JPS62244392A

JPS62244392A - ハイブリド−マを用いて抗体を産生する方法

Info

Publication number: JPS62244392A
Application number: JP61085142A
Authority: JP
Inventors: Yoji Niimoto; 洋士新本; Shunichi Dosemari; 俊一堂迫; Hironori Murakami; 浩紀村上
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1986-04-15
Filing date: 1986-04-15
Publication date: 1987-10-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】主栗上傅剋朋分立本発明は、複数の抗原特異性を有していて臨床検査及び
治療上有効に利用し得る、いわゆる多価抗体をハイブリ
ドーマを用いて産生ずる方法に関する。

鴛メヱυ克避本来、抗体分子の構造は、２本の重１）（Ｈ鎖）と２本
の軽鎖（Ｌ鎖）からなる４本のポリペプチドを単位とし
て単量体型抗体を形成しており、そして抗体の抗原に対
する特異性はＨｔｆｆとＬ鎖のアミノ末端側の可変領域
の組合わせにより規定されるＣ　Ｔｏｎｅｇａｗａ、　
ｒネーチャーＪ　（Ｎａｔｕｒｅ）　３０２．５７５（
１９８３）　）。また、Ｌ鎖はカッパー（に）　１３！
ｉとラムダ（λ）　Ｉｍがあり、Ｈ鎖にはアルファー（
α）鎖、ガンマ−（γ）鎖及びミュー（μ）Ｍがあり、
抗体のクラスはＨｕｆｆの種類によって分類され、α鎖
、重鎖及びμ鎖を含む抗体は、それぞれＩｇＡ、■ｇＧ
及びｒｇＭと称せられている〔河合、「日本臨床」川、
増刊、１５４（１９８４）　）。

近年、インビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でモノクローン
抗体を産生ずる技術は、Ｋｉ；ｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ　（ネーチャー（Ｎａ　ｔｕｒｅ）、２５６−１４
９５（１９７５）　）の細胞融合によるマウス雑種細胞
株（ハイブリドーマ）作成方法の確立によって急速に進
歩し、ヒト型ハイブリドーマも作成されるに至っていて
、臨床応用の可能性が高まっている〔埋込「組織培養」
副、４９０（１９８３）　）。

また、ヒトモノクローン抗体産生株を得る方法としては
、ヒト悪性腫瘍株とヒト正常リンパ球を細胞融合させて
ハイブリドーマを作成する方法と、ヒト正常リンパ球を
ヘルペスウィルスの一種であるエプスタイン−バール・
ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｖｉｒｕｓｓ　ＥＢ
Ｖ）によって形質転換させる方法とがある（Ｋｏｚｂｏ
ｒ　ａｎｄ　Ｒｏｄｅｒ　ｒイミュノロジイ・ターディ
Ｊ　（Ｉｎ＋ｍｕｒｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ）、」、７
２（１９８３））。

しかし、このようにして作成されたモノクローン抗体を
実際に臨床検査や治療に用いる場合には、モノクローン
であるため従来から用いられている免疫抗血清のような
抗体混合物の持つ有効性を発揮し得ない欠点がある。す
なわち、上記抗血・清を用いた場合には抗原物質につい
て多種の抗原決定基を認識して、それを凝集したり、沈
澱させることができるが、モノクローン抗体は、高い特
異性と一定の品質の維持が可能である利点を有する反面
、−個の抗原決定基しか認識できないという特性の故に
、その応用、範囲が限られるという欠点もある。

このようなことから、複数のモノクローン抗体を混合し
て使用することが考慮されるけれども、それには多数の
細胞培養設備を必要とするので実用性に乏しい。

１）が　ンしようとする課本発明は、上述したような状況に鑑みなされたものであ
って、抗体中に複数の種類のＨ鎖とＬ鎖を有するような
抗体を産生ずる細胞株を作成し、抗原物質の多種の抗原
決定基を認識し得る複数の抗原特異性を有する抗体を産
生ずる方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、ヒト抗体生産性細胞株とヒト正常リンパ
球あるいは他の抗体生産性細胞株を細胞融合することに
より、異種のＨ鎖とＬ鎖を有する抗体分子を産生ずるハ
イブリドーマを作成することに成功し、本発明をなすに
至った。

