JPH0689031B2 - マイトジエン活性を有するペプチド - Google Patents
マイトジエン活性を有するペプチドInfo
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- JPH0689031B2 JPH0689031B2 JP61242216A JP24221686A JPH0689031B2 JP H0689031 B2 JPH0689031 B2 JP H0689031B2 JP 61242216 A JP61242216 A JP 61242216A JP 24221686 A JP24221686 A JP 24221686A JP H0689031 B2 JPH0689031 B2 JP H0689031B2
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- peptide
- leu
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Description
【発明の詳細な説明】 〈発明の背景〉 本発明は、マイクロファージ様細胞に対するマイトジエ
ン活性を有する新規ペプチドに関する。
ン活性を有する新規ペプチドに関する。
トロンビンは、細胞に対し様々な影響を及ぼすことが知
られている。フイブリノーゲンを凝固させ、血漿凝固シ
ステムにおける他の因子を酵素により活性化させるほか
に、トロンビンは様々な組織培養繊維芽細胞系におい
て、マイトジエン活性を有することが報告されている
［Perdueら、J.Biol.Chem. 256,2767−2776（1981）参
照］。繊維芽細胞に対する増殖刺激物としてのその機能
は、そのエステル分解活性と密接に関連している。
られている。フイブリノーゲンを凝固させ、血漿凝固シ
ステムにおける他の因子を酵素により活性化させるほか
に、トロンビンは様々な組織培養繊維芽細胞系におい
て、マイトジエン活性を有することが報告されている
［Perdueら、J.Biol.Chem. 256,2767−2776（1981）参
照］。繊維芽細胞に対する増殖刺激物としてのその機能
は、そのエステル分解活性と密接に関連している。
また、ごく最近になつて、トロンビンはヒト抹消血液単
球において走化性活性を有すと言われるようになつた
［Bar−Shavitら、J.Cell.Biol. 96,282−285（198
3）］。
球において走化性活性を有すと言われるようになつた
［Bar−Shavitら、J.Cell.Biol. 96,282−285（198
3）］。
様々な生物学的活性の原因となる、トロンビンのドメイ
ンを同定する試みがされてきた。Bar−Shavitらは、Sci
ence 220,728−730（1983）、において、エステル分解
活性およびフイブリノゲン認識に必要な部位と独立し
た、トロンビン分子上の特異的な領域により、走化性活
性は仲介されていると結論を下している。走化性機能で
重要なのは、それが組織損傷部位における炎症反応の重
要な生理学的刺激物であるかもしれないということであ
る。細胞の指向的移動を伴う、この走化性機能は、細胞
における増殖因子活性である、マイトジエン機能と区別
される。すなわちその因子とは、細胞の分裂や分化を刺
激する。またこれまでトロンビンは、マクロファージ様
細胞に対するマイトジエン効果を誘導することができる
と言われてきた［Bar−Shavitら、J.Cell.Biol. 97,39
6a,Abstract 1494（1983）］。
ンを同定する試みがされてきた。Bar−Shavitらは、Sci
ence 220,728−730（1983）、において、エステル分解
活性およびフイブリノゲン認識に必要な部位と独立し
た、トロンビン分子上の特異的な領域により、走化性活
性は仲介されていると結論を下している。走化性機能で
重要なのは、それが組織損傷部位における炎症反応の重
要な生理学的刺激物であるかもしれないということであ
る。細胞の指向的移動を伴う、この走化性機能は、細胞
における増殖因子活性である、マイトジエン機能と区別
される。すなわちその因子とは、細胞の分裂や分化を刺
激する。またこれまでトロンビンは、マクロファージ様
細胞に対するマイトジエン効果を誘導することができる
と言われてきた［Bar−Shavitら、J.Cell.Biol. 97,39
6a,Abstract 1494（1983）］。
〈発明の簡単な説明〉 本発明により、ヒトトロンビンＢ鎖と類似のテトラデカ
ペプチドが、マクロフアージ様細胞に対する有力なマイ
トジエンであることが発見された。これらマイトジエン
ペプチドは、次に示すアミノ酸配列を含むペプチド、あ
るいはそれから生理学的に受け入れられる塩である。
ペプチドが、マクロフアージ様細胞に対する有力なマイ
トジエンであることが発見された。これらマイトジエン
ペプチドは、次に示すアミノ酸配列を含むペプチド、あ
るいはそれから生理学的に受け入れられる塩である。
Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Ｘ−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−Gl
u−Asn−Asp−Leu−Leu−OH,（ここで、Ｘ＝Trp）。
u−Asn−Asp−Leu−Leu−OH,（ここで、Ｘ＝Trp）。
ここに示されているペプチド構造では、アミノ酸組成は
次のように慣習的に省略して示す。
次のように慣習的に省略して示す。
