JPS62171679A - リンパ球ｂ細胞の細胞分裂誘発剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■８発明の背景 ［技術分野］ 本発明は細胞分裂誘発剤（マイトジェン）に関するもの
であり、さらに詳しくは中性多糖体からなるリンパ球Ｂ
細胞の細胞分裂誘発剤に関する。

本発明のマイトジェンはリンパ球の細胞分裂を誘発する
作用を有している。リンパ球マイトジェンは例えば免疫
賦活活性や免疫抑制活性物質の能力を試験する系によく
利用される。またリンパ球そのものの特性、例えば患者
や実験動物のおかれている状態、特に免疫力をみる試験
において利用される。典型的な方法としては、末梢血ま
たは牌臓中のリンパ球を集め、これにマイトジェンとア
イソトープでラベルした核酸塩基を加え、リンパ球を一
定時間培養したのち細胞を集め、細胞にとり込まれたア
イソトープ量を測定することによってリンパ球の分裂能
力をみることができる。これらの能力があるときは、細
胞分裂時に核酸合成が行われ、核酸塩基が核酸の鎖の中
に取り込まれる。

本発明のマイ１〜ジエンはこのような免疫医学の分野で
利用される。

［先行技術］ 細胞分裂誘発剤マイトジェンとしては種々の物質が知ら
れており、医学研究用にはリンパ球マイトジェンが多く
使用されている。その殆んどはレクチン（赤血球凝集能
をもつ物質）であり、■リンパ球マイトジェンである。

Ｂリンパ球マイトジェンはボーク　ウィード　マイトジ
ェン（ＰＷＭ）など数が少なくしかもＢリンパ球だけで
なくＴリンパ球に対してもマイトジェン活性を有してい
る。

Ｂリンパ球のみに対して活性を有するマイトジェンはり
ボボリサツカライド（ＬＰＳ）１種のみである。ＬＰＳ
は菌から得られるが収量が低いため入手が困ガであり、
また毒性が強く、その使用も動物実験などに制限される
。

本発明者等は先にメリア・アザジラクタ樹皮の熱水抽出
物を精製して得られる多糖体ＭＡ９は強い抗腫瘍作用や
インターフェロン誘導作用を有することを見い出した（
特開昭５７−１７６９１４号、同５７−１７６９１５号
、同６Ｇ−４２３９２９号および同６Ｇ−４５５２１号
公報）。尚多糖体ＭＡ９は上記特許公開公報においては
多糖体Ｎ９ＧＩと命名されているが両者は同一物質であ
る。

本発明者等は上記多糖体ＭＡ９の薬理作用についてさら
に研究を重ねた結果、本多糖体がリンパ球に対して細胞
分裂誘発作用を有することを知り、本発明を完成した。

■０発明の目的 本発明は、毒性の低いマイトジェンを提供することを目
的とする。

本発明はさらにリンパ球８１１１ｆｉに特異的に活性を
有するマイトジェンを提供することを目的とする。

かかる目的を達成するため本発明は下記のイ）および／
または口）を含有するリンパ球Ｂ細胞の細胞分裂誘発剤
よりなる。

イ）　α−（１→４）−グルカンの主鎖にアラビノース
がα−（１→６）結合し、グルコースとアラビノースの
構成割合が約５＝１の中性多糖体。

口）　α−（１→４）−グルカンを主鎖とし、主鎖中に
β−（１→３）フコースを含み、分枝としてα−（１→
６）アラビノースを有し、グルコース、アラビノースお
よびフコースの構成割合が約５：２：１の中性多糖体。

本発明においては上記中性多糖体として多糖体ＭＡ９が
特に好適に使用される。

■０発明の詳細な説明 本発明においてマイトジェンとして好適に使用される多
糖体ＭＡ９は、メリア・アザジラクタ樹皮の熱水抽出物
から得られる中性の多糖体である。

メリア・アザジラクタは学名をメリア・アザジラクタ・
リンネ（Ｈｅｌｉａ　　ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ　Ｌｉ
ｎｎ）またはアザジラクタ・インディカ　ジャス（Ａｚ
ａｄｉｒａｃｈｔａ　　１ｎｄｉｃａ　Ｊｕａｓ）とい
い、熱帯地域に自生する高さ１０ｍ以上に達する木本植
物である。

