FI85379C - Mitogena peptider. - Google Patents

Description

1 85379

Mitogeenisiä peptidejä Tämä keksintö koskee uusia peptidejä, joilla on mi-togeenistä aktiviteettia makrofagin tapaisiin soluihin.

5 On tunnettua, että trombiinilla on monenlaisia vai kutuksia soluihin. Niinpä fibrinogeenin hyydyttämisen ja plasman hyydytysjärjestelmässä olevien muiden tekijöiden entsymaattisesti tapahtuvan aktivoimisen lisäksi on esitetty, että trombiinilla on mitogeenistä aktiviteettia 10 moniin sidekudosemosolulinjoihin kudosviljelyssä. Katso esim. Perdue et ai., J. Biol. Chem. 256 (1981) 2767-2776. Sen toiminta kasvua stimuloivana aineena sidekudosemoso-luille liittyy läheisesti sen esterolyyttiseen aktiviteettiin.

15 Trombiinin on lisäksi myös äskettäin selitetty omaa van kemotaktista aktiviteettia ihmisen perifeerisiin veren monosyytteihin. Bar-Shavit et ai., J. Cell Biol. 96 (1983) 282-285.

Yrityksiä on tehty trombiinin sen alueen tai aluei-20 den identifioimiseksi, joista johtuvat sen eri biologiset aktiviteetit. Niinpä Bar-Shavit et ai., Science 220 (1983) 728-730 päättelevät, että kemotaktinen aktiviteetti välittyy trombiinimolekyylissä olevan sen erityisen alueen kautta, joka on riippumaton niistä paikoista, jotka tarvi-25 taan elektrolyyttiseen aktiviteettiin ja fibrinogeenin tunnistamiseen. Kemotaktisen toiminnan merkittävyys on se, että se voi olla tärkeä inflammatoristen vastausten fysiologinen stimulantti kudosvauriokohdissa. Tämä kemotaktinen funktio, joka aiheuttaa solujen suuntaliikunnan, on erotet-30 tava mitogeenisesta funktiosta, joka on kasvuaktiviteetti-tekijä soluissa, so. tekijä, joka stimuloi solujen jakautumista ja erikoistumista. Aikaisemmin on esitetty, että trombiini voi myös tuoda esiin mitogeenisen vaikutuksen makrofagin kaltaisiin soluihin. Bar-Shavit et ai., J. Cell. 35 Biol. 97 (1983) 396a, Abstract 1494.

2 85379

Esillä olevan keksinnön mukaan on nyt huomattu, että eräät ihmisen trombiinin /3-ketjun tetradekapeptidi-homologit ovat tehokkaita mitogeenejä makrofagin kaltaisille soluille. Näissä mitogeenisissä peptideissä on seu-5 raava aminohapposekvenssi: H-Tyr-Pro-Pro-X.Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH, jossa X = Trp tai Tyr, 10 tai kyseessä ovat näiden yhdisteiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat, esterit tai amidit.

Tässä esitetyissä peptidirakenteissa käytetään ami-nohappokomponenteista seuraavanlaisia tavanomaisia lyhen-15 nyksiä:

