JPS62232567A - 不安定な生化学物質を含有する固形診断試薬の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （本発明の背景） 本発明は診断試薬の分野に関し、特に少なくとも一種の
不安定な生化学物質、たとえば抗体、ヌクレオチドまた
は酵素を含有する診断試薬の調製に関する。

数十年の間に、不安定な生化学物質を含有する診断試薬
が、たとえば病理学的異常の診断のための情報を得るた
めに、与えられた被分析試料についての試験に使用され
ている。たとえば１９６８年１１月２６日付で発行され
たＤｅｕｔｓｃｈによる米国特許第３，４１３，１９８
号、１９７３年６月２０日付で発行されたＢｒ１ｇｇ５
等による米国特許第３．７２１，７２５号、１９７８年
１月１０日付で発行されたＷ　ｕ　ｒｚｂｕｒｇ等によ
る米国特許第４，０６７．７７５号および１９８４年５
月８日付で発行されたＭｏｎｔｅ等による米国特許第４
　、４４７　、５２７号がその例である。これらの特許
の診断試薬は全て、酵素が凍結乾燥状態で使用されてお
り、従って酵素的成分は分解しないが不均一で、信頼で
きない試薬となっている。同じことが、たとえばヌクレ
オチドおよび抗体のような他の分解性成分に関しても言
える。このような凍結乾燥させた生化学物質はまた、相
互に混合物となっており、たとえば補酵素と抗体とか、
あるいは、たとえば酵素安定化剤、増量剤、緩衝剤、酵
素活性化剤等のような各種助剤などとの混合物となって
いる。

従来、このような成分を配合し、種々の方法により次い
で大型粒子、たとえば錠剤に成形されており、診断試験
試薬を自動式臨床分析機で使用しようとする場合には、
その錠剤については最低でも２倍の要件、すなわちその
中の診断用成分の均一な濃度および錠剤間で均一な溶解
速度が求められるものと理解される。

少量、たとえば全景に対して１重量％より多くない量の
凍結乾燥酵素を増量剤、たとえばマンニトールと慣用の
方法で配合する場合、これら２種の成分間の嵩密度の差
違が非常に大きいと配合工程後にこれら成分の分離を生
じさせることがあることが見い出されている。

凍結乾燥酵素を増量剤、たとえばマンニトールと流動床
凝集法により凝集させることが試みられたが、これは成
功しなかった。凍結乾燥酵素の嵩密度がマンニトールに
比較して非常に低いために、この流動化過程で困難な問
題が生じ、生成する凝集物は非常にもろく、後続の処理
中に凝集物の崩壊が生じることも少なくない。他の難点
としては、たとえば凝集室の頂上部におけるフィルター
における軽い重量の凍結乾燥酵素の損失および過大サイ
ズの塊に凝集されることによる生成物の損失が包含され
る。さらにまた、結合剤溶液からの水分の除去に比較的
高い空気温度が必要とされ、酵素の変質および（まだは
）他の不安定成分の分解を招くことがあげられる。

（本発明の要旨） 本発明の目的は少量の酵素と大量の増量剤との均一な配
合物を提供する改善された方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は酵素を含有する新規な中間物
質形態の素材を提供することにあり、この素材は酵素を
均一な濃度および溶解速度を有する錠剤等に成形するこ
とを簡便になし得るものである。

本発明のさらにもう一つの目的は前記の中間物質形態の
素材を製造する一種またはそれ以上の方法を提供するこ
とにある。

本発明のさらにもう一つの目的は前記要件を満たす診断
用錠剤等ならびにそれらの製造方法を提供することにあ
る。

さらに別の目的は抗体およびヌクレオチドに限られずそ
れらを包含する不安定な生化学物質、特に従来は診断試
薬に配合される前に凍結乾燥されていた生化学物質に前
記の目的を適用することを包含する。

本発明の目的および利点は、本明細書および特許請求の
範囲により、当業者に明白になるはずである。

本発明者は、驚くべきことに粒子状増量剤、たとえばマ
ンニトールに、酵素の溶液を、好ましくは流動床被覆法
により被覆できそして、それにより従来、診断試薬の製
造方法にとって必要であると信じられていた凍結乾燥酵
素を使用することが不必要になることを見い出し、本発
明目的を達成した。生成した被覆処理された粒子状増量
剤は次いで構成成分の均一濃度および均一な溶解速度を
有する錠剤に容易に成形することができる。この発見に
もとづき、従来、常に凍結乾燥形態で配合されていた他
の成分、特に診断試験に配合されていた成分が粒子状の
完全に水溶性の増量剤等の上に成功裏に被覆することが
できることが見い出された。

下記の説明においてこのような成分を「不安定生化学物
質」の用語で表わすが、この用語は、特別の態様として
、全ての酵素、全ての抗体、全ての補酵素、全てのヌク
レオチドおよび成る種の基質を包含するものとする。

