JPS6237615B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は呼吸器疾患治療剤、さらに詳しくは尿
中トリプシン阻害物質および／または尿中トリプ
シン阻害物質分解物を有効成分とする呼吸器疾患
治療剤に関する。 肺炎、気管支喘息、気管支炎、気管支の慢性狭
搾、気管支拡張症などの呼吸器疾患において、終
末細気管支以下の異常拡張を特徴とする、いわゆ
る肺気腫がしばしば観察される。臨床的には肺気
腫は咳、痰、呼吸困難などの自覚症状を伴い、感
染などの合併により、呼吸不全や肺性心へと増悪
することも稀ではない。 肺気腫が血清α_１−アンチトリプシン欠損症に
合併すること〔ローレルら（Laurell et al.）、ス
カンジナビア ジヤーナル オブ クリニカル
アンド ラボラトリー インベステイゲーシヨン
（Scandinav.J.Clin.Lab.Invest.）15巻、132頁
（1963年）〕より、肺気腫の発症機序について、エ
リクソン（Eriksson）は白血球や肺胞マクロフ
アージあるいは微生物に起因する局所または流血
中の蛋白質分解酵素の阻害物質であるα_１−アン
チトリプシン（α₁AT）の減少による肺組織の自
己融解説を提唱している〔アクタ メデイカ ス
カンジナビカ（Acta Medica Scandinavica）175
巻、197頁（1964年）〕。しかし、マルトラナ
（Martorana）らはパパイン噴霧によるハムスタ
ーの実験的肺気腫において、α₁ATを静注しても
血清中抗トリプシン活性は有意に上昇するにもか
かわらず、肺気腫を予防し得ないことを報告して
いる〔アメリカン レビユー オブ レスピレイ
トリー デイズイーズ（Am.Rev.Respir.Dis.）
113巻、607頁（1976年）〕。また、肺気腫患者の血
清α₁ATは必ずしも低値を示さないことや、プロ
ゲステロンは肺気腫を予防するがα₁ATの活性上
昇を引き起こさないことなどから、血清α₁ATと
肺気腫との関連性については不明な点が多いとす
る報告〔原田進ら、内科32巻、845頁（1973年）〕
も数多く見られる。 一方、尿中トリプシン阻害物質（以下、UTIと
略す）はトリプシンのみならず、各種の組織障害
性酵素を広範囲に阻害し、また、癌や感染症など
の慢性炎症疾患時にその排泄量が増加することが
知られている。 本発明者らは、肺気腫の発症がエリクソン
（Erikkson）らの主張するように、炎症局所で活
性化された組織障害性酵素による自己融解による
ものであるなら、肺気腫の発症あるいは病状進行
にUTIが何らかの関連をもつている可能性がある
と考え、肺気腫の予防および治療にUIIが有用で
あると推測した。 一方、本発明者らは先にUTIが抗インフルエン
ザウイルス作用を有することを見出し、該UTIを
有効成分とする医薬組成物の発明を完成した。従
つて、UTIは単に肺気腫の治療に有効であるばか
りでなく、その発症の誘因となり得るウイルスや
細菌による呼吸器感染症に対しても効果を有し、
諸種の呼吸器疾患を多面的に改善し得るものと期
待される。 この様な背景に鑑み、本発明者らはUTIの各種
呼吸器疾患に対する効果について検索を重ねた結
果、後述の実験例に示す通り、肺気腫、肺炎およ
び肺線維症に対し、UTIが優れた効果を示すこと
を見出した。しかし、UTIは分子量17000〜70000
の糖蛋白質であり、ヒト以外の動物に由来する
UTIはヒトに対して抗原性を有するため、実質上
ヒトに使用し得なかつた。一方、本発明者らは先
