JPS62228023A - 免疫学的増幅因子と関連組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は細胞性免疫及び体液性免疫の不全に伴う病理学
的状態に関する。かかる状態には後天性免疫不全症候群
（ＡＩＤＳ　）　、ヒト免疫不全ウィルスにより惹起さ
れるもの、及びＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）等がある
。

細胞性免疫の一つの典型的な発現は、遅延型過敏症（Ｄ
Ｈ）皮膚反応である。ＤＨ皮膚反応は適肖な抗原を皮下
注射した際に起る。注射後、２４乃至４８時間以内に局
所炎症（紅斑）及び腫脹肥厚（硬結）が、敏感な個人の
場合に認められる。このＤＨ反応は、典型的にはリンパ
球及び単球の炎症部位の血管周囲への浸潤を伴う。ＤＨ
反応部位に見られる細胞は、末梢血白血球（ＰＢＬ　）
集団に由来するものである。

抗原の侵入に対する免疫的応答を仲介する種々の細胞が
示す他の反応としては、王なものとして次のものが挙げ
られる。即ち、ある特定の抗原に特異的な感受性をもつ
細胞の増殖、抗体の生成を含む多彩な免疫機能を仲介す
る細胞の誘導と増殖、及び異種細胞並びに肺賜に対する
反応である。

本発明は、（１）透析した白血球抽出物より単離される
免疫系の゛増幅因子”を抽出する方法及び（２）同様に
抽出される６増幅因子”自体（本特許請求の範囲ではそ
れら因子を含有する医薬品組成物及びそれらを使用する
方法をも包含する。）に関する。これらの増幅因子は、
細胞免疫応答の質及び量に極度に影響を与え、抗原に対
する不十分な反応を特徴として有する各種の臨床状態の
治療に有用であり、ある種のアレルギー状態の緩和に有
用であり、且つある種の自己免役状態の治療に有用であ
る。

本出願に関連する技術背景は１９８４年８月２８日に特
許された本発明者の米国特許第４，４６８，３７９　Ｃ
以下１６７９特許と呼ぶ）に記載されている。他の有用
な技術背景としては、本発明者の、ヨーロツ共特許公開
公轄隘Ｇｌｙ３８８９（１２，０３，８６）に公開され
た本発明者のヨーロッパ特許出願１に８５１１０１０４
．８がある。

この分野に於ける先行技術は、’３７９特許で考察され
ている。その考察を、参考として本明細書に引用する。

先行技術の多くは、所謂“トランスファー　ファクター
”に関するものであり、本発明の対象物とは極めて異な
り、更に言えばある意味で概念の上で相反する産生物に
関するものである。６トランスフアー　ファクター″の
概念を以下に記す。

“トランスファー　ファクター”標品は、ある特定の抗
原は感作されていることが解っている供与者の白血球か
ら作られる。標品は、その特定の抗原に感作されていな
いことが解っている受容者の皮膚′に皮下注射される。

次に受容者はその特定抗原の強制接種を受ける。そこで
ＤＨ応答が観察される。通常”トランスファー　ファク
ター”を注射されていない場合には、その特定抗原の強
制接種に対しては恐らく反応を示さない。

６トランスフアー　ファクター″の分画と、その性質の
解明は、それに附随する構造的及び化学的な基準が不足
している為に、進歩が妨げられて来た。”トランスファ
ー　ファクター”という用語が果して単一の生化学的産
生物について用いられるのか、或は種々の物質の混合物
を意味するのかは不明である。本発明者は、こういった
標品はその特徴として種々の異なった分子及び成分を含
有していると信する。

増幅因子：増幅因子（場合により゛免疫学的増幅因子”
と呼ぶ）とは、ヒト或は動物が過去に於て既に遭遇した
ことのある、抗原の再導入に対する自らの免疫応答の発
現、即ちその速度或は強度を増幅する物質或は成分を言
う。従って°゛増幅因子”活性は、一般的には、受容者
が既にそれに対して感作を受けている一つの抗原の注射
に続いて起る、受容者体内での正常よりも顕著な免疫応
答の形成を特徴とする特異的な免疫系活性と考えられる
。

６増幅因子″という用語は、ここでは場合に応じて、生
物学的活性要因或は物質を記載する為の名詞或は形容詞
として用いる。かかる物質は、増幅活性を示さない外因
性物質を同時に含有していでも差し支えない。こ＼では
６物質”という用語は互に異なった分子種の混合物であ
るかその可能性のある組成物を記載する為に用いる。

増幅物質は、ＡＩＤＳ及びそれに関連する状態の如く、
局所的或は全身的なアレルギー状態及び免疫不全状態の
治療に有用である。１９８６年４月４日に出願した米国
特許出願１’ｈ８４８，２１０（自己免疫障害の免疫増
幅因子による治療）Ｋ記載した如く、本発明者は、増幅
因子が自己免疫障害の治療にも有用であることを見出し
ている。

上に定義した如く増幅因子は、トランスファーファクタ
ーではなく、それ故にトランスファーファクターは増幅
因子ではない。第一に、トランスファーファクターの効
果は、以前にある特定の抗原に遭遇したことのない受容
者について見られるのに対して、増幅因子の効果は、受
容者が以前に遭遇した（或は同時に遭遇する）抗原の再
導入に際して或はそれに引続いてのみ観察される。更に
トランスファー　ファクターの効果は、ある特定の抗原
に関して特異的であるが、増幅因子は受容者が以前に遭
遇した如何なる抗原に関しても非特異的効果を発現する
。

＋６７９特許には、他の多くの事項と共に６種の増幅因
子（増幅因子１−６と名付ける）の抽出操作が記載され
ている。その操作には、水中エタノール濃度勾配及びオ
ククデシルシランを基本的クロマトグラフィー系として
用いる高圧逆相液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を
採用している。それぞれの増幅因子は、特定の水中エタ
ノール濃度勾配範囲で溶出し、従ってクロマトグラフィ
ーカラムから出て来る物質（流出液）中のエタノール濃
度（”　ｏ、ｓ、溶離能”と呼ぶ物理化学的性質）を用
いて同定出来る。

発明の要約 本発明者は、増幅因子抽出の為に更に必要とする操作を
見出し、か＼る操作により白血球標品から抽出される増
幅因子を見出した。本知見を見出す際に用いた一つのク
ロマトグラフィー系は、アセトニトリル−リン酸水溶液
勾配を用いており、これによって約４乃至７ｓの増幅因
子物質を単離することが可能となる。他のクロマトグラ
フィー系も以下に開示しである。

新しく見出した操作の顕著な優越性は、従来の操作に必
要であった若干の段階を省略し、より容易でおそらくは
より効率的な抽出操作にあり、それによってはるかによ
り経済的な増幅因子の製造と、はるかにより大量の生産
が可能になる。ここに開示する断操作により生産物の、
明らかに高い純度、及び生産物からの外因性物質のより
完全な除去が達成され、これらの操作により得られる生
産物を医療用に使用することを考慮すれば、これらの操
作は、重要な優越性を有すると考え得る。

上述の増幅因子を使用する際の用法及び組成についても
開示する。

好ましい態様についての詳細な記述 以下の考察に於ては、物質が供与者から得られ試験測定
が受容者について行われる手順が記述されている。すべ
ての手順及び試薬は、ヒトを治療する為の無菌的且つ無
毒な産生物を供給出来るように選択されている。これら
の物質の抽出操作に際して用いられる溶媒アセトニトリ
ル（ｃＨ３ＣＮ）の毒性にも拘らず、操作の最終産物に
は、アセトニトリルが全くなく、従ってそれらの産生物
は無毒である。

■、小分子量分画の抽出 本発明に係る調節因子調製に於ける第一段階は、白血球
ペレットの調製であり、次にここで問題になる白血球抽
出物中の小分子量（３５００以下）分画の分離段階とな
る。

例１　白血球抽出物の調製と濾過 白血球ペレットは、’３７９特許の実施例ＩＫ記載した
方法で調製した。抽出物中のＳ（父は’　Ｓｍａｌｌ　
”分子量）分画は゛３７９特許の実施例２に記載の方法
で透析するか、或は限外濾過の如き、それと同等の操作
により単離する。

調製の次の段階は、Ｓ分画のゲル′ｊＭ過である。

この段階は、目的とする物質から他の物質を除いて精製
し、更にＳ−分画物質を、それぞれ特性の異なった数種
の別々の分画に分離する。１６７９特許に記載された下
記二つの手順（例２及び３）は本明細書の例４に記載の
ｐＨ５操作を実施するに自っては不必要であることが明
かになっている。然しなから本明細書例乙に記載のｐｉ
−１２，５操作に於ては、上述の段階を除き得るという
立証はない。

例２　デル濾過 ゲル濾過は、’３７９特許記載の実施例４の方法に従っ
て、上述例１の白血球抽出物に対して実施した。得られ
た各分画を集めて保管した。

（ゲル排除クロマトグラフィーは１６７９特許中でゲル
クロマトグラフィーと同等であると記載されている。） 上述例２０分画は、１６７９％許記載の手順に従って定
量する。主要な及び中等度のフルオレサミン反応性（゛
フルラム・反応性″）のピークを検出し、それらの分画
を選んで以下に記述する精製の為に保管した。

■、逆相液体クロマトグラフィー 上述例１及び６で得た物質についての次の精製は、本発
明者が見出した逆相高圧液体クロマトグラフィーによっ
て実施した。

第１の操作（以下ｐＨ５操作と呼ぶ）は上述の例１．２
或は３のいずれの物質についても使用し得る。第２の操
作（以下ｐＦ４２．５操作と呼ぶ）は上述例６の物質に
ついて使用し得るが例１或は２の物質にはじめから使用
した場合、効果的な結果が得られるや否やは不明である
。いずれの操作もオクチルシランｃ　ｕ　ｏ、ｓ、　′
）樹脂カラムを使用し、燐酸水溶液中のアセトニトリル
濃度勾配で溶離する。

（以下濃度勾配についてのすべての百分率はｖ／ｖで表
わす。）使用したアセトニトリルは、ＨＰＬＣ用である
（　Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ　Ｃｏ、、　Ｐｈｉｌｌｉｐｓ
ｂｕｒｇ、Ｎ、Ｊ、）。

使用したＯ．Ｓ．はＷａｔ、ｅｒ　Ａｓ５ｏｃｉａｚｅ
ｓ　（Ｍｉｌｆｏｒｄ。

Ｍａｓｓ、　）製”　ｍｕ　Ｂｏｎｄａｐａｋ″Ｃ１８
０ｃｔａｄｅｃｙｌＳｉｌａｎｅ逆相分析カラム（０，
３９ｃｒｒＬ（内径）×６０ＣＴＬ）である。使用した
装置は５ｅｖｊ、ｅｓ　　３　Ｂ　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ　’ｌポンプ高圧液体クロマトグラフである。

Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　製装置には紫外吸収検出器
が取り付けられカラムからの流出物ｆ　２１０　ｎｍ　
　の吸収で走査する。

Ａ　勾配範囲の測定 目視表示　Ｐｅｒｋｉｎ　−Ｅｌｍｅｒ　３　Ｂ高圧液
体クロマトグラフは、例えばここで実際に使用した速度
である１、Ｑ　ｍＡ　／　ｍｉｎといったように指定さ
れた流速で作動させるようにプログラム出来る。従って
試料は１分間隔で採集出来る。Ｏｑｂから２０％までの
溶媒勾配は例えば０％から２０係までを２０分間で運転
するようプログラム出来る。従って、勾配を２０分間を
１分間隔に分割し、各１分間隔の間に１ｒＩＬｅの試料
を採集し得る。このような１．Ｏｒ／Ｌｌ試料は、原理
的にはそれぞれ１％の溶媒濃度変化に対応する。Ｐｅｒ
ｋｉｎ　−Ｅ１ｍｅｒ装置の目視表示は上述の数字、従
ってカラムに入る溶媒の濃度を示す。

カラムからの流出液中の実際の溶媒濃度は、例えは標準
曲線に対して補正した流水液の屈折率によって測定し得
る。１６７９特許の記載で説明したように、勾配の初期
部分では流出液の溶媒濃度は装置のカラムにその時点で
プログラムされている溶媒濃度に比べて和尚に低い。

これらのカラムについて補正することは可能であり、カ
ラム（へ流入するのではなくて）から排出する溶媒濃度
が重要な要素であるが故に、補正することは再現性のあ
る結果を可能にする為に重要である。この補正は、ある
種の溶媒（例えばアセトニトリル）については和尚な困
難を伴うけれども、流出液の屈折率を測定しそれから実
際の溶媒濃度を計算することによって実施出来る。又放
射性或は螢光トレナーの使用等種々の他の方法を用いて
、流入溶媒濃度から流出浴媒瀝度を推定若しくは計算し
、それに基づいて補正曲線を作成することも可能である
。もし可能であれば、実際の流入溶媒濃度の尺度として
、溶離時間、試験管番号よりは、流出溶媒の濃度につい
ての何等かの絶対尺度を使用する方がよりよいと信じら
れている。

然しながらどの勾配系に対しても他のすべてのパラメー
ターが一定に保たれるならば、そこには規則正しい相関
が存在するので、溶離時間を一つの尺度或は指標として
使用し得ることに注目しなければならない。

紫外吸収測定 代りのそしておそらくはより望ましい流出液の同一性の
測定は、流出液を採集する範囲についての紫外吸収像（
以下ＵｖＡＰとする）特性によって与えられる。下記で
考察するように本発明者はＵＶＡＰＯ形が、処理速度の
変化といった抽出手順にある程度の変動があっても、尚
見分けがつけられることを見出した。典型的なＵＶＰＡ
を第１図に示した。この図はｐＨ５操作の流出液につい
て得られた。（第２図及び第６図に、ここに記載する他
の操作に際して得た同様の結果を示す。）第１図Ａから
第１図Ｃに異なった流速を用いた同じ物質の像を示した
が像は流速を変化させても見分けがつく程度に同一で変
らない。アセトニトリルのように、用いる溶媒の屈折率
を正確に測定するのが困難な場合には、ＵｖＰＡは問題
の流出物を同定するのにより望ましい手段であり、溶離
時間と結び付ければ本発明者が問題の流出物を同定する
のに最良の様式と考えられる方法を与える。

保持時間 紫外吸収を監視するに際して同時に６保持時間″及びカ
ラム注入時の溶媒濃度を示す為に装置に附属した目視表
示を監視するのは有益である。上述の如く濃度について
の表示数字は計算により実際の濃度の推定値に変換出来
る。゛保持時間”は溶離時間の一つの尺度である。以下
６保持時間′″をＨＰＬＣ実験を始めてからある特定の
流出分画が排出する途中、装置附属の紫外検出器を通過
する時刻迄に経過した時間を意味するものとして使用す
る。検出器と流出口との間の容積はＯ．８　Ｎであり、
流速は約１ｒｎｌ／　ｍｉｎであるので流出液が実際に
カラムから放出される４８秒前に検出器を通過する。

保持時間は、特定のカラムについては繰り返し使用に伴
う”老化″につれて変化する。ここに記載する保持時間
は、新しいカラムを用い、２２°Ｃと２４°Ｃの間の温
度で使用した際の値である。実際問題として標識を附し
た既知物質を、操作に際して同時に走らせ、ここで用い
る操作に対する老化カラムの補正を行うことは可能であ
る。

例えは本発明者は、精製された市販のＴｙｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙをこの目的に使用した。この物質が以下に考察す
る問題の主要物質の一種（ツ、下ベータ１．１１と呼ぶ
増幅因子）よりはＯ．８乃至１．２分早く再現性よく溶
離するからである。

ＢＰＨ５操作 以下に、第一回目のアセトニトリル精製操作（ｐＨ５操
作）を記す。この操作は例１から３までのどの標品にも
適用し得る。例１に記載のより手間のかからない標品を
用いれば経済的には明らかに有利である。

上述例１に従って調製した物質を下記のように分析用カ
ラムを用いるＨＰＬＣにより更に精製分離した。先ずｏ
、　０２　Ｍの試薬用燐酸水溶液に、５ＭのＫＯＩ（水
溶液を滴下し、溶液のＰＨがｐＨ５，０になるように調
整して、燐酸カリウム水溶液（恐らくはに２ＨＰＯ，と
ＫＨ２ＰＯ４の混合物）を調製する。この溶液をＰｅｒ
ｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ装置に分析用アセトニトリルと共に
入れる。装置が次の三つの勾配をカラムに供給するよう
にプログラムする。

（１，＋１０分間に燐酸溶液中のアセトニトリル濃配；
及び （３１１０分間に１Ｏ．０係から１５．０％にする直線
勾配。

流速は１ｍｌ　／　ｍｉｎとした。ついで、上述例１の
物質５−１０ｍｇを、Ｗａ　ｔ　ｅ　ｒ″ｍｕ　Ｂｏｎ
ｄａｐａｋ″Ｏ，Ｓ。

カラムに負荷してＨＰＬＣを開始する。

流出液を採集するに轟り、流水液の紫外吸収を装置に所
属する紫外検出器（最大目盛＝　Ｏ．３２単位）で走査
する。吸収値の図形の一つを第１図に示す。見掛けの溶
媒濃度、保持時間及び紫外吸収を記録する。実験結果ｆ
：以下に説明するとともに下に表Ａとしてまとめた。

本手順で抽出されるいくつかの生物学的物質（以下ベー
タ、デルタ、ゼータ、及びエータの名称で同定）は“３
７９特許に記載する調節因子検定法で試験されている。

本発明者はこれらの物質が増幅因子活性を示すことを見
出している。それ故これらの流出分画は採集保管したが
、その他の分画（以下アルファ、ガンマ、エプシロン、
及ヒテータの名前で同定）は放棄した。

上述の如く溶離操作中、流出液の紫外吸収を２１、　Ｏ
ｎｍで走査し、その際最大目盛をｏ、６２単位に設定し
た。第１図に表すように、本発明者は保持時間１２−１
’４分（装置の表示の観察からすれば凡そアセトニトリ
ル濃度Ｏ．５乃至ｏ、拶一定実濃度として凡そＯ．１乃
至Ｏ．２　％　）に、他から離れた二重の紫外吸収極大
を見出した。この極大に関連して出て来る物質をここで
はアルファと命名する。この物質には既知の免疫学的活
性はない。然しなからこの物質の溶離はここでベータと
命名し本発明者が顕著な増幅因子活性を有することを発
見した物質がまさに溶離してくるという目印（マーカー
）として役立つ。

ベータは約３分後即ち保持時間として１５分と２０分の
間に溶離する。ベータは鋭い−１の紫外吸収極大（ここ
ではベータ極大と呼ぶ〕と共に現われ最大目盛に達する
。表示溶媒濃度は１．２から２．２％、推定溶媒濃度は
Ｏ．４から１．５係である。

ベータ極大の先端の部分はたびたび見、下ベータ１．１
２と記載する物質を含み、本発明者はそれをＴｙｒ　−
Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ　、又はその誘導体と同定した。

時にこの物質はベータ極大の肩として現われる。

例えば、第１図では約１５分に小さな屑があり、これが
Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ金含有流出液に相当する。

他の例として第１図Ａ（２１及び２２分の間の谷の部分
にある小さな極大）、第１図Ｂ（主ベータ極大の前に来
る約１１−１２分のＣＭ）を参照されたい。

ベータの直後、即ち約１７及び２２分の保持時間に、こ
こでがンマと命名する物質が溶離する。

ガンマ物質は、他から離れた巾の広い紫外吸収として或
はベータの溶離の終期に吸収値の屑として現われるのが
特徴である。（第１図ではガンマは最大目盛の約４０％
の単独極大として示されている。