Aminohappo Käytetty lyhenne

L-alaniini Ala tai A

L-arginiini Arg tai R

L-asparagiini Asn tai N

20 L-asparagiinihappo Asp tai D

L-kysteiini Cys tai C

L-glutamiinihappo Glu tai E L-glutamiini Gin tai Q

Glysiini Gly tai G

25 L-histidiini His tai H

L-isoleusiini Ile tai I

L-leusiini Leu tai L

L-lysiini Lys tai K

L-metioniini Met tai M

30 L-fenyylialaniini Phe tai F

L-proliini Pro tai P

L-seriini Ser tai S

L-treoniini Thr tai T

L-tryptofaani Trp tai W

35 L-tyrosiini Tyr tai Y

L-valiini Vai tai V

3 85379

Peptidi I, jossa on seuraavanlainen aminohapposekvenssi : H-Tyr-Pro-Pro-Trp-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH, 5 edustaa ihmisen trombiinin B-ketjun tähteitä 367-380 (tai ihmisen pretrombiini 2:n sekvenssin tähteitä 96-109). Ihmisen pretrombiini 2:n sekvenssin ovat esittäneet Butkowski et ai., J. Biol. Chem. 252 (1977) 4942-4957. Ihmi-10 sen pretrombiini 2:n primaarisen rakenteen johtamiseksi Butkowski et ai. valmistivat pretrombiini 1:n, bromivedyn avulla aikaansaadun hajoamistuotteen eräitä kymotryptisiä peptidifragmentteja, joista fragmenteista yksi vastaa pretrombiini 2:n tähteitä 95-109. Tällä fragmentilla ei 15 osoitettu kuitenkaan olevan mitään biologista aktiviteettia eikä myöskään valmistettu tai esitetty esillä olevan keksinnön mukaista 96-109-fragmenttia.

Peptidi II, jossa on seuraava aminohapposekvenssi:

20 H-Tyr-Pro-Pro-Tyr-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH

on peptidi I:n analogi, jossa tryptofaani on korvattu ty-rosiinilla.

Tämän keksinnön mukaiset uudet tetradekapeptidit 25 osoittivat yllättäen tehokasta mitogeenistä aktiviteettia makrofagin kaltaisiin soluihin, kun taas sen kaksi seuraavanlaista fragmenttia oli tehotonta:

Peptidi III H-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH

Peptidi IV H-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH 30 Nämä havainnot osoittavat, että peptidien I tai II amino-pääteosa on tärkeä esillä olevan keksinnön mukaisten peptidien mitogeeniselle aktiviteetille.

Vaikkakin keksinnön selitys on yhtäpitävä patenttivaatimusten kanssa, jotka erityisesti korostavat ja tarkas-35 ti määrittelevät esillä olevan keksinnön kohteena olevan asian, on otaksuttavissa, että keksintö käy paremmin 4 85379 ymmärrettäväksi seuraavasta edullisten suoritusmuotojen kuvauksesta tarkasteltuna yhdessä oheisten piirustusten kanssa, joissa;

Kuvio 1 on malli ihmisen OC-trombiinin rakenteesta.

5 Kuvio 2 on graafinen esitys tymidiinin liittymisestä J774 muriinin makrofagin kaltaisiin soluihin sekä solupro-teiinin kokonaismäärät solujen oltua altistettuna synteettiselle, mitogeeniselle peptidille keksinnön eräässä toteutusmuodossa .

10 Ihmisen Ot-trombiinin malli kuviossa 1 perustuu protrombiinin, erään 1-ketjuisen tsymogeenin, proteiinini-mistöön, joka tsymogeeni sen jälkeen aktivoidaan ja hajotetaan kahdeksi ketjurakenteeksi tähteiden 272 ja 321 kohdalta tekijä Xa:n avulla. Näin valmistettu aktiivinen 15 entsyymi poistaa A-ketjun ensimmäiset 13 tähdettä tähteen 285 kohdalla autokatalyyttisen tapahtuman avulla, jolloin saadaan oc-trombiinia. Kuviossa nähdään peptidi CB67-129:n rakenne, jossa väliin kytkeytyneen "silmukan B" sekvenssi (so. tähteet 367-375) on esitetty vinoviivoin varjostettu-20 na. Aktiivisen kohdan His 363 (kuusikulmio) ja hiilihydraatin liittymiskohdan (kohdassa Asn 373) , jotka ovat tämän fragmentin merkittäviä rakenteellisia piirteitä, sijainnit on myös osoitettu. Amidin esittäminen kohdissa Asx 355 ja 371 on kyseenalaista samoin kuin väliin kytkey-25 tyneen "silmukan B" trombiinin B-ketjun sekvenssin tarkat rajat.

