JPS62174098A - マイトジエン活性を有するペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈発明の背景〉 本発明は、マクロファージ様細胞に対するマイトジェン
活性を有する新規ペプチドに関する。

トロンビンは、細胞に対し様々な影響を及ぼすことが知
られている。フィブリノーゲンを凝固させ、血漿凝固シ
ステムにおける他の因子を酵素により活性化させるほか
に、トロンビンは様々な組織培養繊維芽細胞系において
、マイトジェン活性を有することが報告されている［　
Ｐｅｒｄｕｅら。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　２５６　、２７６７
−２７７６（１９８１）参照コ。Ｉｌ＠を芽細胞に対す
る増殖刺激物としてのその機能は、そのエステル分解活
性と密接に関連している。

また、ごく最近になって、トロンビンはヒ１〜末梢血液
単球において走化性活性を右づ−ると言われるようにな
った［　Ｂａｒ−３ｈａＶｉｔら、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂ
ｉｏｌ。

９６、　２８２−２８５　　（１９８３）　　コ　。

様々な生物学的活性の原因となる、トロンビンのドメイ
ンを同定する試みがされてきた。Ｂａｒ−３ｈａｖ　ｉ
　ｔらは、　５ｃｉｅｎｃｅ　　２２０　、　７２８−
７３０（１９８３）、において、エステル分解活性およ
びフィブリノーン認識に必要な部位と独立した、トロン
ビン分子上の特異的な領域により、走化性活性は仲介さ
れていると結論を下している。走化性機能で重要なのは
、それが組織損傷部位における炎症反応の重要な生理学
的刺激物であるかもしれないということである。細胞の
指向的移動を伴う、この走化性機能は、細胞における増
殖因子活性である、マイトジェン機能と区別される。す
なわちその因子とは、細胞の分裂や分化を刺激する。

またこれまでトロンビンは、マクロファージ様細胞に対
するマイトジェン効果を誘導することができると言われ
てきた［　Ｂａｒ−３ｈａｖｉｔら、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ
明細書の浄８（内容に変足なし） Ｂｉｏｌ、　　９７．　３９６ａ、　　Ａｂｓｔｒａｃ
ｔ　　１４９４（１９８３）］　　。

〈発明の詳細な説明〉 本発明により、ヒトトロンビンＢ鎖と類似のテトラデカ
ペプチドが、マクロファージ様細胞に対する有力なマイ
トジェンであることが発見された。

これらマイトジェンペプチドは、次に示すアミノ酸配列
を含むペプチド、あるいはそれから生理学的に受は入れ
られる塩、エステル、またはアミドである。

Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ａｓｎ　−１ｊ／Ｓ
−Δ５ｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ａｓｎ−Ａ
ＳＩ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−０トｌ。