第１図Ａ−Ｃに示す実験ではがンマはベータの下降端の
肩に過ぎない。）アルファと同様がンマにも何等既知の
免疫学的活性はない。

ついで２６から２６分の保持時間領域に極大の集りがあ
る。これらの極大の第１（比較的低く最大目盛の６０或
は４０係以下）はここでデルタと命名し、増幅因子活性
を有する生物学的物質に和尚（換言すればこの物質の溶
離と共に出現）する。

デルタは２６−２８分の保持時間範囲で溶離する。

溶媒濃度は装置の目視表示で３．５から４．０％、推定
実濃度で２．８から３．６％である。デルタは本操作に
於ては一定の溶離位置を保たず時によると全くカラムか
ら離脱しないか又は次の物質（エプシロン）の中に埋も
れる。（第１図Ａ−Ｃの実験ではデルタは認めうる極大
としては溶離しなかった。）この群の中の次の大きな吸
収極大は最大目盛の約２０％（又はそれ以上）であり、
１分遅れて保持時間２７−２８分に現われ、巾の広い−
１或は二ｌ極大である。極大はここでエプシロンと命名
する物質を伴う。この物質には既知の免疫学的活性はな
い。

直後、約２分後、保持時間約２９−３２分に来る吸収極
大をここではゼータと名付ける。ゼータは増幅因子活性
を有する。以下に記載するようにゼータは次の操作によ
り２つの成分ゼータ−１及びゼータ−２に分離出来る。

ゼータ−２はゼータ物質のすべての増幅因子活性を含有
する。

その直後、約１分後（保持時間ろ０から６６分）にエー
タ＼が続き、次の極大を伴う。エータは増幅因子の一つ
を含有する。エータは極めて小さい巾の広い吸収極大が
次のそして最後のはるかに高い極大（テーク）の肩とし
て溶離する。（第１図ではエータはテークの肩として示
されている。）最後にテークが凡そ６２から６６分に溶
離するが、既知の免疫学的活性はない。この物質は一皿
の大きな吸収極大を伴う。（ある実験ではエータはカラ
ムからテークと分離して出て来ないで、テークと共に出
て来る。この様子は第１図Ａ−Ｃに例示しである。） 上述の知見をまとめ下記表Ａに要約する：Ｃ，アセトニ
トリル浄化操作 例４記載の物質には燐酸イオンが混在し、又外因性物質
（既知の有用な免疫学的活性のない物質）の除去精製も
不完全である。本発明者は、異なった溶媒系を用いる更
に一つのＨＰＬＣ手順を見出し、燐酸及び外因性物質の
除去を可能にした。その結果得られる物質はかなシの程
度に、外因性物質の混在を少くすると思われる。

先ずＯ．１％　（ｖ／ｖ）　）リフルオロ酢酸（Ｍａｌ
ｌｉ−ｎｃｋｒｏｄｔ、■ｎ、ｃ、、　Ｐａｒｉｓ、　
Ｋｙ、）水溶液を調製し、溶液に十分量の５ＭＫＯＨ水
溶液を滴下してＰＨ２，５Ｋ調整する。この溶液をＨＰ
ＴＪＣ用アセトニアセトニトリルθｒｋｉｎ−Ｅ］、ｍ
θｒ装置に入れる。

装置は、トリフルオロ酢酸水のアセトニトリル濃度が４
５分間［０，１％から４５％まで直線勾配になるように
プログラムする。（２５分間に２５係迄上げる実験も一
応満足な結果を与えるが、４５分間４５％がよし慎Ｍな
策である。）流速は１ｍｌ　／　ｍｉｎに設定した。つ
いでこの装置は下記の個別の３種の操作のいずれにも使
用した。

例４の手順を約４回繰り返し得られるベータ分画を集め
、既述のように”ｍｕ）３ｏ□＋ｄａｐａｋ”Ｏ．Ｓ．
カラムに負荷しＨＰＬＣを開始する。流出液は前述の例
の場合と同様、紫外吸収検出器で走査する。最大目盛を
１．２８に設定する。

混在するがンマ物質は表Ｂに示すように溶離するのでこ
れを放棄する。以下増幅因子ベータ＝１．０と命名する
物質は表Ｂに示すように溶離する。Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
’ｌｙは、後述するように免疫学的活性を有し、必ずで
はないがしばしばＰＨアセトニトリル操作に際してベー
タ極大の先端の小さな極大又は肩に関連する流出物とし
て認められ、時にはＴｙｒ’−Ｇｌｙ−Ｇ１７は先行極
大として見出される。（例４に続く考察を参照）。

同じ操作を例４記載のゼータ物質について繰ｐ返す。ゼ
ータは２つの成分に分画され、以下ゼータ−１及びゼー
タ−２と命名する。前者は既知の免疫学的活性はない。

後者は増幅因子活性を有する。ゼータ−１及びゼータ−
２は表Ｂに示すように溶離する。

Ｃ，エータを用いた実験 同じ手順を例４記載のエータ物質を用いて繰り返す。以
下増幅因子エータ−１と命名する物質が表Ｂに示すよう
に溶離する。実験前にエータ物質に混在していたテータ
物質は後で溶離するが放棄される。

残念ながら、デルタはこの手順を用いて回収されておら
ず、トリフルオロ酢酸で破壊されたと思われる。上述の
結果を以下の表ＢＫ要約する。第２図ＡＸＢに以上三つ
の実験に関するＵＶＡＰを示す。

１５−１８　　１５−１８　１１．８−１４．８　　　
ベータ−１．０２、　　１１−１４　　１１−１４　　
７．８−１Ｏ．８　　ゼータ−１１５−１９１５−１９
１１，８−１５，８ゼータ−２３、１８−２０１８−２
０１４，８−１６，８エータ−１２３−２６２３−２６
１９，８−２２，８テータ上記は三つの別個の実験であ
り、それぞれ三つの異なった物質（順番にベータ、ゼー
タ、そしてエータ）を使用した。

Ｄ、　　ｐＨ２−５操作 以下第二のアセトニトリルによる精製操作を記載する。

前述例乙に記載の手順に従って調製した物質を分析用カ
ラムを用いた１（ＰＬＯで下記のように精製分離した。

先ず前述例４に記載のように燐酸カリ水溶液を調製した
。但しｐｌ（は２．５迄調整するに止めた。この溶液を
ＨＰＬＣ用アセドアセトニトリル　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１
ｍｅｒ装置に入れた。

装置は下記の３種の勾配をカラムに供給するようにプロ
グラムした。（６１）１０分間に燐酸溶液中のアセトニ
トリル濃度をＯ．１係から５係に上げる勾配面）６１）
　４　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＬＣ７５プログラ
ム）；（２３３０分間に５チより２０ｑ６に上げる勾配
曲線Ｏ．２　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＬＣ７５プ
ログラム）；（３）１０分間２０チ流す一定勾配。流速
は１ｍｌ　／　ｍｉｎに設定した。

ついで例６に記載の主フルラム−反応性極大に関連する
フルラム−反応性″′Ｓ”分画５−１０ηを”　ｍｕ　
Ｂｏｎｄａｐａｋ″Ｏ．Ｓ、カラムに負荷し、Ｔ（Ｐ　
ＬＯを開始する。

紫外吸収検出器（最大目盛＝　Ｏ．（４８単位）によＱ
走査すると９個又はそれ以上の極大が現われる。実験の
結果は表３に要約しである。２１０ｎｍの紫外吸収の検
出値を第６図に示す。この手順によシ抽出された物質（
以下パイ、シグマ、エプシロンと命名する）を、’３７
９特許記載の方法で試験し、これらが増幅因子活性を示
すことを見出した。これらの流出分画は採集し保管する
。他の分画（以下ミュー、ニュ〜、クシ−、オミクロン
、ロー及びタウと命令する）は放棄する。

これらの増幅因子物質の溶離に関する実験結果を下記表
ＯＫ要約する。

８１次の精製操作 本発明者は更に上述の操作により得られた物質を、更に
精製し、よｐ多くの外因性物質を除去する精製法を開発
した。既述のベータ物質を上記の技法により更に分＃Ｊ
精製し、その結果得られた生成物は、それらについてア
ミノ酸分析を行い得る程十分な純度をもつに至った。そ
の操作を以下に記載する。

例６Ａ−ペターのエタノール精製 例４に記載のｐＨ５燐酸勾配から派生しベータ（我人参
照）と命名した物質を、加熱することなく真空蒸発器の
中で乾燥させた。この物質はＯ．１係のトリフルオロ酢
酸を用いてフルラム反応性出発物質２００ｒｎｇ当、！
ｌ）１００μｌの溶液になる採得溶解した。Ｐｅｒｋｉ
ｎ−Ｅｌｍｏｒの調製用カラムｉ　ＨＰＬＣに用いたｏ
　３−５　ＣＴｆＬＸ　２．８　ｃｍＯカラムにオクタ
デシルシランを充填し再溶解した物質を加えた。流速は
３．０　Ｎ　／　ｍｉｎ　Ｋ設定した。

装置は下記の勾配を供給出来るようプログラムした。

（月　３０分間に水中のエタノールヲｏ０から５Ｏ．０
係の濃度に上げる直線勾配： （２）５分間に５０係から口％エタノールとする直線勾
配：及び ｆ３）１０分間の１［１［１チ水という一定勾配。

吸収は最大目盛＝Ｏ．１吸収単位、２５４ｎｍで走査し
た。三個の主要極大が認められ、夫々１Ｏ．４−１Ｏ．
６分、１４．０−１３．０分及び１８．０−１９．０分
に溶離した。それらの生物学的活性を検定すると殆んど
すべての活性が、ここでベータ−１．１、と命名する中
間の極大に関連する物質中にあることが見出された。最
後の極大は主としてフェニルアラニンからなる物質と関
連して居り、用いる出発物質の約９０チを含有する。第
１の極大は、吸収単位について云えば、′ｆＪ２及び第
６の極大より低かった。第２及び第６の極大の相対的高
さは標品によって変動する。

屈折率測定に基くと、第２極大の流出液のエタノール濃
度は凡そＯ．１係からＯ．４係であることが解った。

ベータ−１．１、極大に関連する物質のアミノ酸分析を
行い次のような規準化値を得た。

８Ｘ　　２ ｈｒ　　１ ｅｒ　　Ｉ ＩＸ　　Ｉ ｒｏ　　２ ｌａ　　２ ａｌ　　１ 工１ｅ　　Ｉ Ｔｙｒ　　ｉ ｙｓ　　３ Ｈ１日　１ ｒｃ　　ｉ 本発明者は、ペプチド基の数が極めて少ない免疫学的活
性物質が、１種なのかもつと多いのかを確める為には、
前述の操作により得た物質を、よう以上に精製すること
が望ましいと決心した。本発明者は、一つのアセトニ）
　６１）ルＨＰＬＣ操作を考案し、その結果、現在迄に
増幅因子活性を有する次の２種の分子を抽出した。即ち
ジペプチドＴ７ｒ−Ｇｌｙを含有する物質とトリペプチ
ドＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ１ｙを含有する物質である。この
操作はある意味で例５に記載した”浄化”操作と類似し
ているが、異なったカラムを使用し、トリフルオロ酢酸
溶液は２倍稀釈されておシ、又勾配も異なる。ここで用
Ｍ いるＺｏｒｂａｘ　ＸＤｕｐｏｎｔカラムはシリカ粒子
に化学的に結合したオクタデシルシラン基を含有したＤ
ｕｐｏｎｔ製物質を充填した状態で入手出来る。

例６Ｂ−ベータ１．１の稀釈アセトニトリル精製例６Ａ
記載のベータ−１．１物質とＯＤＳ　ＨＰＬＣＭ カラム（Ｚｏｒｂａｘ　ＸＤｕｐｏｎｔ　）に注入、流
速は１ｒｒｔｌ　／　ｍｉｎ　、温度は２５°Ｃ０溶媒
系は（１）１００チアセトニトリル（ｃＨ３ＣＮ）　、
ＨＰＬＣ用、及び（２）Ｏ．０５係トリフルオロ酢酸水
溶液、ＨＰｌ、＋Ｃ用、ｐＨ２，５゜下記の直線勾配を
用いた。

時間区分　　集計時間　　係ＣＨ３ＣＮ以下ベータ−１
．１１と命名する問題の分画は、新しいカラムで凡そ２
３．８から２４．８分で溶離する。この物質は２１０ｎ
ｍの鋭く狭い紫外吸収の極大に関連し、通常４番目の極
大として観察される（若干の変動が存在する）。この物
質は凍結乾燥後、通常の食塩水に再溶解し以後の使用の
為に保管した。下記に示すようにベータ−１．１１はＴ
ｙｒ−Ｇｌｙ　、増幅因子活性を有するジペプチドを含
有する。

今一つの問題の分画がこのカラムから溶離するが、些か
不規則的であった。この分画が溶離する時には、保持時
間は凡そ２２．８−２３．２分であり、ベータ−１６１
１に関連する極大の直前に来るはつきりした２　１０　
ｎｍの紫外吸収極大と関連していた。この物質は凍結乾
燥後正規の食塩水に再溶解し、以後の使用の為保管した
。

下記に示すように、以下ベータ−１．１２と呼ぶこの物
質は増幅因子活性を有するトリヘプチド、Ｔｙ７−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙを含有する。

この操作の流出液中に存在することの屏っている他の成
分はＧｌｙ−Ｇｌｙ　Ｘ５ｅｒ−Ｐｈｅ及びＡ’ｌａで
あり、それと共に多分他のアミノ酸残基も含まれていた
。これらの他成分のいずれも、ＤＨ試験で検定した限り
は、免疫学的活性を持たないように見えた。

この問題の二成分間の混乱？防ぐ為、特に老化したカラ
ムを使用する場合に、本発明者は精製した市販のＴｙｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙをマーカーとしてカラム中を走らせる
のが有益であることを見出している。上述の如く、この
’［’ｙｒ−Ｇａｙ−Ｇｌｙは再現性よくベータ−１．
１１のＯ．８から１．２分前に溶離する。（はぼベータ
−１．１２と同じ溶離帯）。

ここでＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの精製手順を記載するが
、これは本発明者が発熱物質、内毒素、および市販製品
に混在する夾雑物を除去する為に考案した。

その目的は合成由来のＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ製品を、
前述の操作のマーカーとして、又ヒト対象に増幅因子と
して使用する為であった。本発明者が現在布その記載が
ないと信する、かくして得た製品は市販品には、通常見
出される、すべての有毒或は有害な夾雑物金全く含んで
いないと思われる。

例６　Ｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの精製１ｍｉｃｒｏ
ｇｒａｍ　（４）の合成結晶チロシルグリシルグリシン
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕ
ｉｓ。

ＭＯｏ）を１ｍ１ｃｒｏｌｉｔｅｒ　（μｌ）の正規食
塩水に溶かす。この溶液を９９μｌのＯ．０５％トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液と混合する。５０μｌのこ
の混合物を新しい逆相ＨＰＬＣ分析用カラム（Ｚｏｒｂ
ａｘ　、　　ＤｕｐＯｎｔ、　４．６　ｍｍ　Ｘ　２５
　ａｒｔ　）に注入し下記の直線勾配の組み合せで溶離
する。

溶媒Ａ＝１００％アセトニトリル 溶媒Ｂ−ロ、０５％トリフルオロ酢酸水溶液開始　　　
　　　　０　　　１００ １５　ｍｉｎ、　　　　　　　６　　　９４４５　ｍｉ
ｎ、　　　　　　４０　　　６０５０　ｍｉｎ、　　（
終了）　　　　０　　　　１００２１０　ｎｍにおける
溶離曲線吸収（最大目盛Ｏ．０５Ｏ．Ｄ、単位）は凡そ
２１．５乃至２２．７分に鋭く狭い、他の極大よりも遥
かに高い吸収を示す。この溶出物はＴＧＧ″Ｃあり、実
質的に夾雑物を全く含まない。（２２，７分という数字
は新しいカラムを用いた場合である。） 極大に関連する物質を回収、凍結乾燥後無菌正規食塩水
に溶解する。

ついで本発明者はベータ−１．１１物質についてアミノ
酸配列決定を行った。標準技法を用いて増幅因子ベータ
−１．１１がＴｙｒとａｌｙを含有しこの順番で出て来
ると決定した。その故に本発明者はこの物質がＴｙｒ−
Ｇ１７を含有していると同定以それが下記で考察するよ
うに、免疫学的に活性でチドのＮ−末端から除去してア
ミノ酸配列を決定する。）本発明者は、更にベータ−１
．１１中にＴｙｒ−Ｇ’１ｙ−Ｇ’ｌｙを検出し、下記
に考察するように、免疫学的に活性であることを見出し
た。小量の工１θ及びＬｙｓも検出された。これらは用
いた手順に伴うアーチ７アクトであるか、又は標品中に
比較的低濃度に存在する一種或は多種の分子中にある小
量の工ｍｅ／Ｌｙｓ成分（仮説的ではあるが例えばＴｙ
ｒ−工１ｅ−Ｌｙｓ　、　　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｅ　
ＸＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−工１ｅ）を意味する可能性
がある。本発明者は、現段階でこのＩＣｅ／Ｌｙｓ物質
は単にアーチ７アクトであるか又は意味のない成分であ
ると信する。

本発明者は、ベータ−１．１２物質についてもアミノ酸
配列決定を行いＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含有している
ことを見出した。下記に考察するように１本発明者はこ
のトリペプチドが免疫学的に活性であることを見出した
。

本発明者は異性体の形が存在するのが（例えばＤ−アミ
ノ酸の形）、ベータ−１．１１及び１゜１２のＴｙｒ−
Ｇｌｙ及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ物質がそれらに結合
した他の残基（例えばメチル、アセチル、アミド）′ｆ
：持っているのか、或は金属イオンとの錯塩（例えばお
そら（Ｚｎ＋、　’Ｃａ＋、　Ｆｅ＋、　Ｍ碑又はＭｇ
”）が存在するのか、更に若しそうなら何か他の形が異
なった免疫学的活性を持つのかについては確めていない
。下記に述べるように、いくつかの免疫学的検定結果は
ベータ−１．１１及びベータ−１．１２はある点でそれ
ぞれ化学的［製造したＴｙｒ−Ｇ’ｌｙ及びＴｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙとは異なることを示唆し、その理由として
は天然（即ちヒト）物から抽出した標品が精製したペプ
チド化学品よりも免疫学的活性が大きいようにみえる。

（Ｎ製した化学品はメチル、エチル等の置換基を持たず
、又Ｚｎ＋やその他のイオンと錯塩を形成していないが
Ｄ−アミノ酸残基異性体は含有しているかも知れなへ）
天然由来のベータ−１．１１及び１．１２増幅因子標品
は、ヒト又は動物体内で（Ｘ）Ｍ　（Ｙ）という錯塩の
形で存在すると推論する理由はある。ここで（Ｘ）及び
（Ｙ）はそれぞれＴｙｒ−Ｇ］、ｙ　ＸＴｙｒ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙを構成している基から選ばれたものであり、Ｍ
＋はＺｎ＋又はＣａ＋、　Ｆｅ″＋２Ｍｎ１＋−又はＭ
ｇ＋ｆのような２価金属イオンである。Ｔｙｒ基には陰
性部位があシ、それはＭ＋イオンと結合しうるし、最後
のＧｌｙにも同様に結合出来るＣ−末端陰性部位がある
。

こういった錯塩の混合物という可能性も十分に、ある。

本発明者は、ヒトから得た物質中のＴｙｒ−ＧｌｙとＴ
ｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの比を分析するＡに、Ｔｙｒ基を
放射性ヨウ累でヨウ素化し、次にＴｙｒ−Ｇ１７とＴｒ
ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ部分を、グル電気泳動で分離した。