Tämän keksinnön mukaisia uusia mitogeenisiä peptidejä voidaan valmistaa soveltamalla sopivasti peptidisyn-teesiä varten käytettyjä tavanomaisia menetelmiä. Niinpä 30 peptidiketju voidaan valmistaa sarjalla kytkentäreaktioi-ta, joissa rakenneosina olevat aminohapot lisätään kasvavaan peptidiketjuun toivotussa järjestyksessä. Klassillisessa peptidimetodologiassa on hyvin tunnettua käyttää erilaisia typen suojaryhmiä, esim. bentsyylikarbonyylioksi-35 ryhmää tai t-butyylioksikarbonyyliryhmää (BOC), erilaisia kytkentäreagensseja, esim. disykloheksyylikarbodi-imidiä

II

5 85379 tai karbonyylidi-imidatsolia, erilaisia aktiivisia esterei-tä, esim. N-hydroksiftaali-imidin tai N-hydroksisukkin-imidin estereitä sekä erilaisia hajottavia reagensseja, esim. trifluorietikkahappoa. HCl dioksaanissa, booritris-5 (trifluoriasetaattia) ja syaanibromidia sekä liuoksessa suoritettua reaktiota, johon liittyy välituotteiden eristäminen ja puhdistaminen.

Tämän keksinnön mukaisia peptidejä valmistetaan edullisesti Merrifield1 in hyvin tunnetun "kiinteä kannatin" 10 -menetelmän avulla. Katso Merrifield, J. Amer. Chem. Soc.

85, (1983) 2149-54 ja Science 150 (1965) 178-85. Vaikkakin tässä menetelmässä käytetään monia samoja klassillisen peptidisynteesin kemiallisia reaktioita ja suojaryhmiä, aikaansaadaan tällä menetelmällä kasvava peptidiketju kiin-15 nittyneenä karboksyylipääteryhmällään kiinteään alustaan, yleensä ristikytkeytyneeseen polystyreeniin tai styreeni-divinyylibentseenikopolymeeriin. Tämä menetelmä yksinkertaistaa sopivasti valmistuskäsittelyjen lukumäärää, koska ylimääräisten reagenssien poistaminen kussakin vaiheessa 20 suoritetaan yksinkertaisesti pesemällä polymeeri.

Yleinen reaktiojärjestys tavanomaiselle Merridield*in peptidisynteesille voidaan kuvata seuraavalla tavalla: /~\l 1 CICHjOCHj 4 f 7—PS > 25 \_y

CICH;—^ PS 4 CHjOH

30 Kloorimetyloimisvaihe reaktiivisen ryhmän saamisek si liittymään peptidiin, jossa yhtälössä PS = polystyreeni-tähde.

6 85379

O R1 H

Il I

(ch,)jC<x:nhchcoo-<chjcHj),n*h + 5 “*“0""“* O R' O Γ \

Il I II / \ (CHj)jCOCNHCHCOCHj (! V-PS + (CHjCHi)jN * Ha - 10 Esteröimisvaihe - Reaktio t-BOC-suojaryhmää käyt täen ensiksi suojatun aminohapon (R1) trietyyliammonium-suolan kanssa O RJ R' o / v 111 il i in / \ (CHjhCOCNHCHCOOH + C*Hi,N=C=NC*H„ + HjNCHCOCHj 9 V-PS- 15 ·

O RjO R'O / \ O

n I B 1 M / \ I

<CH3)jCOCNHCHCNHCHCOCHj <! PS + C*H|tNHCNHC*H|f<- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Peptidin muodostusvaihe käyttämällä disykloheksyy- 2 likarbodi-imidikytkentäainetta.

3 Tätä vaihetta III seuraa t-BOC:n lohkaisu käsitte 4 lemällä esimerkiksi trifluorietikkahapon 25-%:isella mety- 5 leenikloridiliuoksella ja vapauttamalla N-pääte-amiini yli- 6 määrin käytetyn trietyyliamiinin avulla sallien sen tällöin 7 reagoida seuraavan suojatun aminohapon (R ) aktivoidun 8 karboksyylin kanssa. Viimeinen vaihe käsittää valmiiksi 9 täydennetyn peptidin lohkaisemisen PS-hartsista esimerkik 10 si käsittelemällä vedettömän HF:n kanssa anisolissa.

