JPS62181779A - リンホトキシン耐性細胞及び該細胞を用いるリンホトキシンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リンホトキシンに耐性になった変異細胞及び
増幅可能な遺伝子のＤＮＡ配列を有する新規リンホトキ
シン発現ベクターに係る。更に本発明はリンホトキシン
発現ベクターによるリンホトキシン耐性細胞の形質転換
細胞、及び該形質転換細胞を用いるリンホトキシンの製
造法に係る。

リンホトキシン（ＬＴ）は直接あるいは間接的に癌細胞
のみを攻撃し、壊死させる作用を持ち（ＥｖａｎｓＯ，
Ｈ，ら（１９７７年）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅｓ、　）　、　８７巻、８９８頁〕、制癌剤
としての臨床応用が期待されている。

（従来の技術） ＬＴは、ヒト或いはマウス等の動物のリンパ体細胞ヲフ
イトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ等のレクチン或
いはフォルボールエステルで刺激することにより誘導さ
れるリンホカインの一種である（Ｄｅｖｌｉｎ、　Ｊ、
　Ｊ、　（１９８４年）リンホカインズ（Ｉ、ｙｍｐｈ
ｏｋｉｎｅｓ）　、　９巻、３１３頁〕。ＬＴの蛋白化
学的研究は、いくつかのグループで研究されているが、
分子量約２０，０００の成分がその巌小単位であり、そ
の単位成分が会合したものや、他の成分との複合体があ
るとされている（Ａｇｇａｒｗａｌ　、　Ｂ、　Ｂ、ら
（１９８４年）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー。

２５９巻、６８６頁〕。

ＬＴは、フォルボールエステル、マイト−ジエン等で刺
激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、こ
のような生産法では生産されるＬＴは極めて微金であり
、また大量の新鮮なリンパ球が必要となり量産には不向
きである。また株化されたリンパ球由来の細胞（株化細
胞）をマイト−ジエン等で刺激するとＬＴが誘導的に産
生されることが知られているが、生産能は用いる細胞の
能力に大きく依存しており、やはり量産に適した系とは
言えない。近年ＬＴのｃＤＮＡがクローニングされ、大
腸菌でＬＴ様蛋白の生産が可能になった（　Ｇｒａｙ、
　Ｐ、　Ｗ、ら（１９８４年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）　、　８１２巻、７２１頁）。しかし微生物でつく
られるＬＴ様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白合成機
構が多少異なるため、つくられる蛋白のアミノ末端が天
然のそれと異なる場合が多い。更に微生物によってつく
られるＬＴ様蛋白は、天然のＬＴが糖鎖を有しているの
に対し、糖鎖が結合していない。このように微生物の蛋
白合成系によってつくられたＬＴ様蛋白と天然のＬＴと
は物質として明らかに異なり、治療薬として長期間使用
したり、頻回使用する場合には、抗原抗体反応の問題が
懸念される。

（発明が解決しようとする問題点） 蛋白のアミノ末端が天然のＬＴと同じで且つ糖鎖を有す
るＬＴを生産する為には、動物培養細胞を宿主とした遺
伝子組換えの手法の適用が考えられる。−例として高率
に発現するように設計構築した■、Ｔ発現ベクターで培
養細胞を形質転換し、その形質転換株を培養しＬＴを生
産する方法が考えられる。しかしＬＴは細胞に対し強い
毒性を有する物質であり、従ってＬＴ発現ベクターで形
質転換された細胞は、自らつくるＬＴの為に死滅してし
まい継代培養が可能な形質転換株を得ることは困難なこ
とと思われた。しかし本発明者らは実際にＢＥＩＫ細胞
にＬＴ発現ベクターを導入し、その形質転換細胞を用い
ＬＴの生産が可能であることを示した（特願昭６０−１
４７８７１号）。

また形質転換されたＢＥ：に細胞は継代培養が可能で長
期間にわたりＬＴを生産しつづける細胞であった。本発
明者らはＢＨＫのＬＴに対する感受性を調べたところ、
ＢＥ［ＫはＬＴに対し耐性を示すことを知った。一方Ｃ
ＨＯ，ＦＬ、ＷＩ８Ｔ’ｉ等の細胞はＬＴに感受性を示
し死滅した。またこれらＬＴに感受性を示す細胞をＬＴ
発現ベクターで形質転換した場合、それらの形質転換株
はいずれもＬＴを産生じないか、或いは産生じても極め
て少量しか産生じなかった。ＢＨＫと同様にＬＴに対し
耐性を示す細胞であるＶｅｒｏ、Ｗニー２６　　ＶＡ４
からは安定にＬＴを生産する形質転換株が得られた。

以上の結果から、ＬＴ発現ベクターの形質転換株でＬＴ
を生産させる場合、宿主どしてはＬＴに耐性を示す細胞
が適切であることが見い出され、本発明に至った。

現在非常に多くの細胞が株化されている。それらの細胞
の中にはＬＴに感受性を示すが、形質転換効率が高い、
容易に形質転換株が得られる、細胞増殖の血清依存性が
低い、生育が速い、大量培養が容易である、蛋白の合成
或いは分泌能が高い、細胞の性質が良く知られている、
特殊な遺伝的性質を持つ等の細胞育種上優れた性質を持
つ株がある。それらの細胞においても安定且つ大量にＬ
Ｔを生産する形質転換株を得る技術を確立することはＬ
Ｔの生産土瓶めで重要である。