本発明の記載において、また「被覆」の用語は、これに
限られないが、孔壁が被覆または充填されうる粒子増量
剤の孔中への浸透を包含するものと理解されるべきであ
る。

一般に、本発明による診断用錠剤または類似製剤（水溶
性で固体の不安定生化学物質含有診断試薬としての特徴
を有することができるもの）の製造方法は 仏）不安定生化学物質の水溶液を調製する工程、 （ｂ）　　完全に水溶性で不活性の、好ましくけ非吸湿
性の粒子状固体増量剤を調製する工程、（ｃ）　　前記
粒子状増量剤上に前記不安定生化学物質の水溶液を霧化
し、細滴の形で少食づつ、長時間にわたり均一に噴霧し
、この間、上記の増量剤は周囲気体状媒質と接触させな
がら連続的に攪拌し、そして連続的に上記の不安定生化
学物質の水溶液から水分を蒸発させることにより不安定
生化学物質を粒子状増量剤上に均一に分布させ、そして
その増量剤の実質的な凝集および増量剤における実質的
な水分の蓄積を防止するのに効果的な条件下に、粒子状
増量剤上に不安定生化学物質を配合せしめる工程、（ａ
）　　生成した不安定生化学物質被覆増量剤を所望の乾
燥度まで乾燥する工程、および（ｅ）　　生成した乾燥
された不安定生化学物質で被覆された増量剤を診断試験
試薬として適し、予め定められた溶解速度を有する錠剤
に成形する工程、 を包含する。

成る場合には、工程（ｄ）からの粒状生成物なまた錠剤
形成工程等の必要なく、診断試験に直接的に使用できる
。

前記したように、本発明の発見により、使用される酵素
またはその他の不安定生化学物質が全熱凍結乾燥されて
いないものであることを可能にする。他方、凍結乾燥し
た不安定生化学物質を利用した方が便宜である場合（た
とえば、在庫があったり別の用途がない場合）には、凍
結乾燥した不安定生化学物質を溶解して工程体）に記載
の溶液を得ることもできる。

本発明の好ましい態様によれば、工程（ａ）で調製され
る不安定生化学物質の溶液は、それが酵素を含有する場
合には処理中および処理後の酵素の分解を防止するため
に安定化剤を含有していてもよい。このような安定化剤
の例には、これらに限られるものではないが、牛血清ア
ルブミン、ポリエチレングリコールおよび塩化ナトリウ
ムおよび塩化カリウムのような塩が包含される。この点
に関して特に顕著な利点は成る種の系に最適の安定性を
付与するために、これらの塩を高濃度で使用することが
できることである。本発明以前においてはこのような高
濃度の塩は凍結乾燥させることができなかった。たとえ
ば、グルコースデヒｒＩ：ｌゲナーゼ含有溶液に対して
塩化ナトリウムの約６モル溶液を使用することができ、
ムタロターゼを含有する溶液に対し、塩化カリウムの約
１．５モル溶液を使用することができる。これによって
、凍結乾燥法に比較して格別に高収率の酵素が得られる
。

本発明による方法において、工程（ａ）の噴霧溶液は１
．Ｈな所望の数値、たとえばヘキソキナーゼの場合に、
平均偏差値０．０５で一へ〇〇に調整できるようにする
緩衝剤を含有すると好ましい。

このような緩衝溶液を使用する場合に、脱イオン化水中
の一塩基性リン酸カリウムを使用すると好ましい。また
、本発明においては、使用する緩衝剤は特定されず、特
定の試薬に応じて、いずれかの緩衝剤が使用できる。さ
らに、いづれか特定の系に関連しては、当該技術分野に
おける種々の技術を使用することができる。噴霧溶液は
また、他の診断試薬を含有していてもよく、たとえば一
種または二種以上の抗体、ヌクレオチド等あるいはこれ
に限らず、それらを含めて、種々の不安定生化学物質の
混合物、ならびに粒子状増量剤上に沈着した酵素のため
の固体稀釈剤として働く物質等々を含むその他の診断用
試薬を含有できる。

増量剤の性質に関しては、一般にこれらは１分で水に完
全に溶解することができるものでなければならないもの
と理解されるべきである。

従って、本発明における「増量剤Ｊ　（ｂｕｌｋｉｎｇ
ａｇｅｎ　ｔ　）の用語は一方で純粋マンニトールのよ
うな種々のコアおよび他方で全ＣＫ試薬ブレンＰを包含
する意味を有する。また、「不活性」の用語は増量剤が
診断試験に対し、不利には働かないことを意味する。