11

Lisää taustainformaatiota vakiintuneesta "kiinteä 12 faasi" -synteesimenetelmästä voidaan saada tutustumalla 13 seuraaviin julkaisuihin: Stewart ja Young, "Solid Phase 14

Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 15 1969 sekä Merrifield'in yleiskatsausluku julkaisussa 16

Advances in Enzymology 32, sivut 221-296, F.F. Nolc, toimittaja, Interscience Publishers, New York, 1969; sekä 7 85379

Ericson ja Merrifield, The Proteins, osa 2, sivulta 255 eteenpäin (toimittajat Neurath ja Hill), Academic Press,

New York, 1976.

Makrofagin kaltaisten solujen kasvun stimulointi 5 voidaan määrittää mittaamalla tymidiinin liittyminen soluihin esillä olevan keksinnön mukaisten mitogeenisten peptidien erilaisilla konsentraatioilla. Tämä määritettiin erilaisilla makrofagin kaltaisilla solulinjoilla, joita olivat J773, P388D1, RAW ja PU5. Nämä ovat hyvin tunnet-10 tuja muriinisolulinjoja, joita on saatavissa esimerkiksi laitokselta nimeltään American Type Culture Collection, Rockville, Maryland.

Seuraavat esimerkit valaisevat edelleen keksintöä, joskin huomautetaan, että keksintö ei ole rajoitettu näi-15 hin erityisesimerkkeihin.

Esimerkki 1

Peptidi, I, H-Tyr-Pro-Pro-Trp-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH, joka edustaa ihmisen trombiinin B-ketjun tähteitä 367-380 ja joka sisältää silmukan B muo-20 dostaman väliin kytkeytyneen sekvenssin, kuten kuviossa 1 on esitetty, syntetisoitiin Merrifield'in totunnaisen "kiinteäfaasi"-peptidisynteesin erään muunnoksen avulla, jonka Wilner et ai. ovat esittäneet, Biochemistry 15 (1976) 6 1209-1213 ja 18 (1979) 23, 5078-5082. Täysin suojatusta 25 peptidistä poistettiin suojaukset samanaikaisesti ja peptidi lohkaistiin irti sen hartsikannatteesta Tam'in ja muiden 2-vaiheisella, HF:n katalysoimalla S^-menetelmällä, J. Am. Chem. Soc. 105 (1983) 6442-6455. Raaka peptidi puhdistettiin perusteellisesti ioninvaihtokromatografiän 30 avulla käyttämällä DEAE-Sephacel -pylvästä menetelmän avulla, jonka ovat esittäneet Wilner et ai. Biochemistry 15 (1976) 6, 1209-1213. Peptidin puhtaus varmistettiin käänteisfaasi C^g-nestekromatografiän (HPLC) avulla menetelmän mukaan, jonka ovat esittäneet Fulmer et ai.

35 j. Biol. Chem. 254 (1979) 7208-7212, jossa se kromato-grafoitiin yhtenä ainoana piikkinä. Peptidin todettiin 8 85379 myös olevan homogeenista ohutkerroskromatografiän (TLC) avulla saattamalla se kulkeutumaan yhtenä ainoana täplänä käyttäen kahta erilaista liuotinjärjestelmää. Aminohappo-analyysi antoi moolisuhteet, jotka olivat yhtäpitävät 5 toivotun peptidisekvenssin kanssa.

Tässä peptidisynteesissä kaikki komponentit olivat reagenssilaatua. Na-tert-butoksikarbonyyli (BOC) L-amino-hapot hankittiin toiminimeltä Bachem, Inc., Torrance, CA.

BOC-aminohappoja, joissa oli suojatut sivuketjut, olivat 10 y-bentsyyliglutamiinihappo, /3-bentsyyliasparagiinihappo, O-bentsyylitreoniini, 2-klooribentsyylioksikarbonyyli-L-lysiini, N-formyylitryptofaani ja O-bentsyylityrosiini. Asparagiini tuotiin yhdisteeseen suojaamattomana kytkemällä suoraan disykloheksyylikarbodi-imidin kanssa ekvimolaa-15 risen 1-hydroksibentsotriatsolimäärän läsnä ollessa.