以下本発明の詳細な説明する。

又里立檀底本発明の特徴は、２種類の抗体産生細胞（リンパ球）を
細胞融合させてハイブリドーマを作成し、このハイブリ
ドーマを培地中で培養することにより、複数の重鎖（Ｈ
鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）を有する抗体を産生ずることにある
。

課　をｌするための手。

本発明において用いる抗体産生細胞は、ヒト骨髄腫細胞
（Ｍｙｅｌｏｍａ）、ヒｌ−Ｂリンパ芽球様細胞（Ｂ−
Ｌｙｗｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ　ｃｅｌｌＳＢＬＣ）及
びヒト正常（非形質転換、ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ｅｄ）リンパ球から選択されるものであって、これら細
胞は適当な培地中で一８０℃以下の超低温に凍結保存す
ることができる。

上記抗体産生細胞としては、抗体を分泌していないが、
細胞内に抗体を合成している型の非分泌型抗体産生細胞
を用いることができる。また、これら細胞のうち、正常
リンパ球以外の抗体産生細胞は悪性腫瘍株であって無限
増殖が可能であるため、細胞融合後に作成されたハイブ
リドーマのみを選択するために選択マーカーを有してい
ることが必要であり、該ハイブリドーマの選択には種々
の薬剤耐性株を利用することができる。この薬剤耐性株
としては、８−アザグアニン、６−チオグアニン、ウア
バイン等の薬剤に耐性のある株を用いるとよい。

上掲の２種類の抗体産生細胞の細胞融合は、通常のハイ
プリドーマ作成方法を適用して行い得る。

すなわち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下
で融合を行うことができ、その際ＰＥＧは平均分子量が
１，０００〜６，０００程度のものを用い、また、その
濃度は４０〜６０％で用いるのが好ましい。

上述のごとくして融合して得られた細胞は、選択培地を
用いてハイブリドーマのみが生育可能な条件で培養する
。ここで用いる選択培地としては、通常の動物細胞の培
養に用いられる培地である、ＲＰＭＩ　１６４０培地、
最少必須培地（ＭＥＭ）　、ダルヘツコ変法最少必須培
地、ハムのＦ−１２培地等を例示でき、通常はこれらの
培地にウシ胎児血清（Ｆｅ２）又は新生子牛血清、生血
清、馬血清、大血清等の血清を５〜２０％添加したもの
を用いる。なお、これらの血清に代えて他の増殖因子、
例えばトランスフェリン、エタノールアミン、セレニウ
ム、インスリン、ラクトフェリン、エビダーマルグロー
スファクター等を添加した無血清培地も用いることがで
きる。このような培地中での上記ハイブリドーマの培養
は、５％炭酸ガスを含む空気中で湿度９０％以上の雰囲
気下に３７℃の温度で行うとよい。

このようにしてハイブリドーマを培養することにより産
生された抗体の量は、放射免疫測定法（＋？ＩＡ）また
は酵素結合免疫複合体測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定
することができる。

上述のごとくして産生された抗体は、モノクローン抗体
であるが、異種の抗原特異性を有する抗体集団のように
利用することができるので、免疫抗血清と同様にして臨
床検査や治療に有効に用い得る利点がある。

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

実施例１使用抗体産生細胞：ヒトＢリン芽球様細胞としての、ＷＩＬ−２由来の１ｇ
Ｍ産生（非分泌）６−チオグアニン耐性＋１０−３２３
株と、ヒト正常リンパ球としての、肺がん患者摘出リン
パ節由来のリンパ球（非形質転換細胞）を用いた。