本発明者らはＬＴに耐性を示す細胞を分離する技術を確
立し、その細胞からＬＴを安定に生産する形質転換株を
得ることに成功し、本発明に至った。

遺伝子を細胞に導入した場合、導入遺伝子は宿主染色体
ＤＮＡに安定に組み込まれる場合がある。

遺伝子が組み込まれる染色体上の位置は一見でたらめで
あり、また組み込まれるＤＮＡのコピー数も不規則であ
る。ＬＴ遺伝子を細胞に導入した場合、組み込まれた位
置やコピー数が細胞ごとに異なり、各々の細胞のＬＴ生
産皿は異なる。従って細胞をクローン化することにより
種々の生産量を有する細胞を得ることができる。ＬＴの
生産量はＬ’Ｉ’ｉ伝子のコピー数に相関があると考え
られ、ＬＴの遺伝子数の増加した細胞はＬＴの生産能が
向上するものと期待される。

本発明者らは、ＬＴに耐性を示す細胞を宿主として増幅
可能な遺伝子を有するＬＴ発現ベクターを導入し、適切
な条件下で細胞を選択することにより初めてＬＴの高生
産株の育種に成功し、本発明に至った。またこれらの細
胞は無血清培地でもＬＴを生産し得る細胞であった。Ｌ
Ｔの生産に無血清培地を用いる事はＬＴの培地からの回
収精製を容易にするばかりでなく、製品への血清成分の
混入を防ぐことになる。

以下に本発明を更に詳細に説明する。

（問題点を解決するための手段） （１）ＬＴ耐性株の選択 細胞にＬＴ発現ベクターを導入し、ある目標濃度のＬＴ
を産生させるためには、宿主として用いる細胞が最低そ
の濃度以上のＬＴに対し耐性である必要がある。実際に
はＬＴを分泌している宿主細胞の周辺は、他の玲境より
もＬＴの濃度が高いと考えられるので、宿主として用い
る細胞は目標濃度よりも高い濃度のＬＴに耐性である必
要があると考えられる。細胞が設定した濃度のＬＴに耐
性を示すかどうかを調べるには、その細胞をその濃度の
ＬＴを含む培地で継代培養すればよい。ＬＴ感受性細胞
は、ＬＴの毒性のため培養中に増殖速度が遅くなり、変
性変形し或いは死滅するが、ＬＴ耐性細胞は生育しつづ
ける為に容易に選択できる。またＬＴ感受性株は、培地
中にアクチノマイシンＤやマイトマイシンＣが存在する
と、そのＬＴ感受性が増加し変性変形化が促進されるの
で、ＬＴ耐性細胞と区別される。

（２）ＬＴ耐性変異株の取得 ある濃度のＬＴに感受性を示す細胞から、その濃度以上
のＬＴに耐性を示す細胞を取得するには、ＬＴをその濃
度以上で含む培地中で細胞を継代培養すればよい。その
濃度のＬＴに感受性の細胞は、培養中に増殖が遅くなり
、変性変形し或いは死滅するが、耐性を獲得した細胞は
生育しつづける為に容易に分離できる。この場合ＬＴを
含む培地で選択する前にエチルメタンスルフォネート等
の変異剤で予め細胞を処理してもよい。またＬＴ感受性
細胞は、培地中で致死的濃度でないアクチノマイシンＤ
やマイトマイシンＣが存在すると、そのＬＴ感受性が増
加し変性変形化が促進されるので、ＬＴ酎耐を獲得した
細胞を短期間のうちに濃縮することができる。ＬＴ耐性
を獲得した細胞を本明細書ではＬＴ耐性変異細胞と呼称
する。またＬＴ耐性変異細胞はＬＴに対して耐性を示す
細胞すなわちＬＴ耐性細胞に包含されるものとする。

ここに示した方法によって、基本的にはどのような感受
性細胞からも、ＬＴ耐性を示す細胞が得られる。

またＬＴ耐性変異細胞とは、その親細胞よりも高い濃度
のＬＴに対して耐性を獲得した細胞を示すのであって、
必ずしも細胞の遺伝子に変異を伴っている細胞とは限ら
ない。

（３）ＬＴ発現ベクター ＬＴ発現ベクターとは、細胞に導入した場合、導入され
た細胞がＬＴの生産能を獲得するようなりＮＡ配列を持
つｆ）ＮＡを示す。ＬＴ発現ベクターの一つとしてｐ８
ＶｅＳｍａ　ＩＬＴがあげられる。このプラスミド性ベ
クターは、ＬＴの遺伝子の５′側上流に８Ｖ４０の初期
遺伝子プロモーターが接続したＤＮＡ配列を有し、動物
培養細胞に導入した場合、ＬＴの機能的なメツセンジャ
ーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成は８Ｖ４０の初期プロモー
ターによってコントロールされている（特願昭６０−１
４７８７１号）。

ＬＴ発現ベクターを細胞に導入し、安定に発現する細胞
のみを選択的に増殖させる為には、選択マーカー遺伝子
が同一ＤＮＡ配列上に存在するＬＴ発現ベクターが適切
である。動物細胞での選択マーカー遺伝子としてはＥｃ
ｏｇｐｔＣＭｕｌｌｉｇａｎ、几、Ｃ８ら（１９８０年
）サイエンス、２０９巻、１４２２頁〕、ｎｅｏ　（５
ｏｕｔｈｅｒｎ。

Ｐ、Ｊ、ら（１９８２年）ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・アンド・アプライド・ジエネテイツクス（Ｊ、Ｍ
ｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、　）　、　　１巻、３２
７頁〕、ｄｈｆｒ　［Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、ら（１９８
０年）、プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。

７７巻、８５６７頁〕などの遺伝子が用いられる。前述
のｐｓｖｅｓｍａＩＬＴはＥｃｏｇｐｔ　を有するＬＴ
発現ベクターである。Ｅｃｏｇｐｔを有する発現ベクタ
ーの形質転換株はミコフェノール酸耐性株として分離で
きる。