ペプチドＩは、アミノ酸配列： Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Trp−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−G
lu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH,を有し、ヒトトロンビン
Ｂ鎖の367−380残基（あるいは、ヒトプレトロンビン２
の配列の96−109残基）を示す。ヒトプレトロンビン２
の配列は、But Kowskiら、J.Biol.Chem. 252,4942−49
57（1977）によつて報告されている。ヒトプレトロンビ
ン２の１次構造を誘導するため、But Kowskiらはプレト
ロンビン１のプロモシアン切断生成物のキモトリプテイ
ツクペプチド断片を作成した。その断片の１つは、プレ
トロンビン２の95−109残基に相当する。しかしなが
ら、この断片については、何らの生物学的活性も調べら
れなかつた。また、本発明の96−109断片も作成あるい
は示唆されなかつた。
lu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH,を有し、ヒトトロンビン
Ｂ鎖の367−380残基（あるいは、ヒトプレトロンビン２
の配列の96−109残基）を示す。ヒトプレトロンビン２
の配列は、But Kowskiら、J.Biol.Chem. 252,4942−49
57（1977）によつて報告されている。ヒトプレトロンビ
ン２の１次構造を誘導するため、But Kowskiらはプレト
ロンビン１のプロモシアン切断生成物のキモトリプテイ
ツクペプチド断片を作成した。その断片の１つは、プレ
トロンビン２の95−109残基に相当する。しかしなが
ら、この断片については、何らの生物学的活性も調べら
れなかつた。また、本発明の96−109断片も作成あるい
は示唆されなかつた。
驚ろくべきことに、次に示す２つの断片は不活性である
のに、本発明の新規テトラデカペプチドはマクロフアー
ジ様細胞に対して有力なマイトジエン活性を示した。
のに、本発明の新規テトラデカペプチドはマクロフアー
ジ様細胞に対して有力なマイトジエン活性を示した。
ペプチドIII:H−Tyr−Glu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH ペプチドIV:H−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−Glu−Asn−A
sp−Leu−Leu−OH これらの発見は、ペプチドＩのアミノ末端部分が本発明
のペプチドのマイトジエン活性に重要であるということ
を示唆している。
sp−Leu−Leu−OH これらの発見は、ペプチドＩのアミノ末端部分が本発明
のペプチドのマイトジエン活性に重要であるということ
を示唆している。
〈発明の詳細な説明〉 本明細書は、この発明作成に関係する主題を特に指摘
し、明確にクレイムしているクレイムをもつて終わつて
いるが、本発明は、添付図面と関連した抜擢実施態様に
対する次の詳細な説明から、よく理解されるものと思わ
れる。その添付図面とは、第１図がヒトα−トロンビン
構造のモデルであり、第２図が本発明の１実施態様とし
て、合成マイトジエンペプチドへ細胞をさらした後の、
J774マウスマクロフアージ様細胞によるチミジン取り込
みおよび全細胞タンパク質レベルをグラフに示したもの
である。
し、明確にクレイムしているクレイムをもつて終わつて
いるが、本発明は、添付図面と関連した抜擢実施態様に
対する次の詳細な説明から、よく理解されるものと思わ
れる。その添付図面とは、第１図がヒトα−トロンビン
構造のモデルであり、第２図が本発明の１実施態様とし
て、合成マイトジエンペプチドへ細胞をさらした後の、
J774マウスマクロフアージ様細胞によるチミジン取り込
みおよび全細胞タンパク質レベルをグラフに示したもの
である。
第１図のヒトα−トロンビンモデルは、プロトロンビン
のタンパク質命名法に基づいており、１本鎖チモーゲン
は後に活性化され、因子Xaによつて、272および321残基
のところで２本鎖構造に切断される。このように生成し
た活性型酵素は、自触作用により、285残基のところで
Ａ鎖のはじめの13残基を削除し、α−トロンビンを生成
する。ペプチドCB67−129の構造を、斜線で示した「ル
ープＢ」挿入配列（すなわち367−375残基）と共に示し
てある。また、この断片の重要な構造上の特徴である、
活性部位His363（六角形）と炭水化物付着部位（Asn37
3）の場所も示してある。「ループＢ」トロンビンＢ鎖
挿入配列の正確な範囲がはつきりしないのと同様、Asx3
55と371のアミドの指定ははつきりしない。
のタンパク質命名法に基づいており、１本鎖チモーゲン
は後に活性化され、因子Xaによつて、272および321残基
のところで２本鎖構造に切断される。このように生成し
た活性型酵素は、自触作用により、285残基のところで
Ａ鎖のはじめの13残基を削除し、α−トロンビンを生成
する。ペプチドCB67−129の構造を、斜線で示した「ル
ープＢ」挿入配列（すなわち367−375残基）と共に示し
てある。また、この断片の重要な構造上の特徴である、
活性部位His363（六角形）と炭水化物付着部位（Asn37
3）の場所も示してある。「ループＢ」トロンビンＢ鎖
挿入配列の正確な範囲がはつきりしないのと同様、Asx3
55と371のアミドの指定ははつきりしない。
この発明の新規マイトジエンペプチドは、ペプチド合成
に対する適当な常法手段を適用することにより作成され