にUTIを蛋白質分解酵素で分解することにより、
トリプシン阻害作用並びに抗インフルエンザ作用
を有し、ヒトに対する抗原性のないペプチドが得
られることを見出していることから、このUTI分
解物がUTIと同様の効果を有するか否かについて
も検討した。その結果、後述の実験例に示す通
り、UTI分解物が肺炎、肺気腫および肺線維症に
対し、UTIと同等乃至それ以上の効果を示すこと
を見出し、本発明を完成した。 本発明の治療剤の有効成分であるUTIは哺乳動
物の尿中に広く存在する物質であり、由来する動
物の種類によつてその性状が若干異なることが知
られている〔カールソンら（Carlsson et al.）、
エンザイム（Enzyme）18巻、176頁（1974
年）〕。ヒトUTIは分子量17000−70000の分布を示
し、いずれもトリプシン阻害活性を有する〔プロ
クシエら（Proksch et al.）、ジヤーナル オブ
ラボラトリー アンド クリニカル メデイシ
ン（J.Lab.Clin.Med.）79巻、491頁（1972年）〕
とされ、たとえば、須見らの方法〔ジヤーナル
オブ バイオケミストリー（J.Biochem）83巻、
141頁（1978年）〕により得ることができる。 すなわち、ヒト尿を濃縮し、アルギニン−セフ
アロースカラムを通過させ、0.2M塩化ナトリウ
ムを含む２％アンモニア水で溶出する。ついで、
常法により、セフアデツクスＧ−200カラムに
て、ゲルクロマトグラフイーを実施し、トリプシ
ン阻害物質画分を得る。このようにして精製され
た尿中トリプシン阻害物質は分子量約67000、等
電点２〜３であり、５〜12％の中性糖鎖を含む酸
性糖蛋白質である。 一方、UTI分解物はUTIを蛋白質分解酵素によ
つて分解した後、イオン交換クロマトグラフイ
ー、ゲル過等の一般的な生化学的精製方法を用
いる取得することができる。 UTI分解物の原料としては哺乳動物由来のUTI
はすべて使用しうるが、ヒト由来のものが最も好
ましいことはいうまでもない。 UTIの蛋白質分解酵素による分解は通常、蛋白
質を分解する場合に用いられる一般的方法により
行なう。すなわち、適当な緩衝液に溶解したUTI
に蛋白質分解酵素、例えばパパイン溶液を加えて
37℃前後で10〜60分間反反応させた後、ゲル
過、イオン交換クロマトグラフイー等により精製
して、分子量6000〜9000の画分を得る。この際、
反応混液を凍結乾燥等によつて一且濃縮し、その
後に精製工程を行なうと精製効果が高まるのでよ
り好ましい。なお、得られたUTI分解物を再度、
別の蛋白質分解酵素、例えばペプシン等で処理す
ることにより、更に作用の強い画分を得ることが
できる。 UTIを分解するのに用いる蛋白質分解酵素とし
ては各種の蛋白質分解酵素、例えばパパイン、ペ
プシン、トリプシン、α−キモトリプシン等を使
用することができるが、特にパパイン又はペプシ
ンを用いるのが好ましい。又、これらの酵素は溶
液状態で使用する他、いわゆる固定化酵素として
用いることもできる。 このようにして得た本発明のUTI分解物は分子
量6000〜9000、等電点8.5〜10、極大吸収
278nm、ニンヒドリン反応陽性、窒素含量15〜17
％の性状を有し、水に易溶、エーテルクロロホル
ム、エタノールに不溶である。 次に、本発明のUTIおよび／またはUTI分解物
の有効性および毒性について実験例によつて説明
する。 実験例 １ 肺気腫抑制作用（静脈内投与） マルトラナらの方法、〔マルトラナら
（Martorana et al）、カナデイアン ジヤーナル