今回、本発明者らはｄｈｆｒを有するＬＴ発現ベクター
を作製した。ｄｈｆｒを有するＬＴ発現ベクターの形質
転換株は、宿主としてｄｈｆｒ−株を宿主とすると、ヌ
クレオシド類を含まない培地で容易に選択が可能になる
。ｄｈｆｒとしてはＩ）ＳＶ２ｄｈｆｒ　（Ｍｕｌｌｉ
ｇａｎ、几、Ｃ８とＢｅｒｇ。

Ｐ、（１９８０年）サイエンス、２０９巻、　１４２２
頁〕或いはｐＡｄＤ　２６８　Ｖ　（Ａ）　（Ｋａｕｆ
ｍａｎ、　ＩＬ。

Ｊ、と５ｈａｒｐ、　Ｐ、　Ａ、　（１９８２年）モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー１２巻。

１３０４頁〕等のｄｈｆｒを用いることが可能である。

また高等生物のみならず微生物のｄｈｆｒを利用するこ
ともできる。またジノーイドロ葉酸還元酵素欠損株すな
わちｄｂｆｒ″″株としてはＣＨＯｄｈｆｒ″″［：Ｕ
ｒｌａｕｂ、　Ｇ、とＣｈａｓｉｎ、　Ｌ。

（１９８０年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエニ／ス・ニーニスニー
、７７巻、４２１６頁〕が知られている。またｄｈｆｒ
を有するＬＴ発現ベクターのＬＴの発現をコントロール
しているプロモーターとしては、培養細胞で機能するプ
ロモーターであればどのようなものでもよい。たとえば
構成的な蛋白の遺伝子のプロモーター或いは誘導蛋白の
遺伝子のプロモーターであってもよい。

この場合、ＬＴのｍＩＬＮ　Ａ合成は接続したプロモー
ター領域の制御下におかれ、たとえば接続したプロモー
ター領域が構成的な蛋白の遺伝子のプロモーター領域で
あれば、細胞内でＬＴのｍ几ＮＡは常時合成され、従っ
て細胞はＬＴの構成的生産細胞になる。もし接続するプ
ロモーター領域が、誘導蛋白のものであれば、形質転換
細胞は、ＬＴ誘等蛋白として生産する。

動物培養細胞で機能するプロモーターとして８Ｖ４０の
初期遺伝子プロモーターが知られている。このプロモー
ターは８Ｖ４０ＤＮＡのＨｉｎｄｌｌｌ−Ｐｖｕｌｌフ
ラグメント、約８５０ベースペア（ｂｐ）ＤＮＡ断片に
含まれている。

また、このＤＮＡ断片は逆向きに８Ｖ４０の後期遺伝子
のプロモーターとしての活性を有している。

ヘルペス・シンプレックス・ウィルス（Ｈ８Ｖ）タイプ
ｌのチミジンキナーゼプロモーターモ５Ｖ４０初期遺伝
子プロモーターと同様に構成的なプロモーターであり、
領域の構造はＷａｇｎｅｒらによって示されている［Ｗ
ａｇｎｅｒ、　Ｍ、　Ｊ　、ら（１９８１年）プロシー
デイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス・ニーニスニー、７９巻、１４４１頁〕。

またｄｈｆｔを有するＬＴＱ現ベクターに含まれるＬＴ
をコードするＤＮＡ配列は、ＬＴの発現が可能なものな
らＬＴ染色体ＤＮＡ配列、ＣＤＮＡ配列、合成りＮＡ配
列の何れでも良い。またＤＮＡ配列の一部を人為的に改
変したＤＮＡ配列や欠失、置換、挿入、転移等の変異を
有するものでも良い。

ＬＴ発現ベクターとしては、プラスミドやファージＤＮ
Ａのように、微生物で複製し且つ大量調製可能なものが
利用できる。また細胞への導入に用いるＤＮＡ源として
はプラスミドを保有する微生物、ファージなども利用で
きる。

（４）ＬＴ発現ベクターによるＬＴ耐性細胞の形質転換
株 ＬＴ耐性細胞へのＬＴ発現ベクターの導入法として、ト
ランスフェクション効率に差はあるが、リン酸カルシウ
ム法［Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、ら（１９７７年）セル、１
１巻、２２３頁〕、マイクロインジェクション法［：Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎ、Ｗ、　Ｆ、ら（１９８０年）プロシー
デイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス・ニーニスニー、７７巻、５８９９頁〕、
リポゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法或いは細胞融
合法（５ｃｈｏｆ　ｆｎｅｒ　、　Ｗ、ら（１９８０年
）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。

７７巻、２１６３頁〕等が用いられる。リン酸カルシウ
ム法として用いるＤＮＡ材料としては、　　　　　゛Ｄ
ＮＡ溶液の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利
用できる。細胞融合法では目的Ｊ）ＮＡ配列をプラスミ
ドとして保有している微生物のプロトプラストが用いら
れる。

ＬＴ発現ベクターをＬＴ耐性細胞に導入し、安定にＬＴ
を産生ずる継代培養可能な細胞は、形質転換後、ＬＴ発
現ベクターが保有する選択マーカー遺伝子或いはＬＴ発
現ベクターと同時に細胞に導入した選択マーカー遺伝子
が与える形質によって選択できる。選択マーカー遺伝子
カ、ＥｃｏｇＩ）ｊの場合は、ミコフェノール酸耐性細
胞として選択できる。また選択マーカー遺伝子が、ｄｈ
ｆｒの場合は、宿主細胞をＬＴ耐性のジハイドロ葉酸還
元酵素欠損株すなわちｄｈｆｒ−株を用いることにより
ヌクレオチド類を含まない培地でヌクレオチメ非要求細
胞として容易に分１１１１　テきる。ｄｈｆｒ−株はＵ
ｒｌａｕｂら［：’［ｒｒｌａｕｂ。