る。従つて、伸長しつつあるペプチド鎖へ構成アミノ酸
が望ましい配列で加えられる、一連のカツプリング反応
により、ペプチド鎖は作成される。様々なＮ保護基、例
えばカルボベンジルオキシ基あるいはｔ−ブチルオキシ
カルボニル基（BOC）、様々なカツプリング試薬、例え
ばシジクロヘキシルカルボジイミドあるいはカルボニル
ジイミダゾール、様々な活性エステル、例えばＮ−ヒド
ロキシフタルイミドあるいはＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドのエステル、そして様々な脱保護剤、例えばトリフ
ルオロ酢酸、HCl/ジオキサン、トリス（トリフルオロ酢
酸）ホウ素、臭化シアンの使用、中間生成物の分離、精
製を伴う液相中での反応は、周知の古典的ペプチド方法
論によつて実施できる。
に対する適当な常法手段を適用することにより作成され
る。従つて、伸長しつつあるペプチド鎖へ構成アミノ酸
が望ましい配列で加えられる、一連のカツプリング反応
により、ペプチド鎖は作成される。様々なＮ保護基、例
えばカルボベンジルオキシ基あるいはｔ−ブチルオキシ
カルボニル基（BOC）、様々なカツプリング試薬、例え
ばシジクロヘキシルカルボジイミドあるいはカルボニル
ジイミダゾール、様々な活性エステル、例えばＮ−ヒド
ロキシフタルイミドあるいはＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドのエステル、そして様々な脱保護剤、例えばトリフ
ルオロ酢酸、HCl/ジオキサン、トリス（トリフルオロ酢
酸）ホウ素、臭化シアンの使用、中間生成物の分離、精
製を伴う液相中での反応は、周知の古典的ペプチド方法
論によつて実施できる。
本発明のペプチドは、有名ばメリフイールド固相法によ
り作成される［Merrifield,J.Amer.Chem.Soc 85,2149
−54（1963）およびScience 150,178−85（1965）参
照］。この方法は、古典的ペプチド合成と同様な多くの
化学反応および保護基を使用しているが、カルボキシル
末端が固相、すなわち普通、架橋ポリスチレンあるいは
スチレンジビニルベンゼン共重合体に結合している、伸
長しつつあるペプチド鎖を与えている。各段階での過剰
な試薬の除去は、単にポリマーの洗浄をするのみである
ので、この方法は便宜的に手順上の処理数を簡易化して
いる。
り作成される［Merrifield,J.Amer.Chem.Soc 85,2149
−54（1963）およびScience 150,178−85（1965）参
照］。この方法は、古典的ペプチド合成と同様な多くの
化学反応および保護基を使用しているが、カルボキシル
末端が固相、すなわち普通、架橋ポリスチレンあるいは
スチレンジビニルベンゼン共重合体に結合している、伸
長しつつあるペプチド鎖を与えている。各段階での過剰
な試薬の除去は、単にポリマーの洗浄をするのみである
ので、この方法は便宜的に手順上の処理数を簡易化して
いる。
伝統的なメリフイールドペプチド合成の一般的反応順序
を次のように図解する。
を次のように図解する。
ペプチド付着のための反応性基を与えるクロロメチル化
の段階、PS＝ポリスチレン残基。
の段階、PS＝ポリスチレン残基。
エステル化の段階−ｔ−BOC保護基を使つて保護した第
１のアミノ酸（R1）のトリエチルアンモニウム塩との反
応。
１のアミノ酸（R1）のトリエチルアンモニウム塩との反
応。
ジシクロヘキシルカルボジイミドカツプリング試薬を用
いた、ペプチド合成段階。この段階IIIの次に、例え
ば、トリフルオロ酢酸の25％塩化メチレン溶液によるｔ
−BOCの脱保護および過剰のトリエチルアミンによるＮ
末端アミンの遊離を行い、それが、保護した第２のアミ
ノ酸（R2）の活性カルボキシル基と反応するのを可能に
する。最終段階は、完成したペプチドを、例えば無水HF
のアニソール溶液で処理することにより、PS樹脂から切
断する。
いた、ペプチド合成段階。この段階IIIの次に、例え
ば、トリフルオロ酢酸の25％塩化メチレン溶液によるｔ
−BOCの脱保護および過剰のトリエチルアミンによるＮ
末端アミンの遊離を行い、それが、保護した第２のアミ
ノ酸（R2）の活性カルボキシル基と反応するのを可能に
する。最終段階は、完成したペプチドを、例えば無水HF
のアニソール溶液で処理することにより、PS樹脂から切
断する。
確立された固相合成法に関する背景の情報はさらに、St
ewartとYoungの論文、“Solid Phase Peptide Synthesi
s,"W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco,1969、およびAd
vance in Enzymolgy 32,pp.221−296,F.F.Nold,Ed.,In
terscience Publishers,New York,1969,のメリーフイー
ルドによる総説の章および、Erickson and Merrifield,
The Proteins,Vol.2,p.225et seq.（ed.Neurath and Hi
ll）,Academic Press,New York,1976を参照することに
よつて得られる。
ewartとYoungの論文、“Solid Phase Peptide Synthesi
s,"W.H.Freeman ＆ Co.,San Francisco,1969、およびAd
vance in Enzymolgy 32,pp.221−296,F.F.Nold,Ed.,In
terscience Publishers,New York,1969,のメリーフイー