（ここで、Ｘ＝Ｔ　ｒ　ｌ）あるいはＴｙｒ）。

ここに示されているペプチド構造では、アミノ酸組成は
次のように慣習的に省略しで示す。

Ｌ−アラニン　　　　　　　　ＡｌａあるいはＡし−ア
ルギニン　　　　　　　ＡｒＣｌあるいはＲＬ−アスパ
ラギン　　　　　　ＡＳｎあるいはＮＬ−アスパラギン
酸　　　　　ＡＳｐあるいはＤＬ−システィン　　　　
　　　ＣｙｓあるいはＣＬ−グルタミン酸　　　　　　
ＧｌｕあるいはＥ「−グルタミン　　　　　　　Ｑｌｎ
あるいはＱグリシン　　　　　　　　　　ＧＩＭあるい
はＧ「−ヒスチジン　　　　　　　）（ｉｓあるいはＨ
し一イソロイシン　　　　　　ｌｅあるいはＩＬ−ロイ
シン　　　　　　　　ｌｅｕあるいはＬＬ−リシン　　
　　　　　　　ＬｙＳあるいはＫＬ−メチオニン　　　
　　　　ＭｅｔあるいはＭ［−フェニルアラニン　　　
　ＰｈｅあるいはＦ［−プロリン　　　　　　　　Ｐｒ
ｏあるいはＰＬ−セリン　　　　　　　　　３ｅｒある
いは５Ｌ−１−レオニン　　　　　　　Ｔｈｒあるいは
Ｔ「−トリプトファン　　　　　Ｔｒｌ）あるいはＷ［
−チロシン　　　　　　　　ＴｙｒあるいはＹ［−バリ
ン　　　　　　　　　■ａｌあるいはＶ明細書の浄書（
内容に変更なし） ペプチド■は、アミノ酸配列： Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Δ５ｎ−Ｌｙｓ
−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌ　ｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−０１−１゜を有し、ヒトトロンビン
Ｂ鎖の３６７−３８０残基（あるいは、ヒトプレトロン
ビン２の配列の９６−１０９残基）を示す。ヒトプレト
ロンビン２の配列は、ＢＬＩｔ　Ｋｏｗｓｋｉら、　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　λ５λ、４９４２−４９
５７　（１９，７７）によって報告されている。ヒトプ
レ上１コンピン２の１次構造を誘導するため、ＢｕｔＫ
ｏｗｓｋｉらはプレトロンビン１のブロモシアン切断生
成物のキモトリブチイックペプチド断片を作成した。そ
の断片の１つは、プレトロンビン２の９５−１０９残基
に相当する。

しかしながら、この断片については、何らの生物学的活
性も調べられなかった。また、本発明の９６−１０９断
片も作成あるいは示唆されなかった。

ペプチド■は、アミノ酸配列： ｈ−Ｔｙｒ−ｐｒｏ−ｐｒｏ−”’ｒｙｒ−△５ｎ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ＝Ｇ　ｌ　ｕ−＝　６−
１ 明細書の浄書（内容に変更なし） Ａｓｎ”Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＯＨ。

を持ち、トリプトファンのかわりにチロシンが置換した
、ペプチド■と類似のペプチドである。

驚ろくべきことに、次に示す２つの断片は不活＝　　６
ａ　　− 明細書の浄♂（内容に変更なし） 性であるのに、本発明の新規テトラデカペプチドはマク
ロファージ様細胞に対して有力なマイトジェン活性を示
した。

ペプチドＩ［ｌ：ｌ−１−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ａ
　ｓ　ｐ　−Ｌ　ｅ　ｕ　−１−ｅ　ｕ　−０１−１ペ
プチドｒＶ：Ｈ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ− Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＯＨ これらの発見は、ペプチド■あるいは■のアミン末端部
分が本発明のペプチドのマイトジェン活性に重要である
ということを示唆している。

〈発明の詳細な説明〉 本明細書は、この発明作成に関係する主題を特に指摘し
、明確にフレイムしているフレイムをもって終わってい
るが、本発明は、添付図面と関連した抜擢実施態様に対
する次の詳細な説明から、よく理解されるものと思われ
る。その添付図面とは、第１図がヒトα−トロンビン構
造のモデルであり、第２図が本発明の１実施態様として
、合成マイトジエンペプチドへ細胞をさらした後の、Ｊ
明細書の浄書（内容に変更なし） ７７４マウスマクロフアージ様細胞によるチミジン取り
込みおよび全細胞タンパク質レベルをグラフに示したも
のである。

＝　７ａ　− 第１図のヒトα−トロンビンモデルは、プロトロンビン
のタンパク質命名法に基づいており、１本鎖チモーゲン
は後に活性化され、因子ｘａによって、２７２および３
２１残基のところで２本鎖構造に切断される。このよう
に生成した活性型酵素は、口触作用により、２８５残基
のところでＡ鎖のはじめの１３残基を削除し、α−トロ
ンビンを生成する。ペプチドＣＢ６７−１２９の構造を
、斜線で示した「ループＢ」挿入配列（すなわち３６７
−３７５残基）と共に示しである。また、この断片の重
要な構造上の特徴である、活性部位Ｈｉ　５３６３　（
六角形）と炭水化物付着部位（Ａｓｎ３７３）の場所も
示しである。「ループＢ」トロンビンＢ鎖挿入配列の正
確な範囲がはっきりしないのと同様、ＡＳＸ３５５と３
７１のアミドの指定ははっきりしない。