ＧとＣｈａｓｉｎ＋　Ｌ、　（１９８０年）プロシーデ
イングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス・ニーニスニー、７７巻。

４２１６頁〕の方法により作製できる。

（５）増幅可能な遺伝子を有するＬＴ発現ベクターとそ
のＬＴ耐性細胞の形質転換細胞 ＬＴｇ現ベクターによるＬＴ耐性細胞の形質転換細胞の
ＬＴ生産量は、形質転換細胞に含まれるＬＴｉ伝子０コ
ピー数に相関があると考えられる。ＬＴａ伝子０コピー
数の多い、すなわちＬＴの生産性の高い細胞は、増幅可
能な遺伝子を有するＬＴ発現ベクターを導入後、単細胞
分離或いは増幅可能な遺伝子の増幅した細胞が選択的に
増殖する条件で細胞を選択することにより行うことがで
きた。

増幅可能な遺伝子を有するＬＴ発現ベクターに用いる事
のできる増幅可能な遺伝子としては、ジハイドロ葉酸還
元酵素遺伝子、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ
遺伝子、メタロチオネイン遺伝子が利用できる。またそ
の他の増幅可能な遺伝子（８ｔａｒｋ、　Ｇ、　Ｒ，と
Ｗａｈｌ、Ｇ、Ｍ。

（１９８４年）アニュアル・レビュー・オブ・バイオケ
ミストリー、５３巻、４４７頁〕も利用できる。

ジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子を有するＬＴ発現ベクタ
ーの形質転換細胞からジハイドロ葉酸還元醪素遺伝子の
増幅した細胞は、形質転換後１ｙｕＭ以上の濃度のメソ
トロキセートヲ含む培地で選択され得る。選択された細
胞はジハイドロ葉酸還元酵素遺伝子ばかりでなく、ＬＴ
遺伝子も増幅している場合が多い。また本発明者らは形
質転換後、１ｙｗＭ以上のメソトロキセートを含む培地
で形質転換細胞を単細胞分離することにより、単細胞分
離する前の母集団から高生産株を得ることができた。同
様にメタロチオネイン遺伝子は重金属で、またアスパラ
ギン酸で増幅した細胞が分離できる。

増幅可能な遺伝子を有するＬＴ発現ベクターを導入し、
ある目標濃度のＬＴを生産させるための宿主細胞として
は、その濃度以上のＬＴに耐性を示す細胞ならいずれの
細胞でも良い。増幅可能な遺伝子としてジハイドロ葉酸
還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）を用いる場合は、宿主とし
てｄｈｆｒ−株を用いるとメソトロキセートによる遺伝
子増幅株を分離しやすい利点がある。

（６）形質転換細胞によるＬＴの生産 ＬＴ発現ベクターによって形質転換され、ＬＴを産生ず
るようになった細胞は、通常細胞の培養に用いられる血
清を含んだ培地ばかりでなく、全く血清を含まない無血
清培地でもＬＴを産生ずる事を見い出した。ＬＴの生産
に無血清培地を用いる事はＬＴの培地からの回収精製を
より容易にするばかりでなく、製品への血清成分の混入
を防ぐことになる。

本発明者らが試用した動物培養細胞はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＯ）から入手可
能なハムスター、サル、ヒト由来の細胞であるが、本明
細書に示されているＬＴの製造法を用いれば、少なくと
もを椎動胞、ウィルスによる形質転換細胞等において活
性あるＬＴを産生ずることが可能である。またヒトの細
胞をＳＶ４０で形質転換した株化細胞を生産細胞として
用いる事は、原因不明で癌化或いは株化した細胞に比し
て、適切な手段を講じることにより生産物の安全性の向
上が期待される。８Ｖ４０の形質転換細胞としてＷＩ−
２６ＶＡ４が知られている。

増幅可能な遺伝子を有するＬＴ発現ベクターをＬＴ酎耐
細胞に形質転換した形質転換株と同じ性質を有する細胞
は、増幅可能な遺伝子を有するＤＮＡとＬＴ発現ベクタ
ーによる形質転換（コトランスフエクション）によって
も得られる。コトランスフエクションによって得られた
細胞のＬＴ遺伝子は増幅可能遺伝子と共に増幅するもの
と考えられ、本発明に包含される。

（実施例） 以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」ＮＡ、種々の酵
素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑誌、
成書を参考とした。

１、蛋白質　核酸　酵素、２６巻、４号、　（１９８１
年）臨時増刊　遺伝子操作（共立出版）２、遺伝子操作
実験法、高木東歌編著（１９８０年）講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、高木東歌編著（１９８２年
）Ｊ１談社 ４、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｏｌｏｎｉｎｇ　ａ　ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ　、　’Ｉ’、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編（１９８２年）Ｃｏｌｄ　８ｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ５、　　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６５巻、Ｌ
。

Ｇｒｏｓｓｍａｎ　ら編（１９８０年）　Ａｃａｄｅｍ
ｉｃｒｅｓｓ ６、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、　６８巻、ＲｅＷｕ編（１９７９年）　Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ実施例Ｉ　　ＬＴ耐性細胞の選択 Ｂ］ＥＩＫ−２１（Ｃ−１８）［：ＡＴＯＣ！　　ＣＣ
ＵＩＯ］。

ＣＦＩＯ−Ｋｌ（ＡＴＯＣＣＣＬ−６１：］、ＦＬ（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ６２ｍｌ、ＷＩ８Ｈ（ＡＴＣＣ！　　ＣＣ
Ｌ２５）。

