JPS62181779A - リンホトキシン耐性細胞及び該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法 - Google Patents
リンホトキシン耐性細胞及び該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、リンホトキシンに耐性になった変異細胞及び
増幅可能な遺伝子のDNA配列を有する新規リンホトキ
シン発現ベクターに係る。更に本発明はリンホトキシン
発現ベクターによるリンホトキシン耐性細胞の形質転換
細胞、及び該形質転換細胞を用いるリンホトキシンの製
造法に係る。
増幅可能な遺伝子のDNA配列を有する新規リンホトキ
シン発現ベクターに係る。更に本発明はリンホトキシン
発現ベクターによるリンホトキシン耐性細胞の形質転換
細胞、及び該形質転換細胞を用いるリンホトキシンの製
造法に係る。
リンホトキシン(LT)は直接あるいは間接的に癌細胞
のみを攻撃し、壊死させる作用を持ち(EvansO,
H,ら(1977年)キャンサー・リサーチ(Canc
er Res、 ) 、 87巻、898頁〕、制癌剤
としての臨床応用が期待されている。
のみを攻撃し、壊死させる作用を持ち(EvansO,
H,ら(1977年)キャンサー・リサーチ(Canc
er Res、 ) 、 87巻、898頁〕、制癌剤
としての臨床応用が期待されている。
(従来の技術)
LTは、ヒト或いはマウス等の動物のリンパ体細胞ヲフ
イトヘマグルチニン、コンカナバリンA等のレクチン或
いはフォルボールエステルで刺激することにより誘導さ
れるリンホカインの一種である(Devlin、 J、
J、 (1984年)リンホカインズ(I、ymph
okines) 、 9巻、313頁〕。LTの蛋白化
学的研究は、いくつかのグループで研究されているが、
分子量約20,000の成分がその巌小単位であり、そ
の単位成分が会合したものや、他の成分との複合体があ
るとされている(Aggarwal 、 B、 B、ら
(1984年)ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー。
イトヘマグルチニン、コンカナバリンA等のレクチン或
いはフォルボールエステルで刺激することにより誘導さ
れるリンホカインの一種である(Devlin、 J、
J、 (1984年)リンホカインズ(I、ymph
okines) 、 9巻、313頁〕。LTの蛋白化
学的研究は、いくつかのグループで研究されているが、
分子量約20,000の成分がその巌小単位であり、そ
の単位成分が会合したものや、他の成分との複合体があ
るとされている(Aggarwal 、 B、 B、ら
(1984年)ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー。
259巻、686頁〕。
LTは、フォルボールエステル、マイト−ジエン等で刺
激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、こ
のような生産法では生産されるLTは極めて微金であり
、また大量の新鮮なリンパ球が必要となり量産には不向
きである。また株化されたリンパ球由来の細胞(株化細
胞)をマイト−ジエン等で刺激するとLTが誘導的に産
生されることが知られているが、生産能は用いる細胞の
能力に大きく依存しており、やはり量産に適した系とは
言えない。近年LTのcDNAがクローニングされ、大
腸菌でLT様蛋白の生産が可能になった( Gray、
P、 W、ら(1984年)ネイチャー(Natur
e) 、 812巻、721頁)。しかし微生物でつく
られるLT様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白合成機
構が多少異なるため、つくられる蛋白のアミノ末端が天
然のそれと異なる場合が多い。更に微生物によってつく
られるLT様蛋白は、天然のLTが糖鎖を有しているの
に対し、糖鎖が結合していない。このように微生物の蛋
白合成系によってつくられたLT様蛋白と天然のLTと
は物質として明らかに異なり、治療薬として長期間使用
したり、頻回使用する場合には、抗原抗体反応の問題が
懸念される。
激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、こ
のような生産法では生産されるLTは極めて微金であり
、また大量の新鮮なリンパ球が必要となり量産には不向
きである。また株化されたリンパ球由来の細胞(株化細
胞)をマイト−ジエン等で刺激するとLTが誘導的に産
生されることが知られているが、生産能は用いる細胞の
能力に大きく依存しており、やはり量産に適した系とは
言えない。近年LTのcDNAがクローニングされ、大
腸菌でLT様蛋白の生産が可能になった( Gray、
P、 W、ら(1984年)ネイチャー(Natur
e) 、 812巻、721頁)。しかし微生物でつく
られるLT様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白合成機
構が多少異なるため、つくられる蛋白のアミノ末端が天
然のそれと異なる場合が多い。更に微生物によってつく
られるLT様蛋白は、天然のLTが糖鎖を有しているの
に対し、糖鎖が結合していない。このように微生物の蛋
白合成系によってつくられたLT様蛋白と天然のLTと
は物質として明らかに異なり、治療薬として長期間使用
したり、頻回使用する場合には、抗原抗体反応の問題が
懸念される。
(発明が解決しようとする問題点)
蛋白のアミノ末端が天然のLTと同じで且つ糖鎖を有す
るLTを生産する為には、動物培養細胞を宿主とした遺
伝子組換えの手法の適用が考えられる。−例として高率
に発現するように設計構築した■、T発現ベクターで培
養細胞を形質転換し、その形質転換株を培養しLTを生
産する方法が考えられる。しかしLTは細胞に対し強い
毒性を有する物質であり、従ってLT発現ベクターで形
質転換された細胞は、自らつくるLTの為に死滅してし
まい継代培養が可能な形質転換株を得ることは困難なこ
とと思われた。しかし本発明者らは実際にBEIK細胞
にLT発現ベクターを導入し、その形質転換細胞を用い
LTの生産が可能であることを示した(特願昭60−1
47871号)。
るLTを生産する為には、動物培養細胞を宿主とした遺
伝子組換えの手法の適用が考えられる。−例として高率
に発現するように設計構築した■、T発現ベクターで培
養細胞を形質転換し、その形質転換株を培養しLTを生
産する方法が考えられる。しかしLTは細胞に対し強い
毒性を有する物質であり、従ってLT発現ベクターで形
質転換された細胞は、自らつくるLTの為に死滅してし
まい継代培養が可能な形質転換株を得ることは困難なこ
とと思われた。しかし本発明者らは実際にBEIK細胞
にLT発現ベクターを導入し、その形質転換細胞を用い
LTの生産が可能であることを示した(特願昭60−1
47871号)。
また形質転換されたBE:に細胞は継代培養が可能で長
期間にわたりLTを生産しつづける細胞であった。本発
明者らはBHKのLTに対する感受性を調べたところ、
BE[KはLTに対し耐性を示すことを知った。一方C
HO,FL、WI8T’i等の細胞はLTに感受性を示
し死滅した。またこれらLTに感受性を示す細胞をLT
発現ベクターで形質転換した場合、それらの形質転換株
はいずれもLTを産生じないか、或いは産生じても極め
て少量しか産生じなかった。BHKと同様にLTに対し
耐性を示す細胞であるVero、Wニー26 VA4
からは安定にLTを生産する形質転換株が得られた。
期間にわたりLTを生産しつづける細胞であった。本発
明者らはBHKのLTに対する感受性を調べたところ、
BE[KはLTに対し耐性を示すことを知った。一方C
HO,FL、WI8T’i等の細胞はLTに感受性を示
し死滅した。またこれらLTに感受性を示す細胞をLT
発現ベクターで形質転換した場合、それらの形質転換株
はいずれもLTを産生じないか、或いは産生じても極め
て少量しか産生じなかった。BHKと同様にLTに対し
耐性を示す細胞であるVero、Wニー26 VA4
からは安定にLTを生産する形質転換株が得られた。