好ましい態様によれば、増量剤はマンニトールと同程度
に非吸湿性である。しかしながら、さらに吸湿性の増量
剤もその“吸湿度が被覆処理を干渉しない、すなわち凝
集を生じさせない程度であるかぎり、使用できる。

本発明のもう一つの好ましい態様によれば、粒子状増量
剤は好ましくは実質的に球形の形状を有する。このよう
にすると、被覆処理が、特に流動床被覆法を使用する場
合に、促進される。

さらにまた、生成した実質的に球形の粒子はこれらが自
由流動性であるために有利であり、したがって、錠剤形
成操作を容易にする。球形粒子を得るための多くの球形
形成の手法が存在するが（たとえば米国特許第４　、５
７２　、８９７号明細書第６欄３５〜６０行参照）、マ
ンニトールの場合に、特にＧｌａ　ｔ　を回転顆粒形成
機による、回転顆粒形成法により実質的に球形の粒子を
調製すると好ましい。

本発明のさらに別の好ましい態様によれば、増量剤はマ
ンニトールを含有するばかりでなく、また成る場合には
、マンニトールよりなる、すなわち不純物以外のその他
の成分を組み合せて使用しないものであることができる
。純粋なマンニトールはマンニトールと例えば、少量の
塩化ナトリウムとの混合物よりも凝集がより困難である
ことから、このような純粋なマンニトールが充分に凝集
でき、酵素溶液により被覆されうろことは予想外のこと
である。

増量剤としてマンニトールを使用する以外に、マンニト
ールと実質的に同一の機能を果す不活性で水溶性の、好
ましくは非吸湿性のその他の増量剤、特に有機化合物ま
たはその混合物があり、これら全ての増量剤が本発明に
含まれる。

例をあげると、増量剤は好ましくは、？リオールであり
、これは糖または還元糖、モノマーまたはポリマーであ
ることができ、これらについては米国特許第４　、４４
７　、５２７号明細書第６欄および第７欄に開示されて
おり、これらの記載をここに援用する。増量剤の粒子サ
イズは前記方法により、特に流動末法により、被覆でき
るような大きさである。好ましくは、粒子サイズは約２
０〜８０メツシュ（米国シーブサイズ）内である。

もう一つの態様において、増量剤は高濃度のアス・セラ
ギン酸およびアスノｅラギン酸ナトリウムの緩衝系に比
較して低濃度、たとえば約１０チの濃度でマンニトール
を含有する。これとは逆に、もう一つの態様では増量剤
は高濃度、たとえば約９８％のマンニトールと低濃度の
牛血清アルブミンとを含有する。

本発明で使用できる不安定生化学物質に関しては、診断
試薬に有用な全ての不安定生化学物質が意図される。こ
れらは従来既知の不安定生化学物質ばかりでなく、将来
において発見されるであろうものも包含する。代表的な
系としては、従来技術に関する説明において引用した前
記特許を参照できる。いづれにしても、本発明の好適酵
素の例は、これらに限定されないが、α−グルコシダー
ゼ、β−グルコシダーゼ、グルコース−６−ホスフニー
トテヒーロｒナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコースデヒ
ｒ口ｒ＋−ゼ、ムタロターゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ、コレステロールエステラーゼ、クリセロールホス
フエートオキシダーゼ、グリセロールキナーゼまたはリ
ンゴ酸デヒｒ口ｒナーゼが含まれる。

粒子状増量剤上に抗体を被覆する場合に極めて重要な抗
体は心筋梗塞診断用の最近の試験法で、ＣＫ−ＭＭを阻
害する抗体である。その他の重要な抗体は医薬試験で使
用されているものであり、これらの抗体の溶液は、試験
のその他の反応性成分から抗体を物理的に分離する特別
の目的をもって、酵素と同一の方法でマンニトール等の
上に噴霧することができる。

本発明に従い補酵素を増量剤上に被覆する態様において
、診断試薬分野で特に良く知られている補酵素はフラビ
ンモノヌクレオチｒ１フラビンアデニンジヌクレオチド
、ビリＰキサル５′ホスフェートおよびジアデノシンペ
ンタホスフエートである。

ヌクレオチドを粒子状増量剤上に被覆する場合に、診断
の目的に意図されるヌクレオチドの例には、これらに制
限されないが、アデノシンモノホスフェート、アデノシ
ンジホスフェート、アゾンシントリホスフェート、グア
フシ／モノホスフェート、ウリノンモノホスフェート、
シチジンモノホスフェート、デオキシアデノシンモノホ
スフェート、デオキシグアノシンモノホスフェート、デ
オキシチミジンモノホスフェートおよびデオキシシチジ
ンモノホスフェートがある。