オブ フイジオロジー アンド フアーマコロ
ジー（Can.J.Physiol.Pharmacol.）51巻、635頁
（1973年）〕に従い、体重約70ｇの雄性ゴールデン
ハムスターを１群10匹とし、UTI12mg／Kg、UTI
分解物1.2mg／Kgあるいはα₁AT300mg／Kgをおの
おの静脈内投与した。ついで３％パパイン溶液70
mlを３時間にわたり噴霧吸入させ肺気腫を惹起さ
せた。１週間後肺を摘出し、スペシフイツク ス
タテイツク コンプライアンス（Specific Static
Compliance、SSCと略す）、スペシフイツク ル
ング ボリユーム アト フル インフレーシヨ
ン（Specific Lung Volume at Full Inflation、
SVIと略す）、トータル デフレーシヨン タイ
ム（Total Deflation Time、TDTと略す）およ
び脆弱率を測定した。SSCはΔＶ／５×Ｗで表わし、 （ここに、ΔＶは気管より肺に空気を入れた際、
圧を５cmH₂Oから０cmH₂Oに変化させたときの肺
体積の変化、Ｗは肺湿重量を示す）SVIはＰ／Ｗ （ml／ｇ）で表わし、（ここに、Ｐは20cmH₂Oの圧
で気管より肺に空気を入れたときにおける肺体
積、Ｗは肺湿重量を示す）TDTは20cmH₂Oの圧
力で膨張させた肺が、圧を抜いた時に完全に収縮
するまでの時間（秒）を表わし、脆弱率は20cm
H₂Oの圧力を肺にかけた際の肺の損傷率を表わ
す。結果を第１表に示す。 UTIおよびUTI分解物は肺気腫抑制作用を示し
たが、α₁ATは何ら作用を示さなかつた。

【表】

【表】 実験例 ２ 肺気腫抑制作用（吸入） 体重約70ｇの雄性ゴールデンハムスターを１群
10匹とし、ペントバルビタールナトリウム麻酔下
で体重100ｇ当り１mgのパパインを気管内に注入
した。麻酔がさめた後、20mg／mlに調製したUTI
あるいは２mg／mlに調製したUTI分解物、各10ml
を40分間にわたり噴霧し吸入させた。１週間後に
肺を取り出し、実験例１と同様にSSC、SVI、
TDT、脆弱率を測定した。結果を第２表に示
す。 UTIおよびUTI分解物は有意な肺気腫抑制作用
を示した。

【表】 実験例 ３ 肺炎抑制作用(1) １群７羽とした体重2.6±0.2Kgの白色在来種雄
性家兎の気管内にチユーブを留置し、チユーブを
介して0.1N塩酸を１ml／Kg／dayの割合で３日間
気管内投与して嚥下性肺炎を作成した。この様に
して作成した嚥下性肺炎動物に対し、UTI12mg／
Kg、UTI分解物1.2mg／KgあるいはUTIとUTI分
解物を10：１の比率で含む混合物6.6mg／Kgを塩
酸投与期間中の３日間は塩酸投与前に、さらに４
日目、５日目の合計５日間気管内に投与し、試験
開始後10日目までの死亡率を対照群と比較した。
結果を第３表に示す。UTIあるいはUTI分解物の
投与により、嚥下性肺炎による死亡率が減少し
た。また両者の混合物を投与しても嚥下性肺炎に
よる死亡率が減少した。

【表】 実験例 ４ 肺炎抑制作用(2) １群７羽とした体重2.6±0.2Kgの白色在来種雄
性家兎に0.1N塩酸１ml／Kg／dayをネラトンカテ
ーテルを用いて非麻酔下で気管内に投与した。さ
らに翌日よりネブライザーを用いて0.1N塩酸を
１日２回、10分間ずつ３日間にわたつて吸入させ
嚥下性肺炎を作成した、この様にして作成した嚥
下性肺炎動物に対し、UTI12mg／KgあるいはUTI
分解物1.2mg／Kgを塩酸投与期間中の４日間は塩
酸投与前に気管内に投与した。試験開始後５日目