以上の結果から、LT発現ベクターの形質転換株でLT
を生産させる場合、宿主どしてはLTに耐性を示す細胞
が適切であることが見い出され、本発明に至った。
を生産させる場合、宿主どしてはLTに耐性を示す細胞
が適切であることが見い出され、本発明に至った。
現在非常に多くの細胞が株化されている。それらの細胞
の中にはLTに感受性を示すが、形質転換効率が高い、
容易に形質転換株が得られる、細胞増殖の血清依存性が
低い、生育が速い、大量培養が容易である、蛋白の合成
或いは分泌能が高い、細胞の性質が良く知られている、
特殊な遺伝的性質を持つ等の細胞育種上優れた性質を持
つ株がある。それらの細胞においても安定且つ大量にL
Tを生産する形質転換株を得る技術を確立することはL
Tの生産土瓶めで重要である。
の中にはLTに感受性を示すが、形質転換効率が高い、
容易に形質転換株が得られる、細胞増殖の血清依存性が
低い、生育が速い、大量培養が容易である、蛋白の合成
或いは分泌能が高い、細胞の性質が良く知られている、
特殊な遺伝的性質を持つ等の細胞育種上優れた性質を持
つ株がある。それらの細胞においても安定且つ大量にL
Tを生産する形質転換株を得る技術を確立することはL
Tの生産土瓶めで重要である。
本発明者らはLTに耐性を示す細胞を分離する技術を確
立し、その細胞からLTを安定に生産する形質転換株を
得ることに成功し、本発明に至った。
立し、その細胞からLTを安定に生産する形質転換株を
得ることに成功し、本発明に至った。
遺伝子を細胞に導入した場合、導入遺伝子は宿主染色体
DNAに安定に組み込まれる場合がある。
DNAに安定に組み込まれる場合がある。
遺伝子が組み込まれる染色体上の位置は一見でたらめで
あり、また組み込まれるDNAのコピー数も不規則であ
る。LT遺伝子を細胞に導入した場合、組み込まれた位
置やコピー数が細胞ごとに異なり、各々の細胞のLT生
産皿は異なる。従って細胞をクローン化することにより
種々の生産量を有する細胞を得ることができる。LTの
生産量はL’I’i伝子のコピー数に相関があると考え
られ、LTの遺伝子数の増加した細胞はLTの生産能が
向上するものと期待される。
あり、また組み込まれるDNAのコピー数も不規則であ
る。LT遺伝子を細胞に導入した場合、組み込まれた位
置やコピー数が細胞ごとに異なり、各々の細胞のLT生
産皿は異なる。従って細胞をクローン化することにより
種々の生産量を有する細胞を得ることができる。LTの
生産量はL’I’i伝子のコピー数に相関があると考え
られ、LTの遺伝子数の増加した細胞はLTの生産能が
向上するものと期待される。
本発明者らは、LTに耐性を示す細胞を宿主として増幅
可能な遺伝子を有するLT発現ベクターを導入し、適切
な条件下で細胞を選択することにより初めてLTの高生
産株の育種に成功し、本発明に至った。またこれらの細
胞は無血清培地でもLTを生産し得る細胞であった。L
Tの生産に無血清培地を用いる事はLTの培地からの回
収精製を容易にするばかりでなく、製品への血清成分の
混入を防ぐことになる。
可能な遺伝子を有するLT発現ベクターを導入し、適切
な条件下で細胞を選択することにより初めてLTの高生
産株の育種に成功し、本発明に至った。またこれらの細
胞は無血清培地でもLTを生産し得る細胞であった。L
Tの生産に無血清培地を用いる事はLTの培地からの回
収精製を容易にするばかりでなく、製品への血清成分の
混入を防ぐことになる。
以下に本発明を更に詳細に説明する。
(問題点を解決するための手段)
(1)LT耐性株の選択
細胞にLT発現ベクターを導入し、ある目標濃度のLT
を産生させるためには、宿主として用いる細胞が最低そ
の濃度以上のLTに対し耐性である必要がある。実際に
はLTを分泌している宿主細胞の周辺は、他の玲境より
もLTの濃度が高いと考えられるので、宿主として用い
る細胞は目標濃度よりも高い濃度のLTに耐性である必
要があると考えられる。細胞が設定した濃度のLTに耐
性を示すかどうかを調べるには、その細胞をその濃度の
LTを含む培地で継代培養すればよい。LT感受性細胞
は、LTの毒性のため培養中に増殖速度が遅くなり、変
性変形し或いは死滅するが、LT耐性細胞は生育しつづ
ける為に容易に選択できる。またLT感受性株は、培地
中にアクチノマイシンDやマイトマイシンCが存在する
と、そのLT感受性が増加し変性変形化が促進されるの
で、LT耐性細胞と区別される。
を産生させるためには、宿主として用いる細胞が最低そ
の濃度以上のLTに対し耐性である必要がある。実際に
はLTを分泌している宿主細胞の周辺は、他の玲境より
もLTの濃度が高いと考えられるので、宿主として用い
る細胞は目標濃度よりも高い濃度のLTに耐性である必
要があると考えられる。細胞が設定した濃度のLTに耐
性を示すかどうかを調べるには、その細胞をその濃度の
LTを含む培地で継代培養すればよい。LT感受性細胞
は、LTの毒性のため培養中に増殖速度が遅くなり、変
性変形し或いは死滅するが、LT耐性細胞は生育しつづ
ける為に容易に選択できる。またLT感受性株は、培地
中にアクチノマイシンDやマイトマイシンCが存在する
と、そのLT感受性が増加し変性変形化が促進されるの
で、LT耐性細胞と区別される。
(2)LT耐性変異株の取得
ある濃度のLTに感受性を示す細胞から、その濃度以上
のLTに耐性を示す細胞を取得するには、LTをその濃
度以上で含む培地中で細胞を継代培養すればよい。その
濃度のLTに感受性の細胞は、培養中に増殖が遅くなり
、変性変形し或いは死滅するが、耐性を獲得した細胞は
生育しつづける為に容易に分離できる。この場合LTを
含む培地で選択する前にエチルメタンスルフォネート等
の変異剤で予め細胞を処理してもよい。またLT感受性
細胞は、培地中で致死的濃度でないアクチノマイシンD
やマイトマイシンCが存在すると、そのLT感受性が増
加し変性変形化が促進されるので、LT酎耐を獲得した
細胞を短期間のうちに濃縮することができる。LT耐性
を獲得した細胞を本明細書ではLT耐性変異細胞と呼称
する。またLT耐性変異細胞はLTに対して耐性を示す
細胞すなわちLT耐性細胞に包含されるものとする。
のLTに耐性を示す細胞を取得するには、LTをその濃
度以上で含む培地中で細胞を継代培養すればよい。その
濃度のLTに感受性の細胞は、培養中に増殖が遅くなり
、変性変形し或いは死滅するが、耐性を獲得した細胞は
生育しつづける為に容易に分離できる。この場合LTを
含む培地で選択する前にエチルメタンスルフォネート等
の変異剤で予め細胞を処理してもよい。またLT感受性
細胞は、培地中で致死的濃度でないアクチノマイシンD
やマイトマイシンCが存在すると、そのLT感受性が増
加し変性変形化が促進されるので、LT酎耐を獲得した
細胞を短期間のうちに濃縮することができる。LT耐性
を獲得した細胞を本明細書ではLT耐性変異細胞と呼称
する。またLT耐性変異細胞はLTに対して耐性を示す
細胞すなわちLT耐性細胞に包含されるものとする。
ここに示した方法によって、基本的にはどのような感受
性細胞からも、LT耐性を示す細胞が得られる。
性細胞からも、LT耐性を示す細胞が得られる。
またLT耐性変異細胞とは、その親細胞よりも高い濃度
のLTに対して耐性を獲得した細胞を示すのであって、
必ずしも細胞の遺伝子に変異を伴っている細胞とは限ら
ない。
のLTに対して耐性を獲得した細胞を示すのであって、
必ずしも細胞の遺伝子に変異を伴っている細胞とは限ら
ない。
(3)LT発現ベクター
LT発現ベクターとは、細胞に導入した場合、導入され
た細胞がLTの生産能を獲得するようなりNA配列を持
つf)NAを示す。LT発現ベクターの一つとしてp8
VeSma ILTがあげられる。このプラスミド性ベ
クターは、LTの遺伝子の5′側上流に8V40の初期
遺伝子プロモーターが接続したDNA配列を有し、動物
培養細胞に導入した場合、LTの機能的なメツセンジャ
ーRNA(mRNA)の合成は8V40の初期プロモー
ターによってコントロールされている(特願昭60−1
47871号)。
た細胞がLTの生産能を獲得するようなりNA配列を持
つf)NAを示す。LT発現ベクターの一つとしてp8
VeSma ILTがあげられる。このプラスミド性ベ