Ｖｅｒｏ［：ＡＴＣＣＣＣＬ８１］及びＷＩ−２６ＶＡ
４［ＡＴＣＣＣＣＬ９５．１：ｌを２４穴マルチウエル
プレートの底面全面に培養した。培地を２，０００ユニ
ツト（Ｕ）ＡｎＩ！Ｌ　Ｔ　、　　５％仔牛脂児血清（
ｈａｓ）を含むＭＥＭ培地に交換後、４８時間培養した
。

ＢＨＫ−２１（Ｃ−１８）、Ｖｅｒｏ、ＷＩ−２６ＶＡ
４は形態的な変化が観察されなかったが、ＣＦＩＯ−に
１．ＦＬ、ＷＩ８Ｈは変形し、培養器底面からの剥離が
観られた。このことからＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）、Ｖ
ｅｒｏ、ＷＩ−２６ＶＡ４は２．０００ｖマＬＴに耐性
を示す細胞として選択された。

上記６種の細胞及び０ＨＯｄｈｆｒ″″（：　Ｕｒｌａ
ｕｂ、　Ｇ。

とＣｈａｓｉｎ、　Ｌ、　（１９３０年）プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス・ニーニスニー、７７巻、４２１６頁〕をそれ
ぞれ２４穴マルチウエルプレートの底面全面に培養し、
次に培地を１００　Ｕ／ｍｌのＬＴ。

１μＩ／ｍｌのアクチノマイシンＤ、５％ＦＯ８を含む
ヌクレオシド含有ＭＥＭ・α培地（ＧＩＢＣＯ社製）に
交換後、２４時間培養した。ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）
、Ｖｅｒｏ、ＷＩ−２６ＶＡ４は形態的変化が観察され
なかったが、他の細胞は変形し培養器底面からの剥離が
観られた。

実施例２　　ＬＴ耐性変異株の取得 Ｃｌ−ｌ０ｄｈｆｒ−を７５Ｃ１１１２の底面積を持つ
フラスコに底面全面に培養し、次に培地を２５０　Ｕ／
ｍｌのＬ　Ｔ　、　０．１　ｆｉｇ／ｍｌのアクチノマ
イシ７Ｄ１５％ＦＯ８を含むヌクレオシド含有ＭＥＭα
培地（（４１３ＣＯ社製）に交換後、２４時間培養した
。次に培地をアクチノマイシンＤを含まない培地に更新
し約３週間培養し、生じたコロニーからＣＨＯｄｈｆｒ
−２−３株を分離した。ＣＨＯｄｈｆｒ　２−３株は１
　、０００　Ｕ／ｍｅ以上のＬＴに耐性を示した。

ＣＨＯｄｈｆｒ−を２５Ｃｍ２の底面積を持つフラスコ
に底面全面に培養し、次に培地を１，０ＯＯＵ／ｍｌ！
のＬＴ、５％ＦＣ８を含むヌクレオシド含有ＭＥＭα培
地に交換し、約１ケ月培養し、Ｃｌｌ０　ｄｈ　ｆ　ｒ
−６株を分ｍした。０ＨＯｄｈｆｒ−６株は１．０ＯＯ
Ｕ／ｍｌ！以上のＬＴに耐性を示した。

実施例３　　ＬＴ発現ベクターの作製 ＬＴの発現ベクター１）８ＶｅＬＴｄｈｆｒは、第１図
に示した手順により作製した。すなわちｐ８Ｖ２ｄｈｆ
ｒ（８ｕｂｒａｍａｎｉ　、　Ｓら（１９８１年）モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、１巻、８
５４頁〕のＨｉｎｄｍ部位をＩ３ａｍＨＩリンカ−を用
いてＢａｍＨＩに改変したプラスミドｐｓＶ２ｄｈｆｒ
Ｂからｄｈｆｒを有するＢａｍＨＩ約１，９ｋｂ断片を
、ｐＳＶｅＳｍａ　Ｉ　ＬＴ　Ｃｐ８ＶｅｓｍａＩ　Ｌ
Ｔの作製法については特願昭６０−１４７３７１号に詳
述した〕のＢａｍＨＩで部分分解したＢａｍＥ［Ｉ部位
に挿入し、ｐＳＶｅＬＴｄｈｆｒを作製シタ。

ＬＴ発現ベクターｐＳＶＬｐＴ′Ｋｄｈｆｒは、第２図
−（ａ）　、　（ｂ）　、　（Ｃ）に示した手順により
作製した。すなわちｐＨ８ｖ１０６　ＣＭｃＮｎｉｇｈ
ｔ、８．Ｌ、とＧａｂｉｓ。

Ｅ、几、（１９８０年）ヌクレイツク・アシッズ・リサ
ーチ、８巻、５９１１頁：ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリ−より入手〕のチミジンキナーゼ遺伝子ヲ持ツＩ’
ｖｕ　ＩＩ　ｌｌｆｒ片をｐ８Ｖ２ｇｐｔ　（Ａ’ｌ”
ｃ０３７１４５　：　Ｍｕｌｌｉｇａｎ、■、Ｃ０とＢ
ｅｒｇ、Ｐ、　（１９８０年）サイエンス、２０９巻、
１４２２頁〕のＩ’ｖｕ■部位に挿入しｐｓＶＬｐＴＫ
を作製した〔第２図−（ａ）　］、次ニＩ）ＳＶＩｄ）
ＴＫのＳＶ４０のプロモーターとチミジンキナーゼのプ
ロモーターを含むＢｇｌＩＩ継片をＢａｍＨＩで部分分
解したｐｓＶ２ＬＬＴ（ｐ８ｖ２ＬＬＴの作製法につい
ては特願昭６０−１４７３７１号に詳述した〕のＢａｍ
ＨＩ部位に挿入し、ｐ８ＶＬｐＴＫＬＴを作製した〔第
２図−（９）〕。