ルドによる総説の章および、Erickson and Merrifield,
The Proteins,Vol.2,p.225et seq.（ed.Neurath and Hi
ll）,Academic Press,New York,1976を参照することに
よつて得られる。
マクロフアージ様細胞の増殖刺激は、本発明のマイトジ
エンペプチドの様々な濃度における細胞による、チミジ
ン取り込みを測定することにより、測定される。これ
は、J774,P388D1,RAW,PU5を含む多くのマクロフアージ
様細胞系に対して測定された。これらは、例えばAmeric
an Type Culture Collection,Rockville,Marylandより
入手できる有名な、マウス細胞系である。
エンペプチドの様々な濃度における細胞による、チミジ
ン取り込みを測定することにより、測定される。これ
は、J774,P388D1,RAW,PU5を含む多くのマクロフアージ
様細胞系に対して測定された。これらは、例えばAmeric
an Type Culture Collection,Rockville,Marylandより
入手できる有名な、マウス細胞系である。
この発明は、これら以下の実施例に限定されず、次の実
施例は、この発明をさらに説明するであろう。
施例は、この発明をさらに説明するであろう。
実施例１ ヒトトロンビンＢ鎖の367−380残基を示し、第１図に示
すようなループＢ挿入配列を含むペプチドI, Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Trp−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−G
lu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH, は、Wilnerら、Biochemistry 15（６） 1209−1213（1
976）および18（23）、5078−5082（1979）に記載され
ているように、伝統的なメリフイールド固相ペプチド合
成の修正により合成された。充分保護されたペプチド
は、Tamら，J.Am.Chem.Soc．105,6442−6455（1983）の
２段階HF触媒SN２法により、同時に脱保護および、支持
体である樹脂から切断した。粗ペプチドは、Wilnerら、
Biochemistry 15（６） 1209−1213（1976）に書かれ
ている方法により、DEAE−Sephacel カラムを使つたイ
オン交換クロマトグラフイーで精製した。ペプチドの純
度は、単一ピークとしてクロマトグラフ分析される、Fu
lmerら，J.Biol.Chem.，254,7208−7212（1979）、の方
法に従い、逆相系C18高速液体クロマトグラフイー（HPL
C）により確かめた。また、薄相クロマトグラフイー（T
LC）により、２つの異なる溶媒系を用いた時、単一スポ
ツトとして移動することから、ペプチドが同種であるこ
とも認められた。アミノ酸分析では、望ましいペプチド
配列と一致した、モル比を生じた。
すようなループＢ挿入配列を含むペプチドI, Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Trp−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−G
lu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH, は、Wilnerら、Biochemistry 15（６） 1209−1213（1
976）および18（23）、5078−5082（1979）に記載され
ているように、伝統的なメリフイールド固相ペプチド合
成の修正により合成された。充分保護されたペプチド
は、Tamら，J.Am.Chem.Soc．105,6442−6455（1983）の
２段階HF触媒SN２法により、同時に脱保護および、支持
体である樹脂から切断した。粗ペプチドは、Wilnerら、
Biochemistry 15（６） 1209−1213（1976）に書かれ
ている方法により、DEAE−Sephacel カラムを使つたイ
オン交換クロマトグラフイーで精製した。ペプチドの純
度は、単一ピークとしてクロマトグラフ分析される、Fu
lmerら，J.Biol.Chem.，254,7208−7212（1979）、の方
法に従い、逆相系C18高速液体クロマトグラフイー（HPL
C）により確かめた。また、薄相クロマトグラフイー（T
LC）により、２つの異なる溶媒系を用いた時、単一スポ
ツトとして移動することから、ペプチドが同種であるこ
とも認められた。アミノ酸分析では、望ましいペプチド
配列と一致した、モル比を生じた。
このペプチド合成において、すべての成分は、試薬グレ
ードを持つていた。Ｎα−tert−ブトキシカルボニル
（BOC）Ｌ−アミノ酸は、Bachem,Inc.,Torrance,CAより
購入した。側鎖を保護されたBOCアミノ酸は、γ−ベン
ジルグルタミン酸、β−ベンジルアスパラギン酸、Ｏ−
ベンジルトレオニン、２−クロロベンシルオキシカルボ
ニルレーリシン、Ｎ−ホルミルトリプトフアン、Ｏ−ベ
ンジルチロシンであつた。アスパラギンは、等モルの１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール存在下で、ジシクロヘ
キシルカルボジイミドと直接結合させることにより、保
護せずに、誘導された。BOCアミノ酸の純度は、融点
（補正されていない）と薄相クロマトグラフイーによつ