クターは、LTの遺伝子の5′側上流に8V40の初期
遺伝子プロモーターが接続したDNA配列を有し、動物
培養細胞に導入した場合、LTの機能的なメツセンジャ
ーRNA(mRNA)の合成は8V40の初期プロモー
ターによってコントロールされている(特願昭60−1
47871号)。
LT発現ベクターを細胞に導入し、安定に発現する細胞
のみを選択的に増殖させる為には、選択マーカー遺伝子
が同一DNA配列上に存在するLT発現ベクターが適切
である。動物細胞での選択マーカー遺伝子としてはEc
ogptCMulligan、几、C8ら(1980年
)サイエンス、209巻、1422頁〕、neo (5
outhern。
のみを選択的に増殖させる為には、選択マーカー遺伝子
が同一DNA配列上に存在するLT発現ベクターが適切
である。動物細胞での選択マーカー遺伝子としてはEc
ogptCMulligan、几、C8ら(1980年
)サイエンス、209巻、1422頁〕、neo (5
outhern。
P、J、ら(1982年)ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・アンド・アプライド・ジエネテイツクス(J、M
o1.Appl、Genet、 ) 、 1巻、32
7頁〕、dhfr [Wigler、 M、ら(198
0年)、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。
ラー・アンド・アプライド・ジエネテイツクス(J、M
o1.Appl、Genet、 ) 、 1巻、32
7頁〕、dhfr [Wigler、 M、ら(198
0年)、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。
77巻、8567頁〕などの遺伝子が用いられる。前述
のpsvesmaILTはEcogpt を有するLT
発現ベクターである。Ecogptを有する発現ベクタ
ーの形質転換株はミコフェノール酸耐性株として分離で
きる。
のpsvesmaILTはEcogpt を有するLT
発現ベクターである。Ecogptを有する発現ベクタ
ーの形質転換株はミコフェノール酸耐性株として分離で
きる。
今回、本発明者らはdhfrを有するLT発現ベクター
を作製した。dhfrを有するLT発現ベクターの形質
転換株は、宿主としてdhfr−株を宿主とすると、ヌ
クレオシド類を含まない培地で容易に選択が可能になる
。dhfrとしてはI)SV2dhfr (Mulli
gan、几、C8とBerg。
を作製した。dhfrを有するLT発現ベクターの形質
転換株は、宿主としてdhfr−株を宿主とすると、ヌ
クレオシド類を含まない培地で容易に選択が可能になる
。dhfrとしてはI)SV2dhfr (Mulli
gan、几、C8とBerg。
P、(1980年)サイエンス、209巻、 1422
頁〕或いはpAdD 268 V (A) (Kauf
man、 IL。
頁〕或いはpAdD 268 V (A) (Kauf
man、 IL。
J、と5harp、 P、 A、 (1982年)モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー12巻。
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー12巻。
1304頁〕等のdhfrを用いることが可能である。
また高等生物のみならず微生物のdhfrを利用するこ
ともできる。またジノーイドロ葉酸還元酵素欠損株すな
わちdbfr″″株としてはCHOdhfr″″[:U
rlaub、 G、とChasin、 L。
ともできる。またジノーイドロ葉酸還元酵素欠損株すな
わちdbfr″″株としてはCHOdhfr″″[:U
rlaub、 G、とChasin、 L。
(1980年)プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエニ/ス・ニーニスニー
、77巻、4216頁〕が知られている。またdhfr
を有するLT発現ベクターのLTの発現をコントロール
しているプロモーターとしては、培養細胞で機能するプ
ロモーターであればどのようなものでもよい。たとえば
構成的な蛋白の遺伝子のプロモーター或いは誘導蛋白の
遺伝子のプロモーターであってもよい。
ナル・アカデミ−・オブ・サイエニ/ス・ニーニスニー
、77巻、4216頁〕が知られている。またdhfr
を有するLT発現ベクターのLTの発現をコントロール
しているプロモーターとしては、培養細胞で機能するプ
ロモーターであればどのようなものでもよい。たとえば
構成的な蛋白の遺伝子のプロモーター或いは誘導蛋白の
遺伝子のプロモーターであってもよい。
この場合、LTのmILN A合成は接続したプロモー
ター領域の制御下におかれ、たとえば接続したプロモー
ター領域が構成的な蛋白の遺伝子のプロモーター領域で
あれば、細胞内でLTのm几NAは常時合成され、従っ
て細胞はLTの構成的生産細胞になる。もし接続するプ
ロモーター領域が、誘導蛋白のものであれば、形質転換
細胞は、LT誘等蛋白として生産する。
ター領域の制御下におかれ、たとえば接続したプロモー
ター領域が構成的な蛋白の遺伝子のプロモーター領域で
あれば、細胞内でLTのm几NAは常時合成され、従っ
て細胞はLTの構成的生産細胞になる。もし接続するプ
ロモーター領域が、誘導蛋白のものであれば、形質転換
細胞は、LT誘等蛋白として生産する。
動物培養細胞で機能するプロモーターとして8V40の
初期遺伝子プロモーターが知られている。このプロモー
ターは8V40DNAのHindlll−Pvullフ
ラグメント、約850ベースペア(bp)DNA断片に
含まれている。
初期遺伝子プロモーターが知られている。このプロモー
ターは8V40DNAのHindlll−Pvullフ
ラグメント、約850ベースペア(bp)DNA断片に
含まれている。
また、このDNA断片は逆向きに8V40の後期遺伝子
のプロモーターとしての活性を有している。
のプロモーターとしての活性を有している。
ヘルペス・シンプレックス・ウィルス(H8V)タイプ
lのチミジンキナーゼプロモーターモ5V40初期遺伝
子プロモーターと同様に構成的なプロモーターであり、
領域の構造はWagnerらによって示されている[W
agner、 M、 J 、ら(1981年)プロシー
デイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス・ニーニスニー、79巻、1441頁〕。
lのチミジンキナーゼプロモーターモ5V40初期遺伝
子プロモーターと同様に構成的なプロモーターであり、
領域の構造はWagnerらによって示されている[W
agner、 M、 J 、ら(1981年)プロシー
デイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス・ニーニスニー、79巻、1441頁〕。
またdhftを有するLTQ現ベクターに含まれるLT
をコードするDNA配列は、LTの発現が可能なものな
らLT染色体DNA配列、CDNA配列、合成りNA配
列の何れでも良い。またDNA配列の一部を人為的に改
変したDNA配列や欠失、置換、挿入、転移等の変異を
有するものでも良い。
をコードするDNA配列は、LTの発現が可能なものな
らLT染色体DNA配列、CDNA配列、合成りNA配
列の何れでも良い。またDNA配列の一部を人為的に改
変したDNA配列や欠失、置換、挿入、転移等の変異を
有するものでも良い。
LT発現ベクターとしては、プラスミドやファージDN
Aのように、微生物で複製し且つ大量調製可能なものが
利用できる。また細胞への導入に用いるDNA源として
はプラスミドを保有する微生物、ファージなども利用で
きる。
Aのように、微生物で複製し且つ大量調製可能なものが
利用できる。また細胞への導入に用いるDNA源として
はプラスミドを保有する微生物、ファージなども利用で
きる。
(4)LT発現ベクターによるLT耐性細胞の形質転換
株 LT耐性細胞へのLT発現ベクターの導入法として、ト
ランスフェクション効率に差はあるが、リン酸カルシウ
ム法[Wigler、 M、ら(1977年)セル、1