若しくＴｙｒ−Ｇ’ｌｙ）Ｍ＋Ｆ（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ）錯」釡のみであれば両者は１：１の一定比である
ことが期待される。しかしながらそういったことは起ら
ず、代りに観察された割合は試料毎に変動した。この事
実は数種の異った物質或は錯塩、例えば（Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｙ）Ｍｎ　（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ）、（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ）Ｍ
″“（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、及び（Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ）Ｍ＋（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）が、未だ
同定されていない生理学的要因によって変動する種々の
割合に存在していることを示唆する。

前述のアミノ酸配列決定の結果から、そしてそれに後述
の生物学的検定結果を照し合わせて、本発見者は以下の
如く結論する。既述のベータ物質の中で生物学的に最も
有意義な単−或は複数の成分は、アミノ酸Ｔｙｒ及びＧ
ｌｙを１：１又はに２の比で含有し、決定的な量の他の
如何なるアミノ酸を含有しないことで更に特性づけられ
る。ベータ物質に存在するＴｙｒ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙはその比が一定巻しくは可変の混合物と
して存在するのであろうし、どちらか一方或は両方の分
子が金属イオン（例えばＺｎ＋、　Ｃａ＋、　Ｆｅ＋、
　Ｍｕ＋、又はＭｇ＋）と錯塩を形成している可能性が
あＱ１又両方の分子が恐らく金属イオンを加えて、互に
錯塩を形成しているかも知れない。最終物質から除去さ
れた物質、例えばｐｈθやＧｌｙ−Ｇｌｙは本来免疫学
的活性をもたないが、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ物質と共同作用して後者の安定性又は免疫学
的活性を増強している可能性がある。

上述の一連の操作は、約１０１Ｏの白血球からの抽出物
を含んだ白血球透析外液を用いて開始する。

その結果例６記載のフルラム反応性物質約６０口ｍ９が
得られる。ついでこのものはベータ−１．　０約５００
　ｎｇｋ与え史にＴｙｒ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ−Ｇ’１ｙ
−Ｇｌｙをそれぞれ３若しくは４　ｎｇ与える。００−
１ｐ量のＴｙｒ−Ｇａｙは、後述するように凡そ１臨床
量単位であるが、凡そ４Ｘ１０５の白血球から得られる
。

（然しなから、同じ出発物質は凡そ同じ量の問題のトリ
ペプチドＴｙｒ−Ｇ１ｙ−Ｇ’ｌｙをも与える。）！３
７９特許には記載していない新しい生物学的検定方法を
開発した。１６７９特、７Ｆに於ては、増幅因子活性は
正常対象者が成る抗原に再び遭遇した際のＤＨ（遅延性
過敏性）Ｋ対するｉｊ■、！７強によって検定すると記
載しである。本発明者は、これに加えてその後下記の有
益な検定方法を見出している。

（１ノ　　抗原誘発性の”白血球阻止因子”の増強（″
Ｌニド）； （２）　　マイトジェン、抗原或はアロ抗原の刺戟によ
るインターロイキン−２産生の増強（″より−２”）； （３）細胞障害性細胞のＲａｊｉ細胞への分化に対する
増強； （４）　　マイトジェン或は抗原で刺戟されるインター
ロイキンマの産生増強： （５）　　工Ｌ−２に対する高密度受容体の発現増強。

本発明者は基準（４）は基準（２）のＩＬ−２の産生増
強に対する二次的なものと信する。ベータ及びゼータ−
２は５種の基準の中食くとも６種並びに７６７９特許記
載のＤＨ応答増強の活性を示す。

ベータは５種全部の活性を示し、ゼータ−２に・ついて
ｕＬ工Ｆ検定をまだ行っていない。デルタはマイトジェ
ン誘発工Ｌ−２産生を増強する。エータは細胞障害性細
胞のＲａｊｉ細胞への分化を増強する。デルタ、エータ
、パイ、シグマ、及びエゾシロノは６７９特許記載の増
強されたＤＨ応答を示すが、それ以外の新しい検定方法
については試験していない。

ＤＨ増強検定の工程表は１６７９特奸に載せである６　
Ｌ工Ｆ検定はＧｏｔｔｌ土ｅｂ等、Ｍｏｄｕｌａｔｉｏ
ｎ　ｏｆＨｕｍａｎ　Ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ、　Ｊ、　Ｊｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１３２．２５６
−２６０　（Ｊａｎ、　　１９８４）の論文の２５７頁
に記載されている。他の検定の工程表は当業者には明か
であると信する。

既述のように、本発明に係る物質は増幅作用を有するこ
とを既に示した。これは以下に記すように、ｌ３７９特
許記載のＤＨ検定法を用いて行われた。

゛上述例５に記載のベータ−１．０の倍数稀釈を１ゴの
食塩水溶液中に軟膜白血球４Ｘ１（４８よｐ得た増幅因
子を含む溶液から作った。Ｏ．０５ｍノの破傷風トキソ
イドを”Ａｏ乃至％０に稀釈し患者に小さな（好ましく
は５×５ｍよシやや小さい）皮膚反応を起させるように
し、それに稀釈ベータ−１．０種品Ｏ．１１ｎ！３を加
える。数種の異なった稀釈のベータ−１．ｏと同時に同
量の破傷風トキソイド（ＴＴ）をベータ−１．ｏを加付 え　　く患者に皮下注射した。患者の腕に生ずる応答皮
膚部位の各々について概ね直交する２方向の直径を以下
に示す時間に測定した。

（“ＴＴ十〜”はＴＴと指定した濃度迄稀釈したベータ
を意味しＴＴ”の＆はベータ−１．０なしのＴＴ　’？
’ある。） ５時間後、Ｔ’Ｉ’＋１０−８、ＴＴ＋１０−９、及び
ＴＴへの応答は夫々１４Ｘ１４關、１９Ｘ１４、及び６
×６であった。２４時間後：２０Ｘ２４ｍｍｚ　　１９
　×２３．１４　×１２゜例７を、例６Ｂ記載の産生物
１μｌ当９１μｇから始めだ、増幅因子ベータ−１．１
１の倍数稀釈について繰り返した。例６Ｂ記載の産生物
１０口ｐｇは凡そ軟膜白血球６×１（４８から得られた
量であると推定される。又増幅因子ベータ−１．１％の
分子量は凡そ２６９であると推定出来る。それ故、１μ
ｇ／μｌは凡そ４ｍＭ溶液である。４　ｆＭ　（フエン
トモル）及び３．４　ｆＭの稀釈を調製した。

例７記載の手順に従うと、５時間後の観察でＴＴ　−）
−［］、１１ｍ１３４ｆＭＸＴＴ　＋　［１，１ｍ１３
Ｏ．４　ｆＭ及びＴＴに対する応答はそれぞれ７×８朋
、９×９、及び３×５であった。２４時間後：１８Ｘ２
１ｍｙｘ、１９Ｘ１９．１４Ｘ１５゜ 例７を例６Ｃ記載の産生物１μｌ当ジ１μｙよジ始めた
ベータ−１．１２の倍数稀釈について繰り返した。例６
Ｃ記載の産生物１００　ｐｇは、凡そ軟膜白血球３Ｘ１
［）８から得られた量であると推定される。又増幅因子
ベータ−１．１ｍの益子量は２９５であると推定される
。それ故１４７μｌは凡そ３　ｍＭ浴溶液ある。３　ｆ
Ｍ及びＯ．３ｆＭの稀釈を調製した。

例７記載の手順に従うと、５時間後の観察で、ＴＴ十Ｏ
．１　”　３　ｆＭＸＴＴ　＋　Ｏ．１　ｍｌｌ　［１
，３ｆＭ及びＴＴに対する応答はそれぞれ７×８ｍｍ、
９Ｘ９、及び３×５であった。２４時間後：　１８Ｘ２
１ｍｍ、　　１　９Ｘ１　９、１　４Ｘ１　５゜ベータ
−１．１２の場合、ＤＨ応答がベータ−１．１２そのも
のによる（即ち、本質的ＩＣＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙか
らなる物質による）のか又はベータ−１．２の代謝物ベ
ータ−１．１１（即ち、本質的にはＴｙｒ−Ｇ１７より
なる物質）によるのかは定かでない。Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙというアミノ酸残基配列を含むペンタペプチド（
エンケファリン）がこの分子（即ちＨ２Ｎ　Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−’Ｇｌｙｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−ＯＨ）のＧ１７−
Ｇｌ７アミド結合を開裂して加水分解するジペプチジル
アミノペゾチダーゼの作用により生体内で分解されるこ
とが知られている。（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ　。

Ｍａｌｆｒｏｙ、　ａｎｄ　Ｂａｕｍｅ、　ＢｉＯ３，
ｏｇｉｃａｌ　１ｎａｃｔｉｖａｔｉ□Ｈｏｆ　ｅｎｋ
ｅｐｈａｌｉｎＳａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｅ
ｎｋｅｐｈａｌｉｎ−ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｃａｒｂ
ｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ　（”ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ
ａｓｅ”）ａｓ　ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、　２
９　Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ１７
１５．１７１６（１９８１）には多数のこの分野の研究
が引用要約されている。）それ故にＴｙｒ−Ｇ１７−Ｇ
１７の見掛げの免疫的増幅効果はＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙその自体よシも寧ろＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの代謝物
であるＴｙｒ−Ｇｌｙに起因しているのかも知れない。

（例えばヘタシリンは生体内で一部アンビリシンに転換
されるので、同様の効果を出すことが知されている。即
ちヘタシリンの代謝物が抗生物質として作用する。） 一方、どちらの分子も元来免疫増幅効果を有する可能性
もある。例えば、このリンフ才力インの受容体部位がこ
の分子の’ｌ”ｙｒ−Ｇｌｙ部分と結合し、残ジのひ１
ｙアミノ酸残基は受容体への結合及び生物学的活性には
、中立的な役割を持つということもあ逆得る。又Ｔｙｒ
−Ｇｌｙ−σ１ｙが異なった受容体部位と相互作用をす
るがＴｙｒ−Ｇｌｙと同様の生物学的効果を有すること
も可能である。さもなくば、両方のペプチドの恐らくは
痕跡量の金属（例えばＺｎ＋、　Ｃａ４＋、　Ｆｅ”、
　Ｍｎ＋又はＭ　ｇ（＋　）を介した錯塩が必要なのか
も知れない。この問題の解決は例えば適当なアミノペプ
チダーゼ阻害剤の存在でＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇａｙ中のＴ
ｙｒ−Ｇｌｙアミド結合を分解されてＴｙｒ−Ｇｌｙが
産生するのを抑制して行う体内でのＴｙｒ−Ｇ’１ｙ−
Ｇｌｙを用いた試験といった将来の研究を待つ必要があ
る。Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙがそのま＼で作用するにし
ろ、代謝物Ｔｙｒ−Ｇｌｙとして作用するにしろいずれ
にしても、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ１７は明かに増幅因子活
性を増強するのに用い得る（丁度ヘタシリンがアンピリ
ジン様効果を発揮するのに用いられるように）。従って
本発明の範囲内と考えられる。

この問題はその外の要素によって更に複雑となる。本発
明者は市販の合成製品を精製して調製したＴｙｒ−Ｇｌ
ｙ及びＴｙｒ−Ｇａｙ−Ｇｌｙ標品について検定を行っ
た。本発明者はこれらのＴｙｒ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇ工ｙ標品を精製し医薬品として受け入れられな
い（毒性の有能性のある）爽雑物をそれらから除去した
。精製した市販のペプチドの示す免疫学的活性は（活性
化合物の同重量について）ヒト白血球透析液よ９得た対
応する標品よす低い。若しヒト由来の産生物が精製市販
ペプチド製品と同一であるならば、こういった相違が起
ってはならない０ それ故本発明者は両者は同一でないと結論する。

市販製品は一部又は全部生物学的産生物とは異な７す る同位体形かも知れない。生物学的物質は、既に考察し
たように例えば痕跡量のＺｎ　　といった金属イオンと
錯塩を形成しているかも知れない。生物学的物質は化学
的な差異の為に合成化学物質より生体内でより安定かも
知れない。精製化学製品は唯単なるシペゾチド又はトリ
ペプチドそのものであシ、それらからの誘導体ではない
のに対して、生物学的産生物は、Ｈの代ジにメチル、ア
セチルアミドのような置換基金含有してるかも知れない
し又こ＼で使用した分析法では検出出来ない他の化学的
変化を起しているかも知れない。

然しなから、市販化学品由来の製品は生物学的によシ活
性が低いように見えるけれども、これらは調製するのに
より安価であり、恐らくより繰ジ返し可能な結果を与え
るであろう。従って、いろいろな要素の利害得失を考慮
して、化学的に得た製品は、恐らくは最適ではないにし
ろ、生物学的に十分でろり、それ故により好ましい商業
的実施態様の基盤であるという結論を導き得よう。

本発明者はここで本発明に記載する他の増幅因子のＤＨ
検定結果に戻る。

例８　デルタのＤＨ検定 例７に記載の手順を例４記載のデルタについて繰り返し
た。６時間後、ＴＴ　＋　Ｉ　Ｏ−７及びＴＴへの応答
は夫々１９Ｘ１８朋、１３Ｘ１１であった。２６時間後
：　２３×２９ｍｍ、７Ｘ６゜例９　ゼータ−２のＤＨ
検定 例７記載の手順を例５記載のゼータ−２について繰シ返
した。ここでは、ＴＴＯ代Ｑにツベルクリン（’ＰＰＤ
”）から得たＮ＃蛋白を用いた。

１２時間後ノＰＰＤ　＋　１０”−６、ＰＰＤ＋ｉ［］
−７、ＰＰＤ　−１−ｉ　［１−８、及びＰＰＤへの応
答はそれぞれ、１　Ｘ　１ｍｍ５１５Ｘ２２．１４Ｘ１
１、及び１×１であった。２７時間後”　２　Ｘ　２　
ｍｍｚ　　２２　Ｘ２４．１５×１５、及び６×６゜ 例７記載の手順を例５記載のエータについて繰夛返した
。４時間後、ＴＴ　＋１０−”、ＴＴ　十１０−４、Ｔ
Ｔ＋１０−５、ＴＴ＋１０−”、及びＴＴへの応答はそ
れぞれ２×３ｍｍ、７Ｘ７．２×３．３×６及び２×２
であった。１６時間後＝８×１１　ｍｗｚ　１６　×２
０　％　１６　Ｘ　１５．４×５、及び６×４゜ 例７記載の手順を例６記載の物質パイについて繰り返し
た。６時間後、ＴＴ＋１０”７、ＴＴ十１０−８、ＴＴ
＋Ｉ　Ｏ−９、及びＴＴへの応答はそれぞれ８×１０朋
、１２×１１．７×８、及び２×３であった。２１時間
後：　１２　Ｘ　１２ｍｍｚ２１×１５．１５×１６、
及び１４Ｘ１３゜例７記載の手順を例６記載の物質シグ
マについて繰り返した。４時間後ＴＴ　＋　１０−７、
ＴＴ　−１−１０−８、ＴＴ＋１０−９、及びＴＴへの
応答は１２ｘｉ　１ｙｎｘ　　１３Ｘ１２．４Ｘ２、及
び４×２であった。８．５時間後：１７Ｘ１５朋、１９
×２Ｏ．５×４、及び５×４゜ 例７記載の手順を例６記載の物質エプシロンについて繰
）返した。５．５時間後、ＴＴ＋１０−↓及びＴＴへの
応答はそれぞれ１６×１０ｍｍ。

１０×８であった。９時間後二１５Ｘ２５．１３Ｘ１０
゜１１時間：２５Ｘ２３．１２Ｘ１５゜ 本発明に係る増幅因子物質のヒト免疫系応答を増幅する
効果は多数のＡＩＤＳ　（後天性免疫不善症候群）及び
ＡＲＥ３　（ＡＩＤＳ−Ｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｍｐｌｅ
Ｘ　）患者で試験されて来た。この研究で用いたすべて
の増幅因子物質はＬｉｍｕｌｕｓ検定（Ｍ、Ａ、　Ｂｉ
ｏｐｒｏｄｕｃｔｓ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａ、）用いて検定した限りで
は内毒素の混在はなかった。下記の例で実施した試験を
例証する。（以下で用いる用語”Ｔ−ヘルパー細胞はＴ
４　、ＣＤ４　、Ｌｅｕ３　及びＴ４と命名される細胞
を包含する。） 本発明者は経験的な方法によシ、以下に記載する手順に
於ては、これらの製品の有効投与量は白血球４００，０
００から得られ例５記載の方法で精製されｏ、ｉ　コの
無菌生理的食塩溶液に溶解したものであることを確認し
た。（この白血球４ｘ１０５から得られる投与量を以下
時々″１ベータ標準投与量”と呼ぶ。） カポジ肉腫を持つＡＩＤＳ患者、ＤＴ、に本人の双子兄
弟（正常健常人）かも得た同系白血球と共にベータ−１
．０を投与した。ＤＴは又ベータ−１．０なしに同様の
輸注も受けた。

第一回目の約１−Ｏｘ　１０１ｏ同系白血球の輸注（ベ
ータ−１．０無添加）はＤＴに中程度の植物凝集素（Ｐ
ＨＡ　）に対する増殖応答を起こした。

１６日以内にこの応答は弱まシ基準値に達し、循環中の
ヘルパー白血球のサプレッサー白血球に対する比（Ｔ４
／Ｔ８比〕に変化はなかった。

第一回目の輸注から１０日後にＴＤＫ１回のベータ標準
投与量（上記４０Ｏ．ロロＯ白血球から得た投与量）を
与えた。ＤＴのＰＨＡ応答に効果はなかった。

次の一連の治療を２回目の同系白色法の輸注（再び同数
の白血球）に続り２４．４８．７２時間後のそれぞれ４
００２口０Ｏ．４，０００，０００゜及び４０口、ロロ
Ｏ（即ち１．１０、及び１標準投与量）から得た量の増
幅因子皮下投与よシ構成した。これに伴いＤＴのＰＨＡ
応答は有意に増加した。その際同時にＴ４／Ｔ３比か増
大しその結果Ｔ４＋細胞の絶対数が増加しＴ８＋細胞の
数が減少した。約１ケ月後免疫応答に関するこれらの数
値は低下し概ね以前の水準に達した。

第一回目と同様な第三回目の輸注（無ベータ）を与えた
。ＰＨＡ応答にもＴ４／Ｔ８比にも効果は観察されなか
った。

これらの研究を行う間、平行して工Ｌ−２の産生の研究
も行った。はじめには、ＰＨＡＫ応答する工Ｌ−２の産
生は観察されなかった。これは患者のマイトジェンに対
する低い増殖応答と相互関連があった。第一回目の白血
球輸注はこのパラメーターに影響しなかった。第二回目
の輸注（白血球並びにベータ−１．０共）の後には、Ｐ
ＨＡは有意の水準に工Ｌ−２を誘発した。

１５人からなるＡＩＤＳ患者の集団にベータ−１．０の
標準投与量を毎月１回６投与量に達する迄（３ケ月）与
えた。これら１５人の患者の中、６人はカンジダ感染（
カンジダ症）をも六１２人はカボジ肉腫分もっていた。

臨床症状を監視したところ、体重減少もなくベータの胃
性も認められなかった。

有意なカンジダ感染の減少が治療の結果観察され、４分
の６の患者が治療予定を完了した。

破傷風トキソイドに対する皮膚試験感受性（ＤＨ試験）
は、４７チの患者で著しく増強した後再び殆んど平常の
水準に戻った。ｗａｌｔｅｒＲｅｅｉのＡＩＤＳ　／Ａ
Ｒ８ｇ症度分類（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ。