に頚動脈を切断して放血死せしめて開胸し、肺動
脈から大量の生理食塩水を一定圧下に潅流し、肺
内の血液を除去した。次いで肺を摘出し、肺１ｇ
当り９mlの生理食塩水を加えてホモジナイズし、
得られたホモジネートを用いリン脂質の定量を行
つた。また、肺表面活性物質の指標として肺ホモ
ジネートを3000rpm、10分間遠心分離し、上清を
生理食塩水で希釈し、その１mlに95％エタノール
１mlを加えて15秒間撹拌し、15分後に気体−液体
界面に存在する安定な小気胞の有無を観察した。
多くの気胞が試験管壁に沿い環をつくれば陽性と
し、表面活性を陽性となる最大希釈率として表わ
した。結果を第４表に示した。 UTIおよびUTI分解物は有意な嚥下性肺炎抑制
作用を示した。

【表】

【表】 実験例 ５ 肺線維症抑制作用 今野の方法〔肺と心 21巻、31頁（1974年）〕
に準じ、体重20Kgのdd系雄性マウスを１群10匹
とし、ブレオマイシン10mg／Kgを10日間腹腔内投
与した。UTI12mg／KgまたはUTI分解物1.2mg／
Kgを１日１回連日静注した。ブレオマイシン投与
４週後、林の方法〔抗研誌 24巻、253頁（1972
年）〕に準じ、肺中コラーゲンへの ¹⁴C−ハイド
ロキシプロリンの取り込みを指標として、コラー
ゲン量を測定した。結果を第５表に示す。 UTIおよびUTI分解物はコラーゲン量を減少さ
せた。

【表】 実験例 ６ 急性毒性 体重約20ｇのddy系マウスを１群10匹とし、
UTI、UTI分解物あるいはUTIとUTI分解物を
10：１の比率で含む混合物、おのおの２ｇ／Kgを
生理食塩水溶液として静脈内または腹腔内に注射
し、１週間にわたつて症状を観察した。観察期間
中の体重変化は生理食塩水投与群のそれと同様で
あり、また死亡例も認められなかつた。また１週
間経過後の剖検所見にも何ら異常は認められなか
つた。 以上の実験例から明らかなように、UTIおよ
び／またはUTI分解物は肺気腫、肺炎あるいは肺
線維症を顕著に抑制し、しかも、これらの作用を
発現する用量は急性毒性の結果から充分安全な用
量である。従つて、UTIおよび／またはUTI分解
物は肺気腫、肺炎、肺線維症をはじめとする各種
呼吸器疾患の予防および治療に極めて有用な薬物
となり得るものである。 UTIおよび／またはUTI分解物の成人の治療量
は１日当り１〜1000mgであるが、症状あるいは用
法に応じて適宜増減することができる。 UTIおよび／またはUTI分解物は通常、注射剤
あるいは吸入剤として投与されるが、経口投与剤
又は直腸用剤として用いることもできる。注射剤
及び吸入剤としては用時溶解して用いる凍結乾燥
製剤、経口投与剤としてはカプセル剤、錠剤、顆
粒剤、散剤あるいは経口用液体製剤、直腸用剤と
しては直腸用坐剤とするのが適当である。これら
の製剤を調整するにあたつては、慣用の製薬用担
体あるいは賦形剤等とともに慣用の方法を使用す
ることができる。 以下に本治療剤の製剤を実施例として示すが、
製剤はこれのみに限定されるものではない。 実施例 １ 凍結乾燥注射剤 ヒトUTI4ｇを200mlの生理食塩水に溶解し、メ
ンブランフイルターを用いて無菌的に過する。
液を滅菌したガラス容器に10mlずつ充填して凍
結乾燥し、これを密栓して凍結乾燥粉末製剤とす
る。 実施例 ２ 凍結乾燥吸入剤 0.015Mリン酸緩衝液（PH7.2）150mlに溶解し
たヒトUTI2ｇに、パパイン７ｇを添加し、37℃
で30分間放置後凍結乾燥する。凍結乾燥粉末を
0.154M塩化ナトリウム溶液52mlに溶解し、同溶