て評価された。DEAE−SephacelはParmacia Fine Chemic
als,Piscataway,NJより購入した。Bio−Gel Ｐ−２（2
0−400メツシユ）はBio−Rad Laboratorise,Rockville
Centre,NY、より購入した。スチレンジビニルベンゼビ
ーズ、１％架橋、200−400メツシユ、クロロメチル化
（1.16ミリ当量Cl/g）は、Lab Systems,Ins.,San Mate
o.CAより購入し、使用前、18時間、温（60℃）ジメチル
ホルムアミドによつて抽出した。
ードを持つていた。Ｎα−tert−ブトキシカルボニル
（BOC）Ｌ−アミノ酸は、Bachem,Inc.,Torrance,CAより
購入した。側鎖を保護されたBOCアミノ酸は、γ−ベン
ジルグルタミン酸、β−ベンジルアスパラギン酸、Ｏ−
ベンジルトレオニン、２−クロロベンシルオキシカルボ
ニルレーリシン、Ｎ−ホルミルトリプトフアン、Ｏ−ベ
ンジルチロシンであつた。アスパラギンは、等モルの１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール存在下で、ジシクロヘ
キシルカルボジイミドと直接結合させることにより、保
護せずに、誘導された。BOCアミノ酸の純度は、融点
（補正されていない）と薄相クロマトグラフイーによつ
て評価された。DEAE−SephacelはParmacia Fine Chemic
als,Piscataway,NJより購入した。Bio−Gel Ｐ−２（2
0−400メツシユ）はBio−Rad Laboratorise,Rockville
Centre,NY、より購入した。スチレンジビニルベンゼビ
ーズ、１％架橋、200−400メツシユ、クロロメチル化
（1.16ミリ当量Cl/g）は、Lab Systems,Ins.,San Mate
o.CAより購入し、使用前、18時間、温（60℃）ジメチル
ホルムアミドによつて抽出した。
ペプチド合成において、テトラメチルアンモニウムヒド
ロキシドにより、この残基（例えばロイシン）を中和
し、Ｎα−tert−BOC−Ｌ−ロイシンテトラメチルアン
モニウム塩とクロロメチル化された樹脂とをジメチルス
ルホキシド（DMSO）中で、80°１時間反応させることに
より、不溶性支持体へのCOOH末端残基のエステル化は行
われた。アミノ基の脱保護は、25％トリフルオロ酢酸の
塩化メチレン溶液を使つて行われ、中和は、10％トリエ
チルアミンの塩化メチレン溶液を使つて行われた。すべ
ての残基カツプリングは、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド塩化メチレン溶液（４当量）を使つて行われ、カツ
プリングは、Kaiser（ニンヒドリン）法により検査し
た。そして、Ｎ−アセチルイミダゾールを使い、ターミ
ネイト（もし必要であれば）した。完成し、充分に保護
されたペプチドは、先に述べた２段階HF−触媒SN２法に
より、不溶性の支持体より切断し、脱保護した。
ロキシドにより、この残基（例えばロイシン）を中和
し、Ｎα−tert−BOC−Ｌ−ロイシンテトラメチルアン
モニウム塩とクロロメチル化された樹脂とをジメチルス
ルホキシド（DMSO）中で、80°１時間反応させることに
より、不溶性支持体へのCOOH末端残基のエステル化は行
われた。アミノ基の脱保護は、25％トリフルオロ酢酸の
塩化メチレン溶液を使つて行われ、中和は、10％トリエ
チルアミンの塩化メチレン溶液を使つて行われた。すべ
ての残基カツプリングは、ジシクロヘキシルカルボジイ
ミド塩化メチレン溶液（４当量）を使つて行われ、カツ
プリングは、Kaiser（ニンヒドリン）法により検査し
た。そして、Ｎ−アセチルイミダゾールを使い、ターミ
ネイト（もし必要であれば）した。完成し、充分に保護
されたペプチドは、先に述べた２段階HF−触媒SN２法に
より、不溶性の支持体より切断し、脱保護した。
ドライエチルエーテルにより樹脂を洗浄した後、粗ペプ
チドは、10％酢酸中に抽出し、凍結乾燥した。ペプチド
は、DEAE−Sephacelカラムにより同時に脱塩、精製し、
varigrad device（Buchler Instruments,Ins.,Fort Le
e,N.J.）において開発された、リニヤーソルトグラジエ
ンとにより溶出した。初期緩衝液は、0.05Mホウ酸ナト
リウムで、最終緩衝液は、0.5M塩化ナトリウムを含む初
期緩衝液であつた。カラムの大きさは、1.2×40cmであ
つた。溶出画分は、225nMの吸収およびシリカゲルＧ（M
erck Darmstadt,Germany）でプレコートしたガラスプレ
ートを使つた薄相クロマトグラフイーによつて分析し
た。フルオレスカミンおよび塩素:O−トリジン噴霧は、
ペプチド発色に用いられた。薄相クロマトグラフイーに
用いた２つの溶媒系は、 （１）１−ブタノール−酢酸−水（1:1:1、v/v/v）およ
び （２）酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 （5:5:1:3、v/v/v/v）であつた。
チドは、10％酢酸中に抽出し、凍結乾燥した。ペプチド
は、DEAE−Sephacelカラムにより同時に脱塩、精製し、
varigrad device（Buchler Instruments,Ins.,Fort Le
e,N.J.）において開発された、リニヤーソルトグラジエ
ンとにより溶出した。初期緩衝液は、0.05Mホウ酸ナト
リウムで、最終緩衝液は、0.5M塩化ナトリウムを含む初
期緩衝液であつた。カラムの大きさは、1.2×40cmであ