Ｍｅａ、３１４．１３１　（１９８６）参照）によれば
、カンジダ感染と皮膚感受性の喪失は高度に進行した免
疫不全の徴候であり、ベータ−１．０のこれら症状を回
復する有効性は医学的に有意義である。

マイトジェン誘起の白血球増殖は投与毎に逐次増大し、
マイトジェン誘起の工Ｌ−２産生も少くとも６０％の患
者で増大する。ポーフライ一ド（北米産ヤマゴボウ）マ
イトジェン（ｐｗＭ　）への応答はｍ３当＃）５０−１
００以上のＴ４＃胞を保持している患者では増大する。

１４人の患者からなるＡＩＤＳ患者の集団にベータ−１
．０の１標準投与量を２週間毎に６回（凡そ６ケ月）与
えた。これらの対象患者の中、６人はカンジダ感染を持
ち、１１人はカボジ肉腫を持っていた。

臨床症状を監視したところ、１４人の患者中１１人では
体重が増加し、１１人に平均体ム増加４．４ボンドが起
った。ベータ−１．０の毒性は認められず、血清尿酸濃
度は低下し、クレアチンホスホキナーゼ濃度も低下した
。高濃度の尿酸、クレアチンホスホキナーゼはＡＩＤＳ
に特徴的な組織破壊を反映し、これらの物質の濃度低下
及び体重減少の回復は有意な臨床的改善を示唆する。

破傷風トキソイドに対する皮膚反応感受性は対象の５７
係で回復した。カンジダ感染は６名の対象では完全に消
失し、他の１名で軽減した。

マイトジェン誘起の白血球増殖は増大した。

ベータ−１．０２回投与者の患者の６０４でマイトジェ
ン誘起の工Ｌ−２産生が増大した。

また、ベータ−１．０２回投与後に、すべての患者にお
いて、５Ｏ−１００Ｔ−ヘルパー細胞Ｃθ１１／　ａｎ
３以上が保持されていた。

ホークライードマイトジェン（ＰＷＮ）に対する応答は
ｍｖｔ５当９５０−１００Ｔ以上のＴ−ヘルパー細胞を
保持する患者で増大する。ＰＷＮに対する弱い増大が第
２回目の投与後ｒｎｒｒｉ’当り５０−１００より少い
Ｔ−ヘルパー細胞を保持する患者に現われたが、次の２
回の投与に続いて除徐に増大しだ。

ベータ−１．０による治療中Ｔ−ヘルパー細胞の破壊速
度の低下があった。例えば無治療のＡＲＣ患者は典型的
な場合１ケ月に約１３．４細胞の速度でＴ−ヘルパー細
胞を失う。既述の１月毎にベータ−１．０を投与された
ＡＲＣ患者（例１５）では、Ｔ−ヘルパー細胞喪失は７
．２細胞／月であるのに対して、２週間に１度それを投
与された患者（例１５Ａ）では、Ｔ−ヘルパー細胞喪失
速度は４．２細胞／月であった。これらの数値はベータ
−１．０はＡＲＣに典型的なＴ−ヘルパー細胞破壊の速
度を低下することを示す。ここで破壊遅延は投与量に比
例する。

例１５Ｂ　　ベータ−１．０の連続投与：第６群５名の
患者、Ａ］′Ｄ８６名（ＲＢ、ＪＢ、及びＲＧ）とＡＲ
Ｃ２名（ＷとＣＭ　）をベータ−１．ＯＴ：凡そ１年の
間治療した。（２週毎に皮肉に１標準投与量）。皮膚試
験感受性は３名で完全に１名で部分的に（ＲＢ、　ＪＢ
、　ＷＷ、及びＣＭ　）回復した。

カンジダ感染は２名の初期にそれをもった患者（ＲＢと
ＣＭ　）で改善し、他の患者には現われなかった。Ｔ−
ヘルパーａ　Ｎｇｌの百分率は一過的に４名の患者（Ｒ
Ｂ、　ＲＧ、　ｗ、とＣＭ　）　Ｔ増加シタ。

３名ノＪａ者（ＲＥ、　’ｆｆ、とｃｍ）ｄ可成ｐ体厘
を増加した。ＰＨＡ−誘起の白血球増殖は５名全員で、
ＰＷＭ応答は４名（ＲＢ、　Ｒ（）、　ＷＷ、とＣＭ　
）で、■Ｌ−２産生け６名（ＲＢ、　ＷＷ、とＣＭ　）
　テ増大した。

これらの試験はベータ−１０口が人体のＴ−ヘルパー細
胞集団に陽性の効果を有し、Ｔ−ヘルパー細胞失損分特
徴とするヒト免疫応答の改善に有用であることを意味す
る。ベータの投与はＴ−ヘルパー白血球中の損失サブセ
ットの機能を部分的に修復すると思われる。患者ＤＴに
行ったような試験は、ベータがＡＩＤＳ　、患者に見ら
れるＴ８＋細胞の過剰部分が存在する場合ですら、Ｔ−
ヘルパー細胞機能の損失を部分的に直し得ることを示唆
する。

さらに、ぺ〜夕が免疫学的機能を改善する為には、残存
Ｔ−ヘルパー細胞機能にある最低限の水準があると思わ
れ、若しＴ−ヘルパー細胞喪失が余シにも厘症であれば
、リンホカインとしてのベータの投与に応答し、その結
果免疫学的に再構築されるに十分なＴ−ヘルパー細胞が
残存しなくなるであろう。上述の結果は、Ｔ−ヘルパー
細胞密度が１００細胞／　ｍＸ以下に低下すると、免疫
学的機能を再構築するのが困難或は不可能になるのでは
ないかということを示唆する。

例１６　免疫応答の増大 増幅因子は例５に記載のように調製精製し、プールし、
凍冷乾燥後生理的食塩水又は生理学的に許容可能な他の
溶媒に再溶解する。適宜の有効投与量（例えば白血球４
Ｘ１０５から精製した量であるベータ−１．０の標準投
与量を含むＯ．１属溶液〕を皮肉注射する。増大する免
疫応答性を、患者がそれに対して感受性のあることの解
っている任意の抗原（例えば破傷風トキソイド）への患
者の反応性によって増幅因子投与前後を比較しながら監
視する。

いくつかの増幅因子を、望まれる効果に従い、単独若し
くは混合して投与する。増幅因子の投与により起こされ
る全身的調整の持続は患者によって変動するので、例え
ば上述したような適当な感受性試験で定期的に監視しな
ければならぬ。担当医師の職業的判断に従い望まれる免
疫性の増幅を維持する為の必要に応じて追加用量を投与
する。

例１６Ａ　　化学療法 化学療法を受けるある患者の免疫系応答が低下している
。担当医師は患者が日和見感染に罹るかも知れないと気
づかい患者の免疫系活性の増大を望む。成人男子である
患者の体重は７０ｋｇである。

医師は自身の医学的判断から適当と思うベータ−１．１
１又は１　、　１２　、ＴＧ（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ）又はＴ
ＧＧ（’Ｉ’ｒｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）の投与量を決定す
る。（例えば上述したベータ−１．１１又は１．１２の
有効投与量又はＴＧ　６０　ｐｇ若しくはＴＧ、Ｇ　８
０ｐｇを毎週）、　この投与量を皮肉若しくは皮下に注
射する。

患者の免疫機能を患者の免疫能を測定する週毎の血液検
査で監視する。毎月抗原（例えば破傷風トキソイド）の
繰り返し注射による検査も行う。

医師は患者の経過を監視し自身の医学的判断の命するの
に従い投与量を増減する。

増幅因子物質を皮膚吸収させる方がそれを皮下注射する
よりもよシ好都合であることが解って米用いれば一定用
量の増幅因子物質をよシ緩徐に投与出来、従ってより長
期に亘って治療効果がある。

最後に、経口投与は出来ない場合もあろうから、この投
与経路は最終使用者が必要に応じて行う自己投薬に際し
ては、他の経路よシも広い可能性を有する。即ちストレ
ス状態が個人の免疫系に及ぼす有害な効果に即座に対抗
する場合或は定期的な医学的監視の間の慢性症例（例え
ばリューマチ性関節炎、糖尿病又は老齢性アレルギー）
を治療する場合といった例が挙げられる。

免疫系不全に罹った患者を以下のように例５に記載のベ
ータ−１０口で治療する。患者の前腕を７０％のイソプ
ロピルアルコール拭いた後乾かす。予めオートクレーブ
で事前滅菌したヤスリ板（薬局型）を軽く使って患者の
皮膚表面を擦る、即ち５−６回板でなでる。皮膚のその
部分を７０係のイソプロピルアルコールで拭きそして乾
かす。

医学的に決められた用量のベータ−１．０を救急絆創膏
（例えばＪｏｈｎｓｏｎ　＆　Ｊｏｈｎｓｏｎ　”バン
ドエイド”）のカーゼ部分、凡そ２５ｍｍＸ１．５ｒｔ
ａｕ、に塗りつけて擦った部分に塗布する。

医学的に決められる用量は処方医の選択に委せられるべ
きものであるが、ベータの標準投与量は適当であろうと
信する。

同じ手順はエータ、ゼータ−２及び他の増幅因子にも使
い時る。

■　ワクジンと臨床試薬 増幅因子は、単独又は混合で弱いワクジンに免疫応答を
生じさせるのに使用し得る。多くの病原菌、例えばいく
つかの黄色ブドウ状菌亜種とかヒストプラズマ症やカン
ジダ症の原因となるカビはある程度の患者に強い免疫応
答を誘発出来ない。

さらに、こういった患者に免疫を与える為の満足出来る
ワクジンもない。上述のカビ感染は特に癌化学療法とか
免疫抑制剤を処方されている患者には特に危険である。

こういった病原菌に対して患者にワクジン採種するには
、これらの弱い抗原に対する患者の免疫応答を増強する
ことによって可能である。これは有効用量の弱い抗原と
有効用量の増幅因子を同時に投与することで達成出来る
。化学療法や移植手術を受けようとする患者には治療の
前にこうしたワクチン接種を受けヒストプラズマ症やカ
ンジダ症に対する罹病性を減少させることが出来る。

以下に記載するように、使用すれば、増幅因子は医薬に
おける予防手段の範囲を拡張し弱い抗原を免疫法に使用
し得る範囲を拡大することが期待される。

ワクジンは、好しくは、例４．５、或は６記載の増幅因
子と望まれる病原菌と混合して調製し、又光分の弱毒化
と無菌状態を保証する点に関してはよく知られた方法に
従って調製する。

ついでワクチンを標準手順で投与する。対象者はこうし
てその病原菌に対して免疫される。

ただ単に両者を混合するよりも、抗原を増幅因子に化学
的に結合させれば特定の受容体部位の誘起を確実にする
ことが出来る。その化学結合は錯塩、共有結合、イオン
結合又は水素結合のいずれを用いてもよい。

増幅因子物質はどれも抗原に対するＤＨ反応の発症を加
速出来るので、それらを用いである対象者がある特定の
病原菌にさらさ扛でいるか或は他の病原菌であるかを決
める、より迅速な臨床試験を供給することが可能である
。例えば結核感染に対する、よジ迅速な試験が要望され
ている。現在ＴＢ試験の結果が出るには２４から６６時
間を要する。この時間間隔の為に試験対象者は二度目の
通院を余儀なくされ、出費と不便さを強いられるか、さ
もなくば結果は葉書で郵送される他ない（これは不正確
であったり当てにならなかったりする。）迅速臨床試験
の経済的有オＵさは明かである。

患者Ａｉｄツベルクリン試験が陽性であることが解って
いる。患者Ｂｉｄ試験が陰性であることが解っている。

Ｏ．５ツベルクリン単位のＰｕｒｉｆｉｅｄ　Ｐｒｏｔ
ｅｎｉＤｅｒｉｖａｔｉｖｅ　（Ｐａｒｋｅ　Ｄａｖｉ
ｓ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ−Ａｐ’１ｉｓｏｌ。

ＰＰＤ　）をＯ．２／ｌｕの食塩水に溶かした標品Ｃを
調製する。標品りを１ａの標品Ｃと約１０　ｆｇ（フエ
ントダラム）のベータ−１．１２ｅ含有する０、１　Ｍ
の食塩水と混合して調製する。

患者ＡとＢに夫々２ケ所にｏ、ｉ、ｍの標品ＣとＯ．１
コの標品りを夫々注射する。下記の皮膚反応（朋Ｘ　ｍ
ｍ　）が夫々標品ＣとＤについて観測されている。

５　　　　　　　　０　　　　１８Ｘ２０　　　　０　
　　　（４８　　　　０　　１６Ｘ１８　　０　　０２
４　　　１８Ｘ２０　１６Ｘ１８　　０　　０３６　　
　　　　　　１６Ｘ１８　　１０Ｘ１２　　　　　　　
　口　　　　　　０■　更に高度に精製された形の増幅
因子ベータ−更に純度を上げる為の操作は既に記載した
。

それによりベータ−１．０はより高度に精製され、望ま
しくないフェニルアラニンのような外因性物質を含まな
いようになシ、その際ベータ−１．１．１．１１及び１
．１２が得られた。例７．７Ａ。

及び７Ｂに記載のＤＨ試験によれば、１ｆ、！１ｔ（１
０−１５，９）のぺ〜ター１．１１は凡そ５５−１Ｏｆ
のベータ−１１口の効果を持つことが示された。それ故
、ベータ−１．１．１．１１及び１．１２の有効治療投
与量（重量比）はベータ−１、ＯＫ対するそれより低く
、又それと同時に、くＱ返し可能な結果が入手可能にな
ることが期待出来る。（然しなから現時点のベータ−１
．１．１．１１及び１．１２に関する知識では、ベータ
−１．１．１．１１及び１．１２を与える為にベータ−
１．０から除去した物質が免疫学的系に全く何等の機能
も持たないと結論することは可能でない。） 以下に示す数字はより高度に調製された生産物のよジ高
い固有の免疫学的活性を示唆する。一般に見掛は上１　
ｆｇの分子種状物質、ベータ−１．１１及び１．１２、
は生物学的活性が５−１０ｆ、＠のベータ−１．０と等
価である。このことは例１９．２Ｏ．２１及び２１Ａに
記載するＤＨ検定結果及び例１９．２Ｏ．２１、及び２
１ＡＫ：記載すル後述の結果から示唆される。例７Ａ及
び７Ｂ記載のＤＨ検定結果に加えて３種類の結果がベー
タ−１　、　１１　（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ含有物質）につい
て作シ上げられた。それらは以下の項目に関する試験で
ある＋１１生体内工Ｌ−２受容体発現；（２）試験管内
インターフェロン−ガンマ生産；及び（３）２名のＡＲ
Ｃ’患者に対する生体内臨床結果 体発現に対する効果 ベータ−１．１７の倍数稀釈を調製した、即ちｌ／１０
００稀釈から始めそれを１．２．４．−５１２の係数で
倍数稀釈する。ｌ／］　ＯＯＯ稀釈はベータ＝１．１１
濃度４３．５　ｐＭの標品を与えるのに対して、１／ｓ
　１２，０００稀釈はベータ−１．１１濃度９１ｆＭの
標品を与える。破傷風トキソイド（’Ｉｌ’Ｔ）標品は
ｍｌｌ！７ｔＪ、１沈降単位（Ｌｆ）の力価を持つよう
調製した。

細胞培養をＴＴ標品単独及びベータ−１．１１と混合し
たＴＴを用いて準備した。培養をインキュベートし工Ｌ
−２受容体に対する適当な抗体と混合した。受容体発現
に関する結果を、受容体を低密度に保有するＴ−ヘルパ
ー細胞と受容体を高密度に保持する“Ｐ−ヘルパー細胞
とについて作表した。

（受容体を高密度に保持するＴ−ヘルパー細胞は免疫学
的に活性／ｉ細胞であると考えられている。）用いた細
胞は正常対象者よシ採集した。

ＴＴ標品単独の場合、４．７％の゛ｒ−ヘルパー細胞が
低密度のＩＬ−２受容体を発現し、Ｏ．４０％のＴ−ヘ
ルパー細胞が高密度のＩＬ−２受容体全発現した。

受容体を低密度−保持するＴ−ヘルパー細胞を最大発現
させる量にはプラトーがＴＴ＋１／４０００ベータ−１
．１（９，９％）から’［’Ｔ＋１／３．．。。。（８
，４％）までの間にあった。高密度受容体に関する最高
値は”１５］２０００　（９−９％）に於て見られた。

この最高値は曲線が着実に上昇している部分に現われた
。

従ってベータ−１，１１を更に稀釈して用いれば、百分
率が下ジ始める前にもつと高い値に達したであろうと信
じられる。現在の結果からは、どこで最高が現われるか
を指定することは可能でないが、それは１／ｘ＋ｏ２ｔ
、ｏｏ　（４５ｆＭ　）と１／４，０％．○０（１１ｆ
ｔ、Ａ）の間のどこかでありそうに思われる。

低密度プラトーはベータ−１．１１の効果として工ｌ−
２受容体の発現が概ね倍加されることを明かにした。も
つと直接に当面の問題に関係のある高密度の最高値は、
ベータ−１．１１の影響として、ＩＬ−２受容体が２５
倍増加することを明にし、しかもこの数字は、更によシ
稀釈したベータ−１．１１を用いたとすれば得れるであ
ろう増加にはおそらく及ばない。

１］、１Ｌｆ／ｍｌ及び１．Ｑ　Ｌ　ｆ／ｍｌ　Ｔ　Ｔ
標品を用いベータ−１．１１の正常細胞中でのインター
フェロン−ガンマ産生に対する効果を測定した。前述と
同様、ベータ−１．１１の倍数稀釈を１／コ０゜０から
１１５１２＋０００（即ち４３．５　ｐＭよシ９１　ｆ
ｔ＜　）まで調製した。

［１，Ｉ　Ｌｆ／ｒｎｌと１−　ＯＬｆ／ｍ７’Ｔ’　
Ｔ　標品単独では、それぞれ１．０及び１Ｏ．４単位／
　ｍｌｊのインターフェロン−ガンマの産生を誘起した
。

０、１Ｌｆ／ｒ１１１Ｔ’Ｔ＋　’／２５６＋０００ベ
ータ−１．１１は最高値である２９．８単位／ｍｌＶを
、又Ｏ．ＩＬｆ／ｍ／！ＴＴ＋１１５□２．ｏｏｏベー
タ−１−１１　Ｕ２９．１単位／ゴを産生じ、従ってベ
ータ−１．１１の至適稀釈は１８２　ｆｌｖｌと９ｉｆ
Ｍとの間であった。

１、Ｑ　Ｌｆ／ｍ１ＴＴ＋　１１５１２，０００は、最
高値である２５．６単位／ｍ１３ｆｒ、産生じた。

Ｏ．１Ｌｆ／酩ＴＴ標品の場合、最高値は基準線値の約
６０倍であった（４５及び９１ｆＭの間）。

ｉ、ＱＬｆ／ｄＴＴ標品の揚台、最高値は基準線値の約
２．５倍であった（凡そ９１ｆＭに於て）。

二つのＴＴ＋ベータ−１．１１の免疫学的試験、即ち高
密度工Ｌ−２受容体の発現及び抗原誘起インターフェロ
ン−ガンマ産生に於て、ベータ−１．１１の至適濃度は
凡そ９　Ｑ　ｆＭであると思われる。

これらの二種の検定は一般的には免疫学的効果を表すと
考えられておシ又ベータ−１．１１調製の原料となる他
のベータ物質の場合には臨床的免疫学的効果と特異的に
相互関連することが見出されている。それ故に本発明者
はこれらの検定結果はベータ−１．１１が生体内増幅効
果を対象者に起こす可能性が高いことを意味するもので
あると結論する。