この発明の新規マイトジエンペプチドは、ペプチド合成
に対づ−る適当な常法手段を適用することにより作成さ
れる。従って、伸長しつつあるペプチド鎖へ構成アミノ
酸が望ましい配列で加えられる、一連のカップリング反
応により、ペプチド鎖は作成される。様々なＮ保護基、
例えばカルボベンジルオキシ基あるいはｔ−ブチルオキ
シカルボニル基（ＢＯＣ）　、様々なカップリング試薬
、例えばジシクロへキシルカルボジイミドあるいはカル
ボニルジイミダゾール、様々な活性エステル、例えばＮ
−ヒドロキシフタルイミドあるいはＮ−ヒドロキシスク
シンイミドのエステル、そして様様な脱保護剤、例えば
トリフルオロ酢酸、Ｈｃ１／ジオキサン、トリス（トリ
フルオロ酢酸）ホウ素、臭化シアンの使用、中間生成物
の分離、精製を伴う液相中での反応は、周知の古典的ペ
プチド方法論によって実施できる。

本発明のペプチドは、有名なメリフィールド固相法によ
り作成される［Ｈｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　Ａｍｅ
ｒ。

５）参照コ。この方法は、古典的ペプチド合成と同様な
多くの化学反応および保護基を使用しているが、カルボ
キシル末端が固相、すなわち普通、明細書の浄書（内容
に変更なし） 架橋ポリスチレンあるいはスチレンジビニルベンゼン共
重合体に結合している、伸長しつつあるペプチド鎖を与
えている。各段階での過剰な試薬の除去は、単にポリマ
ーの洗浄をするのみであるので、この方法は便宜的に手
順上の処理数を簡易化している。

伝統的なメリフィールドペプチド合成の一般的反応順序
を次のように図解する。

ペプチド付着のための反応性基を与えるクロロメチル化
の段階、ＰＳ−ポリスチレン残基。

明細書の浄書（内容に変更なし） 中 〇 工 〉 ！ 、、′− ￥９ ？ −１０ａ　　　− 明細書の浄書（内容に変更なし） エステル化の段階−ｔ−ＢＯＣ保護基を使って保護した
第１のアミノｆｌ（Ｒ’）の１〜リエチルアンモニウム
塩との反応。

明細書の浄書（内容に変更なし） −１１ａ　　　− 明細書の浄書（内容に変更なし） ジシク０ヘキシルカルボジイミドカップリング試薬を用
いた、ペプチド合成段階。この段階■の次に、例えば、
トリフルオロ酢酸の２５％塩化メチレン溶液によるｔ−
ＢＯＣの脱保護および過剰のトリエチルアミンによるＮ
末端アミンの遊離を行い、それが、保護した第２のアミ
ノｉ！ｌ（Ｒ２）の活性カルボキシル基と反応するのを
可能にする。

最終段階は、完成したペプチドを、例えば無水ＨＦのア
ニソール溶液で処理することにより、ＰＳ樹脂から切断
する。

確立された固相合成法に関する背景の情報はさらに、ｓ
　ｔ　ｅｗａ　ｒ　ｔとｖｏｕｎｏ　’の論文、”Ｓｏ
ｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ−　　１１ｂ　　− Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”　Ｈ．　　Ｈ
．　　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ．。

Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，　１　９　６　９　、お
よびＡｄＶａｎＣｅ　ｔｎＥｎｚｙｍｏｌ（ＩＶ　　３
２．　ＩＩＤ．　２２１−２９６．　Ｆ汀。

Ｎｏｌｄ，　　Ｅｄ．、　　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ
　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，　　１　９
　６　９　、のメリーフィールドによる総説の章および
、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ　ａｎｄ　Ｈｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，
　ＴｈｅＰｒｏｔｅｉｎｓ，　Ｖｏｌ．　２　、　Ｄ．
２　２　５ｅｔ　ｓｅｑ．　　（ｅｄ。

Ｎｅｕｒａｔｈ　ａｎｄ旧Ｉｔ）　、　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ，　ＮｅｗＹｏｒｋ，　１　９　７　６
を参照することによって得られる。