粒子状増量剤上に不安定な物質を被覆する場合に、診断
の目的に意図される不安定な物質の例には、これらに制
限されないが、ｐ−二）ロフェニル誘導体化デキストラ
ン、α−ケトグルタレート、クルコース−６−ホスフェ
ート、ホスホエノールピルベート、クリセルアルテヒ１
−３−ホスフエートオヨヒフラクトース−６−ホスフェ
ートがある。

いづれにしても、本発明が全ての抗体、全ての酵素、全
ての補酵素および全てのヌクレオテＰ並びに温度および
（または）水分の点で分解する可能性のある成る種の物
質を含むいづれかの不安定な生化学物質の溶液を使用し
て被覆を行なうことができることは明白である。

与えられた粒子状増量剤上に配合される与えられた不安
定生化学物質の濃度は特定の診断試験の要求に従って変
えられる。−例として、代表的で好ましい濃度を次表に
示す。

註）ＢＳＡ　＝牛血清アルブミン Ｍ　＝メツシュサイズ（米国シーブ） 下記で示すように、ポリエチレングリコールを潤滑剤と
して使用すると好ましく、これはメツシュサイズを有意
に増大させることなく、錠特に約１重量−の被覆量で使
用する。低分子量を有するＰＥＧが意図されるが、粒子
の摩擦に対して同様により大きい防護を与えることから
２０　、０００の分子量を有するＰＥＧが好ましい。

マンニトールが４０〜６０メツシュの粒子サイズを有し
、そして酵素が一つにはグルコース−６−ホスフニート
デヒＰ口ｒナーゼマタハへキソキナーゼであるか、また
は一つにはグルコースデヒ１０デナーゼまたはムタロタ
ーゼである系が特に重要である。

均質性の観点から、生成する錠剤が不安定生化学物質濃
度に関して５％より少ない程度で変化する活性率を有す
るような均質性を有する粒子を提供することが望ましく
、本発明はこのような均質性を達成できる。

粒子状増量剤を酵素で被覆した後に、本発明のもう一つ
の態様に従い、生成した粒子状固体ｌを追加の賦形剤の
一つまたは二つ以上の層で被覆する。この追加の賦形剤
は錠剤形成を助長しそして（または）診断試験それ自体
を補助するものである。−例として、潤滑剤、たとえば
ポリエチレングリコール、好ましくはポリエチレングリ
コール２０　、０００の層を付加して、錠剤形成を容易
にし、摩擦を最小にし、そしてその処理中に酵素が粒子
状増量剤から分離するのを防止することが意図される。

このような被覆は醪素被覆工程後に、中間乾燥工程を行
なうことなく直接に充分に適用できることが予想外に見
い出された。しかしながら、この被覆は乾燥工程後にも
同様に適用できることは勿論のことである。

もう一つの例では、一定の溶解速度を有する被覆が得ら
れ、これにより生成する生成物に予め定められた時間の
溶解特性が与えられる。同様に、−依存性被覆を用いて
酵素が特定の−でだけ放出されるようにすることもでき
る。さらに、本発明のもう一つの態様に従い、試験用の
その他の成分、たとえば別の生化学物質等を、粒子上に
別に被覆することもできる。

本発明の方法の特に好ましい態様によれば、増量剤を酵
素で被覆するために、流動床被覆法を使用する。流動床
被覆法は広く種々の工業界で使用されている。しかしな
がら、診断試薬分野では、不安定生化学物質の凍結乾燥
の必要性が認識されており、そして既知の方法による操
作可能性が証明されていることから、流動床被覆技法の
適用は本発明以前には明らかに考えられたことがなかっ
た。

さらにまた、考えられたとしても、本発明においては粒
子状増量剤が完全に水溶性でなければならないことから
当業者は流動床被覆法は成功しないと結論しているに違
いない。この理由は、不安定生化学物質が水性媒質中で
噴霧されるので、この水性媒質が粒状の水溶性増量剤の
表面を攻撃し、粘着性の表面をもたらし、所望の被覆さ
れた自由流動性粒子ではなくむしろ望ましくない粒子の
塊を生成することになるからである。確かに、流動化凝
集を凍結乾燥酵素に試みた場合に、このような現象が生
じる。従って、本発明における流動床被覆法の成功は全
く格別のことである。

流動床被覆法の詳細に関しては、最適結果に到達するた
めに調節されるべきかなりの変動因子が知られている。

たとえば、このような変動因子としては、物理的特性、
粒子サイズおよび確 噴霧される物質に対する親和性を含む　　増量剤の性質
、その中に含有される特定の不安定生化学物質ばかりで
なく、またその濃度を含む特定の被覆溶液並びにいづれ
かの賦形剤が包含される。これらの「生成物変動因子」
は、たとえばノズルの霧化空気圧力、液体噴霧速度、流
動化空気温度および湿度、流動化空気速度等を含むプロ
セス変動因子と相関関係を有する。