次にｐ８Ｖ２ｄｈｆｒＢからｄｈｆｒを有するＢａｍ１
Ｉ工断片をｐｓＶＬｐＴＫＬＴのＢａｍＨＩ部位に挿入
し、ｐ８ＶＬｐＴＫＬＴｄｈｆｒを作製した〔第２図−
（Ｃ）〕。

実施例４　　ＬＴ発現ベクターによるＬＴ耐性細胞の形
質転換 ＬＴ発現ベクター１）８ＶｅＬＴｄｈｆｒ或いは１）８
ＶＬＩ）ＴＫＬＴｄｈｆｒを用い、ＢＨＫ−２１（Ｃ−
ｔａ）。

ＣＨＯ−Ｋｌ、ＦＬ、ＷＩＳＨ，Ｖｅｒｏ、ＷＩ−２６
ＶＡ４　、０ＨＯｄｈｆｒ−、ＣＨＯｄｈｆｒ″″２−
８及びＣＨＯｄｈｆｒ″′６を宿主としてＷｉｇｌｅｒ
らの方法（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７年）セル、１１巻
。

２２３頁〕に準じて形質転換を行った。

プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め５％ＦＯ
８を含む培地で生育させた細胞（２Ｘ１０５細胞７３ｍ
１ｇ培地／直径６ｃｍ培養皿）に加え、１５時間後に培
地を更新し、４８時間培養した。次にＣＨＯｄｈｆｒ−
、ＣＨＯｄｈｆｒ−２−３、ＣＨＯｄｈｆｒ６の培地を
５％ＦＯ８，２５μＩ／ｍｌミコフェノール酸、２５０
μめ４司キサンチンを含むヌクレオシドを含まないＭＥ
Ｍα培地（ＧＩＢＯＯ社製）に変え、またその他の培地
を５％ＦＯ８，２５μｌ／ｍｌ！ミコフェノール酸、２
５０μＩ／ｍｌキサンチン、２５ｔｔｌｉ／ｍｌアデニ
ンｅ　５　ａ　Ｉ　７ｍｌチミジン、０，１μめ翔りア
ミノプテリンを含むＭΣＭ培地に変え、約８週間培養し
た。生じたコロニーを分離し、２４穴マルチウエルプレ
ートに生育させ、培地を５％ＦＣ８を含む培地或いは含
まない培地に更新し、４８時間後の培地に含まれるＬＴ
を、Ｌ９２９細胞を標的細胞とする細胞致死効果で測定
した（Ｒｕｆｆ　、　Ｍ、　Ｒ，とＧｉｆｆｏｒｄ、　
Ｇ、　Ｅ、　（１９８１年）リンホカインズ、２巻、２
３５頁）。すなわち９６穴マルチデイツシユに２Ｘ１０
’細胞／Ｗｅｌｌ／１００μｌ培地で１日培養後、培養
液を除き、アクチノマイシンＤ　　ｌ　ａｌ／ｒｎｌ　
、５％牛脂児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で種々の濃
度に希釈したサンプルを１００μｌ加え、２０時間後の
細胞の変性致死効果を測定した。ＬＴＩユニットは５０
％の致死率を与える濃度とした。

下表１〜５に示すように、ＬＴＱ現ベクターを導入した
ＢＨＫ−２１（０−１３）、Ｖｅｒｏ、ＷＩ−２６ＶＡ
４　、　ＣＩｆＯｄｈｆｒ−２−８、（ＨＯｄｈｆｒ−
６からは５００Ｕ／噌を越すＬＴ産性能を有す形質転換
株が得られたが、ＣＨＯ−に１　、ＦＬ、ＷＩＳＨ。

（ｌＨＯｄｈｆｒ−からはそのような株が得られなかっ
た。

なお、表１〜５には夫々の形質転換株のうち、ＬＴ生産
性の高い代表的な３株の例を示す。

（以下余白） 表−５ ＣＨＯｄｈｆｒ−６の形質転換株によるＬＴの生産実施
例５　形質転換株のメントロキセー）（ＭｔＸ）による
選択 実施例４で得られたＢＨＫの形質転換株をそれぞれ直径
１０儒のディツシュに１０”乃至８Ｘ１０５細胞植え、
５０ｎＭ乃至５００　ｎＭの〜ｔｔｘ　を含む培地で約
１ケ月培養し、それぞれの濃度のＭ　ｔ　ｘに対して耐
性を示すコロニーを分離した。２４穴マルチウエルプレ
ートに生育させて、培地を５９６ＦＣ，Ｓを含む培地或
いは含まない培地に更新し、４８時間後の培地に含まれ
るＬＴを測定した。表−６に示すように、１００　ｎＭ
或いは２００　ｎＭのＭｔｘで選択した細胞から、親株
よりも高いＬＴ生産性を示す株が得られた。

実施例４で得られたＣＨＯｄｈｆｒ−２−３株或いはＣ
ＨＯｄｈｆｒ−６株の形質転換株をそれぞれ直径１０ｃ
ｍのディツシュに１０　乃至８×１０　細胞植え、１ｎ
Ｍ乃至５００　　ＬｐＭのＭｔｘを含む培地で約１ケ月
培養しそれぞれの濃度のＭｔＸに対して耐性を示すコロ
ニーを分離した。２４穴マルチウエルプレートに生育さ
せ、培地を５％ＦＯ８を含む培地或いは含まない培地に
更新し、４８時間後の培地に含まれるＬＴを測定した。