マクロファージ様細胞の増殖刺激は、本発明のマイトジ
ェンペプチドの様々な濃度における細胞による、チミジ
ン取り込みを測定することにより、測定される。これは
、Ｊ７７４．Ｐ３８８Ｄ１。

ＲＡＷ．ＰＵ５を含む多くのマクロファージ様細胞系に
対して測定された。これらは、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌ！ｅｃｔｉｏｎ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｈａｍａｎｄより入手できる有名な、マウス細胞系であ
る。

この発明は、これら以下の実施例に限定されず、次の実
施例は、この発明をさらに説明するである明細書の浄書
（内容に変更なし） う。

実施例１ ヒトトロンビンＢ鎖の３６７−３８０残基を示し、第１
図に示すようなループＢ挿入配列を含むペプチド■。

Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ
−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ　−Ａｓｎ−Ａｓｐ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＯＨ。

は、Ｗｉｌｎｅｒら、　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
　上５’（６）　　　１２０９−１２１３　（１９７６
）および工８　（２３＞、５０７８−５０８２　（１９
７９）に記載されているように、伝統的なメリフィール
ド固相ペプチド合成の修正により合成された。充分保護
されたペプチドは、Ｔａｍら、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ
ｍ、　Ｓｏｃ、　　１０５　。

６４４２−６４５５　（１９８３）の２段階ＨＦ触媒Ｓ
Ｎ２法により、同時に説保護および、支持体である樹脂
から切断した。粗ペプチドは、Ｗｉｌｎｅｒら　、　　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　　コ−５（６）、　　１
　２０９−１　２１３（１９７６）に書かれている方法
にＪ：す、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｃｅｌ■カラ
ムを使ったイオン交換明細書の浄書（内容に変更なし） クロマトグラフィーで精製した。ペプチドの純度は、単
一ピークとしてクロマトグラフ分析される、−１３ａ　
　　− Ｆｕｌｍｅｒら、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ
、、　　２５４．　７２０８−７２１２　（１９７９）
、の方法に従い、逆相系Ｃ１８高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＩ　Ｇ＞により確かめた。また、両相クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）により、２つの異なる溶媒系を
用いた時、単一スポットとして移動づることから、ペプ
チドが同種であることも認められた。アミノ酸分析では
、望ましいペプチド配列と一致した、モル比を生じた。

このペプチド合成において、すべての成分は、試薬グレ
ードを持っていた。Ｎ　　−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボ
ニル（ＢＯＣ）１−アミノ酸は、８ａｃｈｅｍ、　Ｉｎ
ｃ、、　Ｔｏｒｒａｎｃｅ、　ＣＡより購入した。側鎖
を保護されたＢＯＣアミノ酸は、γ−ベンジルグルタミ
ン酸、β−ベンジルアスパラギン酸、Ｏ−ベンジルトレ
オニン、２−クロロペンジルオキシ力ルポニルレーリシ
ン、Ｎ−ホルミルトリプトファン、０−ベンジルチロシ
ンであった。アスパラギンは、等モルの１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール存在下で、ジシクロへキシルカルボ
ジイミドと直接結合させることにより、保護せずに、誘
導された。ＢＯＣアミノ酸の純度は、融点（補正されて
いない）と両相クロマトグラフィーによって評価された
。Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｔ）ｈａｃｅｌはＰａｒｍａ
ｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　ｐ＋ｓｃａｔ
ａｗａｙ、　ＮＪより購入した。

Ｂ　ｉ　ｏ−Ｇｅ　１ｏＰ−２（２００−４００メツシ
ユ）はＢ　ｉ　ｏ　−Ｒａ　ｄ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　Ｃｅｎｔｒｅ、　ＮＹ、より購入
した。スチレンジビニルベンゼビーズ、１％架橋、２０
０−４００メツシユ、クロロメチル化（１，１６ミリ当
量Ｃｆｌ／９）は、Ｌａｂ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ
、、　Ｓａｎ　Ｈａｔｅｏ。