本発明に適用する場合に、これらの変動因子はいづれか
特定の系について特別に設定でき、通常的実験により、
最適の結果を得ることができる。

本発明の目的に関して、いづれかの与えられた系に最適
の結果を得るために、下記のガイドラインが役立つであ
ろう。

流動床被覆処理の被覆時間については、たとえばマンニ
トールの酵素被覆の場合に、６０〜６０分が好適である
ことが見い出された。さらに長い時間を使用すると、若
干の摩擦が生じ、酵素物質の！ンニトールからの分離が
生じることが見い出された。

最終的分析においては、処理中の実質的な凝集を防止す
ることが重要である。これは一般に、不安定生化学物質
の被覆中の凝集が約１チより少ないことを意味する。（
しかしながら、被覆剤としてポリエチレングリコールを
使用すると、非常に容易に崩壊できる若干の凝集が生じ
る。

従って、ポリエチレングリコール被覆操作後に得られる
生成物は４０メツシュ篩に通すと好ましい）。

湿度条件に関しては、流動化に乾燥空気、たとえば２０
℃で４チまたはそれ以下の相対湿度を有する空気を使用
すると好ましいということが見い出された。同様に、被
覆操作中の粒子が実質的に湿潤しないようにすることが
重要である。たとえば、被覆された粒状固体が多くて約
１０重量％の水分を有するようにすると好ましい。

粒子状増量剤上に沈着した各液滴は次の液滴が入ってく
る前に蒸発されることが望ましいので、流動化空気速度
と液体噴霧速度および液滴の霧化塵との間に相互関係が
存在する。その他の因子には流動化空気温度および湿度
、並びに使用される特定の噴霧ノズルの特性が含まれる
。

噴霧溶液中の成分の濃度に関しては、少量の水が流動化
工程に導入されるように、できるだけ濃厚な溶液を使用
すると好ましい。処理中に導入される水分の量が多くな
るに従って、長い乾燥時間および（または）高い温度を
使用する必要性が生じる。他方、噴霧溶液中の成分の濃
度はこれらの成分が粒子状増量剤により捕獲される前に
早まって沈殿する結果が生じるほど高くないことが重要
である。噴霧溶液は不安定生化学物質が変質しないよう
に、低温、たとえば４℃で貯蔵することが望ましい。

前記の因子は全て処理を操作可能にするものであるより
はむしろ処理を最適にするだめのものである。

「生成物変動因子」に関しては、生成する診断試薬が被
分析溶液にできるだけ速く溶解して、分析評価を遅延す
ることなく行なうことができるようにすることが本発明
の目的に対して重要である。一般に、本発明による実験
試薬は１分より短かい時間で溶解する。特定の診断試薬
錠剤の特定の溶解時間は現在使用されている仕様書の注
意書きを援用する。公表されていない場合でも、これは
当業者によく知られており、これらの情報をここに援用
する。

本発明が操作可能であることは全く予想されえないこと
であることから、酵素濃度が約１重量％である酵素被覆
マンニトール生成物の顕微鏡検査を行なった。酵素被覆
物は識別できない。

従って、酵素溶液の代りに色素溶液を使用し、その他は
同一にした。このようにしても、生成した粒子上に色素
を見ることはできなかった。

この点で、本発明はこのようなメカニズムに拘束されな
いが、使用された粒状マンニトールかの外側表面は認め
られるほど湿っていないので、粒子の有害な凝集を生じ
させるような粘着性フ本発明の予想外の成功に寄与して
いるものと信じられる。

流動床被覆技法を利用でき、そして診断試薬の調製にお
ける、エネルギー増大、装置の増加および時間消耗を伴
なう凍結乾燥工程を省略できるという知見を当業者が持
ったならば、当業者が広く種々の粒状増量剤および不安
定生化学物質に本発明を使用できることは認められるべ
きである。換言すれば、本発明の実行可能性が認識され
たならば、いづれかの指定の系に最適の方法を見い出す
ことは単に通常的実験の問題である。

さらに別の労力を必要とすることなく、当業者は前記説
明を使用して、本発明を充分すぎる程度にまで利用でき
るものと信じられる。従って、下記の好ましい特定の態
様は巣に説明のためのものであり、いづれのどのような
点についても、記載されていない残りの部分について、
これを制限しようとするものではない。

本明細書全体をとおして、全ての温度は摂氏塵（℃）に
より未補正で示し、そして全ての部およびパーセンテー
ジは別記されていないかぎり重量による。メツシュサイ
ズは米国篩サイズを用いた。

例　　１ 剤の調製 Ｇｌａ　ｔ　を社製の標準装置として提供されている、
回転式顆粒形成機用装入部品および付属部品を用いるＧ
ｌａｔｔ　（）ＰＣＧ−５流動床類粒形成機をこの方法
で使用する。