1巻、223頁〕、マイクロインジェクション法[:A
nderson、W、 F、ら(1980年)プロシー
デイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス・ニーニスニー、77巻、5899頁〕、
リポゾーム法、DEAE−デキストラン法或いは細胞融
合法(5chof fner 、 W、ら(1980年
)プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。
株 LT耐性細胞へのLT発現ベクターの導入法として、ト
ランスフェクション効率に差はあるが、リン酸カルシウ
ム法[Wigler、 M、ら(1977年)セル、1
1巻、223頁〕、マイクロインジェクション法[:A
nderson、W、 F、ら(1980年)プロシー
デイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス・ニーニスニー、77巻、5899頁〕、
リポゾーム法、DEAE−デキストラン法或いは細胞融
合法(5chof fner 、 W、ら(1980年
)プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。
77巻、2163頁〕等が用いられる。リン酸カルシウ
ム法として用いるDNA材料としては、 ゛D
NA溶液の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利
用できる。細胞融合法では目的J)NA配列をプラスミ
ドとして保有している微生物のプロトプラストが用いら
れる。
ム法として用いるDNA材料としては、 ゛D
NA溶液の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利
用できる。細胞融合法では目的J)NA配列をプラスミ
ドとして保有している微生物のプロトプラストが用いら
れる。
LT発現ベクターをLT耐性細胞に導入し、安定にLT
を産生ずる継代培養可能な細胞は、形質転換後、LT発
現ベクターが保有する選択マーカー遺伝子或いはLT発
現ベクターと同時に細胞に導入した選択マーカー遺伝子
が与える形質によって選択できる。選択マーカー遺伝子
カ、EcogI)jの場合は、ミコフェノール酸耐性細
胞として選択できる。また選択マーカー遺伝子が、dh
frの場合は、宿主細胞をLT耐性のジハイドロ葉酸還
元酵素欠損株すなわちdhfr−株を用いることにより
ヌクレオチド類を含まない培地でヌクレオチメ非要求細
胞として容易に分1111 テきる。dhfr−株はU
rlaubら[:’[rrlaub。
を産生ずる継代培養可能な細胞は、形質転換後、LT発
現ベクターが保有する選択マーカー遺伝子或いはLT発
現ベクターと同時に細胞に導入した選択マーカー遺伝子
が与える形質によって選択できる。選択マーカー遺伝子
カ、EcogI)jの場合は、ミコフェノール酸耐性細
胞として選択できる。また選択マーカー遺伝子が、dh
frの場合は、宿主細胞をLT耐性のジハイドロ葉酸還
元酵素欠損株すなわちdhfr−株を用いることにより
ヌクレオチド類を含まない培地でヌクレオチメ非要求細
胞として容易に分1111 テきる。dhfr−株はU
rlaubら[:’[rrlaub。
GとChasin+ L、 (1980年)プロシーデ
イングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス・ニーニスニー、77巻。
イングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス・ニーニスニー、77巻。
4216頁〕の方法により作製できる。
(5)増幅可能な遺伝子を有するLT発現ベクターとそ
のLT耐性細胞の形質転換細胞 LTg現ベクターによるLT耐性細胞の形質転換細胞の
LT生産量は、形質転換細胞に含まれるLTi伝子0コ
ピー数に相関があると考えられる。LTa伝子0コピー
数の多い、すなわちLTの生産性の高い細胞は、増幅可
能な遺伝子を有するLT発現ベクターを導入後、単細胞
分離或いは増幅可能な遺伝子の増幅した細胞が選択的に
増殖する条件で細胞を選択することにより行うことがで
きた。
のLT耐性細胞の形質転換細胞 LTg現ベクターによるLT耐性細胞の形質転換細胞の
LT生産量は、形質転換細胞に含まれるLTi伝子0コ
ピー数に相関があると考えられる。LTa伝子0コピー
数の多い、すなわちLTの生産性の高い細胞は、増幅可
能な遺伝子を有するLT発現ベクターを導入後、単細胞
分離或いは増幅可能な遺伝子の増幅した細胞が選択的に
増殖する条件で細胞を選択することにより行うことがで
きた。
増幅可能な遺伝子を有するLT発現ベクターに用いる事
のできる増幅可能な遺伝子としては、ジハイドロ葉酸還
元酵素遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ
遺伝子、メタロチオネイン遺伝子が利用できる。またそ
の他の増幅可能な遺伝子(8tark、 G、 R,と
Wahl、G、M。
のできる増幅可能な遺伝子としては、ジハイドロ葉酸還
元酵素遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ
遺伝子、メタロチオネイン遺伝子が利用できる。またそ
の他の増幅可能な遺伝子(8tark、 G、 R,と
Wahl、G、M。
(1984年)アニュアル・レビュー・オブ・バイオケ
ミストリー、53巻、447頁〕も利用できる。
ミストリー、53巻、447頁〕も利用できる。
ジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子を有するLT発現ベクタ
ーの形質転換細胞からジハイドロ葉酸還元醪素遺伝子の
増幅した細胞は、形質転換後1yuM以上の濃度のメソ
トロキセートヲ含む培地で選択され得る。選択された細
胞はジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子ばかりでなく、LT
遺伝子も増幅している場合が多い。また本発明者らは形
質転換後、1ywM以上のメソトロキセートを含む培地
で形質転換細胞を単細胞分離することにより、単細胞分
離する前の母集団から高生産株を得ることができた。同
様にメタロチオネイン遺伝子は重金属で、またアスパラ
ギン酸で増幅した細胞が分離できる。
ーの形質転換細胞からジハイドロ葉酸還元醪素遺伝子の
増幅した細胞は、形質転換後1yuM以上の濃度のメソ
トロキセートヲ含む培地で選択され得る。選択された細
胞はジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子ばかりでなく、LT
遺伝子も増幅している場合が多い。また本発明者らは形
質転換後、1ywM以上のメソトロキセートを含む培地
で形質転換細胞を単細胞分離することにより、単細胞分
離する前の母集団から高生産株を得ることができた。同
様にメタロチオネイン遺伝子は重金属で、またアスパラ
ギン酸で増幅した細胞が分離できる。
増幅可能な遺伝子を有するLT発現ベクターを導入し、
ある目標濃度のLTを生産させるための宿主細胞として
は、その濃度以上のLTに耐性を示す細胞ならいずれの
細胞でも良い。増幅可能な遺伝子としてジハイドロ葉酸
還元酵素遺伝子(dhfr)を用いる場合は、宿主とし
てdhfr−株を用いるとメソトロキセートによる遺伝
子増幅株を分離しやすい利点がある。
ある目標濃度のLTを生産させるための宿主細胞として
は、その濃度以上のLTに耐性を示す細胞ならいずれの
細胞でも良い。増幅可能な遺伝子としてジハイドロ葉酸
還元酵素遺伝子(dhfr)を用いる場合は、宿主とし
てdhfr−株を用いるとメソトロキセートによる遺伝
子増幅株を分離しやすい利点がある。
(6)形質転換細胞によるLTの生産
LT発現ベクターによって形質転換され、LTを産生ず
るようになった細胞は、通常細胞の培養に用いられる血
清を含んだ培地ばかりでなく、全く血清を含まない無血
清培地でもLTを産生ずる事を見い出した。LTの生産
に無血清培地を用いる事はLTの培地からの回収精製を
より容易にするばかりでなく、製品への血清成分の混入