ＣＡ、より購入し、使用前、１８時間、温く６０℃）ジ
メチルホルムアミドによって抽出した。

ペプチド合成において、テトラメチルアンモニウムヒド
ロキシドにより、この残基（例えばロイシン）を中和し
、Ｎ　　−ｔｅｒｔ　−Ｂ　ＯＣ−Ｌ−ロイシンブトラ
メチルアンモニウム塩とクロロメチル化された樹脂とを
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、８０″１時間
反応させることにより、不溶性支持体へのＣＯＯ目末端
残塁の工ステル化は行われた。アミノ基の脱保護は、２
５％トリフルオロ酢酸の塩化メチレン溶液を使って行わ
れ、中和は、１０％トリエチルアミンの塩化メチレン溶
液を使って行われた。すべての残基カップリングは、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド塩化メチレン溶液（４当
量）を使って行われ、カップリングは、Ｋａｉｓｅｒ　
にンヒドリン）法により検査した。そして、Ｎ−アセチ
ルイミダゾールを使い、ターミネイト（もし必要であれ
ば）した。

完成し、充分に保護されたペプチドは、先に述べた２段
階ＨＦ−触媒ＳＮ２法により、不溶性の支持体にり切断
し、脱保護した。

ドライエチルエーテルにより樹脂を洗浄した後、粗ペプ
チドは、１０％酢酸中に抽出し、凍結乾燥した。ペプチ
ドは、Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｌｌｈａＣｅｌカラムに
より同時に脱塩、精製し、ｖａｒｉｇｒａｄ　ｄｅｖｉ
ｃｅ（Ｂｕｃｈｌｅｒ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉ
ｎｃ、、　Ｆｏｒｔ　Ｌｅｅ、　Ｎ、　Ｊ、）において
開発された、リニャーソルトグラジエントにより溶出し
た。初期緩衝液は、０．０５Ｍホウ酸ナトリウムで、最
終緩衝液は、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む初期緩衝液
であった。カラムの大きさは、１．２Ｘ４０ｃｍであっ
た。溶出画分は、２２５　ｎＨの吸収およびシリカゲル
Ｑ（ＨｃｒｃｋＤａｒｌｌｌＳｔａｄｔ、　Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）でプレコートしたガラスプレートを使った両相ク
ロマトグラフィーによって分析した。フルオレスカミン
および塩素：〇−トリジン噴霧は、ペプチド発色に用い
られた。両相クロマトグラフィーに用いた２つの溶媒系
は、（１）１−ブタノール−酢酸−水（１：１：１、Ｖ
／Ｖ／Ｖ）および （２）　　酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水（５：５：
１：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）であった。

望ましいペプチドが、主要ピークとして溶出した。この
ピークは続いて、０．５Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液を
用いて２．５ｘ　１００ｃｍＢ　ｉ　ｏ　−Ｇｅｌ　　
Ｐ−２カラムにより脱塩した。逆相Ｃ１８カラムを使っ
たこのペプチドのＨＰＬＣ分析により、ペプチドは同種
であることが示された。また、このペプチドは、アミノ
酸分析において予想されたモル比も与えた。

明細書の浄書（内容に変更なし） 実施例２ ペプチド■、 Ｈ−Ｔｈｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−ＬＶＳ
−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ａｓｎ−
ＡＳ＋）−Ｌｅｕ−１ｅｕ−ＯＨ。