従来メリア・アザジラクタ抽出物が種々な薬理作用を有
することは知られている。即ち、メリア・アザジラクタ
の樹皮、東部、花部、梁部、枝部、根皮または樹脂を水
または親水性溶媒で抽出するかあるいは微粉砕して皮膚
化粧料を得る方法（特公昭５２−２８８５３　、同５２
−２８８５４および同５３−１０１２５）、上記メリア
・アザジラクタ原料を親水性溶媒および（または）熱水
で抽出して抗菌作用、胃腸・肝臓機能改善作用を有する
成分を得る方法（特公昭５３−１０１２４）および上記
メリア・アザジラクタ原料を疎水性溶媒で抽出して皮膚
疾患およびリュウマチの治療に有効な成分を得る方法（
特公昭５３−１３６８９）が報告されている。

しかしながら、メリア・アザジラクタ抽出物がマイトジ
ェン作用を有することはまだ報告されていない。

本発明におけ°る多糖体ＭＡ９は前記特開［６０−４５
５２１号に記載の方法によって得られる。即ち、メリア
・アザジラクタ樹皮を熱水で抽出し、抽出液を例えば次
の（Ａ）乃至（Ｃ）の方法で処理することによって得ら
れる。

（Ａ）　　上記抽出液を限外−過し、得られた限外濾過
内液に低級アルコールを加え、生成する沈澱を採取する
。

（Ｂ）　　上記抽出液を透析膜法またはアルコール沈澱
法により精製し、得られた精製物を水に溶解し、該水溶
液を分画分子吊約１Ｘ１０３〜１×１σ５乃至ｌＸ１０
３〜２　Ｘ　１０５の分子篩剤を用いて分子篩処理し、
３つに分れる多糖体画分のうち最初の画分から多糖体を
採取する。

（Ｃ）　　上記抽出液を透析膜法、アルコール沈澱法ま
たは限外濾過法で精製し、得られた精製抽出液を分画分
子量範囲の上限が７００〜ｓ、ｏｏ。

で下限が１００以下である架橋されたデキストランゲル
と接触させ、接触水溶液から多糖体を採取する。

上記の方法において、メリア・アザジラクタ樹皮を熱水
で抽出処理する操作は常法に従って行なわれる。即ち、
細断した樹皮に熱水を加えるか、あるいは、樹皮に水を
加え、その混合物を加熱沸騰させることによって実施さ
れる。抽出を１〜３気圧の加圧下に行うと多糖体の収率
および純度が向上する。加熱は沸騰水浴中または直火で
行うことができる。抽出時間は原料の品質等に従って適
宜決定されるが通常１乃至４８時間である。抽出終了後
、抽出混合物を濾過することにより熱水抽出液が得られ
る。このような熱水抽出に先立って、該樹皮を有機溶媒
および（または）常温の水で抽出前処理することにより
、不要部分を予め除去しておくことも望ましい。抽出前
処理に使用する溶媒としてはメタノール、エタノール、
プロパツール、ピリジン、アセトンのような極性有機溶
媒、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｎ−ヘキサン、ク
ロロホルム、四塩化炭素、酢酸エチルのような非極性有
機溶媒があげられる。

かくして得られた熱水抽出液は、上述した（Ａ）乃至（
Ｃ）の方法によって処理される。

上記アルコール沈澱法において、アルコールの添加をｐ
Ｈ１〜３の条件で行うと生成物の純度が一層向上する。

上記の方法によって得られる多糖体ＭＡ９は下記の物理
化学的特性を有する。

（イ）　色と形状 凍結乾燥品は白色粉末である。

（ロ）　赤外線吸収スペクトル ＩＲνに”　ｔｓ−’　：　３４００．２９３０．１６
３０ａＸ （ハ）　紫外線吸収スペクトル 水溶液中の測定で吸収極大を示さず末端吸収のみを示す
。

（ニ）　溶解性 水に可溶でメタノール、エタノール、アセトン、エーテ
ル、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼンおよびヘキサ
ン等の有機溶媒に不溶である。

（ホ）　呈色反応 フェノール硫酸反応、アンスロン硫酸反応に陽性でヨウ
素の添加により青緑色を呈する。

参考までに、上で得られた多糖体ＭＡ９を分画分子聞約
１Ｘ１Ｇ３〜２Ｘ１０５乃至ｌＸ１０３〜８×１０５の
ゲル濾過剤を充填したカラムにかけ、蒸留水で溶離する
と多糖体が２つの両分に分画される。

最初に溶出する画分を多糖体ＭＡ９ａ　、後に溶出する
多糖体をＭＡ９ｂとする。上記ゲル濾過剤としてはデキ
ストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニル系
のポリマーゲル、多孔性ガラスピーズ等が使用される。