表−７に示すように全ての濃度で選択した細胞から親株
よりも高いＬＴ生産性を示す株が得られた。

（以下余白） 実施例６　　ＬＴの回収 実施例５に記載したＬＴ生産細胞２−８Ｅ−１−５５を
５％ＦＯ８を含むＭＥＭα培地（ＧＩＩｌＣＯ社製）で
培養した。培養液ｔｏｏｍｌ！を５ｍＭリン酸緩衝液で
透析後、ＤＥＡＥ−セルロースカラム（２Ｘ１０ｃｍ）
に吸着させ、０〜０．３ＭＮａＣ１の濃度勾配で溶出さ
せた。収率は約７５％で８６万ユニツトのＬＴが回収さ
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＳＶｅＬＴｄｈｆｒの作製の模式
図、第２図−（ａ）、第２図−（至）及び第２図−（Ｃ
）はそれぞれプラスミドｐ８ＶＬｐＴＫ、、ｐ８ＶＬｐ
ＴＫＬＴ及びｐ８ＶＬｐＴＫＬＴｄｈｆｒの作製の模式
図である。 図中、ＥｃｏＲＩ　、ＢａｒｒＬＴＩＩ、８ｍａ１．８
ａｌ　ＩＩＨｉｎｄｌｎ、ＰｖｕＬ及びＢｇｌｌｌはそ
れぞれ制限酵素Ｅｃｏ几Ｉ、ＢａｍＨｉ　、８ｍａ　Ｉ
、８ａｌ　Ｉ。 Ｈｉｎ　ｄ　ｍ　＋　Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉｆ及びＢｇｌＩＩ
の認識部位を示す。 またＬＴ　、Ａｍｐｒ、Ｅｃｏｇｐｔ　、ｄｈｆｒ及び
ＴＫはそれぞれＬＴｉ伝子１アンピシリン耐性遺伝子、
大ｒｙａｍのグアニン・ホスホリボシル・トランスフェ
ラーゼ遺伝子、ジハイドロ莱酸還元酵素遺伝子及び単純
ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子を示す。Ｓ
Ｖｅ　、ｐＴＫ、ｐＡはそれぞれＳＶ４０の初期遺伝子
プロモーター領域、単純ヘルペスウィルスのチミジンキ
ナーゼ遺伝子のプロモーター領域及び８Ｖ４０のポリア
デニル酸付加シグナルを含む領域を示す。 特許出願人　　鐘淵化学工業株式会社 代理人　弁理士　浅　野　真　− 第１図 第２　図−（ａ） 図面の、′Ｉ）Ｉ壜内、２に変更な１．）第金図−（Ｃ
） 手続補正書 昭和Ｈ年！月７日 １、事件の表示 昭和６１年　イ寺　ｉ′＋ＩＩＩ第２３６３７号３、　
補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 フリガナ 、。　、ｒｒ　　　　　大阪市北区中之島三丁目２番４
号ｒ９基（名称）（０ツリ鐘淵化学工業株式会社代表者
　新納眞人 ４、代理人