この装置の生成物容器に、８０メツシュより小さいサイ
ズに予め整えられているマンニトール５ｋｇを装入する
。この凝集処理用の結合剤溶液としては、８重量／容量
チポリビニルピロリドン（分子量＝　４０，０００）お
よび２重量／容量チポリエチレングリコール（分子量＝
　２０，０００）の溶液を使用する。

マンニトールを次のパラメーターを用いて、回転式顆粒
形成機（Ｇｌａｔｔからの標準操作方法に従う）で凝集
させる： 結合剤溶液流速＝　７５ｍ＃／分 霧化空気圧力　＝２パール 結合剤溶液の量＝　１８００尻ｅ 顆粒形成温度　３６０℃ ローター速度　＝２５０〜３００　ｒｐｍ結合剤溶液の
噴霧の完了後に、ローター速度を減じて、粒子の摩滅を
防止し、顆粒を６０℃の温度で１チより少ない水含有量
にまで乾燥させる。

生成する顆粒を篩に通し、４０〜６０メツシュの部分を
選別する。この得られた４０〜６０メツシュマンニト一
ル顆粒ヲシーＰ、すなわち粒状増量剤として使用し、こ
の上に酵素、ヌクレオチｒ、抗体等を含有する溶液を噴
霧する。

する： １、　ムタロターゼ溶液 成　分： 塩化カリウム　　　　　　　　７４．６ｇポリエチレン
グリコール２０，０００　　２２．５．９牛血清アルブ
ミン　　　　　　ｓｏ、ｏＩＩ脱イオン化水　　　　　
　　　１０１００Ｏ凍結乾燥したムタロターゼ１６０　
、０００単位を上記溶液７２０ｍ／に溶解する。

２、　グルコースデヒｒロｒナーゼ溶液成　分： 塩化ナトリウム　　　　　　　１７５９ポリエチレング
リコール２０，０００　　２０．９脱イオン化水　　　
　　　　　１０００ｔ／凍結乾燥したグルコースデヒＰ
口ｒナーゼ８．９７０，０００単位を上記溶液９６０ｍ
Ａ！に溶解する。

３、　　グルコース−６−ホスフニートデヒＰログナー
セ溶液成　分： 牛血清アルブミン　　　　　　　ｉｓｏ！１０．０２Ｍ
す／酸カリウム緩衝剤（ＰＨ７，０）　９００１１！／
凍結乾燥したグルコース−６−ホスフニートデヒＰＩ：
Ｉデナーゼ３，０００，０００単位（４，５８＃）を上
記溶液に溶解する。

４、　ヘキソキナーゼ溶液 成　分： 牛血清アルブミン　　　　　　　９０９０．０２Ｍリン
酸カリウム緩衝剤ｐｉ−１７，０５４０扉ｇ凍結乾燥し
たヘキソキナーゼ１．５００，０００単位（１９，８７
５１）を上記溶液５４０ｍ１に溶解する。

Ｃ９流動床酵素被覆 ムタロターゼ溶液、クルコースデヒｒｏｆｆナーゼ溶液
およびグルコース−６−ホスフニートデヒドログナーゼ
溶液を下記の方法により、それぞれ５　ｋｇのマンニト
ールシーＰ（前記Ａに記載のもの）上に約４℃の温度で
噴霧する。

サイズ１２のノズルを有するＧｌａｔｔ　ＧＰＣＧ　−
５流動床類粒形成機を、Ｇｌａ　ｔ　ｔによる標準部品
として供給されている標準生成物容器および付属部品を
用いて、この処理に使用する。

酵素溶液は下記のツクラメ−ターを用いて、流動床上の
マンニトールシーＰ上に噴霧する：酵素溶液流速＝　３
０Ｒ１１分 霧化空気圧力＝２．５パール 被覆温度　　＝３８℃ 流動化空気湿度＝４チ韮 ヘキソキナーゼ溶液は前記方法を用いて、マンニトール
シード６ゆ上に噴霧する。

酵素溶液をマンニトールシーＰ上に噴霧した後、直ちに
、２０チポリエチレングリコール２０　、０００の溶液
を酵素被覆マンニトールシーＰ上に噴霧する。

顆粒を次いで、約４−の相対湿度を有する３８℃流動化
空気を使用して、１％より少ない水含有量にまで乾燥さ
せる。

凍結乾燥されたヘキソキナーゼとマンニトール上に噴霧
被覆されたヘキソキナーゼとの間の比重量の比較を２種
の方法により行なった。最初に、凍結乾燥へキソキナー
ゼおよび噴霧被覆へキソキナーゼをそれぞれ、タール塗
布した２５Ｎｇガラス製目盛付きシリンダーに注入する
。それぞれの容積および重量を記録して、ゆるく詰めら
れた場合の比重量を決定する。両方の目盛付きシリンダ
ーを次に、Ｔｈｏｍａｓ振動式振動篩に固定し、最大振
幅で２分間振動させ、密に詰めた場合の容積を測定する
。各容積を各被験物質の重量で割算し、比重量を決定す
る。