本発明者は、ベータ−１．１１で治療した２人のＡＲＣ
恵者について行った試験の中でこういった゛推論と矛盾
しない結果を得ている。

患者ＡＫ総計６投与のＯ．１ｇベータ−１．１１を２週
間に１回、約２ケ月に亘って与えた。患者の免疫応答を
白血球のポークライードマイトジェン（ＰＷＨ）への反
応性を測定して測った。

基準線応答が治療前に６２４１単位であることを確立し
、これを比較の目的で１００％と呼ぶ。

患者のその後ＰＷＭ反応測定値を下記に表示する二〇（
基！！Ａ線＞　　　　６２４’１　　　１００％１　　
　　　１４．０２７　　２２５ ２　　　　　１３．８７５　　２２２ ３　　　　　１２．０５８　　１９３ ４　　　　　１１．７５３　　１８８ ５　　　　　１Ｏ．３５８　　１６６ 患者人がベータ−１．１１による治療の結果として、破
傷風トキソイドに対するＤＨ反応も回復したことが観察
されたＰＷＮ反応性の傾向からＯ．１ｐｇは、少くとも
この７Ｗ者にとって過剰用荀であったことを示唆する。

即ち、−計最初のＯ．１ｐｇ投与で患者Ａの免疫系が再
構築し始めると、その後投与する０、１ｐｇは患者Ａの
体内におけるこの物質の至適濃度よシ尚くなってしまっ
た。本発ツｊ者は増幅因子にはある至適濃度があること
、及び全適量以上又は以下の投与は至適投与よシも低い
増幅因子効果しか生じないことを見出した（例えば１３
７９特許、ｃｏｌ、　１３−１４．１６−ｉ７参参照側
２１Ａ　　ベータ−１．１１の２ケ月投与恵者Ｂｉｄそ
の免疫系を再構築する為に前もってベータ−１，０の標
準投与量で一定ル１間治療を受けていた。ついで患者に
２週に一度投与量Ｏ．１　ｐ　ｇのベータ−１．１１を
総計４投与まで与えた。

患者の免疫機能は、患者Ａの場合と同様ｐＨ７Ｎ反応性
を測定して測った。患者の反応性は正常よシ僅かに低い
水準を全期間に亘って維持した。患者の破傷風トキソイ
ドに対するＯ　Ｈ応答も又正常よシ僅かに低い水準を維
持した。

患者Ｂについての結果は、Ｏ．１ｐｇはこの患者にとっ
て概ね正しい投与量であったことを示唆する。

化写合成で傅た免疫増幅因子Ｔｙｒ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ
−Ｏｌｙ−Ｇｌｙについて試験管内並びに生体内試験を
行った。下記の結果は例証的である。本発明者が見た多
量の試験結果は、化学合成で侍たジペプチド及びトリペ
プチドは免役学的に自然界から得た標品ベータ−１．１
１及び土１２よりＮＭあたりでは活性が低いことを示唆
する。

例６記載の精製’］ｌ’ＧＯを無菌食塩水に溶かし、最
終濃度を３　Ｘ　１０−１３Ｍとした。この碑品を神品
Ａと名付ける。更に１：１０の述次櫂釈を標品Ａよシ調
製し下記のＴ（’＋Ｇモル濃度の神品Ｂ、Ｃ，及びＤを
得た。

３Ｘ１０−１３　３Ｘ１０−１４　３Ｘ１０−５　３Ｘ
１０−”各Ｏ．１Ｍの試料を試験対象受容者に、受容者
が以前から感受性があることの明らかになっている抗体
と共に皮肉注射した。使用した抗原はＯ．０５Ｍの破傷
風トキソイドであった。（松準液状破傷風トキンイド、
５ｑｉｂｂ　／　Ｃｏｎａｕｇｔ、の”／２ｏ４釈）。

それに加え対照として同量の破傷風トキソイド抗原をＴ
（）ｃ＋を全く加えない正規の無菌食塩水（標品Ｅ　）
　Ｏ．１　ｍノと共に注射した。それぞれ３．１Ｏ．５
、及び２３時ｉ４ｊ後、注射部位を検査した。反応局所
の大きさく朋Ｘ朋）は下記の通シであった。（試験対照
者は成人男子で体重は大体７０　ｋｇ）。

Ａ　　３ｘｌＯ−１３Ｍ　　１２ｘ１［１１５ｘ１７　
１５ｘ１５Ｂ　　３Ｘ１０−”Ｍ１４Ｘ１２　１５Ｘ１
８　１６Ｘ１８Ｃ３ｘ１［］−１１５Ｍ　１７Ｘ１８　
２０Ｘ２２　１８Ｘ１７Ｄ　　３Ｘ１０−”Ｍ　　１２
Ｘ１１　１４Ｘ１４　１０Ｘ１１Ｅ　食塩水対照　　７
Ｘ７　　　９Ｘ９　　１．１ＳＸ１２もう一つの対照と
して、上記検品ＣのＴｏＧＯｏｌＭを抗原を加えないで
、試験対照に注射した。

４８時間の間、反応は認められなかった。

上記の結果から６フ工ントモル溶液（１フ工ントモルー
ｉ　ｘ　１Ｑ−”’　ＧＭＷ　（ｆ　７　ム分子＠、　
）　ｓ　１フ工ントモルｄ液＝　Ｉ　Ｘ　１０−”　Ｍ
　；共に以下１ｆＭと省略）、即ち全投量量３　Ｘｌ　
０−１９モル、が１Ｏ．５時間後に最大応答を起こすこ
とが解る。

Ｏ．１解の３　［１ｆＭ及び３００　ｆＭ峙液の投与は
Ｏ．１厩の３　ｆＭｍ液よシも弱い効果を起こす。その
理由は至適を起える投与は矛盾した効果を生じ、よシ多
量の増幅因子の投与によう免疫反応を低下させる為であ
る。

同様の効果は本発明者の１６７９特肝中で触れられてい
る。上のｇ釆からこの試験では３　ｆＭが凡そ最大免疫
効果に対する至適当である為に、投与量を３　ｆＭへ下
げると生じる反応局所が小さくなることも又解る。

ヒトの免疫系のＴ（＋（’＋　Ｋ対する高い感受性がこ
れらの試験で示される。治療Ａｌｌ　３　ｆｖ　＃液Ｏ
．１ｄという投与量は極めて微少な用量（０，００［１
３フ工ントモル）である。１フ工ントモルのＴＧａ　ｉ
ａ　約２７７ｘ１０’μｇである。ＴＧ（’＋　１ピコ
モル（１ｐＭ＝　１ｘ　ｉ　Ｑ　”　ｎＭＷ　）の釦は
約２７７　Ｘ　１０−６μｇである。

例２３　　工Ｌ　−２試験管内試験 正常対象者を用いて、マイトジェン誘起に対応して、Ｔ
ＧＧが１：Ｌ−２の試験管内産生を誘起する能力を測定
する為に試験を行った。マイトジェンとしてＰＨＡ　（
ＷｅＵｃｏｍｅ　ＲｅｏｇｅｕｔＳＨＡ　１６　）をＴ
（）Ｇ添加酸で無添加で使用した。マイトジェンに応答
する。Ｔ　Ｔ、　−２の産生け、上述したと同じ至適濃
度現象（矛盾効果）を特徴とする。Ｔ（）Ｇ添加ＰＨＡ
誘起工り一産生のＴＧＧ無添加ＰＩ（、Ａ肪起工Ｌ−２
産土に対する比を示す実験結果を集めた。

対象者＃１でこの比はＴ（’］、Ｇの至適濃度に於て１
．４５であった。対象者＃２でこの比はＴＧｆｌの至通
嬢度で２．５５であった。この結果はマイトジェン誘起
ＩＬ−２産主に対するＴＧＧの有意義な効果を示すもの
と信する。

上述の結果に基いて本発明に係るベータ−１．０及びそ
の他の増幅因子物質の特性をより一層正確に明かにする
ことが出来る。又それ等の物質を精製し又お互に又他の
物質から分離する手順をより正確に記載することも出来
る。

これらの増幅因子物質はすべて逸出なｐＨの燐酸中アセ
トニトリル勾配でＯ，Ｓ、溶離可能であることを特徴と
する。（以下に用いる燐酸中アセトニトリル勾配で’　
ｏ、ｓ溶離可能”という意味は次の通少である：オクタ
デシルシラン（Ｏ，Ｓ、）からアセトニトリル濃度を上
昇させる燐酸中アセトニトリル勾配によシ逆相高圧液体
クロマトグラフィで溶離され得る。この定義１３７９％
許のｃｏｌ、１５に記載のものと類似している。） ある特定の条件でＯ，Ｓ、溶離可能であるという性質又
はそれに伴うパラメーターを使えばこれらの増幅因子物
質を、それらが相対的清離能の順序で並べ得ることを利
用して、よりよく特徴ずけ又分離することが可能になる
。例えば、ベータ−１．０は仏シ出液中にＯ．４−１．
５　％のアセトニトリルを含有するに過ぎない次「配範
囲でＯ，Ｓ、溶離可能である。

増幅因子ゼータ−２はアセトニトリルがずっと高い濃度
で始めてＯ．Ｓ、溶離可能である等々。以下で考察する
ように、この事実は分子を栴成する化学成分に関する情
報を与える。更に同じ解ｒＵＨＡをより酸性の溶液中で
行う為にはよシ高いアセトニトリル濃度を必要とするよ
うに思われ、このことは、将来同種の異なったＨＰＬＣ
’系を試行錯誤的に開発する為の指針に対する示唆とな
る。

これらの増幅因子物質はいくつかのパラメーターによっ
て特徴づけられる。

（１）一定の増幅因子物質は勾配中のある特異的な領域
、即ちアセトニトリル下限濃度ａから上限濃度すの間で
主としてＯ，Ｓ、溶離可能である；（２１この増幅因子
は８以上の勾配領域では主としてＯ．Ｓ、溶離可能でな
い； （３１この増幅因子には、外因性物質から厳密に精製さ
れた時には、ａ以下の領域でＯ，Ｓ、酸離可能な物質は
本質的に全く含まない； （４）　　この増幅因子には、外因物質から厳密に精製
された時には、５以上の領域で主としてＯ−Ｓ、溶離用
能な物質は本質的に全く含まない： （５）任意の増幅因子に対して勾配のＰＨと勾配の溶離
領域を規定するアセトニトリル濃度の間に逆相関があり
得る。

第６及び４の項目は１３７９特許（ｃｏＡ、１５中）の
中で説明されているのでその考察をこ＼に収載する。

例６に続き既述したように、勾配の為に注入する溶媒の
濃度と排出若しくは流出溶媒濃度とは区別しなければな
らない。後者はある一定の時点に於て常にいくらか低い
。前者は不変でないから、注入濃度の数字は常に極めて
概略に述べなければならないし又それは他の操作条件に
も依存する。

注入濃度の数字は又ある程度なで選択の問題である。即
ち、百分率ａからｂまでを含んだ流出綱部領域が存在す
るのを確実にする為には、少くとも原理的に必ず勾配を
ａより下より開始してｂより上で終了する必要がある。

然１〜ながら若し勾配が丁度すのかすかに上で終了した
時には、流出溶媒がｂＫ達するには限りなく長い時間（
遅延効果の為）を要する。従って、自業者は目的の分目
１を当妥な時間内に妥当な労賃で完了する為にとを十分
に起えて終了する勾配を選択するであろう。

分子の性質についていくらかの情報がＨＰ　１．、Ｃの
結果によって与えらｎる。逆相ＨＰＬＣに於ては、非イ
オン性化合物は極性の逆の順序に溶離する。

最も極性の高い化合物が第一に溶離する。そｎ故、ベー
タは一番早く溶離するのでゼータ−２よ〃極性か尚い。

一般的建言えば、アルキルとかペンシルのような、炭化
水素又は疎水性基が附加した分子Ｘは、ＮＨ２とかＣ０
ＯＨ基のように親水性基が附加した同じ分子Ｘよシ極性
が低い。それ故、ベータは恐らくゼータ−２に較べてよ
シ栽水性の成分をもってお少、ゼータ−２は一層確かに
ベータに較べてよシ大きな戻水化物成分（そうでなけれ
ばより多くの炭素−炭素二重結合又は両者）を持ってい
る。

Ｔｙｒ−Ｇｌｙジペゾチド物質と関連のあるベータ１．
１１物質はＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　）リペプチド物質
とＩｉＡ連ノするベータ１．１２物質の後で溶離する。

このことは天然物質についても又合成的に侍た化合物に
ついても真実であるように見える。これは異常な溶離挙
動である。何故ならば一般にょシ小さな分子はよシ緩＜
　Ｏ，Ｓ、カラムに結合し従ってより太きな分子よシ先
に溶離する。しかしながら相対的疎水性も又役割を果た
す。Ｔｙｒ基は疎水傾向のあるベンゼン環をもちそして
ＴｙｒはＴｙｒ−Ｇｕｙ−０１ｙに較べてＴｙｒ−Ｇｌ
ｙの場合に相対的により大きな部分を栴成する。

その上どの任意の増幅因子もＨＰＴ−、Ｃ系と関連した
紫外吸収像（以下”ｔＪＶＡＰ■、Ｕ１ｔｒａ’Ｖｉｏ
ｌｅｔａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　）及び
増幅因子のその像の中で占める位置（以下”　ＵＶＰＰ
■、Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｐｒｏｆｉｌｅ　ｐｏｓｉ
ｔｉｏｎ　）によって特性づけることが出来る。紫外ｒ
Ｊ＆収は特定の型の分子内結合と関連のあることが知ら
れている。例えば２１０　ｎｍ及び２８５　ｎｍの吸収
はとりわけベゾチド結合に関連し、２５４ｎｍの吸収は
とりわけ炭素環の存在と関連がある。それ故にＴＪＶＡ
Ｐの結果は分子の構造がたとえ解っていなくともそのｍ
ＨＬに対する反復可能な・指絞“又は”指針°・を与え
る。ＵＶＡＰの結果は又分子内にどんな化学的基があシ
うるかを示唆する。

本発明者はＵＶＡＰとｖｖｐｐが既に記載の操作でよい
指針になることを見出しておシ、又現実の問題として両
者とも反覆的に医薬品として有用な産生物を生ずるよう
な精製を本発明者にとって可能にした道具して極めて、
満足出来るものであった。

ＵＶＡＰと’ｏｖｐｐは遠からず鮨業者によって、分子
の段階迄精製浄化するのが難しい生物学的活性物質を特
性ずける有用な方法として認識されると信する。この点
に関しては、ＴＪ’ＶＡＰ　／　ＵＶＰＰは物質の物理
的化学的性質についての一つのパラメーターであり、そ
の物質の分子量、特定の溶媒に対する溶解度、臭い、味
及びその物質の構造の分子図形以外の他のパラメーター
と類似している。更に：　ＴＪＶＡＰ／ｌ、１ＶＰＰを
、ある物質が他の物質から区別出来るというように、そ
の物質を同定又は特性づけするのに使うことは非常に適
癌である。

第１図から３１ｄ：、特定の物質がどこで溶離するかを
見分けるという分野に熟練する人々にとってｒｆｉＨＰ
ＬＣ’のパラメーターに変動があるにも拘らず、これら
の図が最低限”それを見ればそれが解る”弐基準を与え
るという点で助けとなろう。後述の考察で、本発明に係
る増幅因子物質のＵＶＡＰによる％性づけを説明する。

本特許明測書の最後の部分に、用語・ＴＪＶＡＰ“及び
’　ＵＶＰＰ”が（％許請求の範囲中に使用する為に）
、よシ明確に定義されている。

Ｃ，アミノ酸配列に関する結果 最後に、少くとも種々のベータ物質に関する限シ、ベー
タに相消の量存在し、固有の増幅因子活性に関連してい
るアミノ酸残基がＴｙｒと（＋１ｙのみであることを示
すアミノ酸配列に関する結果がある。その故にベータの
活性成分はヂベフ０チにＴｙｒ−Ｇｌｙとトリペプチド
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−（＋ｌｙ又はそれらからの誘導体であ
ると正当性をもって考え得る。

（Ｉ誘導体Ｉとは上述の分子のメチル化、アセチル化、
水酸化された等の形、又はエステル或はこの分子から誘
導される他の分子を意味する。その概念は以下によシ詳
細に明確化される。）本明細署記載の増幅因子に対する
上述の記述的並びに特性化結果は次のように吸約し説明
出来る。

ベータ ベータはある特定の抗原に感受性のある受容者のＤＨ（
遅延型過敏）皮膚応答に対して加速及びに増強効果を持
つ。例７参照。ベータを抗原と共に投与した除土する反
応は皮肉注射後６から２４時間後極大に達し、その後速
かに清聴する。（対照的に、増幅剤なしの正常なりＨ応
Ｓは抗原の注射後２４から３０時間後に極大に達する。

）最大の増幅活性は至適確度に於て認められ、至適以上
又は以下の濃度はＤＢ応答増幅の低下をまねく。

ベータは凡そＯ．４から１．５％（ｖ／ｖ）のアセトニ
トリル濃度の間でＯ，Ｓ、溶離可能である。即ち流出液
の屈折率が凡そ１．３３０から’１．３３３のＰＩ→５
燐酸中燐酸ドアセトニトリル勾配内である。ベータの、
Ｐ１１５操作下紫外吸収像（ＵＶＡＰ）による特性は、
二重極大（アルファ）の後で他から離れた巾広の低い極
大（ガンマ）の前か或ｉｄそれ自身に屑（やはりガンマ
）を持つ他から離れた極大に関連する物質である。ガン
マはその後に空ｍＪ部（谷部）が続き、量的に大きな紫
外吸収がない。

ベータ中の一つ又はそれ以上の本質的に活性な成分は公
称分子量限界が６５００である透析膜を通過する。比較
的精製度の低い状態で、ベータは１３７９％許の増幅因
子１と同じか或はその一部分と考えられる。

ベータの主活性成分をこ＼ではベータ−１．１１と命名
した。このものは分子量２３９のヂペゾチドＴｙｒ−Ｇ
ｌｙであると考えられる。ベータ中の今一つの成分はベ
ータ−１．１２であシ、分子量２９５のトリペプチドＴ
ｙｒ　−Ｇｌｙ−Ｇ４　ｙと同定された。既述のように
然しなからべ〜ター１．１１とベータ−１．１１は、互
にそして／またはＺｎ″のようをイオンと錯塩を形成し
従ってそれらをジベゾチド及びトリペプチドそのものと
は必ずしも考えられない可能性がある。異性体のｈ」能
性も考えなければならずそして他の基（例えばメチル、
アセチル、アミド）の財力りについても同様である。然
しながらこれらのものは、その葦＼の形単独で存在する
のか他の基と結合しているのかは別にして軒本質的真に
はＴｙｒ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙから構成
されていると結論出来る。

ベータは上述の如く精製された後１６７９特許記載の水
中エタノールＨＰＬＣ操作にかけられた。

その結果はベータ−１．１１は１３７９％許記載の増幅
因子１と同じ勾配領域で溶離することを示す。

現在の情報の程度では増幅因子１とベータ中の各部分と
の正確な関係を決定することは出来ない。

ベータ−１．１が増幅因子１の一部分に対応する一方こ
＼に記載の他の増幅因子例えばゼータが増幅因子１の他
の部分でるるということもあシ鞠る。

デルタ デルタは抗原に対して増強されたそして延長された応答
を生じる。例８参照、デルタの生物学的活性は一般的に
はベータのそれと似ている。

デルタはアセトニトリル濃度が凡そ２．８から３．３％
のＰＨ５勾配から尚離する。デルタのＰ［」５操作下Ｕ
ＶＡＰによる特性としてガンマの極大又は肩の後に来る
吸収像の空間部（谷部）に続く６極大群の最初の他から
離れた極大をもつ。デルりはｐｌ（５操作で、特にｐＨ
が５．０から逸脱した時にはいつでも分離して回収され
るわけではない。恐らくはデルタ中の分子はベータのそ
れよシも拍゛造上よシ億性が低い。何故ならば後者が一
番始めに＃ず離する。