つた。溶出画分は、225nMの吸収およびシリカゲルＧ（M
erck Darmstadt,Germany）でプレコートしたガラスプレ
ートを使つた薄相クロマトグラフイーによつて分析し
た。フルオレスカミンおよび塩素:O−トリジン噴霧は、
ペプチド発色に用いられた。薄相クロマトグラフイーに
用いた２つの溶媒系は、 （１）１−ブタノール−酢酸−水（1:1:1、v/v/v）およ
び （２）酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水 （5:5:1:3、v/v/v/v）であつた。
望ましいペプチドが、主要ピークとして溶出した。この
ピークは続いて、0.5M重炭酸アンモニウム緩衝液を用い
て2.5×100cmBio−Gel P−２カラムにより脱塩した。逆
相C18カラムを使つたこのペプチドのHPLC分析により、
ペプチドは同種であることが示された。また、このペプ
チドは、アミノ酸分析において予想されたモル比も与え
た。
ピークは続いて、0.5M重炭酸アンモニウム緩衝液を用い
て2.5×100cmBio−Gel P−２カラムにより脱塩した。逆
相C18カラムを使つたこのペプチドのHPLC分析により、
ペプチドは同種であることが示された。また、このペプ
チドは、アミノ酸分析において予想されたモル比も与え
た。
実施例２ 実施例１の精製テトラデカペプチドのマクロフアージ様
細胞に対するマイトジエン効果を測定するため、次の試
験を行なつた。3 [H]−TdR取り込み 24ウエルデイスポーザブルプラスチツクプレート（Falc
on,Oxnard,CA）１ウエル当り５×105の初期濃度、37℃9
5％CO2、湿潤条件下で、10％ウシ胎児血清（FCS）を含
むダルベツコ変法イーグル培地（DMEM）に浮遊した様々
な細胞系をプレートに入れた。DNA合成の停止（すなわ
ちG0／G1）は、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む
血清不含DMEMで、48時間細胞を培養することにより、行
なった。それから、細胞をペプチドあるいは様様なトロ
ンビン型、あるいはFCSに48時間さらした。チミジン取
り込みの増加は、Ｎ−メチル3[H]−TdR（１μCi/ml）の
２時間のパルスの後に、評価された。細胞は３倍量のPB
S（リン酸緩衝食塩水、pH7.4）で４回洗浄し、10％トリ
クロル酢酸で沈澱させ（30分、４回）、その不溶物は、
２倍量のETOH:ET2Ｏ（3:1 v/v）で抽出した。沈澱物
は、N NaOHで溶解し、dye−bindingアツセイ（Bio Rad
Labs,Richmond,CA）を使つたタンパク質定量と、液体シ
ンチレーシヨンスペクトロメトリーのため、適量が回収
された。
細胞に対するマイトジエン効果を測定するため、次の試
験を行なつた。3 [H]−TdR取り込み 24ウエルデイスポーザブルプラスチツクプレート（Falc
on,Oxnard,CA）１ウエル当り５×105の初期濃度、37℃9
5％CO2、湿潤条件下で、10％ウシ胎児血清（FCS）を含
むダルベツコ変法イーグル培地（DMEM）に浮遊した様々
な細胞系をプレートに入れた。DNA合成の停止（すなわ
ちG0／G1）は、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む
血清不含DMEMで、48時間細胞を培養することにより、行
なった。それから、細胞をペプチドあるいは様様なトロ
ンビン型、あるいはFCSに48時間さらした。チミジン取
り込みの増加は、Ｎ−メチル3[H]−TdR（１μCi/ml）の
２時間のパルスの後に、評価された。細胞は３倍量のPB
S（リン酸緩衝食塩水、pH7.4）で４回洗浄し、10％トリ
クロル酢酸で沈澱させ（30分、４回）、その不溶物は、
２倍量のETOH:ET2Ｏ（3:1 v/v）で抽出した。沈澱物
は、N NaOHで溶解し、dye−bindingアツセイ（Bio Rad
Labs,Richmond,CA）を使つたタンパク質定量と、液体シ
ンチレーシヨンスペクトロメトリーのため、適量が回収
された。
これらの試験に使用した様々な細胞系は、マウスマクロ
フアージ様細胞系、J774,P388D1,RAW,PU5であつた。こ
れらの試験に使用した様々なトロンビンの種類は、血小
板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子（EGF）、繊維
芽細胞成長因子（FGF）、神経成長因子（NGF）であつ
た。これら既知のポリペプチド成長因子に関する背景の
情報としては例えば、Krisらによる最近の総説記事、Bi
otechnology,February 1985,pp.135−140,およびHormon
al Proteins and Peptides,Ed.by Choh Hao Li,Vol.12,
“Growth Factors",Academic Press,1984における包括
的な総説を参照することができる。EGF,NGF,FGFは、Bio
medical Technologies,Cambridge,Massachusettsより商
業上入手できる。典型的なテストにおいて、最適ペプチ
ド濃度（すなわち108Ｍ）に増殖停止した細胞を24時間
さらした後、細胞数はコントロール値、培養ウエル当り
1.2−２×105細胞の２倍に増加した。対照として、既知
の増殖促進作用剤である、PDGF,EGF,NGF,FGFは500ng/ml
の濃度範囲まで、これらの細胞の増殖を誘導しなかつ
た。その結果は、第２図および表１で、下記に示してあ
る。第２図において、静止したJ774細胞中のベースライ