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. （１）リンホトキシン耐性変異細胞。
2. （２）細胞がジハイドロ葉酸還元酵素欠損細胞である特
   許請求の範囲第１項記載の変異細胞。
3. （３）細胞の由来がＣＨＯｄｈｆｒ＾−である特許請求
   の範囲第１項或いは第２項記載の変異細胞。
4. （４）リンホトキシン耐性細胞を宿主としたリンホトキ
   シンの製造方法。
5. （５）リンホトキシン耐性細胞がＢＨＫ−２１（Ｃ−１
   ３）、Ｖｅｒｏ或いはＷＩ−２６　ＶＡ４である特許請
   求の範囲第４項記載の製造方法。
6. （６）リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性変
   異細胞である特許請求の範囲第４項記載の製造方法。
7. （７）細胞の由来がＣＨＯｄｈｆｒ＾−である特許請求
   の範囲第６項記載の製造方法。
8. （８）増幅可能な遺伝子のＤＮＡ配列が同一のＤＮＡ鎖
   上に存在するリンホトキシン発現ベクター。
9. （９）リンホトキシンのＤＮＡ配列がヒト染色体ＤＮＡ
   配列である特許請求の範囲第８項記載のリンホトキシン
   発現ベクター。
10. （１０）増幅可能な遺伝子がジハイドロ葉酸還元酵素の
    遺伝子である特許請求の範囲第８項或いは第９項記載の
    リンホトキシン発現ベクター。
11. （１１）発現ベクターがｐＳＶｅＬＴｄｈｆｒ或いはｐ
    ＳＶＬｐＴＫＬＴｄｈｆｒの何れかである特許請求の範
    囲第８項記載のリンホトキシン発現ベクター。
12. （１２）リンホトキシン発現ベクターによるリンホトキ
    シン耐性細胞の形質転換細胞。
13. （１３）リンホトキシン発現ベクターのリンホトキシン
    のＤＮＡ配列が、ヒト染色体ＤＮＡ配列である特許請求
    の範囲第１２項記載の形質転換細胞。
14. （１４）リンホトキシン耐性細胞がＢＨＫ−２１（Ｃ−
    １３）、Ｖｅｒｏ或いはＷＩ−２６　ＶＡ４である特許
    請求の範囲第１２項或いは第１３項記載の形質転換細胞
    。
15. （１５）リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
    変異細胞である特許請求の範囲第１２項或いは第１３項
    記載の形質転換細胞。
16. （１６）リンホトキシン耐性変異細胞の由来がＣＨＯｄ
    ｈｆｒ＾−である特許請求の範囲第１５項記載の形質転
    換細胞。
17. （１７）リンホトキシン発現ベクターによるリンホトキ
    シン耐性細胞の形質転換細胞を培養し、リンホトキシン
    を生成せしめ、これを採取することを特徴とするリンホ
    トキシンの製造方法。
18. （１８）リンホトキシン発現ベクターのリンホトキシン
    のＤＮＡ配列がヒト染色体ＤＮＡ配列である特許請求の
    範囲第１７項記載の製造方法。
19. （１９）リンホトキシン耐性細胞がＢＨＫ、Ｖｅｒｏ或
    いはＷＩ−２６　ＶＡ４である特許請求の範囲第１７項
    或いは第１８項記載の製造方法。
20. （２０）リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
    変異細胞である特許請求の範囲第１７項或いは第１８項
    記載の製造方法。
21. （２１）リンホトキシン耐性変異細胞の由来がＣＨＯｄ
    ｈｆｒ＾−である特許請求の範囲第２０項記載の製造方
    法。
22. （２２）培養に用いる培地が無血清培地である特許請求
    の範囲第１７項乃至第２１項の何れかの項記載の製造方
    法。
23. （２３）増幅可能な遺伝子のＤＮＡ配列が同一ＤＮＡ鎖
    上に存在するリンホトキシン発現ベクター或いは増幅可
    能な遺伝子のＤＮＡ配列を有するＤＮＡとリンホトキシ
    ン発現ベクターの何れかによるリンホトキシン耐性細胞
    の形質転換細胞。
24. （２４）リンホトキシン発現ベクターのリンホトキシン
    のＤＮＡ配列が、ヒト染色体ＤＮＡ配列である特許請求
    の範囲第２３項記載の形質転換細胞。
25. （２５）リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
    変異細胞である特許請求の範囲第２３項或いは第２４項
    記載の形質転換細胞。
26. （２６）形質転換細胞が、形質転換後、増幅可能な遺伝
    子の増幅した細胞が選択的に増殖する培養条件で選択さ
    れた細胞である特許請求の範囲第２３項乃至第２５項の
    何れかの項記載の形質転換細胞。
27. （２７）増幅可能な遺伝子が、ジハイドロ葉酸還元酵素
    の遺伝子である特許請求の範囲第２３項或いは第２４項
    記載の形質転換細胞。
28. （２８）リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
    変異細胞である特許請求の範囲第２７項記載の形質転換
    細胞。
29. （２９）リンホトキシン耐性細胞がジハイドロ葉酸欠損
    細胞である特許請求の範囲第２７項或いは第２８項記載
    の形質転換細胞。
30. （３０）リンホトキシン耐性細胞がＢＨＫ−２１（Ｃ−
    １３）、Ｖｅｒｏ或いはＷＩ−２６　ＶＡ４である特許
    請求の範囲第２７項記載の形質転換細胞。
31. （３１）リンホトキシン耐性変異細胞の由来がＣＨＯｄ
    ｈｆｒ＾−である特許請求の範囲第２８項記載の形質転
    換細胞。
32. （３２）形質転換細胞が、形質転換後、１ｎＭ以上の濃
    度のメソトロキセートに耐性を示す細胞として選択され
    た細胞である特許請求の範囲第２７項乃至第３１項の何
    れかの項記載の形質転換細胞。
33. （３３）増幅可能な遺伝子のＤＮＡ配列が、同一ＤＮＡ
    鎖上に存在するリンホトキシン発現ベクター或いは増幅
    可能な遺伝子のＤＮＡ配列を有するＤＮＡとリンホトキ
    シン発現ベクターの何れかによるリンホトキシン耐性細
    胞の形質転換細胞を培養し、リンホトキシンを生成せし
    め、これを採取することを特徴とするリンホトキシンの
    製造方法。
34. （３４）リンホトキシン発現ベクターのリンホトキシン
    のＤＮＡ配列がヒト染色体ＤＮＡ配列である特許請求の
    範囲第３３項記載の製造方法。
35. （３５）リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
    変異細胞である特許請求の範囲第３３項或いは第３４項
    記載の製造方法。
36. （３６）形質転換細胞が、形質転換後、増幅可能な遺伝
    子の増幅した細胞が選択的に増殖する培養条件で選択さ
    れた細胞である特許請求の範囲第３３項乃至第３５項の
    何れかの項記載の製造方法。
37. （３７）増幅可能な遺伝子がジハイドロ葉酸還元酵素の
    遺伝子である特許請求の範囲第３３項或いは第３４項記
    載の製造方法。
38. （３８）リンホトキシン耐性細胞がリンホトキシン耐性
    変異細胞である特許請求の範囲第３７項記載の製造方法
    。
39. （３９）リンホトキシン耐性細胞がジハイドロ葉酸欠損
    細胞である特許請求の範囲第３７項或いは第３８項記載
    の製造方法。
40. （４０）リンホトキシン耐性細胞が、ＢＨＫ−２１（Ｃ
    −１３）、Ｖｅｒｏ或いはＷＩ−２６　ＶＡ４である特
    許請求の範囲第３７項記載の製造方法。
41. （４１）リンホトキシン耐性変異細胞の由来がＣＨＯｄ
    ｈｆｒ＾−である特許請求の範囲第３８項記載の製造方
    法。
42. （４２）形質転換細胞が、形質転換後、１ｎＭ以上の濃
    度のメソトロキセートに耐性を示す細胞として選択され
    た細胞である特許請求の範囲第３７項乃至第４１項の何
    れかの項記載の製造方法。
43. （４３）培養に用いる培地が無血清培地である特許請求
    の範囲第３３項乃至４２項の何れかの項記載の製造方法
    。