デルタは例５に記載の−４２，５トリフルオロ酢鍍浄化
操作からは回収可能でない。デルタは酸加水分解に影響
をうけ易い結合をもっているのであろう。

ゼータ ゼータも又抗原に対して力ｎ速され且増強された対応を
起こし、一般的に活性はベータに類似している。但し加
速の程度はベータに対する応答よシいくらか迅速さに欠
ける。ゼータについての最大増幅活性は、ベータについ
てと同様に至適治産でのみ認め得られ至適以上の濃度を
用いると増幅の低下又ｉｄ：ＤＨ対応の抑制さえみられ
る。

ゼータは凡そ３．５から４．１％の間のｌ）Ｉ］５燐酸
燐酸上アセトニトリル勾配分でｏ−８，＃ｍｒ＝可能で
あシ、その際匝出液の屈折率は凡そ１．３４４から１．
３４５である。ゼータの一５操作下ＵＶＡＰによる特性
として、他から離れた３つの極大（若しデルタが排出し
ない場合は２つ）の最後でその前にガンマの極大又は肩
の後に来る吸収像の空間部（谷部）があシ、その後には
他から離れた巾広の極大（テーク）上の肩（エータ）が
来るかそうでなければ他から離れた巾広の極大（テーク
）Ｋ続く小さな極大（エータ）が来る。実施例５記載の
浄化操作に於ては、ゼータ−２は３番目の主極大である
。

恐らくゼータ−２の中の分子はデルタのそれらよシ構造
の極性がよ）低い。何故なれば後者力（けじめに溶離す
る。同じ理由でゼータ−２はベータよシ（若しくはＴｙ
ｒ−Ｇｌｙ又はＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙｘ　ｂ　）極性
が低い。上に示したようにゼータは以前に増幅因子１と
同定した増幅因子の一成分であろう。

エータ エータも又抗原に対して加速され且増強された対応を起
し、一般にベータに類似する。但し加速の程度はベータ
に対する応答よ）もいくらかよく迅速さに欠けるように
見える。

エータは凡そ３．７から４．４％の間のｐｌ−１５燐酸
中アセトニトリル勾配の部分でＣ１，Ｓ、溶離ｉｉｒ能
である。

その際流出液の屈折率は凡そ１．３４７から１．３５３
まででるる。エータのＰＨ５操作ＴｖｖＡｐＫよる特性
として、ガンマ極大又は肩に続く吸収像の空間部（谷部
）の後に来る他から離れた６つ（若しデルタが排出しな
ければ２つ）の極大の最後の極大に続き小さな巾広の極
大又は先行する（又は包含される）他から離れた巾広極
大の肩となる。

エータの更に高度に精製された形であるエータ−１中の
分子はゼータ−２のそれらよシも構造中の極性がよシ低
い。何故なれば後者が先に溶離する。

パイ パイも又抗原に対して加速式れ増強された応答を起こし
、一般的にベータに類似する。パイは凡そ１２．０から
１３．５％の間の、ｌ−１２，５燐酸中アセトニトリル
勾配の部分でＯ．８．溶離可能である。パイのｐｉ−１
２，５操作下のＴＪＶＡＰにより９つの極大の中の５番
目の位置に来る二重極大として特性づけ出来る。典型的
にはパイに先行してより高い極大（オミクロン）が、後
続に２つの互に接近したより高い極大（ロー及びシグマ
）が現われる。オミクロンの極大には深い谷部が先行す
る。

シグマ シグマも又抗原に対して加速され且増強された応答を起
し、一般にベータに類似する。但し加速の程度はベータ
に対する応答よシもよ少迅速さに欠けるように見える。

シグマは凡そ１４．０から１４．５％の間のｐｌ」２．
５燐酸中アセトニトリル勾配の部分でＯ，Ｓ、溶離可能
である。シグマのｐ）１２．５操作下ＴＩＶＡＰによる
特性は、９極犬の７番目であシ典型的にはよシ高い極大
（口〜）が極めて近接して先行し、より低い極大若しく
は尾を引く肩（タウ）、ついで他から離れた高い極大（
エプシロン）が後に続く。ｐＨ２，５操作のシグマがｐ
）Ｉ　５操作のベータと同じ物質であるかも知れないと
いう可能性がめる。

恐らくシグマ中の分子はパイのそれらよシ構造中の極性
がよシ低い。何故ならば後者が先に溶離する。

エプシロン エプシロンは増強されたＤＨ応答を起こし活性に関して
は一般的にベータに類似する。例９参照。

エプシロンはＰｆ−１２，５操作に於て凡そ１５．８か
ら１６・０のアセトニトリル濃度で溶離する。

エプシロンのｐＨ２，５操作下ＵＶＡＰによる特性は９
極大中の９番目であ）、７＃目ピーク（シグマ）から尾
を引く下降像に続く：この下降像を、小さな極大又は肩
（タウ）が横切る。…２．５操作のエプシロンがｐ）Ｉ
　５操作のデルタと同じ物質であること可能性もある。

恐らくエプシロン中の分子はシグマのそれらより構造中
の極性がよシ低い。何故なら後者が先に溶離する。

総括結語 以上に記載した免疫系の増幅因子は免疫系の応答を、直
接的には細胞性免疫に関して又恐らく間接的に液性免疫
にも影響を与えて調節する。これらの物質はそれらの性
質が現在名に特性つけられ、そして予期に反してトラン
スファーファクターとも又先行技術に報告されているト
ランスファーファクターの部分分画とも全く異なってい
ることが明かにされるほど高度の純度を持つように調製
された。更に、本発明に係るこれらの物質（はヒト対象
に投与し、それに有益な効果を生じ、その効果が何等既
知の有害な副作用なしに有益な結果を生むは、現時点で
存在する資料である生物学的活性と物理的性質によって
十分よく定義されている。これらの物質は必ずしも唯一
の分子或は化学的成分から構成されているわけではない
。但しそれらの発見の結果としてヂペゾヂド及びトリペ
プチｒの化学的（それぞれＴｙｒ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　）分子が試験管内及び生体内で固有の
増幅因子活性を有することを発見した。部分精製した産
生物中に存在する成分のあるものは固有の増幅因子活性
を欠除するが、しかしそれらが固有の活性を持つことが
明にされた成分の増幅因子作用を促進するのに何等かの
役割を来している可能性はある。

産生物 ここに記載の増幅因子物質は各種の免疫性減退状態に罹
っている患者の治療に医学的に有用である。そういった
状態の中でも特にＡＩＤＳ　（後天性免疫不全症候群）
及びＡＲＣ（ＡＩＤＳ　ｒｅｌａｔｅｄｃｏｍｐｌｅｘ
　）は増幅因子治療によく反応するように思われる。多
数のＡＩＤＳ及びＡＲＣに罹った患者が、ベータ分画に
属するいろいろな部分の投与の結果、有意の臨床的改善
を見た。更にこれらの増幅因子産生物の投与からは痙性
の報告はなく、従ってこれらのものは治療上の使用に対
して特に有望であると思われる。

特にこｔらの物質が正常人からであって、特別に指定し
た供与者から単離されたものでなく、従って貯留した徊
料からの大規則な精製力Ｓ可能である。その土、本発明
はある柚の増幅因子物質が低分子量のペプチド産生物を
固有の活性成分として含有するという発見を包含する。

この発見は、増幅因子組成物の本質的に化学的であって
、本質的に生物学的でｔ／′ｊ：、ない方法による調製
への道を開く。

以下詳細に俊速するように、この発見は又既に発見され
た産生物を、それらの医薬的性質を改良する為に行う分
子的な操作への道をも開く。それ故に、本発明は以下に
示唆する分子的操作産生物を包含すると考えられる。

本発明はこれら産生物の治療的使用、及び産生物を活性
成分とする医薬品も又包含する。

ＨＰＬＣ操作 本発見は、こ＼に記載する。新しい物質の精製遊びに抽
出に関する斬新な操作をも包含する。いくつかのＨＰＬ
・Ｃ゛アセトニトリル操作開発は、他の類似系の正体を
決定するの釦も応用出来るある種の一般的原理を与えた
。従って、本発明の範囲は上の原理に従う或は原理の教
義を使用する他の神々なＩ（ＰＬＣ系を包含する。それ
らの原理を次に扱約する。

第一に、碗度勾配の正確な形がどうであるかは決定的で
はない。むしろ勾配のどこで、問題の物質がカラムから
排出するかを決定することが重要である。包配のその部
分は混み倉≧いてけいけない。即ちｄＣ／　ｃｉｔは、
こ＼でＣは溶媒濃度を表わすが、問題の物質が排出する
（更に既述した遅延効果の為に、それらの点に先行する
）点に於て比較的に低い値でなければならない。それ故
、勾配曲線は、有用な物質の排出する或は物質の分離が
望まれる点及びその前では相対的に平坦でなければなら
ない。着し単一の勾配曲線がこの要求に合うならば、そ
れを選べばよい。さもなくば、一連の曲線を組み合せな
ければならない（応用例４及び乙におけるように）。

又、既に指摘したように、注入勾配を溶媒濃度によって
指定する場合には、勾配の範囲は、遅延要素の為に、概
略であり、適切な範囲はその故に他の操作パラメーター
及び使用者がこの操作にどれだけ長い時間をかけられる
かに依存する。（例えば、例６Ａの手順に於て、０％か
ら５０％の勾配を、凡そＯ．１％からＯ．４％の溶媒濃
度の流出液でカラムを離脱するベータ−１．０物質を溶
離するのに使用した。この勾配は、代りに０％から２５
％或は１０％又は５％快でにプログラムすることも出来
、十分の時間をかければ、Ｏ．４％の点は最終的に達し
得られる筈である。） 勾配を如何に使うかを決定するにあたって、保持時間と
ＴＪＶＡＰ　（後述にて考察）というパラメータが再現
性のある結果を実現するのに役立つ。保持時間はカラム
の老朽化と共に移動する為に、それを任意の既知マーカ
ーに対して補正することが有用であシ得る。その例は精
製した市販のＴｙｒ−（＋１ｙ−Ｇｌｙをマーカーの一
つとして使用出来るベータ−１，１１について既に説明
しである。

第二に、使用する溶媒系について良好な収率を与えるに
は…を調整しなければならない。既述のように１　この
操作に於て効率的な分離の為のＰ６１）とアセトニトリ
ル濃度には　逆相関があるように思われる。正確なＰ）
調整は試行錯誤の問題である。

第三に、燐酸緩衝液はＯ．０２　Ｍでこの手順に効果的
であると解った。若し異った濃度の緩衝液或は酢酸とか
硫酸のような異った酸イオンを用いると、その際の溶媒
濃度及びＰＨの正しい調整は異なるであろう。これを例
証する例４．５及び６を比較されたい。

第四に、相対的に塩基性の緩衝液（例４参照）５参照）
。他方相対的に酸性の緩衝液は間頭の物質のあるものを
分解するおそれがある（例５参照）従ってこれには相殺
点がある。

最後に、ある特定の勾配を計測する際に、紫外吸収像（
ＵＶＡＰ）は、良好な分離が達成されつ＼あるか否かを
決定するのに極めて有用である。（この点は、ＵＶＡＰ
の位置によって流出物の正体を決定するのと関連して、
更に詳細に後述する。）本発明はそれについて特定の且
好ましい実施様態の関連で記述されて来たが、それは本
発見の精神及び岬、囲から逸脱することなく更に変形を
行うことが出来る。本出願は、一般に本発明の原琲に副
い且つ本発明に固有の技術の中で既知乃至は慣習的実施
の範囲に入るような本開示からの逸脱を含む、本発明に
係る一切の変更、使用及び適用を網羅することを意図す
る。

本明細書の特許請求範囲は、上文に用いた用語を使用す
る。その語粟が些かなりとも通常の用法と異なる限シは
先行の開示に基いて居シ、且つそれに徴して理解される
べきである。以下の考察は本特許請求の範囲に用いた用
語及び語葉のもつ側面を更に詳しく述べる。

用語ｗ　ＰＨ−調節されたＷは例４．５及び６に詮ける
ように、塩基、酸、或は緩衝液を用いての−の変更を指
す。用語°燐酸−水−溶液″は燐酸アルカリ又はアルカ
リ土類金属（Ｋ、Ｎａ、　Ｃａ、　Ｍｇ。

等の強塩基）塩の緩衝液や溶液であシ、例４及び６記載
のようなものである。

勾配に用いる濃度百分率は（ｖ／ｖ）に基いている。勾
配中の注入溶媒濃度を記述するのに“凡そ“という言葉
を用いる場合、用いる数字は、用いる濃度をある程度ま
で、実験者の選択にまかせようとする既述の考慮に基い
ている。上記の如く、溶媒の土限を原理的には望んでい
る溶媒濃度の殆んど上限迄低減することは可能であるが
、これは時間従って人件費の高騰蛋びに一定の時間内の
精製量の減少の犠牲においてのみ実行出来る。こういっ
た方′Ｍは不便であろうし、本発明者が本発明を実施す
る最善の様式とは考えないにしろ、実行可能ではあろう
。従って、こういった方策は本発明の精神と範囲の中、
又“凡そ″（さもなくば記載中では注入勾配の溶媒濃度
の数字が望む物質を溶離出来る注入勾配について記され
ていることに留意すべきである。従って記載の濃度限界
は必ずしも同じ物質がいくらかより狭い或はより広い注
入勾配範囲でも溶離され得る可能性（本自に、それは事
実である）を除外するものではない。

用語・外因性物質・は本発明が目的とする増幅因子活性
を持たないか或は少くとも固有の増１陥因子活性を持た
ない物質を指す。

用語ｗｕｖｐｐｌ（’紫外低位Ｉｉ￥１・）は増幅因子
物質が他のＨＰＬ、Ｃカラムから排出する物質に対して
どこでカラムから排出するかにょシ、且紫外吸収像（既
述のＵＶＡＰ　）の形を関係づけの枠として増幅因子物
質を特性づけるのに用いる。例えば、仮想的な例をあげ
るとして、若しある操作のＵＶＡＰが人間の横顔に似て
いた場合、ある物質を、流出液の紫外吸収の読みが仮想
的紫外吸収像（ＵＶＡＰ）土の鼻の先端に対応した時に
溶離するＴ物質として定義出来得る。その特定の物質の
ＴＪＡＰＰは１鼻の先端で″となシ、その物質は仮想的
ＵＶＡＰの鼻の先端部分に関連していることを意味する
ことになろう。

この仮想物質のＵＶＰＰは、本発明に係る現実の物質に
ついて第１図ＡからＣによって示されるように、その像
が流速の増減或は勾配曲線の変更によって変形された時
ですら区別可能な状態を保つであろう。鮨業者にとって
、この像の位相幾何学的特徴は勾配の修正によって導入
される歪みにも拘らずそれを区別可能にし、鼻の先端位
置を尚探シ出すことが出来る。

それ故に、用語″ＵＶＰＰ’は、本％Ｗｆ請求の範囲に
用いられるように、溶媒濃度が時間と共に単調に増加す
るＩ（ＰＬＯ手順の過程に於て、器械の検出器を通過す
る流水液の紫外吸収曲線の位相幾何学的特性（そしであ
る程度迄紫外吸収極大の相対的大きさ）を指す。その特
性はこの手順中のその勾配近傍で溶離する物質の特性に
直接関連して表現される。ＵＶＰＰは、例えばとぐにき
まったＰＨの燐酸−水溶液−アセトニトリルといった特
定の溶媒系勾配に関して指定されなければならず、又例
えば２１ＣＪｎｍといったようにとくにきまった紫外波
長に関して指定されなければない。（ここでは殆んどの
結果は、２１［］ｎｍが既知のペプチド結合に典型的に
関連している為に、この波長に関したものである。） ＵＶＰＰ結釆は既に本明細書”上記結果に対する考察−
の項で個々の増幅因子物質を記述する為に与えである。

既に注意したように、ここに記載した装置に於ては、物
質はカラムから離れる少し前に紫外吸収検出器を通過す
る（例えば１ＴＬｌ　／　ＢｉＨの流速では４８秒早く
又検出器後部管内容積はＱ、８ｒｎｌ）。

用語”Ｏ，Ｓ、溶離Ｗは、本明Ｓ書の例１８に続く部分
で詳細に説明されている。次のような句即ち勾配の特定
の領域冒で主として浴Ｍ可能“及び１で溶離可能な物質
を殆んど全く含まない胃が時に応じて使用される。物質
が一つの決った領域璽で主としてＯ．Ｓ、溶離可能″で
あるとは問題の物質の少くとも５１％がその特定の勾配
領域で。、ｓ。

溶離可能であることを意味する。物質が勾配の一つの決
った領域Ｃ″’ｃ”　ｏ、ｓ、溶離可能な物質を殆んど
全く含まない譜というのけ、問題の物質の１０％以下の
量がその特定の領域でＯ．Ｓ．溶解可能な物質を構成す
る本ことを意味する。

用＠「出発増幅因子標品質は、例１−４に記載のような
部分ｈＩ製された増幅因子又は調節因子物質を指す。用
語″ＡＣＴＦ　Ｑ、１％勾配”はトリフルオロ酢酸−溶
液一中一アセトニトリル勾配を意味し、その中で上記ト
リフルオロ酢酸はＯ．１％（Ｖ／Ｖ）であシ、そのＰ）
Ｉは凡そ２．５に調整されており、又上記の勾配を作る
注入アセトニトリルの凝度は凡そ０％の僅か上から凡そ
２５％迄の範囲を包含する。用語”　ＡＣＴＰ　Ｏ，０
５％勾配“はトリフルオロ酢酸躊液中アセトニトリル勾
配を意味し、その中でトリフルオロ酢酸は凡そＯ．０５
％（Ｖ／Ｖ）であムその…は凡そ２．ｓＫ可調整れてお
〃、又上記の勾配を作る為の注入アセトニトリル濃度は
凡そ１゜％よシ僅か上から凡そ３０％の節、囲を包含す
る。

本特許請求の範囲にはポリペプチド様分子種並びにポリ
ペプチド、トリペプチド、及びジペプチドへの言及がな
されている。これらの用語が本特許請求の範囲に用いら
れる場合には複数のアミノ酸残基（即ち、それぞれポリ
ペプチド、トリペプチド或はジペプチドアミノ酸残基配
列）を含有するが他の基或は成分・もそこに化学的に接
合若しは結合していることもある分子を指す。その結合
は錯塩、共有−合、イオン結合、又は水素結合のいずれ
であってもよい。そのような他の基は、特に制限はない
が例として挙げれば、メチル、アセチル、水酸基、Ｃ０
０Ｊアミド、ペントース、及びＺｎ　＋ＸＣａ”１Ｍｎ
　′ｌ＋さらにＭｇ＋といった金属イオンでメジ、エス
テルも存在し得よう。例えＱ了、ポリペプチド物質であ
る分子種について引き合いに出すならば、この用語は、
中でも次に夕６１）＝己するすべての分子種（いつくか
は仮想的）−切を包含する。

（１）　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ＋　（２）　Ｔｙｒ−Ｇ１７−
ＣＯＯＣ２Ｈ５，（３’　ＣＨ３−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ。

（４１’Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ＧＩＹ＋　（５）　ＨＯＯＣ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ。