液で平衡化したセフアデツクスＧ−100のカラム
（10×83cm）でゲル過し、分子量7000〜9000の
画分を集める。得られた画分をローリーら
（Lowry et al.）の方法〔ジヤーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）
193巻265頁（1951年）〕により、牛血清アルブミ
ンを標準蛋白質として蛋白質量を測定し、10mg／
mlとなるよう生理食塩水を加えて調整する。これ
を、メンブランフイルターで除菌過したのち、
10mlずつガラス容器に分注して凍結乾燥した後密
栓して、凍結乾燥吸入剤とする。 実施例 ３ 注射用液剤 実施例２の方法で得た分子量7000〜9000の画分
１ｇにペプシン20mgを加えて37℃で10分間放置し
たのち、4N水酸化ナトリウム溶液を加えてPH８
に調製後凍結乾燥する。凍結乾燥粉末を50mlの水
に溶解後0.02Mリン酸緩衝液（PH8.0）で平衡化
したセフアデツクスＧ−25のカラム（５×50cm）
を通過させて緩衝液を置換したのち、同緩衝液で
平衡化したCM−セフアロースのカラム（2.6×15
cm）に吸着させた。次いで、0.2M塩化ナトリウ
ムを含む同緩衝液を用いて直線濃度勾配法により
溶出し、分子量6000〜7000の画分を集めた。この
画分を実施例２と同様にして蛋白質量を測定し、
10mg／mlとなるよう生理食塩水で調整したのちメ
ンブランフイルターで除菌過し、液を５mlず
つガラス容器に分注密栓して注射用液剤とする。 実施例 ４ 注射用液剤 実施例３の方法で得た分子量6000〜7000のUTI
分解物１ｇおよびヒトUTI10ｇを1100mlの生理食
塩水に溶解し、これをメンブランフイルターで除
菌過したのち５mlずつガラス容器に分注密栓し
て注射用液剤とする。 実施例 ５ 錠 剤 ヒトUTI ４ ｇ 乳糖 3.2ｇ ポテト澱粉 1.5ｇ ポリビニールアルコール 0.15ｇ ステアリン酸マグネシウム 0.15ｇ 上記成分をそれぞれ秤量し、ヒトUTI、乳糖お
よびポテト澱粉を均一に混合する。この混合物に
ポリビニールアルコールの水溶液を加え、湿式・
顆粒造粒法により顆粒を調整する。この顆粒を乾
燥し、ステアリン酸マグネシウムを混合した後、
圧縮打錠して重量100mgの錠剤とする。 実施例 ６ 経口用液体製剤 ブタUTI〔カールソンら（Carlsson et al.）、
エンザイム（Enzyme）18巻、176頁（1974年）〕
５ｇを0.015Mリン酸緩衝液（PH7.2）400mlに溶
解し、これにパパイン15ｇを添加し、37℃で30分
間放置凍結乾燥する。凍結乾燥粉を0.154M塩化
ナトリウム溶液250mlに溶解し、同溶液で平衡化
したセフアデツクスＧ−100カラム（14×90cm）
でゲル過し、分子量7000〜9000の画分を集め
る。得られた画分を前記のローリーらの方法によ
り蛋白質量を測定して、100mg／mlとなるよう調
整する。これをメンブランフイルターで除菌過
した後、単シロツプを加えて経口用液体製剤とす
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 尿中トリプシン阻害物質および／または尿中
   トリプシン阻害物質分解物を有効成分とする呼吸
   器疾患治療剤。 ２ 尿中トリプシン阻害物質がヒト由来である特
   許請求の範囲第１項記載の治療剤。 ３ 治療対象の疾患が肺気腫、肺炎および肺線維
   症からなる群から選ばれた１または２以上の疾患
   である特許請求の範囲第１項記載の治療剤。