細胞融合　びハイブリドーマの培　：上記の　１）０−３２３株Ｉ　Ｘ　１０’個とリンパ球
２　Ｘ　１０’個に、Ｋ６ｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ
の方法〔ネーチャーｒ　Ｎａ　ｔｕｒｅ　＋２５６．４
９５（１９７５）　）に従い、１ｍｌの５０％ＰＥＧ　
（分子量４，０００、シグマ社）を１分間かけて添加し
て融合を行った。得られた細胞を９６穴マイクロタイタ
ープレートに播種した後、ヒボキサンチン／アミノプテ
リン／チミジン（ＨＡＴ）を含むｌＯ％ＦＣ５添加のＲ
ＰＭＩ　１６４０培地中で培養した。この培地中ではＨ
Ｏ−３２３株は死滅し、一方正常リンパ球はもともと増
殖しないので、融合により作成されたハイブリドーマの
みが増殖した。

なお、上記培地中での培養は、炭酸ガス５％を含む空気
中で湿度９０％以上野雰囲気に３７℃の温度で５週間行
った。

上記培養を５回行うことにより、３６２個のハイブリド
ーマを得た。このうち、ＩｇＡを産生じているハイブリ
ドーマは２７個、ＩｇＧを産生じているものは１８０個
、ＩｇＭを産生じているものは１２８個であった。

また、いくつかのハイブリドーマは複数の抗体を産生し
ており、そのうちＩｇＡとＩｇＭを同時に分泌するハイ
ブリドーマは２３個得られた。

次に、ＩｇＡとＩｇＭを同時に分泌するいくつかのハイ
ブリドーマの産生ずる抗体を、α鎖、μ鎖、に鎖及びλ
鎖に対する抗体を用いてＥＬＩＳＡで測定したところ、
同一分子内に測定した全てのポリペプチドを含んでいた
。すなわち、Ｈ鎖にα鎖とμ鎖、し鎖にに鎖とλ鎖を含
む抗体が得られた。

なお、＋１０−３２３株はμ鎖とに鎖を合成していたの
で、ハイブリドーマの産生ずる抗体中のα鎖とλ鎖はリ
ンパ球由来であることが明らかとなった。

この複合抗体の分子量は８０万〜１００万であり、Ｉｇ
Ｍの構造に類似していた。

実施例２使用抗体産生細胞：ヒトＢリンパ芽球様細胞としての１）０−３２３株由来
の６−チオグアニン耐性及びウアバイン耐性０−２株と
、■ｇＡ産生（分泌）ヒトＢリンパ芽球様細胞２１−２
株を用いた。

細胞融合及びハイブリドーマの培養：上記　０−２株Ｉ　Ｘ　１０７個と２１−２株Ｉ　Ｘ　
１０’個を実施例工に記載したと同様の手順で融合させ
、次いでウアバインを含むＩＩＡＴ培地中で培養を行っ
て、融合により作成されたハイブリドーマのみを増殖さ
せた。すなわち、上記培地中ではＯ−２株は１（ＡＴの
存在により死滅し、一方２１−２株はウアバインにより
死滅するので、ハイブリドーマのみが選択される。

上記１回の培養により８２個のハイブリドーマが得られ
、そのうち５６個のハイブリドーマはＩｇＡを産生じて
おり、またＩｇＡ産生ハイブリドーマの全ては同時にＩ
ｇＭも産生じていた。また、産生された抗体は、同一分
子内にα鎖、μ鎖、に鎖及びλ鎖の４種類のポリペプチ
ドを含んでいた。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）２種類の抗体産生細胞を細胞融合させて作成した
ハイブリドーマを培養することにより、同一分子内に２
種類の重鎖と軽鎖を有することを特徴とする抗体の産生
方法。
（２）抗体産生細胞は、ヒト骨髄腫細胞、ヒトリンパ芽
球様細胞及びヒト正常リンパ球から成る群から選択され
る特許請求の範囲第（１）項記載の抗体の産生方法。
（３）産生された抗体は、２種類の抗原特異性を有する
抗体である特許請求の範囲第（１）項記載の抗体の産生
方法。
（４）２種類の重鎖がヒトα鎖及びμ鎖である特許請求
の範囲第（１）項記載の抗体の産生方法。
（５）２種類の軽鎖がヒトκ鎖及びλ鎖である特許請求
の範囲第（１）項記載の抗体の産生方法。