ントリチウムラベルチミジン（3[H]−TdR）取り込み
は、１ウエル当り、5000cpm±420s.e.m（平均標準誤
差）であつた。結果は、トリプリケート測定の平均値で
表現してある。
フアージ様細胞系、J774,P388D1,RAW,PU5であつた。こ
れらの試験に使用した様々なトロンビンの種類は、血小
板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子（EGF）、繊維
芽細胞成長因子（FGF）、神経成長因子（NGF）であつ
た。これら既知のポリペプチド成長因子に関する背景の
情報としては例えば、Krisらによる最近の総説記事、Bi
otechnology,February 1985,pp.135−140,およびHormon
al Proteins and Peptides,Ed.by Choh Hao Li,Vol.12,
“Growth Factors",Academic Press,1984における包括
的な総説を参照することができる。EGF,NGF,FGFは、Bio
medical Technologies,Cambridge,Massachusettsより商
業上入手できる。典型的なテストにおいて、最適ペプチ
ド濃度（すなわち108Ｍ）に増殖停止した細胞を24時間
さらした後、細胞数はコントロール値、培養ウエル当り
1.2−２×105細胞の２倍に増加した。対照として、既知
の増殖促進作用剤である、PDGF,EGF,NGF,FGFは500ng/ml
の濃度範囲まで、これらの細胞の増殖を誘導しなかつ
た。その結果は、第２図および表１で、下記に示してあ
る。第２図において、静止したJ774細胞中のベースライ
ントリチウムラベルチミジン（3[H]−TdR）取り込み
は、１ウエル当り、5000cpm±420s.e.m（平均標準誤
差）であつた。結果は、トリプリケート測定の平均値で
表現してある。
第１図は、ヒトα−トロンビン構造のモデルであり、第
２図は、本発明の１実施態様として、合成マイトジエン
ペプチドへ細胞をさらした後の、J774マウスマクロフア
ージ様細胞によるチミジン取り込みおよび全細胞タンパ
ク質レベルをグラフに示したものである。
２図は、本発明の１実施態様として、合成マイトジエン
ペプチドへ細胞をさらした後の、J774マウスマクロフア
ージ様細胞によるチミジン取り込みおよび全細胞タンパ
ク質レベルをグラフに示したものである。
Claims (2)
- 【請求項１】次のアミノ酸配列 Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Trp−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−G
lu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH,からなる強力なマイトジ
エン活性を有するペプチドあるいはその生理学的に許容
できる塩。 - 【請求項２】生理学的に許容できる担体または賦形剤と
ともに、活性成分として次のアミノ酸配列 Ｈ−Tyr−Pro−Pro−Trp−Asn−Lys−Asn−Phe−Thr−G
lu−Asn−Asp−Leu−Leu−OH,からなるペプチドまたは
その製薬的に許容できる塩を含む、インビトロマクロフ
ァージ様細胞の生長刺激用薬剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US787411 | 1985-10-15 | ||
| US06/787,411 US4704451A (en) | 1985-10-15 | 1985-10-15 | Mitogenic peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62174098A JPS62174098A (ja) | 1987-07-30 |
| JPH0689031B2 true JPH0689031B2 (ja) | 1994-11-09 |
Family
ID=25141385
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61242216A Expired - Lifetime JPH0689031B2 (ja) | 1985-10-15 | 1986-10-14 | マイトジエン活性を有するペプチド |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4704451A (ja) |
| EP (1) | EP0220157B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0689031B2 (ja) |
| AT (1) | ATE69240T1 (ja) |
| AU (1) | AU595249B2 (ja) |
| CA (1) | CA1299814C (ja) |
| DE (1) | DE3682368D1 (ja) |
| DK (1) | DK169346B1 (ja) |
| FI (1) | FI85379C (ja) |
| IE (1) | IE59403B1 (ja) |
| IL (1) | IL80300A (ja) |
| NO (1) | NO169127C (ja) |