（６１Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙｙ　（７１Ｔｙｒ４
１ｙ−Ｄ−Ａｌａ−ＨＣＩ。

（勿論、存在する基は、ペゾチド基に化学的に結合する
非ペプチドをも含んですべて医薬的に或幻：生物学的に
受け入れ可能でなけれ６ｆならないということは正しく
判断されるであろう。）ポリペプチドという用語が本特
許請求の囲に用いられた場合は、上に列記した分子イ重
の例は、すべてポリペプチド物質であシ、それらの２つ
又はそれ以上の如何なる混合物又は錯塩も又そうである
。例（１）から（３１はジペプチド物質であり、それら
の任意の混合物もそうである。例（４）から（７）はそ
れぞれトリペプチド物質であシ、それらの任意の混合物
もそうである。例（１０１はある一つのペプチド物質が
今一つのジペプチド物質と形成した錯塩であシ、例（Ｉ
Ｉ）はジペプチド物質がトリペプチド物質と形成した錯
塩である。

本特許請求の範囲に用いられた場合、あるジペプチドが
今一つの物質、例えば今一つのジペプチド物質、トリペ
プチド物質、或は非ペプチドと錯塩を形成していても、
尚ジペプチド物質である。

同様に、あるトリペラ０チド物質は今一つの物質、例え
ば今一つのジペプチド物質、トリペプチド物賃或は非ペ
プチドと錯塩を形成していても尚トリペプチド物質であ
る。それ故に一つの定ま゛つた成分がジペプチド物質で
ある産生物の引用は、問題の成分がジペプチド物質とあ
る物質との錯塩である産生物を包含することもあろう。

ペプチド配夕ＵＫ番号を付する場合には、Ｎ−末端から
始める通常の慣習を用いる。他の末端（最後に記する残
基）はＣ−末端である。例えば、例（９）に於て、メチ
ル基は（Ｔｙｒのある）Ｎ−末端にあ）そしてエチル基
は（Ｌｅｕのある）Ｃ−末端にあΣ。例（３）及び例（
９）はＮ−メチル化物質であシ、即ちそれぞれＮ−メチ
ル化Ｔｙｒ−Ｇｌｙ　＊質とＮ−メチル化ペンタペプチ
ド物質である。例（２）はエステル化されたＴｙｒ−Ｇ
ｌｙ　ｖｌＪ質であシ、エチル基によシＣ−末端でエス
テル化されている。（ｃｏｏ　（ｄ　Ｇｌｙアミノ酸残
基忙属し、通常ポリペブチげの最後のアミノ酸残基の末
端に存在するＣ０ＯＨに由来する。）例（１）から（５
１、（７）及び（８）はＴｙｒ−Ｇｌｙ　７ミノ酸残基
配列を含有し、例（６）と（９）その間にＤ−アミノ酸
残基が挿入されたＴｙｒ−Ｇｌｙアミノ酸残基配列を含
有する。例（４）及び（５１ばＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
アミノ酸残基配列を含有し、例（９）はその中にＤ−ア
ミノ酸残基が挿入されたＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙアミノ
酸残基配列を含有する。

ここに記載した天然に存在するポリペプチドを合成的に
作った物質はここに開示した情報のＪ：ＶＣ築き上げら
れる将来の研究を基礎にして開発されるであろう、又そ
ういった合成物質が、若し受け入れ難い夾雑物から精製
されればヒトの白血球抽出物由来の天然物質の代シに使
われ侍ようことが予期される。例えば、薬品の吸収速度
及び血中濃度がある製品の天然又は先例発見された型の
分子の修飾によって改善され得ることが知られて居シ、
過去の文献には数多くの例が記載されている。即ち、ク
ロロテトラサイクリンは脱塩素化されて改良型のテトラ
サイクリン製品を与えたし、クロロチアジド中の一つの
結合が飽和されてヒドロクロロチアジドが作られ、その
結果有効投与量が１θ倍低くなり、又ペニシリンの数多
くの合成品がそのベータラクタム環に付いた側鎖を修飾
することによって供給され、その例として分子の末端に
ペンシルを附加或は側鎖に伺いたＨをＣＨ３或はＮＨ２
で置換した等の製品が知られて訃シ、それによって製品
を（ペニシリナーゼの作用による）加水分解に強くした
シ、さもなくば元来の分子に存在しな〃）つた望ましい
特性を与えた。

これに関連して、ポリペプチドの酵素的分解の阻害に関
する諸報文を要約したＳｃｈｗａｒｚ、　Ｍａｌｆｒｏ
ｙ。

ａｎｄ　Ｅａｕｍｅ　（引用上掲）の報文を考慮する必
要がある。彼等はペプチド配列Ｈ２Ｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ・・・Ｃ０ＯＨを含有する物質の加水分解及び
不活性化を阻害する為の適箔な分子成分の附加について
教える種々の報文を要約した。これらの報文はＴｙｒ残
基のＮ−メチル化がアミノベゾチダーゼによるＴｙ　ｒ
　−Ｇｌ　ｙアミド結合の加水分解或は開裂を阻害する
と示唆する。それらは又Ｃ−末端Ｃ０ＯＨのアミド化、
エステル化、及びアルコールによる置換を示唆する。さ
らに、それらばＤ−アミノ酸のＣ−末端或はその近傍へ
の附加或はそのような（例えばＤ　−Ａｌａ　）基のＴ
ｙｒとＧｌｙの残基間への挿入を示唆する。これらの方
策が果してうまく行って酵素反応を阻害しその結果Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの免疫増幅因子
としての生体内効力を改善するか否かは、この技術の予
測困難さを考慮すると、定かでない。然しなから、熟練
者はこの有望な道を研究するであろうと信じられるので
、これらの方策を試みるのは本特許請求の範囲内である
。

このような今後の合成品或は誘導体はここで本開示厳び
にここに特許を申請する発明の範囲内であると考えられ
る。従って本特許請求の範囲の中にある″アミノ酸残基
配列がＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであるトリペプチド物質
Ｕのような句は、合成誘導体型のようなＴｒｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙの誘導体型を包含する意図を持つ。そのような
誘導体は先行する項に記載されたものを包含する。例え
ばＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの誘導体で、Ｈの代シにＣＨ
３又はＮＨ２、を若しくはｃｏｏａの代シにアルコール
を置換したもの：エステル：Ｄ−Ａｌａのよりなり一ア
ミノ酸残基の分子内への挿入によるアミノ酸残基配列の
伸長。それらは又製薬技術、特にペプチド製薬技術に於
て既知の他の誘導体を包含する。

上述の教義に従い、用語”阻害物“が、　それに阻害物
が結合している”といった句で本特許請求の範囲に用い
られた場合、例証の為に上げれば、Ｓｃ、ｈｗａｒｔｚ
等によって示唆された如（Ｔｙｒ残基のＮ−メチル化に
用いるメチル或は末端カルボキシルをアミド化するアミ
ドといった基を意味する。

更に一般的に言えば、阻害物とは、その存在がポリペプ
チドの酵素的開裂を阻害するであろう部位に於て、ポリ
ペプチド物質に結合（又は中に挿入）されつる任意の基
を意味する。Ｓｃｈｗａｒｔｚ等が教えるように、末端
カルボキシル基のエステル化も又酵素的開裂を阻害し又
そのカルボキシルのアルコールによる置換も同様釦働く
。更に上の著者等はＤ−アミノ酸の挿入が酵素的開裂を
阻害すると教える。従ってこれらの例それぞれは酵素的
開裂を阻害する為に、ポリペプチド物質に阻害剤を結合
させる例証となる。同じ文脈の中で１に結合された・は
り中に挿入された智を包含することを意図する。上述の
阻害剤の例は徹底的であるよりは寧ろ例証的であること
を意図している。

更に、阻害剤をポリペプチドに結合ちせる代シに、ポリ
ペプチドと混合することが出来る。

Ｓｃｈｗａｒｔｚ等はポリペプチドと混ぜると酵素的団
１裂を阻害することの解っているｉｌｉ々の阻害剤をＨ
己述している。例えばバシトラシン、ビューロマイシン
、ベスタチン、アマスタチン、及ヒチオＪＬ　７アン。

然しなから本発明者は、現時点に於ては生体内投与に際
して起る稀釈効果の為に、結合の方が混合よフも生体内
使用の為にはよシ好ましい実施様態であると信する。そ
れ故、阻害物はこの目的の為に、唯単に混ぜ合せるだけ
で医薬品組成物釦含ませることが出来るけれども、阻害
物を成分中の活性分子に結合させることがより好ましい
と考えられる。

動物とか人間の対象に生体内でＴｙｒ−Ｇｌｙに代謝す
る関連分子を投与することによｐ　Ｔｙｒ−Ｇｌｙ若し
くはＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを血流中又はそれがリンフ
才力インとして作用する部位に入れることも出来る。

Ｓｃｈｗａｒｔｚ等はあるポリペプチドが如何にして、
（ｓｃｋｍａｒｔＺ等及び彼等が記述した仕事を行った
大人、即ちオピオイドペプチド効果に関心があるがここ
に記載する効果には関心のない人々の目的の為に）“不
活性”或は゛無用”であるＴｙｒ−ＧｌｙとかＴｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙのような分子成分に酵素的に開裂され得
るかを記述している。彼等はＬｅｕ−及びＭｅｔ−エン
ケファリンのラットやマウスへの注射が如何にして就中
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ代謝物の産
生という結果になって終るかを記述している。

仮等は精製されたアンジオテンシン変換＃素（以下ＡＣ
Ｅと呼ぶ）とジペプ〜チジルカルポキシベプチダーゼ（
以下ＤＰＣＰと呼ぶ）がポリペプチド中のＧｌｙ−Ｐｈ
ｅアミド結合を開裂してＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ分子成
分を産生ずることが出来るか、そしてＧｌｙ−Ｇ１ｙア
ミド結合がヂベゾジルアミノペプチダーゼで開裂されて
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ分子成分を産生じ得ることを記述してい
る。彼等は又ＡＣＥがＤＰＣＰの一種であると同定し最
終的に”エンケファリン−ＤＰＣＰ　”又は・エンケフ
ァリナーゼ“と命名されたｌＷ素が彼等の興味をもつポ
リペプチドを１不活性１なＴｙｒ−Ｇｌｙ及びＴｙｒ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙのような分子成分に代謝する主たる酵素
であると結論した。勿論これらの研究者に興味のない・
不活性１な分子成分は本発見に於て興味のある産生物で
ある。

これらの事実はＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ａ−Ｂ−Ｃ或はＴｙｒ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｅ−Ｆ　（ここでＡ−Ｂ−Ｃ及
びＤ−Ｅ−Ｆ”は、Ｐｂｅ−Ｍｅｔ若しくはＰ、ｈｅ−
Ｌｅｕのような他の基である）ｆ！：ヒト、マウス、ラ
ット、又は他の動物に投与して生体内でＴｙｒ　−Ｇｌ
ｙ又はＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを（−且Ａ−Ｂ−Ｃ又は
Ｄ−Ｅ−Ｆが酵素的に開裂し去シ、後に免疫学的に興味
ある分子成分を残すと）産生じ得ることを示唆する。こ
れは既知の医薬的方策であるので、本発明の範囲中にあ
ると考えられる。しかしながら、本発明の要旨及び本発
明者の示唆によるが、Ｔｈｙ−Ｇｌｙ　、　Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙに関するクレームの範囲を逃れるために行
なう方法は、好ましいものとは考えられない。

用語雷小ペプチド増幅因子１は医薬品組成物に関するい
くつかの特許請求の範囲中に使用されている。この言葉
はベータ−土０、ベータ−土１、ベータ−１，１１、ベ
ータ−１．１２、及びゼータ−２、並びにそれら相互間
の錯塩からなる集団の栴成要素を意味することを意図す
る。固有の生物学的活性を有するそれらの成分は、既述
のようにベータ産生物の場合にはジペプチド（Ｔｙｒ−
Ｇｌｙ　）物質及びトリペプチド（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ　）であると同定されている。この用語は、既に用
飴ジペｔチド、トリペプチド及びポリペプチド物質を定
義する際に記載したように、上記の本来活性なアミノ酸
残基配列の合成的修飾を包含することも意図する。

例えばＮ−メチル化Ｔｙｒ−Ｇｌｙは小ペプチド増幅因
子として包含されようし、Ｇｌｙ部分の末端Ｃ００Ｈ基
がエステル化又は医薬として受け入れ得られる０２Ｈ５
０Ｉ（のようなアルコールで置換されたＴｙｒ−Ｇｌｙ
も同様であろう。