これらは例えばセファデックスＧ−２００、セファクリ
ルＳ−３００（商品名、ファルマシア社製品、スエーデ
ン）、バイオゲルＰ−３００（商品名、バイオラッド社
製品、米国）、トヨバールＨＷ−６０（商品名、東洋曽
達工業社製品、日本）等の製品名で市販されている。

多糖体ＭＡ９ａおよび多糖体ＭＡ９ｂの構造および物理
化学特性は下記の通りである。

１１１狂人豆と イ）構造 α−（１→４）−グルカンの主鎖にアラビノースがα−
（１→６）結合し、グルコースとアラビノースの構成割
合が約５：１の中性多糖体。

口）　色と形状 凍結乾燥品は白色粉末である。

ハ）溶解性 水に可溶で、メタノール、エタノール、アセトン、エー
テル、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン及びヘキサ
ン等の有機溶媒に不溶である。

二）　￥色反応 フェノール硫酸反応、アンスロン硫酸反応に陽性でヨウ
素の添加により青緑色を呈する。

ホ）分子量 セファデックスＱ　−２００カラムゲルりロマトグラフ
ィで単一のピークを与え、分子量は約９４．０００であ
る。

へ）　比旋光度 ２５゜ 〔α）　　、　＋　１３６．０°　（Ｃ＝　０．５．　
Ｈ２０）ト）　赤外線吸収スペクトル ＩＲシＫＢｒｃｔａ−１：　３４００．２９３０．１６
２０ａｘ チ）　紫外線吸収スペクトル 水溶液中の測定で吸収極大を示さず、末端吸収のみを示
す。

す）　　Ｃ核磁気共鳴スペクトル 重水中で外部基準にＶＭＳ　（テトラメチルシラン）を
使用して測定した１００ＨＨ１１３Ｃ核磁気共鳴スペク
トルは次の通りである。

δｐｐｍ　　：　６２．１．　６２．７．　６７．３．
　７２．９．　７４．８゜７８．１．　７８．７．　８
２．４．　８５．５．　９９．２゜１０１．１．　１０
８．９ 芝慧潜ｊυ！釘Ｌ イ）　構　造 α−（１→４）−グルカンを主鎖とし、主鎖中にβ−（
１→３）フコースを含み、分枝としてα（１→６）アラ
ビノースを有し、グルコース、アラビノースおよびフコ
ースの構成割合が約５：２：１の中性多糖体。

口）　色と形状 凍結乾燥品は白色粉末である。

ハ）溶解性 水に可溶で、メタノール、エタノール、アセトン、エー
テル、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼンおよびヘキ
サン等の有機溶媒に不溶である。

二）　呈色反応 フェノール硫酸反応、アンスロン硫酸反応に陽性でヨウ
素の添加により青緑色を呈する。

ホ）分子量 セファデックスＧ　−２００カラムグルクロマトグラフ
イで単一のピークを与え、分子量は約２１　、０００で
ある。

へ）　比旋光度 ２５゜ 〔α）　　、＋１４３．７°　（Ｃ＝　０．５．　Ｈ２
０）ト）　赤外線吸収スペクトル Ｉ　Ｒｖ　ＫＢ’　ｃｍ−１：　３４００．２９３０．
１６３０ｍａ× チ）　紫外線吸収スペクトル 水溶液中の測定で吸収極大を示さず、末端吸収のみを示
す。

す）　　Ｃ核磁気共鳴スペクトル 重水中で外部基準にＴＭＳ　（テトラメチルシラン）を
使用して測定した１００）ＩＨｚ１３Ｃ核磁気共鳴スペ
クトルは次の通りである。

δｐｐｍ　：　１８．２．６２．３．６２．７．６７．
４．７１．１゜７２．０．７３．２．７４．９．７８．
３．７８．９゜８２．９．８３．９．８５．６．９９．
４．　、１０１．２゜１０５．０．　１０９．１ 本発明の多糖体ＭＡ９は上記多糖体ＭＡ９ａおよび多糖
体ＭＡ９ｂの混合物とみることができ、多糖体ＭＡ９ａ
およびＭＡ９ｂは同様の薬理活性を示した。

従ってマイトジェンとして使用する場合は多糖体ＭＡ９
をさらに多糖体ＭＡ９ａとＭＡ９ｂとに分離する必要は
なく、両者の混合物の状態で、即ち、多糖体ＭＡ９の状
態で使用するのが実際的である。