BOC-aminohappojen puhtaus vahvistettiin sulamispisteiden (ei-korjattujen) ja ohutkerroskromatografiän avulla. DEAE-Sephacel saatiin toiminimeltä Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J. Bio-GelR P-2 (200-400 meshiä) hankittiin 20 toiminimeltä Bio-Rad Laboratories, Rockville, Centre, NY. Styreeni-divinyylibentseenihelmet, 1-%risesti ristikytkey-tyneitä, 200-400 meshiä, kloorimetyloituja (1,16 mekviv. Cl/g) hankittiin toiminimeltä Lab Systems, Inc., San Mateo, CA ja uutettiin lämpimällä (60°C) dimetyyliformamidilla 18 25 tuntia ennen käyttöä.

Peptidisynteesissä suoritettiin COOH-päätetähteen esteröinti liukenemattomaan alustaan neutraloimalla tämä tähde (so. leusiini) tetrametyyliammoniumhydroksidilla ja reagoittamalla N^tert-BOC-L-leusiini-tetrametyyliammonium-30 suolakomponentti kloorimetyloidun hartsin kanssa dimetyyli-sulfoksidissa (DMSO) 80°:ssa tunnin ajan. Suojauksen poistaminen aminoryhmältä suoritettiin käyttämällä trifluori-etikkahapon 25-%:ista metyleenikloridiliuosta ja neutralointi suoritettiin käyttämällä trietyyliamiinin 10-%:ista 35 metyleenikloridiliuosta. Kaikki tähteiden kytkemiset suoritettiin metyleenikloridissa käyttämällä disykloheksyyli- 1 9 85379 karbodi-imidiä (4-molaarinen ylimäärä reagensseja) ja kytkeytymisiä seurattiin käyttämällä Kaiser'in (ninhydriini) koetta ja kytkemiset lopetettiin (tarvittaessa) käyttämällä N-asetyyli-imidatsolia. Valmiiksi saatu, täysin suojattu 5 peptidi lohkaistiin irti sen liukenemattomasta kannatteesta ja suojaukset poistettiin 2-vaiheisen, HF:n katalysoiman SN2-menetelmän avulla, kuten edellä on esitetty.

Kuivalla etyylieetterillä suoritetun hartsin pesun jälkeen raaka peptidi uutettiin 10-%:isessa etikkahapossa 10 ja kuivattiin jäädyttämällä. Peptidistä poistettiin samanaikaisesti suola ja puhdistettiin perusteellisesti käyttämällä DEAE-Sephacel-pylvästä ja eluoitiin lineaarisilla suo-lagradienteilla, jotka oli kehitetty varigrad-kojeessa (Buchler Instruments, Inc., Fort Lee, N.J.).

15 Alussa käytetty puskuri oli 0,05M natriumboraatti ja rajapuskuri oli aluksi käytetty puskuri, joka sisälsi lisäksi 0,5M natriumkloridia. Pylvään mitat olivat 1,2 x 40 cm. Eluaattifraktiot analysoitiin absorbenssin avulla arvolla 225 nM sekä ohutkerroskromatografiän avulla käyt-20 tämällä lasilevyjä, jotka oli etukäteen päällystetty silica gel G:llä (Merck Darmstadt, Germany). Fluoreskamii-ni ja kloori: o-tolidiinisuihkeita käytettiin peptidin saamiseksi silmin nähtäväksi. Ohutkerroskromatografiaan käytetyt kaksi liuotinjärjestelmää olivat 25 (1) 1-butanoli/etikkahappo/vesi (1:1:1, til./ til./til.) ja (2) etyyliasetaatti/pyridiini/etikkahappo/vesi (5:5:1:3, til./til./til./til.).