を防ぐことになる。
るようになった細胞は、通常細胞の培養に用いられる血
清を含んだ培地ばかりでなく、全く血清を含まない無血
清培地でもLTを産生ずる事を見い出した。LTの生産
に無血清培地を用いる事はLTの培地からの回収精製を
より容易にするばかりでなく、製品への血清成分の混入
を防ぐことになる。
本発明者らが試用した動物培養細胞はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション(ATCO)から入手可
能なハムスター、サル、ヒト由来の細胞であるが、本明
細書に示されているLTの製造法を用いれば、少なくと
もを椎動胞、ウィルスによる形質転換細胞等において活
性あるLTを産生ずることが可能である。またヒトの細
胞をSV40で形質転換した株化細胞を生産細胞として
用いる事は、原因不明で癌化或いは株化した細胞に比し
て、適切な手段を講じることにより生産物の安全性の向
上が期待される。8V40の形質転換細胞としてWI−
26VA4が知られている。
プ・カルチャー・コレクション(ATCO)から入手可
能なハムスター、サル、ヒト由来の細胞であるが、本明
細書に示されているLTの製造法を用いれば、少なくと
もを椎動胞、ウィルスによる形質転換細胞等において活
性あるLTを産生ずることが可能である。またヒトの細
胞をSV40で形質転換した株化細胞を生産細胞として
用いる事は、原因不明で癌化或いは株化した細胞に比し
て、適切な手段を講じることにより生産物の安全性の向
上が期待される。8V40の形質転換細胞としてWI−
26VA4が知られている。
増幅可能な遺伝子を有するLT発現ベクターをLT酎耐
細胞に形質転換した形質転換株と同じ性質を有する細胞
は、増幅可能な遺伝子を有するDNAとLT発現ベクタ
ーによる形質転換(コトランスフエクション)によって
も得られる。コトランスフエクションによって得られた
細胞のLT遺伝子は増幅可能遺伝子と共に増幅するもの
と考えられ、本発明に包含される。
細胞に形質転換した形質転換株と同じ性質を有する細胞
は、増幅可能な遺伝子を有するDNAとLT発現ベクタ
ーによる形質転換(コトランスフエクション)によって
も得られる。コトランスフエクションによって得られた
細胞のLT遺伝子は増幅可能遺伝子と共に増幅するもの
と考えられ、本発明に包含される。
(実施例)
以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める「組換えDNA実験指針」NA、種々の酵
素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑誌、
成書を参考とした。
大臣の定める「組換えDNA実験指針」NA、種々の酵
素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑誌、
成書を参考とした。
1、蛋白質 核酸 酵素、26巻、4号、 (1981
年)臨時増刊 遺伝子操作(共立出版)2、遺伝子操作
実験法、高木東歌編著(1980年)講談社 3、遺伝子操作マニュアル、高木東歌編著(1982年
)J1談社 4、 Mo1ecular Oloning a l
aboratorymanual 、 ’I’、Man
iatisら編(1982年)Cold 8pring
Harbor Laboratory5、 Met
hods in Enzymology、 65巻、L
。
年)臨時増刊 遺伝子操作(共立出版)2、遺伝子操作
実験法、高木東歌編著(1980年)講談社 3、遺伝子操作マニュアル、高木東歌編著(1982年
)J1談社 4、 Mo1ecular Oloning a l
aboratorymanual 、 ’I’、Man
iatisら編(1982年)Cold 8pring
Harbor Laboratory5、 Met
hods in Enzymology、 65巻、L
。
Grossman ら編(1980年) Academ
icress 6、 Methods in Enzymology
、 68巻、ReWu編(1979年) Academ
ic Press実施例I LT耐性細胞の選択 B]EIK−21(C−18)[:ATOC! CC
UIO]。
icress 6、 Methods in Enzymology
、 68巻、ReWu編(1979年) Academ
ic Press実施例I LT耐性細胞の選択 B]EIK−21(C−18)[:ATOC! CC
UIO]。
CFIO−Kl(ATOCCCL−61:]、FL(A
TCCCCL62ml、WI8H(ATCC! CC
L25)。
TCCCCL62ml、WI8H(ATCC! CC
L25)。
Vero[:ATCCCCL81]及びWI−26VA
4[ATCCCCL95.1:lを24穴マルチウエル
プレートの底面全面に培養した。培地を2,000ユニ
ツト(U)AnI!L T 、 5%仔牛脂児血清(
has)を含むMEM培地に交換後、48時間培養した
。
4[ATCCCCL95.1:lを24穴マルチウエル
プレートの底面全面に培養した。培地を2,000ユニ
ツト(U)AnI!L T 、 5%仔牛脂児血清(
has)を含むMEM培地に交換後、48時間培養した
。
BHK−21(C−18)、Vero、WI−26VA
4は形態的な変化が観察されなかったが、CFIO−に
1.FL、WI8Hは変形し、培養器底面からの剥離が
観られた。このことからBHK−21(C−13)、V
ero、WI−26VA4は2.000vマLTに耐性
を示す細胞として選択された。
4は形態的な変化が観察されなかったが、CFIO−に
1.FL、WI8Hは変形し、培養器底面からの剥離が
観られた。このことからBHK−21(C−13)、V
ero、WI−26VA4は2.000vマLTに耐性
を示す細胞として選択された。
上記6種の細胞及び0HOdhfr″″(: Urla
ub、 G。
ub、 G。
とChasin、 L、 (1930年)プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス・ニーニスニー、77巻、4216頁〕をそれ
ぞれ24穴マルチウエルプレートの底面全面に培養し、
次に培地を100 U/mlのLT。
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス・ニーニスニー、77巻、4216頁〕をそれ
ぞれ24穴マルチウエルプレートの底面全面に培養し、
次に培地を100 U/mlのLT。
1μI/mlのアクチノマイシンD、5%FO8を含む
ヌクレオシド含有MEM・α培地(GIBCO社製)に
交換後、24時間培養した。BHK−21(C−13)
、Vero、WI−26VA4は形態的変化が観察され
なかったが、他の細胞は変形し培養器底面からの剥離が
観られた。
ヌクレオシド含有MEM・α培地(GIBCO社製)に
交換後、24時間培養した。BHK−21(C−13)
、Vero、WI−26VA4は形態的変化が観察され
なかったが、他の細胞は変形し培養器底面からの剥離が
観られた。
実施例2 LT耐性変異株の取得
Cl−l0dhfr−を75C1112の底面積を持つ
フラスコに底面全面に培養し、次に培地を250 U/
mlのL T 、 0.1 fig/mlのアクチノマ
イシ7D15%FO8を含むヌクレオシド含有MEMα
培地((413CO社製)に交換後、24時間培養した
。次に培地をアクチノマイシンDを含まない培地に更新
し約3週間培養し、生じたコロニーからCHOdhfr
−2−3株を分離した。CHOdhfr 2−3株は1
、000 U/me以上のLTに耐性を示した。
フラスコに底面全面に培養し、次に培地を250 U/
mlのL T 、 0.1 fig/mlのアクチノマ
イシ7D15%FO8を含むヌクレオシド含有MEMα
培地((413CO社製)に交換後、24時間培養した
。次に培地をアクチノマイシンDを含まない培地に更新
し約3週間培養し、生じたコロニーからCHOdhfr
−2−3株を分離した。CHOdhfr 2−3株は1
、000 U/me以上のLTに耐性を示した。
CHOdhfr−を25Cm2の底面積を持つフラスコ
に底面全面に培養し、次に培地を1,0OOU/ml!