例えばベータ−１．１又はベータ−１．１１がエタノー
ル／水および／またはアセトニトリル／トリフルオロ酢
酸系を用いて分離される操作の操作クレームに於ては、
特許請求の範囲は・Ｊｅｐｓｏｎ　”様式で記載されて
おシそれによって何が請求されているかの記述ｔについ
て、明確さを改善し且短縮を可能にしている。この様式
の使用は特許請求の範囲の前文にある内容が発見時に於
て陳腐であったこと暗示することを意図しない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、例４に記載の一１５抽出操作に於て、ＨＰＬ
Ｃカラムから溶離する際の流出液の紫外吸収を２１０　
ｎｍ″′Ｃ測定した図面である。縦軸は吸収単位（最大
目盛＝　Ｏ．３２単位）を表し、横軸は時間（２分／１
目＆）を表わす。流出液の各分画は名速か変えである。 第２図は物質ベータについて行った、例５に記載する類
似の図表である。 第３図は例乙に記載のＰ）１２．５抽出操作についての
類似の図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の諸性質を持つことを特徴とする組成物。 （ａ）人体の免疫系の示す応答の速さ、強さ或は長さを
   増大させ、該応答とは、 （１）上記生体が以前に遭遇した或は同時に始めて遭遇
   する少くとも一つの抗原の生体への導入に対するもので
   あり、 （２）ヒトの免疫系機能に特異的に帰することが出来、 （３）上記抗原の上記生体への導入に続いて起る； （ｂ）上記組成物の上記免疫系応答に対する効果とは反
   対の、上記免疫系応答に対する効果を持つような他の異
   種物質を実質的に全く含まず；（ｃ）上記生体が以前に
   遭遇したことがなく又同時に遭遇することのない如何な
   る抗原に対して抗原特異的免疫系応答を伝達するような
   物質を実質的に含有せず； （ｄ）その構成成分は （１）平均分子量が凡そ２００より大きく凡そ１５００
   より小さく、且つ （２）少くとも一つの結合が凡そ２１０ｎｍに於ける紫
   外吸収に関連をもつ、 分子種よりなり； （ｅ）燐酸水溶液中−アセトニトリル勾配によりＯ．Ｓ
   ．（オクタデシルシラン）溶離可能であり；且つ （ｆ）医薬品として受け入れ難い成分を実質的に全く含
   有しない。 （２）分子種がポリペプチドであることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載する物質。 （３）６個以下のペプチド基を持つことを特徴とする特
   許請求の範囲第２項に記載するポリペプチド物質。 （４）チロシン（Ｔｙｒ）及びグリシン（Ｇｌｙ）アミ
   ノ酸残基を含有することを特徴とする特許請求の範囲第
   ３項に記載するポリペプチド物質。 （５）Ｔｙｒ−Ｇｌｙを唯一のアミノ酸残基配列として
   含有するのを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載す
   る物質。 （６）アミノ酸残基配列Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを含有
   することを特徴とする特許請求の範囲第４項に記載する
   ポリペプチド物質。 （７）トリペプチド物質で１つのＴｙｒ残基がアミノ酸
   残基配列のＮ−末端に位置することを特徴とする特許請
   求の範囲第６項に記載する物質。 （８）Ｔｙｒ残基がＮ−メチル化されていることを特徴
   とする特許請求の範囲第７項に記載するポリペプチド物
   質。 （９）アミノ酸残基配列のＣ−末端にあるカルボキシル
   残基が、アミド化又はエステル化されていることを特徴
   とする特許請求の範囲第７項に記載するポリペプチド物
   質。 （１０）アミノ酸残基配列のＣ−末端にカルボキシル基
   の代りにアルコールがあることを特徴とする特許請求の
   範囲第７項に記載するポリペプチド物質。 （１１）アミノ酸残基配列のＮ−末端以外の位置にＤ−
   アミノ酸残基を含有することを特徴とする特許請求の範
   囲第３項に記載するポリペプチド物質。 （１２）阻害物が結合されていることを特徴とする特許
   請求の範囲第３項に記載する物質。 （１３）少くとも２個のポリペプチド物質が錯塩を形成
   しており、それぞれのポリペプチド物質は、３個以下の
   アミノ酸残基をもち、且つ上記錯塩はＺｎ＾■、Ｃａ＾
   ■、Ｍｇ＾■、Ｍｎ＾■、及びＦｅ＾■よりなる一群の
   金属イオンより選ばれた少くとも１つの金属イオンを分
   子内に含有することを特徴とする、特許請求の範囲第３
   項に記載するポリペプチド物質。 （１４）上記燐酸水溶液が凡そ０．０２Ｍ濃度の溶液で
   あり、そのｐＨが凡そ５に調整されており、且つ上記勾
   配のアセトニトリル注入濃度が凡そ０％より僅か上から
   凡そ１５％に及ぶ範囲を含むという附加制限を更に有す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載するポ
   リペプチド物質。 （１５）下記の再附加制限を更に有することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１４項に記載するポリペプチド物質
   。（以下ベータと表わす。） （ａ）流出液中のアセトニトリル濃度が凡そ０．２％と
   凡そ１．５％の間となる上記勾配の範囲では、主として
   Ｏ．Ｓ．溶離可能であり； （ｂ）流出液のアセトニトリル濃度が凡そ０．２％以下
   になる上記勾配範囲では実質的にＯ．Ｓ．溶離可能でな
   く； （ｃ）流出液のアセトニトリル濃度が０．２％以下であ
   る上記勾配の部分ではＯ．Ｓ．溶離可能物質を殆んど全
   く含まず； （ｄ）上記勾配がアセトニトリル濃度に関し単調に増加
   する場合にあつては、流出液のアセトニトリル濃度が凡
   そ１．５％以上となる上記勾配では主としてＯ．Ｓ．溶
   離可能な物質を殆んど全く含まない。 （１６）下記の附加制限を更に有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１５項に記載する物質（以下ベータ−
   １．０と表わす）。 （ａ）ＡＣＴＦ０．１％勾配（トリフルオロ酢酸濃度を
   ０．１％としたトリフルオロ酢酸中アセトニトリル濃度
   勾配）でＯ．Ｓ．溶離可能であり；（ｂ）流出液のアセ
   トニトリル濃度が凡そ１１．８％と凡そ１４．８％の間
   となる上記ＡＣＴＦ勾配部分で主としてＯ．Ｓ．溶離可
   能であり； （ｃ）流出液のアセトニトリル濃度が凡そ１１．８％以
   下となる上記勾配部分では実質的にＯ．Ｓ．溶離可能で
   なく； （ｄ）溶出液のアセトニトリル濃度が凡そ１１．８％以
   下となる上記勾配部分ではＯ．Ｓ．溶離可能物質を殆ん
   ど全く含まず；且つ （ｅ）上記勾配がアセトニトリル濃度に関して単調に増
   加する場合にあつては、流出液のアセトニトリル濃度が
   凡そ１４．８％以上となる上記勾配部分では主としてＯ
   ．Ｓ．溶離可能な物質を殆んど全く含まない。 （１７）Ｔｙｒ−Ｇｌｙを唯一のアミノ酸残基配列とす
   るジペプチド物質であることを特徴とする特許請求の範
   囲第１６項に記載する物質。 （１８）Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを唯一のアミノ酸残基
   配列とするトリペプチド物質であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１６項に記載する物質。 （１９）下記の附加条件を更に有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１５項に記載する物質（以下ベータ−
   １．１と表わす）。 （ａ）少くとも注入エタノール濃度が凡そ０．１％以下
   から凡そ１０％以上の間の範囲を含む水中−エタノール
   勾配でＯ．Ｓ．溶離可能であり；（ｂ）流出液のエタノ
   ール濃度が凡そ０．１％と０．４％の間となる上記勾配
   の部分では主としてＯ．Ｓ．溶離可能であり； （ｃ）流出液のエタノール濃度が凡そ１％以下になる上
   記勾配の部分ではＯ．Ｓ．溶離可能でなく；（ｄ）流出
   液のエタノール濃度が凡そ０．４％以下になる上記勾配
   の部分ではＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆んど全く含まず
   ； （ｅ）上記勾配が単調に増加する場合にあつては、流出
   液のエタノール濃度が凡そ０．４％以上となる上記勾配
   の部分では主としてＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆んど全
   く含まない。 （２０）下記の附加制限を更に有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１９項に記載する物質（以下ベータ−
   １．１１と表わす） （ａ）ＡＣＴＦ０．０５％勾配に於てＯ．Ｓ．溶離可能
   であり； （ｂ）上記勾配から１０％より２０％までのアセトニト
   リルの注入濃度の凡そ中間で溶離し；（ｃ）Ｔｙｒ−Ｇ
   ｌｙが唯一のアミノ酸残基配列であるジペプチド物質か
   ら成り；且つ （ｄ）上記勾配及び２１０ｎｍに関して概して第４番目
   のするどく巾の狭い他から離れた極大となるＵＶＡＰ（
   紫外吸収像）をもつ。 （２１）下記の附加制限を更に有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１９項に記載する物質（以下ベータ−
   １．１２と表わす）。 （ａ）ＡＣＴＦ０．０５％勾配でＯ．Ｓ．溶離可能であ
   り； （ｂ）１０％から２０％のアセトニトリル濃度の注入範
   囲の凡そ始め３分の１で上記勾配から溶離し； （ｃ）Ｔｖｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙが唯一のアミノ酸残基配
   列であるトリペプチド物質より成り；且つ （ｄ）上記勾配及び２１０ｎｍに関して概ね第３番目の
   するどく巾の狭い他から離れた極大となるＵＶＡＰを持
   つ。 （２２）２５４ｎｍ及び少くとも凡そ０％より僅かに上
   から凡そ２０％に亘る注入エタノール濃度範囲を含む水
   中−エタノール勾配に関して下記のＵＶＰＰ（紫外吸収
   像位置）を持つという附加制限を有し、且Ｔｙｒ−Ｇｌ
   ｙアミノ酸配列を含有することを更に特徴とする特許請
   求の範囲第１５項に記載する物質。 （ａ）３つの主要極大の第２番目の極大（以下“ベータ
   −Ｉ極大”と名付ける）であり； （ｂ）高さがより低い極大が続き；且つ （ｃ）概ね高さが等しいか又はやや高いフェニルアラニ
   ンを含有する分画に関連する極大が直前を先行する。 （２３）下記の附加制限を更に有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１４項に記載するポリペプチド物質（
   以下デルタと表わす）。 （ａ）流出液が凡そ２．８％と凡そ３．３％間のアセト
   ニトリル濃度となる上記勾配の部分で主としてＯ．Ｓ．
   溶離可能であり； （ｂ）流出液が凡そ２．８％以下のアセトニトリル濃度
   となる上記勾配の部分で本質的にＯ．Ｓ．溶離可能でな
   く； （ｃ）流出液が凡そ２．８％以下のアセトニトリル濃度
   となる上記勾配の部分でＯ．Ｓ．溶離可能物質を殆んど
   全く含まず；且つ （ｄ）上記勾配が単調に増加する場合にあつては、流出
   液が凡そ３．３％より大きいアセトニトリル濃度となる
   上記勾配の部分で、主としてＯ．Ｓ．溶離可能な物質を
   殆んど全く含まない。 （２４）下記の附加条件を更に特徴とする特許請求の範
   囲第１４項に記載する物質（以下ゼータと表わす）。 （ａ）流出液が凡そ３．５％と凡そ４．１％間のアセト
   ニトリル濃度となる上記勾配の部分で主としてＯ．Ｓ．
   溶離可能であり； （ｂ）流出液が凡そ３．５％以下のアセトニトリル濃度
   になる上記勾配部分で本質的にＯ．Ｓ．溶離可能でなく
   ； （ｃ）流出液が凡そ３．５％以下となる上記勾配部分で
   Ｏ．Ｓ．溶離可能の物質を殆んど全く含まず；且つ （ｄ）上記勾配が単調に増加する場合にあつては、流出
   液が凡そ４．１％以上のアセトニトリル濃度になる上記
   勾配の部分で主としてＯ．Ｓ．溶離可能の物質を殆んど
   全く含まない。 （２５）下記の附加制限を更に特徴とする特許請求の範
   囲第２４項に記載する物質（以下ゼータ−２と表わす）
   。 （ａ）ＡＣＴＦ０．１％勾配でＯ．Ｓ．溶離可能であり
   ；（ｂ）流出液が凡そ１１．８％と凡そ１５．８％間の
   アセトニトリル濃度になる上記勾配の部分で主としてＯ
   ．Ｓ．溶離可能であり； （ｃ）流出液が凡そ１１．８％以下のアセトニトリル濃
   度になる上記勾配の部分で本質的にＯ．Ｓ．溶離可能で
   なく； （ｄ）流出液が凡そ１１．８％以下のアセトニトリル濃
   度になる上記勾配の部分でＯ．Ｓ．溶離可能の物質を殆
   んど全く含まず；且つ （ｅ）上記勾配が単調に増加する場合にあつては流出液
   が凡そ１５．８％以上のアセトニトリル濃度になる上記
   勾配の部分で、主としてＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆ん
   ど全く含まない。 （２６）下記の附加制限を更に有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１４項に記載するポリペプチド物質（
   以下エータと表わす） （ａ）流出液が凡そ３．７％及び凡そ４．４％の間のア
   セトニトリル濃度になる上記勾配の部分で主としてＯ．
   Ｓ．溶離可能であり； （ｂ）流出液が凡そ３．７％以下のアセトニトリル濃度
   になる上記勾配の部分で本質的にＯ．Ｓ．溶離可能でな
   く； （ｃ）流出液が凡そ３．７％以下のアセトニトリル濃度
   になる上記勾配の部分でＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆ん
   ど全く含まず；且つ （ｄ）勾配が単調に増加する場合にあつては、流出液が
   ４．４％以上のアセトニトリル濃度になる上記勾配の部
   分で主としてＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆んど全く含ま
   ない。 （２７）下記の附加制限を更に有することを特徴とする
   特許請求の範囲第２６項に記載するポリペプチド物質（
   以下エータ−１と表わす）。 （ａ）ＡＣＴＦ０．１％勾配でＯ．Ｓ．溶離可能であり
   ；（ｂ）流出液が凡そ１４．６％と凡そ１６．８％間の
   アセトニトリル濃度になる上記勾配の部分で主としてＯ
   ．Ｓ．溶離可能であり； （ｃ）流出液が凡そ１４．８％以下のアセトニトリル濃
   度になる上記勾配の部分で本質的に溶離可能でなく； （ｄ）流出液が凡そ１４．８％以下のアセトニトリル濃
   度になる上記勾配の部分でＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆
   んど全く含まず；且つ （ｅ）上記勾配が単調に増加する場合にあつては、流出
   液が凡そ１６．８％以上のアセトニトリル濃度になる上
   記勾配の部分で主としてＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆ん
   ど全く含まない。 （２８）上記燐酸水溶液が凡そ０．０２Ｍ燐酸であり、
   そのｐＨが凡そ２．５に調整され且つ上記勾配の注入ア
   セトニトリル濃度が凡そ０．１％から凡そ２０％の範囲
   を含むという附加制限を更に有することを特徴とする特
   許請求の範囲第２項に記載するポリペプチド物質。 （２９）下記の附加制限を更に有することを特徴とする
   特許請求の範囲第２８項に記載するポリペプチド物質（
   以下パイと表わす）。 （ａ）流出液が凡そ１２．０％及び凡そ１３．５％間の
   アセトニトリル濃度になる上記勾配の部分で主としてＯ
   ．Ｓ．溶離可能であり； （ｂ）流出液が凡そ１２．０％以下のアセトニトリル濃
   度になる上記勾配の部分で本質的にＯ．Ｓ．溶離可能で
   なく； （ｃ）流出液が凡そ１２．０％以下のアセトニトリル濃
   度になる上記勾配の部分でＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆
   んど全く含まず；且つ （ｄ）上記勾配が単調に増加する場合にあつては、流出
   液が１３．５％以上のアセトニトリルになる上記勾配の
   部分で主としてＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆んど含まな
   い。 （３０）下記の附加制限を更に有することを特徴とする
   特許請求の範囲第２８項に記載するポリペプチド物質（
   以下シグマと表わす）。 （ａ）流出液が凡そ１４．０％と凡そ１４．５％間のア
   セトニトリル濃度になる上記勾配の部分で主としてＯ．
   Ｓ．溶離可能であり； （ｂ）流出液が凡そ１４．０％以下のアセトニトリル濃
   度になる上記勾配の部分で本質的にＯ．Ｓ．溶離可能で
   なく； （ｃ）流出液が凡そ１４．０％以下のアセトニトリル濃
   度になる上記勾配の部分でＯ．Ｓ．溶離物質を殆んど全
   く含まず；且つ （ｄ）上記勾配が単調に増加する場合にあつては、流出
   液が凡そ１４．５％以上のアセトニトリル濃度になる上
   記勾配の部分で主としてＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆ん
   ど全く含まない。 （３１）下記の附加制限を更に特徴とする特許請求の範
   囲第２８項に記載のポリペプチド物質（以下エプシロン
   と表わす）。 （ａ）流出液が凡そ１５．８％と凡そ１６．０％間のア
   セトニトリル濃度になる上記勾配の部分で主としてＯ．
   Ｓ．溶離可能であり； （ｂ）流出液が凡そ１５．８％以下のアセトニトリル濃
   度になる上記勾配の部分で本質的にＯ．Ｓ．溶離可能で
   なく； （ｃ）流出液が凡そ１５．８％以下のアセトニトリル濃
   度になる上記勾配の部分でＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆
   んど全く含まず；且つ （ｄ）上記勾配が単調に増加する場合にあつては、流出
   液が１６．０％以上のアセトニトリル濃度になる勾配の
   部分で主としてＯ．Ｓ．溶離可能な物質を殆んど全く含
   まない。 （３２）医薬品として受け入れられる賦形薬中に有効投
   与量毎包装し医薬品組成物として供給することを特徴と
   する特許請求の範囲第２項に記載するポリペプチド物質
   。 （３３）上記ポリペプチド物質が少くとも１種類の小ペ
   プチド増幅因子を包含することを特徴とする特許請求の
   範囲第３２項に記載する医薬品組成物。 （３４）有効量の抗原若しくは病源体を添加し、それに
   よりワクチン組成物を供給するととを特徴とする特許請
   求の範囲第３３項に記載する医薬品組成物。 （３５）有効量の臨床診断用抗原若しくは病源体を添加
   し、それにより上記抗原若しくは病源体への事前遭遇を
   診断することを目的とする組成物を供給するのを特徴と
   する特許請求の範囲第３３項に記載する医薬品組成物。 （３６）人が以前に遭遇したか若しくは同時に遭遇する
   抗原の導入に対して上記の人の免疫応答を増幅すること
   を目的とし、上記の人に特許請求の範囲第２項に記載す
   るポリペプチド物質を、有効投与量、医薬的に受け入れ
   られる賦形薬と共に投与することから成るのを特徴とす
   る方法。 （３７）上記ポリペプチド物質が少くとも１種類の小ペ
   プチド増幅因子を包含することを特徴とする特許請求の
   範囲第３６項に記載する方法。 （３８）上記の人が免役不全症若しくは免疫性減退状態
   にあることを特徴とする特許請求の範囲第３６項に記載
   する方法。 （３９）上記の疾病がＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群
   ）若しくはＡＲＣ（ＡＩＤＳ関連症候群）であることを
   特徴とする特許請求の範囲第３８項記載の方法。 （４０）上記の疾病がＴ−ヘルパー細胞機能の欠損に関
   連することを特徴とする特許請求の範囲第３８項に記載
   する方法。 （４１）上記のヒトがＴ−ヘルパー細胞を含有する輸注
   をも受けることを特徴とする特許請求の範囲第３８項に
   記載する方法。 （４２）上記の投与が前記の人の皮膚部位に於て皮膚当
   てから、前記の人に与えられることを特徴とする特許請
   求の範囲第３６項に記載する方法。 （４３）上記の増幅因子が少くとも１種類の小ペプチド
   増幅因子を包含することを特徴とする特許請求の範囲第
   ３６項に記載する方法。 （４４）ヒト若しくは哺乳類の細胞性免疫系機能を増進
   させるのを目的とし、少くとも１種類のＴｙｒ−Ｇｌｙ
   アミノ酸配列を分子内にもつ分子種を含有する医薬組成
   物の有効投与量を前記のヒト若しくは哺乳類に投与する
   ことからなるのを特徴とする方法。 （４５）上記のＴｙｒ残基が上記ポリペプチド物質のア
   ミノ酸残基配排のＮ−末端にあることを特徴とする特許
   請求の範囲第４４項に記載する方法。 （４６）上記のＴｙｒ残基がＮ−メチル化されているの
   を特徴とする特許請求の範囲第４５項に記載する方法。 （４７）上記ポリペプチド物質のアミノ酸残基配列のＣ
   −末端にあるカルボキシル基がアミド化若しくはエステ
   ル化されていることを特徴とする特許請求の範囲第４５
   項に記載する方法。 （４８）上記の分子種がアミノ酸残基配列のＮ−末端以
   外の位置に挿入されたＤ−アミノ酸残基を含有し、且つ
   上記位置が、上記Ｄ−アミノ酸の存在なしには、上記の
   ヒト或は哺乳類の体内に存在する酵素作用により開裂を
   受け易いペプチド結合が存在する箇所であることを特徴
   とする特許請求の範囲第４５項に記載する方法。 （４９）Ｄ−アミノ酸残基が上記Ｔｙｒ−Ｇｌｙアミノ
   酸残基配列のＴｙｒとＧｌｙ残基間に挿入されているこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第４５項に記載する方法
   。 （５０）上記の分子種中のアミノ酸残基がメチル化若し
   くはアミド化され、その位置が上記メチル若しくはアミ
   ド化なしには、上記のヒト或は哺乳類の体内に存在する
   酵素作用によつて開裂を受け易いペプチド結合が存在す
   る箇所であることを特徴とする特許請求の範囲第４４項
   に記載する方法。 （５１）阻害物が上記のポリペプチド物質に結合されて
   いることを特徴とする特許請求の範囲第４４項に記載す
   る方法。 （５２）上記のポリペプチド物質がＴｙｒ−Ｇｌｙ物質
   及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの中の少くとも１種類の物
   質を含有するのを特徴とする特許請求の範囲第４４項に
   記載する方法。 （５３）上記の分子種が生体内でＴｙｒ−Ｇｌｙ物質或
   はＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに代謝することを特徴とする
   特許請求の範囲第４４項に記載する方法。 （５４）医薬品として受け入れ得る担体及びＴｙｒ−Ｇ
   ｌｙ若しくはその医薬品として受け入れ得る誘導体の有
   効投与量から成り、医薬品として受け入れ難い成分を全
   く含まない医薬品組成物。 （５５）阻害物が上記のＴｙｒ−Ｇｌｙに結合された若
   しくは上記組成物に包含されることを特徴とする特許請
   求の範囲第５４項に記載する組成物。 （５６）医薬品として受けられ得る担体及びＴｙｒ−Ｇ
   ｌｙ−Ｇｌｙ若しくはその医薬品として受け入れ得る誘
   導体の有効投与量から成る医薬品組成物。 （５７）阻害剤が上記のＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに結合
   されている或は上記の組成物に包含されているのを特徴
   とする特許請求の範囲第５６項に記載の組成物。 （５８）医薬品として受け入れ得る担体及び体内でＴｙ
   ｒ−Ｇｌｙ若しくはＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに代謝する
   医薬品として受け入れ得る物質の有効投与量から成る医
   薬品組成物。 （５９）出発物ベータ標品を含有するカラムを稀薄燐酸
   水溶中のアセトニトリル勾配で溶離することにより、部
   分精製された増幅因子物質を産生せしめて、ベータ物質
   を精製する方法において、 （１）上記の部分精製増幅因子物質をオクタデシルシラ
   ンを充填した逆相高圧液体クロマトグラフィーカラムに
   乗せる； （２）上記カラムを凡そ０．１％以下のエタノール濃度
   から凡そ０．４％以上の濃度までの注入範囲を包含する
   水中エタノール勾配で溶離し、それに伴い複数の流出分
   画を産生する；更に （３）エタノール濃度が凡そ０．１％と凡そ０．４％の
   間である予め定めた流出分画を選び、所要分画を採集す
   る、 ことからなり、それによつて、より精製されたベータ物
   質を入手可能にすることを特徴とする方法。 （６０）紫外吸収を凡そ２５０−２６０ｎｍで監視し、
   選択される上記の流出物分画は初期極大群を構成する主
   要紫外吸収極大の中央極大に関連するものであり、且つ
   上記の極大群の３番目がフェニルアラニンを含有する分
   画に関連することを特徴とする特許請求の範囲第５９項
   に記載する方法。 （６１）下記の追加段階を段階（３）のあとに含めるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第５９項に記載する方法
   。 （４）採取した上記の流出分画をオクタデシルシランを
   充填した逆相高圧液体クロマトグラフィーカラムに乗せ
   ； （５）上記のカラムを凡そ１０％以下のアセトニトリル
   濃度から凡そ２０％以上までの範囲を包含するトリフル
   オロ酢酸水溶液中アセトニトリル勾配で、上記トリフル
   オロ酢酸濃度を０．０５％（凡そｐＨ２．５）として溶
   離し、それに伴つて複数個の追加流出分画を産生し；更
   に （６）予め定めた追加流出分画を選び、所要分画を採集
   する。 （６２）紫外吸収を凡そ２１０ｎｍで監視すること及び
   採集した上記の追加流出分画が概ね４番目の極大である
   鋭い、巾の狭い、他から離れた極大に関連するものであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第６１項に記載する
   方法。 （６３）紫外吸収を凡そ２１０ｎｍで監視すること及び
   、採集する上記の追加流出分画が概ね第３番目の極大で
   ある鋭い、巾の狭い、他から離れた極大に関連するもの
   であることを特徴とする特許請求の範囲第６１項に記載
   する方法。 （６４）上記のカラム中を予めＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
   物質であると判明している物質を通過させることにより
   保持時間について補正し、上記物質の上記保持時間を予
   め斯く定め、ついで、上記のカラム使用に際して、上記
   保持時間を利用して上記の予め定めた追加流出分画が流
   出を開始する兆候を与えることを特徴とする特許請求の
   範囲第６１項に記載する方法。 （６５）標識を施したＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ物質をカ
   ラム中に通過させ上記の予め定めた追加流出分画が溶離
   を開始する兆候を与えることを特徴とする特許請求の範
   囲第６１項に記載する方法。 （６６）結核菌との遭遇をヒトについて検査するのを目
   的として、医薬として受け入れ得る液状担体中に有効な
   投与量のツベルクリンを含有した硝子瓶及びＴｙｒ−Ｇ
   ｌｙ、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ若しくはそれらの誘導体
   を含有する医薬品組成物の有効投与量とから構成される
   ことを特徴とする臨床検査試薬品。