Toivottu peptidi eluoitui pääasiallisesti puhtaana 30 tuotteena. Tästä poistettiin sen jälkeen suolat käyttämällä Bio-Gel-pylvästä (mitat 2,5 x 100 cm) ja 0,5 M am-moniumbikarbonaattipuskuria. Tämän peptidin HPLC-analyysi käyttäen käänteisfaasi-C^g-pylvästä osoitti peptidin olevan homogeenista. Tämä peptidi antoi myös odotetut mooli-35 suhteet aminohappoanalyysissä.

10 85379

Esimerkki 2

Peptidiä II, H-Tyr-Pro-Pro-Tyr-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu-OH, valmistettiin esimerkin 1 menetelmän mukaan lukuun ottamatta sitä, että "kiinteä 5 faasi" -synteesissä korvattiin BOC-tryptofaani ekvimolaa-risella määrällä BOC-tyrosiinia.

Esimerkki 3

Esimerkin 1 mukaisen puhdistetun tetradekapeptidi I:n mitogeenisten vaikutusten makrofagin kaltaisiin solui- 10 hin määrittämiseksi suoritettiin seuraavat kokeet: o /H_7~TdR:n liittyminen. Erilaisia solulinjoja levitettiin päällysteeksi Dulbecco'n Modified Eagle Medium -väliaineessa (DMEM), joka sisälsi 10 % vasikansikiösee- rumia (FCS), kostutetussa 95-%:isessa C05-atmosfäärissä o s ^ 15 37 C:ssa lähtötiheyden ollessa 5 x 10 kuoppaa kohti 24- kuoppaisiin kertakäyttöisiin muovilevyihin (Falcon,

Oxnard, CA). DNA-synteesin (so. GQ/G^) keskeytys suoritettiin hautomalla soluja 48 tuntia seerumivapaassa DMEMrssa, joka sisälsi 0,1 % naudan seerumialbumiinia (BSA). Solut 20 saatettiin sen jälkeen alttiiksi peptidille tai erilaisille trombiinimuodoille tai FCS:lie 48 tunnin ajaksi. Suurentunut tymidiinin liittyminen arvioitiin noudattaen kak-si tuntia kestänyttä N-metyyli /H_7-TdR:n pulssia (1 ^uCi/ ml). Solut pestiin kolme kertaa PBS:ssä (fosfaatilla pus-25 kuroitu ruokasuolaliuos, pH 7,4) arvolla 4, saostettiin 10-%:isella trikloorietikkahapolla (30 minuuttia arvolla 4) ja liukenematon aine uutettiin kaksi kertaa EtOH:Et20-seoksella (3:1, til./til.). Sakka liuotettiin 1N NaOH:hon ja liuoksesta otettiin määräosat proteiinin määrityksiä 30 varten, joissa käytettiin värinsidontakoetta (Bio Rad Labs., Richmond, CA) sekä nestetuikespektrometriaa.

Näissä kokeissa käytetyt erilaiset solulinjat olivat muriinin makrofagin kaltaiset solulinjat J774, P388D1, EAS ja PU5. Näissä kokeissa käytetyt erilaiset trombiini-35 muodot olivat verihiutaleista johdettu kasvutekijä (PDGF), orvaskeden kasvutekijä (EGF), sidekudosemosolun kasvutekijä i 11 85379 (FGF) sekä hermon kasvutekijä (NGF). Taustainformaation saamiseksi näille tunnetuille polypeptidin kasvutekijöille katso esimerkiksi Kris'in ja muiden hiljattain julkaistua katsausartikkelia, Biotechnology, helmikuu 1985, sivut 5 135-140; sekä laajaa katsausta julkaisussa Hormonal