のLT、5%FC8を含むヌクレオシド含有MEMα培
地に交換し、約1ケ月培養し、Cll0 dh f r
−6株を分mした。0HOdhfr−6株は1.0OO
U/ml!以上のLTに耐性を示した。
に底面全面に培養し、次に培地を1,0OOU/ml!
のLT、5%FC8を含むヌクレオシド含有MEMα培
地に交換し、約1ケ月培養し、Cll0 dh f r
−6株を分mした。0HOdhfr−6株は1.0OO
U/ml!以上のLTに耐性を示した。
実施例3 LT発現ベクターの作製
LTの発現ベクター1)8VeLTdhfrは、第1図
に示した手順により作製した。すなわちp8V2dhf
r(8ubramani 、 Sら(1981年)モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、1巻、8
54頁〕のHindm部位をI3amHIリンカ−を用
いてBamHIに改変したプラスミドpsV2dhfr
Bからdhfrを有するBamHI約1,9kb断片を
、pSVeSma I LT Cp8VesmaI L
Tの作製法については特願昭60−147371号に詳
述した〕のBamHIで部分分解したBamE[I部位
に挿入し、pSVeLTdhfrを作製シタ。
に示した手順により作製した。すなわちp8V2dhf
r(8ubramani 、 Sら(1981年)モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、1巻、8
54頁〕のHindm部位をI3amHIリンカ−を用
いてBamHIに改変したプラスミドpsV2dhfr
Bからdhfrを有するBamHI約1,9kb断片を
、pSVeSma I LT Cp8VesmaI L
Tの作製法については特願昭60−147371号に詳
述した〕のBamHIで部分分解したBamE[I部位
に挿入し、pSVeLTdhfrを作製シタ。
LT発現ベクターpSVLpT′Kdhfrは、第2図
−(a) 、 (b) 、 (C)に示した手順により
作製した。すなわちpH8v106 CMcNnigh
t、8.L、とGabis。
−(a) 、 (b) 、 (C)に示した手順により
作製した。すなわちpH8v106 CMcNnigh
t、8.L、とGabis。
E、几、(1980年)ヌクレイツク・アシッズ・リサ
ーチ、8巻、5911頁:ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリ−より入手〕のチミジンキナーゼ遺伝子ヲ持ツI’
vu II llfr片をp8V2gpt (A’l”
c037145 : Mulligan、■、C0とB
erg、P、 (1980年)サイエンス、209巻、
1422頁〕のI’vu■部位に挿入しpsVLpTK
を作製した〔第2図−(a) ]、次ニI)SVId)
TKのSV40のプロモーターとチミジンキナーゼのプ
ロモーターを含むBglII継片をBamHIで部分分
解したpsV2LLT(p8v2LLTの作製法につい
ては特願昭60−147371号に詳述した〕のBam
HI部位に挿入し、p8VLpTKLTを作製した〔第
2図−(9)〕。
ーチ、8巻、5911頁:ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリ−より入手〕のチミジンキナーゼ遺伝子ヲ持ツI’
vu II llfr片をp8V2gpt (A’l”
c037145 : Mulligan、■、C0とB
erg、P、 (1980年)サイエンス、209巻、
1422頁〕のI’vu■部位に挿入しpsVLpTK
を作製した〔第2図−(a) ]、次ニI)SVId)
TKのSV40のプロモーターとチミジンキナーゼのプ
ロモーターを含むBglII継片をBamHIで部分分
解したpsV2LLT(p8v2LLTの作製法につい
ては特願昭60−147371号に詳述した〕のBam
HI部位に挿入し、p8VLpTKLTを作製した〔第
2図−(9)〕。
次にp8V2dhfrBからdhfrを有するBam1
I工断片をpsVLpTKLTのBamHI部位に挿入
し、p8VLpTKLTdhfrを作製した〔第2図−
(C)〕。
I工断片をpsVLpTKLTのBamHI部位に挿入
し、p8VLpTKLTdhfrを作製した〔第2図−
(C)〕。
実施例4 LT発現ベクターによるLT耐性細胞の形
質転換 LT発現ベクター1)8VeLTdhfr或いは1)8
VLI)TKLTdhfrを用い、BHK−21(C−
ta)。
質転換 LT発現ベクター1)8VeLTdhfr或いは1)8
VLI)TKLTdhfrを用い、BHK−21(C−
ta)。
CHO−Kl、FL、WISH,Vero、WI−26
VA4 、0HOdhfr−、CHOdhfr″″2−
8及びCHOdhfr″′6を宿主としてWigler
らの方法(Wiglerら(1977年)セル、11巻
。
VA4 、0HOdhfr−、CHOdhfr″″2−
8及びCHOdhfr″′6を宿主としてWigler
らの方法(Wiglerら(1977年)セル、11巻
。
223頁〕に準じて形質転換を行った。
プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め5%FO
8を含む培地で生育させた細胞(2X105細胞73m
1g培地/直径6cm培養皿)に加え、15時間後に培
地を更新し、48時間培養した。次にCHOdhfr−
、CHOdhfr−2−3、CHOdhfr6の培地を
5%FO8,25μI/mlミコフェノール酸、250
μめ4司キサンチンを含むヌクレオシドを含まないME
Mα培地(GIBOO社製)に変え、またその他の培地
を5%FO8,25μl/ml!ミコフェノール酸、2
50μI/mlキサンチン、25ttli/mlアデニ
ンe 5 a I 7mlチミジン、0,1μめ翔りア
ミノプテリンを含むMΣM培地に変え、約8週間培養し
た。生じたコロニーを分離し、24穴マルチウエルプレ
ートに生育させ、培地を5%FC8を含む培地或いは含
まない培地に更新し、48時間後の培地に含まれるLT
を、L929細胞を標的細胞とする細胞致死効果で測定
した(Ruff 、 M、 R,とGifford、
G、 E、 (1981年)リンホカインズ、2巻、2
35頁)。すなわち96穴マルチデイツシユに2X10
’細胞/Well/100μl培地で1日培養後、培養
液を除き、アクチノマイシンD l al/rnl
、5%牛脂児血清を含むイーグルMEM培地で種々の濃
度に希釈したサンプルを100μl加え、20時間後の
細胞の変性致死効果を測定した。LTIユニットは50
%の致死率を与える濃度とした。
8を含む培地で生育させた細胞(2X105細胞73m
1g培地/直径6cm培養皿)に加え、15時間後に培
地を更新し、48時間培養した。次にCHOdhfr−
、CHOdhfr−2−3、CHOdhfr6の培地を
5%FO8,25μI/mlミコフェノール酸、250
μめ4司キサンチンを含むヌクレオシドを含まないME
Mα培地(GIBOO社製)に変え、またその他の培地
を5%FO8,25μl/ml!ミコフェノール酸、2
50μI/mlキサンチン、25ttli/mlアデニ
ンe 5 a I 7mlチミジン、0,1μめ翔りア
ミノプテリンを含むMΣM培地に変え、約8週間培養し
た。生じたコロニーを分離し、24穴マルチウエルプレ
ートに生育させ、培地を5%FC8を含む培地或いは含
まない培地に更新し、48時間後の培地に含まれるLT
を、L929細胞を標的細胞とする細胞致死効果で測定
した(Ruff 、 M、 R,とGifford、
G、 E、 (1981年)リンホカインズ、2巻、2
35頁)。すなわち96穴マルチデイツシユに2X10
’細胞/Well/100μl培地で1日培養後、培養
液を除き、アクチノマイシンD l al/rnl
、5%牛脂児血清を含むイーグルMEM培地で種々の濃
度に希釈したサンプルを100μl加え、20時間後の
細胞の変性致死効果を測定した。LTIユニットは50
%の致死率を与える濃度とした。
下表1〜5に示すように、LTQ現ベクターを導入した
BHK−21(0−13)、Vero、WI−26VA
4 、 CIfOdhfr−2−8、(HOdhfr−
6からは500U/噌を越すLT産性能を有す形質転換
株が得られたが、CHO−に1 、FL、WISH。
BHK−21(0−13)、Vero、WI−26VA
4 、 CIfOdhfr−2−8、(HOdhfr−
6からは500U/噌を越すLT産性能を有す形質転換