は固相合成においてＢＯＣ−１−リブトファンのかわり
に同モル量のＢＯＣ−ヂロシンを用いたのを除き、実施
例１の方法に従い作成された。

実施例３ 実施例１の精製テトラデ力ペプヂドのマクロファージ様
細胞に対するマイトジェン効果を測定するため、次の試
験を行なった。

２４ウエルデイスポーザブルプラスチツクプレート（Ｆ
ａｌｃｏｎ、　０ｘｎａｒｄ、　ＣＡ）　１ウェル当り
５×１０　の初期濃度、３７℃９５％ＣＯ２、湿潤条件
下で、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むダルベツコ
変法イーグル培地（ＤＭＥＭ＞に浮遊した様々な細胞系
をプレートに入れた。ＤＮＡ合成の停止（すなわちＧ／
Ｇ、）は、０．１％ウシ〇 明細書の浄書（内容に変更なし） 血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清不含ＤＭＥＭで、
４８時間細胞を培養することにより、行なった。それか
ら、細胞をペプチドあるいは様様なトロンビン型、ある
いはＦｅ２に４８時間さらした。チミジン取り込みの増
加は、Ｎ−メチル３［ｔ−１］　−ＴｄＲ（１μＣｉ／
ｍｅ）の２時間のパルスの後に、評価された。細胞は３
倍量のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７，４）で４回
洗浄し、１０％トリクロル酢酸で沈澱させ（３０分、４
回）、その不溶物は、２倍量のＥＴＯＩ−１：ＥＴ、２
０（３：１　　ｖ／ｖ）で抽出した。沈澱物は、Ｎ　　
ＮａＯＨで溶解し、ｄｙｅ　−ｂｉｎｄｉｎａ　７’）
ｔ−ｉ’（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｓ、　Ｒｉｃｈｍｏ
ｎｄ、　Ｃ八）を使ったタンパク質定量と、液体シンデ
レージョンスペクトロメトリーのため、逃けが回収され
た。

これらの試験に使用した様々な細胞系は、マウスマクロ
ファージ様細胞系、Ｊ７７４．Ｐ３８８Ｄｉ、ＲＡＷ、
ＰＬ１５であった。これらの試験に使用した様々なトロ
ンビンの種類は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）　、
上皮成長因子（ＥＧＦ）、！Ｉ維芽細胞成長因子（ＦＧ
Ｆ）　、神経成長因子（ＮＧＦ）であった。これら既知
のポリペプチド成長因子に関する背景の情報としては例
えば、Ｋｒ１ｓらによる最近の総説記事、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ。

Ｆｅｂｒｕａｒｙ　１９８５．　ｐｐ、　　１３５−１
４０．およびｔｌｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　
ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　、Ｅｄ、　ｂｙＣｈｏｈ　
Ｈａｏ　Ｌｉ、　Ｖｏｌ、　１２．　　”Ｇｒｏｗｔｈ
　Ｆａｃｔｏｒｓ”。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８４における包
括的な総説を参照することができる。ＥＧＦ、ＮＧＦ。

ＦＧＦは、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ。

Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓよ
り商業上入手できる。典型的なテストにおいて、最適ペ
プチド濃度（すなわち１０”　Ｍ）に増殖停止した細胞
を２４時間さらした後、細胞数はコントロール値、培養
ウェル当り１．２−２ｘ１０”細胞の２倍に増加／Ｉｄ
の濃度範囲まで、これらの細胞の増殖を誘導しなかった
。その結果は、第２図および表１で、下記に示しである
。第２図において、静止したＪ７７４１１１１中のベー
スライントリチウムラベルチミジン（”［Ｈ］−ＴｄＲ
）取り込みは、１つニー　　２〇　　− ル当り、５０００　ｃｐｍ±４２０　ｓ、ｅ、ｍ、　（
平均標準誤差）であった。結果は、トリプリケート測定
の平均値で表現しである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒトα−トロンビン禍造のモデルであり、第
２図は、本発明の１実施態様として、合成マイトジェン
ペプチドへ細胞をさらした後の、Ｊ７７４マウスマクロ
ファージ様細胞によるチミジン取り込みおよび全細胞タ
ンパク質レベルをグラフに示したものである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列、 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｘ＝ＴｒｐあるいはＴｙｒ） を含む強力なマイトジエン活性を有するペプチド、ある
   いはその生理学的に許容可能な塩、そのエステル、又は
   そのアミド。
2. （２）ＸがＴｒｐである特許請求の範囲第１項のペプチ
   ド。
3. （３）ＸがＴｙｒである特許請求の範囲第１項のペプチ
   ド。
4. （４）次のアミノ酸配列、 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｘ＝Ｔｒｐ又はＴｙｒ） を含む強力なマイトジエン活性を有するペプチドあるい
   はその生理学的に許容可能な塩、エステル又はそのアミ
   ドの成長刺激量に、マクロファージ様細胞をさらすこと
   を特徴とする、マクロファージ様細胞の成長を刺激する
   方法。
5. （５）ＸがＴｒｐである特許請求の範囲第４項の方法。
6. （６）ＸがＴｙｒである特許請求の範囲第４項の方法。