ゆるく詰めた場合の比重量　０．０７７５ｇ／ｃｃ　　
０．６６０１１／ｃ密に詰めた場合の比重量　　０．１
１８０ｇ／ｃｃ　　００７４９１１／ｃマンニトール上
に被覆されたヘキソキナーゼのゆるく詰めた場合の比重
量は凍結乾燥へキソキナーゼのものより８．５倍大きい
。マンニトール上に被覆されたヘキソキナーゼの密に詰
めた場合の比重量は凍結乾燥へキソキナーゼのものより
６．３倍大きい。

凍結乾燥へキソキナーゼとマンニトール上ニ被覆された
ヘキソキナーゼとを粉末流動性についてまた比較した。

変動が１チより少ない錠剤重量効率を得るためには良好
な粉末流動性物性が一般に必須である。粉末流動性測定
値は底部を切り取り、そこに代りに錠剤プレスダイ（７
１５２インチ直径パンチサイズ）を付けた１００ｃｃプ
ラスチック製目盛付きシリンダーに各被験材料を入れる
ことにより得られる。底部のダイの孔の上に一片のテー
プを置いて、測定の用意ができるまで粉末の流動を防止
する。粉末流動速度はＥｐｓｏｎ　）（Ｘ−２０コンピ
ユーターに連結した８ａｒｔｏｒｉｕｓ１４０４秤によ
り装入物の重量を記録することにより追跡する。粉末が
目盛付きシリンダーからダイの孔を通って秤皿上に流動
するに従う重量が各秒毎に記録されるように、ＢＡＳＩ
ＣでＥｐｓｏｎ　ＨＸ−２０をプログラムする。ダイを
通る比較にならない粉末流動が凍結乾燥へキソキナーゼ
について生じた。マンニトール上に被覆されたヘキソキ
ナーゼは前記装置を使用して、６ｇ／秒の平均粉末流動
速度を示した。

Ｄ９診断試薬における酵素被覆マンニトールシーＰの使
用 グルコースデヒＹａｒナーゼおよびムタロターゼ顆粒（
これらは工程Ｃに記載のとおりにして調製する）を、標
準流動床顆粒形成機凝集方法を用いて製造したＮＡＤ　
（ニコチンアミＰアデニンジヌクレオチｒ）顆粒および
トリス（ヒｒロキシメチル）アミノメタン顆粒と混和す
る。

生成する顆粒配合物は標準分光光度計測定法によりグル
コースについて測定して、完全に化学物質を構成してい
た。この顆粒配合物を５ｔｏｋｅｓＲｏｔａｒｙ　Ｔａ
ｂｌｅｔゾレス上で、標準供給フレームおよび計量ホツ
ノＪ？−を用いるが、プレスに５ｔｏｋｅｓ−Ｐｅｎｗ
ａｌｔを付けてねじれ性・ぐンチ機構が得られるように
改良して錠剤に成形する。

ヘキソキナーゼおよびグルコース−６−ホスフニートデ
ヒＰロゲナーゼ顆粒（これらは工程Ｃに記載のとおりに
して調製する）を、１）ビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉ
ｓ）［２，２−ビス−（ヒＰロキシメチル）　−２，２
’、２“−ニトリロ−トリエタノール〕、Ｎ−アセチル
−シスチン、デキストロース、ＥＤＴＡおよび酢酸マグ
ネシウムを含有する緩衝剤顆粒（この緩衝剤顆粒は標準
回転式顆粒形成機凝集方法を使用し、次いで前記工程Ｃ
に記載のポリエチレングリコールの場合と同様の方法で
、非イオン性表面活性剤Ｂｒｉ、）−３５で被覆するこ
とにより調製される）；２）標準流動床法により凝集さ
レタクレアチンホスフエート／マンニトール顆粒；およ
び３）　ＡＭＰ　（アデノシンモノホスフェート）、Ａ
ＤＰ　（アデノシンジホスフェート）　、ＮＡＤＰにコ
チンアミＰアデノシンジヌクレオチドホスフェート）お
よびマンニトールよりなり、標準回転式顆粒形成法によ
り凝集された補酵素顆粒と配合する。生成する顆粒は標
準分光光度測定法によるクレアチンキナーゼの測定値に
より、完全な化学物質を構成していた。この顆粒配合物
を前記グルコース試験について記載した方法と同一の方
法により錠剤に成形する。