株が得られたが、CHO−に1 、FL、WISH。
(lHOdhfr−からはそのような株が得られなかっ
た。
た。
なお、表1〜5には夫々の形質転換株のうち、LT生産
性の高い代表的な3株の例を示す。
性の高い代表的な3株の例を示す。
(以下余白)
表−5
CHOdhfr−6の形質転換株によるLTの生産実施
例5 形質転換株のメントロキセー)(MtX)による
選択 実施例4で得られたBHKの形質転換株をそれぞれ直径
10儒のディツシュに10”乃至8X105細胞植え、
50nM乃至500 nMの〜ttx を含む培地で約
1ケ月培養し、それぞれの濃度のM t xに対して耐
性を示すコロニーを分離した。24穴マルチウエルプレ
ートに生育させて、培地を596FC,Sを含む培地或
いは含まない培地に更新し、48時間後の培地に含まれ
るLTを測定した。表−6に示すように、100 nM
或いは200 nMのMtxで選択した細胞から、親株
よりも高いLT生産性を示す株が得られた。
例5 形質転換株のメントロキセー)(MtX)による
選択 実施例4で得られたBHKの形質転換株をそれぞれ直径
10儒のディツシュに10”乃至8X105細胞植え、
50nM乃至500 nMの〜ttx を含む培地で約
1ケ月培養し、それぞれの濃度のM t xに対して耐
性を示すコロニーを分離した。24穴マルチウエルプレ
ートに生育させて、培地を596FC,Sを含む培地或
いは含まない培地に更新し、48時間後の培地に含まれ
るLTを測定した。表−6に示すように、100 nM
或いは200 nMのMtxで選択した細胞から、親株
よりも高いLT生産性を示す株が得られた。
実施例4で得られたCHOdhfr−2−3株或いはC
HOdhfr−6株の形質転換株をそれぞれ直径10c
mのディツシュに10 乃至8×10 細胞植え、1n
M乃至500 LpMのMtxを含む培地で約1ケ月
培養しそれぞれの濃度のMtXに対して耐性を示すコロ
ニーを分離した。24穴マルチウエルプレートに生育さ
せ、培地を5%FO8を含む培地或いは含まない培地に
更新し、48時間後の培地に含まれるLTを測定した。
HOdhfr−6株の形質転換株をそれぞれ直径10c
mのディツシュに10 乃至8×10 細胞植え、1n
M乃至500 LpMのMtxを含む培地で約1ケ月
培養しそれぞれの濃度のMtXに対して耐性を示すコロ
ニーを分離した。24穴マルチウエルプレートに生育さ
せ、培地を5%FO8を含む培地或いは含まない培地に
更新し、48時間後の培地に含まれるLTを測定した。
表−7に示すように全ての濃度で選択した細胞から親株
よりも高いLT生産性を示す株が得られた。
よりも高いLT生産性を示す株が得られた。
(以下余白)
実施例6 LTの回収
実施例5に記載したLT生産細胞2−8E−1−55を
5%FO8を含むMEMα培地(GIIlCO社製)で
培養した。培養液tooml!を5mMリン酸緩衝液で
透析後、DEAE−セルロースカラム(2X10cm)
に吸着させ、0〜0.3MNaC1の濃度勾配で溶出さ
せた。収率は約75%で86万ユニツトのLTが回収さ
れた。
5%FO8を含むMEMα培地(GIIlCO社製)で
培養した。培養液tooml!を5mMリン酸緩衝液で
透析後、DEAE−セルロースカラム(2X10cm)
に吸着させ、0〜0.3MNaC1の濃度勾配で溶出さ
せた。収率は約75%で86万ユニツトのLTが回収さ
れた。
第1図はプラスミドpSVeLTdhfrの作製の模式
図、第2図−(a)、第2図−(至)及び第2図−(C
)はそれぞれプラスミドp8VLpTK、、p8VLp
TKLT及びp8VLpTKLTdhfrの作製の模式
図である。 図中、EcoRI 、BarrLTII、8ma1.8
al IIHindln、PvuL及びBglllはそ
れぞれ制限酵素Eco几I、BamHi 、8ma I
、8al I。 Hin d m + P v u If及びBglII
の認識部位を示す。 またLT 、Ampr、Ecogpt 、dhfr及び
TKはそれぞれLTi伝子1アンピシリン耐性遺伝子、
大ryamのグアニン・ホスホリボシル・トランスフェ
ラーゼ遺伝子、ジハイドロ莱酸還元酵素遺伝子及び単純
ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子を示す。S
Ve 、pTK、pAはそれぞれSV40の初期遺伝子
プロモーター領域、単純ヘルペスウィルスのチミジンキ
ナーゼ遺伝子のプロモーター領域及び8V40のポリア
デニル酸付加シグナルを含む領域を示す。 特許出願人 鐘淵化学工業株式会社 代理人 弁理士 浅 野 真 − 第1図 第2 図−(a) 図面の、′I)I壜内、2に変更な1.)第金図−(C
) 手続補正書 昭和H年!月7日 1、事件の表示 昭和61年 イ寺 i′+III第23637号3、
補正をする者 事件との関係 特許出願人 フリガナ 、。 、rr 大阪市北区中之島三丁目2番4
号r9基(名称)(0ツリ鐘淵化学工業株式会社代表者
新納眞人 4、代理人
図、第2図−(a)、第2図−(至)及び第2図−(C
)はそれぞれプラスミドp8VLpTK、、p8VLp
TKLT及びp8VLpTKLTdhfrの作製の模式
図である。 図中、EcoRI 、BarrLTII、8ma1.8
al IIHindln、PvuL及びBglllはそ
れぞれ制限酵素Eco几I、BamHi 、8ma I
、8al I。 Hin d m + P v u If及びBglII
の認識部位を示す。 またLT 、Ampr、Ecogpt 、dhfr及び
TKはそれぞれLTi伝子1アンピシリン耐性遺伝子、
大ryamのグアニン・ホスホリボシル・トランスフェ
ラーゼ遺伝子、ジハイドロ莱酸還元酵素遺伝子及び単純
ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子を示す。S
Ve 、pTK、pAはそれぞれSV40の初期遺伝子
プロモーター領域、単純ヘルペスウィルスのチミジンキ
ナーゼ遺伝子のプロモーター領域及び8V40のポリア
デニル酸付加シグナルを含む領域を示す。 特許出願人 鐘淵化学工業株式会社 代理人 弁理士 浅 野 真 − 第1図 第2 図−(a) 図面の、′I)I壜内、2に変更な1.)第金図−(C
) 手続補正書 昭和H年!月7日 1、事件の表示 昭和61年 イ寺 i′+III第23637号3、
補正をする者 事件との関係 特許出願人 フリガナ 、。 、rr 大阪市北区中之島三丁目2番4
号r9基(名称)(0ツリ鐘淵化学工業株式会社代表者
新納眞人 4、代理人
Claims (43)
- (1)リンホトキシン耐性変異細胞。
- (2)細胞がジハイドロ葉酸還元酵素欠損細胞である特
許請求の範囲第1項記載の変異細胞。 - (3)細胞の由来がCHOdhfr^−である特許請求
の範囲第1項或いは第2項記載の変異細胞。 - (4)リンホトキシン耐性細胞を宿主としたリンホトキ
シンの製造方法。 - (5)リンホトキシン耐性細胞がBHK−21(C−1
3)、Vero或いはWI−26 VA4である特許請
求の範囲第4項記載の製造方法。 - (6)リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性変
異細胞である特許請求の範囲第4項記載の製造方法。 - (7)細胞の由来がCHOdhfr^−である特許請求
の範囲第6項記載の製造方法。 - (8)増幅可能な遺伝子のDNA配列が同一のDNA鎖
上に存在するリンホトキシン発現ベクター。 - (9)リンホトキシンのDNA配列がヒト染色体DNA
配列である特許請求の範囲第8項記載のリンホトキシン
発現ベクター。 - (10)増幅可能な遺伝子がジハイドロ葉酸還元酵素の
遺伝子である特許請求の範囲第8項或いは第9項記載の
リンホトキシン発現ベクター。 - (11)発現ベクターがpSVeLTdhfr或いはp
SVLpTKLTdhfrの何れかである特許請求の範
囲第8項記載のリンホトキシン発現ベクター。 - (12)リンホトキシン発現ベクターによるリンホトキ
シン耐性細胞の形質転換細胞。 - (13)リンホトキシン発現ベクターのリンホトキシン
のDNA配列が、ヒト染色体DNA配列である特許請求
の範囲第12項記載の形質転換細胞。 - (14)リンホトキシン耐性細胞がBHK−21(C−
13)、Vero或いはWI−26 VA4である特許
請求の範囲第12項或いは第13項記載の形質転換細胞
。 - (15)リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