| ZA (1) | ZA867783B (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2131389A1 (en) * | 1992-03-02 | 1993-09-16 | John M. Maraganore | Thrombin receptor antagonists |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4376071A (en) * | 1980-08-21 | 1983-03-08 | Research Corporation | Mitogenic spinal cord growth factor |
| US4517338A (en) * | 1983-06-20 | 1985-05-14 | Chiron Corporation | Multiple reactor system and method for polynucleotide synthesis |
| US4515920A (en) * | 1984-04-30 | 1985-05-07 | The Rockefeller University | Synthesis of peptides and proteins |
-
1985
- 1985-10-15 US US06/787,411 patent/US4704451A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-10-14 IL IL80300A patent/IL80300A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-10-14 FI FI864146A patent/FI85379C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-10-14 EP EP86870149A patent/EP0220157B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-14 CA CA000520437A patent/CA1299814C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-14 NO NO864088A patent/NO169127C/no not_active IP Right Cessation
- 1986-10-14 DK DK489086A patent/DK169346B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-10-14 AT AT86870149T patent/ATE69240T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-10-14 AU AU63878/86A patent/AU595249B2/en not_active Ceased
- 1986-10-14 DE DE8686870149T patent/DE3682368D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-10-14 IE IE270586A patent/IE59403B1/en not_active IP Right Cessation
- 1986-10-14 JP JP61242216A patent/JPH0689031B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-10-14 ZA ZA867783A patent/ZA867783B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| CA1299814C (en) | 1992-04-28 |
| IL80300A (en) | 1991-07-18 |
| DE3682368D1 (de) | 1991-12-12 |
| ZA867783B (en) | 1987-08-26 |
| FI864146A0 (fi) | 1986-10-14 |
| IL80300A0 (en) | 1987-01-30 |
| IE59403B1 (en) | 1994-02-23 |
| EP0220157A3 (en) | 1989-02-15 |
| DK489086D0 (da) | 1986-10-14 |
| FI85379C (fi) | 1992-04-10 |
| US4704451A (en) | 1987-11-03 |
| JPS62174098A (ja) | 1987-07-30 |
| ATE69240T1 (de) | 1991-11-15 |
| FI864146A (fi) | 1987-04-16 |
| DK169346B1 (da) | 1994-10-10 |
| NO864088D0 (no) | 1986-10-14 |
| DK489086A (da) | 1987-04-16 |
| EP0220157B1 (en) | 1991-11-06 |
| FI85379B (fi) | 1991-12-31 |
| NO864088L (no) | 1987-04-21 |
| NO169127C (no) | 1992-05-13 |
| NO169127B (no) | 1992-02-03 |
| EP0220157A2 (en) | 1987-04-29 |
| IE862705L (en) | 1987-04-15 |
| AU6387886A (en) | 1987-04-16 |
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