本発明の多糖体は任意所要の製剤用担体または賦形剤を
用いて錠剤、粉剤、液剤に製剤化され、それ自体公知の
方法でマイトジェンとして使用される。

次に試験例をあげて本発明の多糖体ＭＡ９がマイトジェ
ン作用を有することを示す。

試験例 マウスリンパ球に対するマイトジェン活性マウス牌臓を
とり出し、細胞を分離する。細胞を生理食塩水で洗浄し
たのち、塩化アンモニウム溶液を加えて赤血球を除く。

細胞を洗浄し、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ　Ｉ　
−１６４０培地に懸濁し、細胞の数を４ｘｉｏａ個／ｌ
１ｒ１に調整する。９６穴平型マイクロプレートの各穴
にこの懸濁液の０．１ｄずつを入れ、ここに多糖体ＭＡ
９溶液０．１ｄを加え、３７℃で４４時間、５％ＣＯ２
インキュベーター中で培養する。次に各穴に〔３日〕−
チミジン１μＣ１を加え、さらに４時間培養する。この
のち、セルハーベスタ−により各穴の細胞をグラスフィ
ルター上に集め、３〜４回水で洗浄し、乾燥させたのち
、フィルター上のアイソトープ量を測定する。結果を表
１に示す。表１に示すようにＣ３Ｈ／Ｈｅ　Ｎマウス牌
細胞に対し多糖体ＭＡ９５０μｇ／ｍで無添加（コント
ロール）の１０．３倍、５００μ９／ｄで３５．９倍と
明らかにリンパ球マイトジェン活性を示す。これはしＰ
Ｓの１０，４倍より高活性である。Ｃ３Ｈ／Ｈｅ　Ｊマ
ウスはＬＰＳにレスポンスしないことが知られているが
、この牌細胞試料もコントロールの１．０倍と確かにレ
スポンスしていない。これに対してＭＡ９はマイトジェ
ン活性をもつことから当試料にはＬＰＳの環境からのコ
ンタミネーションのないことを示している。

ＢＡ、ＬＢ／ｃ　（ｎｕ／ｎｕ）　マウスは成熟ＴＩｍ
胞が欠如している変異マウスであり、リンパ球はほとん
どがＢ細胞である。これに対し、Ｔｅｌ胞マイトジェン
であるＣ０ｎＡ（コンカナバリンＡ）は〔３Ｈ〕−チミ
ジンのとり込みがないこと、Ｂ細胞マイトジェンである
ＬＰＳにはとり込みがあることそしてＭＡ９にもとり込
みがあることがらＭＡ９はＢ細胞マイトジェンであるこ
とがわかる。ＢＡＬＢ／　ｃ　（ｔｈｙｖＪｓ）は牌臓
でなく胸腺細胞を用いた。

胸腺にはＴ細胞がほとんどであり、これに対してＣ０ｎ
Ａのマイトジェン活性は強く、ＬＰＳおよびＭＡ９の活
性はほとんどない。このことがらＭＡ９はＴ細胞には作
用しにくいことがわかる。

以上の結果を総合して、多糖体ＭＡ９はリンパ球のＢ細
胞に対して特異的にマイトジェン作用を有し、■細胞に
対しては無効であることが明らかである。

表　　　　　１ リンパ球への〔３日〕−チミジンの取り込み多糖体ＭＡ
９を体重２０±１３のＩＣＲ雄性マウスに投与して急性
毒性試験を行なった結果、［Ｄ５−は腹腔内投与で６０
０１Ｎ９／に９以上、経口投与では１０００１！！Ｊ／
Ｎ１９以上であった。

■６発明の具体的作用効果 本発明によれば、多糖体ＭＡ９からなるマイトジェンが
提供される。本発明のマイトジェンはリンパ球のＴ細胞
には活性を有せずＢ細胞に特異的に活性を有する。多糖
体ＭＡ９はメリア・アザジラクタ樹皮の熱水抽出物から
得られる多糖体であって工業的な生産が容易である。さ
らに、本発明の多糖体ＭＡ９は毒性が非常に低い。従っ
て本発明のマイトジェンは免疫医学分野において安全な
試薬として有利に使用される。

特許出願人　　　テ　ル　七　株　式　会　社（外２名
）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記のイ）および／またはロ）の多糖体を含有するリン
   パ球Ｂ細胞の細胞分裂誘発剤。 イ）α−（１→４）−グルカンの主鎖にアラビノースが
   α−（１→６）結合し、グルコースとアラビノースの構
   成割合が約５：１の中性多糖体。 ロ）α−（１→４）−グルカンを主鎖とし、主鎖中にβ
   −（１→３）フコースを含み、分枝としてα−（１→６
   ）アラビノースを有し、グルコース、アラビノースおよ
   びフコースの構成割合が約５：２：１の中性多糖体。