変異細胞である特許請求の範囲第12項或いは第13項
記載の形質転換細胞。 - (16)リンホトキシン耐性変異細胞の由来がCHOd
hfr^−である特許請求の範囲第15項記載の形質転
換細胞。 - (17)リンホトキシン発現ベクターによるリンホトキ
シン耐性細胞の形質転換細胞を培養し、リンホトキシン
を生成せしめ、これを採取することを特徴とするリンホ
トキシンの製造方法。 - (18)リンホトキシン発現ベクターのリンホトキシン
のDNA配列がヒト染色体DNA配列である特許請求の
範囲第17項記載の製造方法。 - (19)リンホトキシン耐性細胞がBHK、Vero或
いはWI−26 VA4である特許請求の範囲第17項
或いは第18項記載の製造方法。 - (20)リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
変異細胞である特許請求の範囲第17項或いは第18項
記載の製造方法。 - (21)リンホトキシン耐性変異細胞の由来がCHOd
hfr^−である特許請求の範囲第20項記載の製造方
法。 - (22)培養に用いる培地が無血清培地である特許請求
の範囲第17項乃至第21項の何れかの項記載の製造方
法。 - (23)増幅可能な遺伝子のDNA配列が同一DNA鎖
上に存在するリンホトキシン発現ベクター或いは増幅可
能な遺伝子のDNA配列を有するDNAとリンホトキシ
ン発現ベクターの何れかによるリンホトキシン耐性細胞
の形質転換細胞。 - (24)リンホトキシン発現ベクターのリンホトキシン
のDNA配列が、ヒト染色体DNA配列である特許請求
の範囲第23項記載の形質転換細胞。 - (25)リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
変異細胞である特許請求の範囲第23項或いは第24項
記載の形質転換細胞。 - (26)形質転換細胞が、形質転換後、増幅可能な遺伝
子の増幅した細胞が選択的に増殖する培養条件で選択さ
れた細胞である特許請求の範囲第23項乃至第25項の
何れかの項記載の形質転換細胞。 - (27)増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素
の遺伝子である特許請求の範囲第23項或いは第24項
記載の形質転換細胞。 - (28)リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
変異細胞である特許請求の範囲第27項記載の形質転換
細胞。 - (29)リンホトキシン耐性細胞がジハイドロ葉酸欠損
細胞である特許請求の範囲第27項或いは第28項記載
の形質転換細胞。 - (30)リンホトキシン耐性細胞がBHK−21(C−
13)、Vero或いはWI−26 VA4である特許
請求の範囲第27項記載の形質転換細胞。 - (31)リンホトキシン耐性変異細胞の由来がCHOd
hfr^−である特許請求の範囲第28項記載の形質転
換細胞。 - (32)形質転換細胞が、形質転換後、1nM以上の濃
度のメソトロキセートに耐性を示す細胞として選択され
た細胞である特許請求の範囲第27項乃至第31項の何
れかの項記載の形質転換細胞。 - (33)増幅可能な遺伝子のDNA配列が、同一DNA
鎖上に存在するリンホトキシン発現ベクター或いは増幅
可能な遺伝子のDNA配列を有するDNAとリンホトキ
シン発現ベクターの何れかによるリンホトキシン耐性細
胞の形質転換細胞を培養し、リンホトキシンを生成せし
め、これを採取することを特徴とするリンホトキシンの
製造方法。 - (34)リンホトキシン発現ベクターのリンホトキシン
のDNA配列がヒト染色体DNA配列である特許請求の
範囲第33項記載の製造方法。 - (35)リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
変異細胞である特許請求の範囲第33項或いは第34項
記載の製造方法。 - (36)形質転換細胞が、形質転換後、増幅可能な遺伝
子の増幅した細胞が選択的に増殖する培養条件で選択さ
れた細胞である特許請求の範囲第33項乃至第35項の
何れかの項記載の製造方法。 - (37)増幅可能な遺伝子がジハイドロ葉酸還元酵素の
遺伝子である特許請求の範囲第33項或いは第34項記
載の製造方法。 - (38)リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
変異細胞である特許請求の範囲第37項記載の製造方法
。 - (39)リンホトキシン耐性細胞がジハイドロ葉酸欠損
細胞である特許請求の範囲第37項或いは第38項記載
の製造方法。 - (40)リンホトキシン耐性細胞が、BHK−21(C
−13)、Vero或いはWI−26 VA4である特
許請求の範囲第37項記載の製造方法。 - (41)リンホトキシン耐性変異細胞の由来がCHOd
hfr^−である特許請求の範囲第38項記載の製造方
法。 - (42)形質転換細胞が、形質転換後、1nM以上の濃
度のメソトロキセートに耐性を示す細胞として選択され
た細胞である特許請求の範囲第37項乃至第41項の何
れかの項記載の製造方法。 - (43)培養に用いる培地が無血清培地である特許請求
の範囲第33項乃至42項の何れかの項記載の製造方法
。
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61023637A JPS62181779A (ja) | 1986-02-05 | 1986-02-05 | リンホトキシン耐性細胞及び該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法 |
AU59453/86A AU603768B2 (en) | 1985-07-04 | 1986-07-01 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
CA000512923A CA1302921C (en) | 1985-07-04 | 1986-07-02 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
US06/882,109 US4988624A (en) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin DNA, lymphotoxin expression vector |
EP86109069A EP0207518B1 (en) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
DE8686109069T DE3686909T2 (de) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin-dns, lymphotoxin-expressionsvektor, lymphotoxin-expressionsvektor enthaltender transformant und verfahren zur herstellung von lymphotoxin. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61023637A JPS62181779A (ja) | 1986-02-05 | 1986-02-05 | リンホトキシン耐性細胞及び該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62181779A true JPS62181779A (ja) | 1987-08-10 |
Family
ID=12116086
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61023637A Pending JPS62181779A (ja) | 1985-07-04 | 1986-02-05 | リンホトキシン耐性細胞及び該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS62181779A (ja) |
-
1986
- 1986-02-05 JP JP61023637A patent/JPS62181779A/ja active Pending
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