例　　２ クレアチンキナーゼ試験（前記されている）用の顆粒配
合物上に錠剤形成する以前にＣＫ−ＭＭ阻害抗体を噴霧
するために、この被覆方法をまた使用できる。使用され
る方法は前記０項に流動床酵素被覆に関して記載されて
いる方法と同一である。この方法を使用すると、ＣＫ−
■試験に使用される種々の顆粒全体に抗体（これは０．
５チ塩化ナトリウム−４％牛血清アルグミン溶液に溶解
して使用する）が均一に分布される。

例　　に の方法はまた原材料の比重量を増加させるために、マン
ニトールシーを上にＮＡＤ　（酸化型および還元型）の
ようなヌクレオチーをマンニトールシーＰ上に被覆する
のに使用できる（処理方法は前記の酵素の場合と同様に
する）。この比重量の増加は顆粒中のＮＡＤの均一性（
ｃ，Ｖ。

ｒｅ錠剤重量＝２〜３チ）を、凍結乾燥ＮＡＤおよびマ
ンニトールの標準流動床顆粒形成法による凝集の場合（
ｃ，Ｖ、＝４〜８％）と比較して改善する。

前記例はこれらの例に使用したものの代りに、本発明に
一般的または特定的に開示されている反応剤および（ま
たは）操作条件を使用して、同様の成功をもって反復で
きる。

前記記載から、当業゛者は本発明の必須の特徴を容易に
確認でき、そして本発明の精神および範囲から逸脱する
ことなく、当業者は本発明を稽々の用途および条件に適
応させるために、種種に変更および修正できることは明
白である。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）不安定な生化学物質を含有する完全に水溶性の固
   形診断試薬の製造方法であつて、 （ａ）不安定な生化学物質の水溶液を調製する工程、 （ｂ）粒子状で不活性の完全に水溶性の固体増量剤を調
   製する工程、 （ｃ）前記固体粒子状の増量剤上に前記不安定生化学物
   質の水溶液を霧化し、細滴の形で少量づつ長時間にわた
   つて均一に噴霧し、この間、上記の増量剤を連続的に攪
   拌状態におき、その間周囲気体状媒質と接触せしめ、そ
   して、連続的に上記の不安定な生化学物質の水溶液から
   水分を蒸発させ、そして上記の粒子状増量剤上に不安定
   生化学物質を均一に分布させ、また、その増量剤の実質
   的な凝集あるいは増量剤中の実質的な水分の蓄積を防止
   するのに効果的な条件下に、該粒子状増量剤上に不安定
   生化学物質を配合せしめる工程、 （ｄ）生成した不安定生化学物質で被覆された増量剤を
   所望の乾燥度まで乾燥する工程、および （ｅ）生成した乾燥された不安定生化学物質で被覆され
   た増量剤を診断試験試薬として適し、予め定められた溶
   解速度を有する錠剤に成形する工程、 を含んでなることを特徴とする製造方法。
2. （２）前記の不安定生化学物質が酵素、抗体、補酵素ま
   たはヌクレオチドを含む、特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。
3. （３）前記の不安定な生化学物質の水溶液が酵素および
   工程中における酵素の分解を防止するための安定化剤を
   含有する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）前記の粒子状増量剤が非吸湿性で実質的に球形の
   形状を有する、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
5. （５）前記の粒子状増量剤がマンニトールを含む、特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。
6. （６）ポリエチレングリコール２０，０００の溶液を用
   い、工程（ｃ）と（ｄ）との中間時点で、生成した不安
   定生化学物質被覆粒子状増量剤をこの溶液で被覆する工
   程をさらに包含する、特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。
7. （７）診断試薬の調製に適する粒子状素材であつて、そ
   の粒子が不活性で完全に水溶性の増量剤より基本的にな
   り、この増量剤はその上に、少なくとも部分的に不安定
   生化学物質のコーティングを有することを特徴とする粒
   子状素材。
8. （８）前記の増量剤の核が非吸湿性で、実質的に球形で
   ある、特許請求の範囲第７項に記載の粒子状素材。
9. （９）前記の不安定な生化学物質が酵素、抗体、補酵素
   またはヌクレオチドを含む、特許請求の範囲第７項に記
   載の粒子状素材。
10. （１０）前記の粒子状増量剤が４０〜６０メッシュの粒
    子サイズを有するマンニトールより基本的になる、特許
    請求の範囲第７項に記載の粒子状素材。
11. （１１）前記の粒子がさらにポリエチレングリコール２
    ０，０００のコーティングを有する、特許請求の範囲第
    ７項に記載の粒子状素材。
12. （１２）被分析物中に診断試薬を溶解し、生成する溶液
    の物理的特徴により被分析物を評価する診断試験を行う
    方法において、診断試薬として、特許請求の範囲第７項
    〜第１１項に記載の素材を使用することを含む方法。