Proteins and Peptides, toimittaja Choh Hao Li, osa 12, "Growth Factors", Academic Press, 1984. EGF, NGF ja FGF ovat ostettavissa toiminimeltä Biomedical Technologies, Cambridge, iMassachusetts. Eräässä tyypillisessä kokeessa 10 aiheutti solujen, joiden kasvu oli pysäytetty, 24 tuntia kestänyt alttiinaolo peptidin optimaalisille konsentraa- g tioille (so. 10 M) solujen lukumäärän suurenemisen noin kaksinkertaiseksi vertailuarvosta, joka oli 1,2 x 2x10^ solu/viljelykuoppa. Vertailun vuoksi mainittakoon, että 15 tunnetut kasvua edistävät aineet PDGF, EGF, NGF ja FGF eivät kyenneet aikaansaamaan näiden solujen lisäkasvua kon-sentraatioalueiden ollessa aina arvoon 500 ng/ml asti. Tulokset on esitetty jäljempänä kuviossa 2 ja taulukossa I. Kuviossa 2 perusviivalla tritiumilla käsitellyn tymidiinin 3 20 ( /H/-TdR) liittyminen lepotilassa oleviin J774-soluihin oli 5 000 cpm + 420 s.e.m. (keskimääräinen standardivirhe) kuoppaa kohti. Tulokset on esitetty kolminkertaisten määritysten keskiarvona.

Taulukko I

25 Kasvultaan pysäytettyjen makrofagin kaltaisten kas- vainsolulinjojen mitogeeninen stimulointi ^/H/-TdR:n liittyminen/ k mg/proteiinia (prosen-

Solut Mitogeeni Kons./kuoppa tuaalinen suureneminen)C

30 i) J774 Peptidi 10~8M 140 ± 8,5 " PDGF3 > 500 ng 9,4 ± 0,3 " EGFa " 5,2 ± 0,2 " FGFa M 0 ± 0,4 " NGF3 " 0 ± 0,5 2) J774 Poptidi 10"8M 190+12 35 P388D1 " 10'7M 226 t 22 RAW " 10'8M 276 ± 18 PU5 " 10 6M 112 ± 4,4 12 85379 a. Nämä valmisteet stimuloivat yli 4-kertaisen suurenemisen 3 /Hj-TdR:n liittymisessä lepotilassa oleviin HF-soluihin esitetyssä konsentraatiossa. Perusviivalla tapahtuva liittyminen ei-stimuloituihin soluihin oli 280 cm ± 5 21 s.e.m. kuoppaa kohti.

b. Tässä esitetään konsentraatio, joka tuottaa /H/-TdR:n spesifisen optimaalisen liittymisen. Siinä tapauksessa, että stimulointi ei ollut huomattavasti suurempi kuin vertailukohteelle (so. yli 1,5-kertainen), on ilmoitet- 10 tu korkein koestettu konsentraatio.

c. /H/-TdR:n liittyminen määritettiin edellä esitetyllä tavalla. Jokainen arvo esittää keskimääräistä prosentuaalista suurenemista 1 s.e.m., joka on saatu kolmesta viljelmästä kyseisessä kokeessa. Vertailukelpoiset tu- 15 lokset saatiin ainakin kolmessa riippumattomassa kokees sa. Alleviivatut arvot osoittavat huomattavaa stimulaatiota .

Monet muut esimerkit ovat ilmeisiä alan ammattimiehelle hänen luettuaan esillä olevan selostuksen poikkeamat- 20 ta keksinnön ideasta ja piiristä ja kaikkien tällaisten esimerkkien on tarkoitettu sisältyvän oheisten patenttivaatimusten puitteisiin.

I:

Claims (6)

1. Peptidi, jolla on voimakas mitogeeninen aktiviteetti ja joka sisältää seuraavan aminohapposekvenssin 5 H-Tyr-Pro-Pro-X-Asn-Lys-Asn-Phe-Thr-Glu-Asn-Asp-Leu-Leu- OH jossa X on Trp tai Tyr, ja sen fysiologisesti hyväksyttä-10 vät suolat, esterit ja amidit.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että X on Trp.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen peptidi, tunnettu siitä, että X on Tyr.

4. Menetelmä makrofagin kaltaisten solujen kasvun stimuloimiseksi in vitro, tunnettu siitä, että mainitut solut stimuloidaan kasvua stimuloivalla määrällä patenttivaatimuksen 1 mukaista peptidiä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että X on Trp.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X on Tyr. 14 «5379