する分離層（２）が形 成されていることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．黒色の分離層（２）が形成されていることを特徴とする請求の範囲第４項記 載の方法。
6. ６．螢光または燐光トレーサーを含む粒子（６，６′６，′′）を試料に添加し 、各粒子の表面が測定すべき抗体（３，３，′３′′）のうちの１つの抗原（４ ，４，′４′′）で覆われ、各粒子がそれ特有のトレーサーを有すること、並び に各磁性粒子の表面が測定すべき抗体のうちの１つの抗原で覆われた磁性粒子（ ５，５′，５′′）を試料に添加すること、並びに螢光粒子の各々がその特有の 波長において別々に測定されることを特徴とする、１つの試料からいくつかの抗 体を測定するための請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．螢光トレーサーを含む粒子（６．６′，６′′）を試料に添加し、各粒子の 表面が測定すべき抗体（３，３′，３′′）のうちの１つの抗原（４，４′，４ ′′）で覆われており、該粒子の各々がそれ特有のトレーサーを有すること、並 びに磁性粒子（１２）を試料に添加し、磁性粒子の各々の表面が測定すべき抗体 の全ての抗原で覆われていること、並びに螢光粒子の各々をその特有の波長にお いて別々に測定することを特徴とする、１つの試料からいくつかの抗体を測定す るための請求の範囲第１項記載の方法。