JPS6210208B2

JPS6210208B2 -

Info

Publication number: JPS6210208B2
Application number: JP53013604A
Authority: JP
Inventors: Sadayoshi Horiguchi; Akio Hasegawa
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1978-02-10
Filing date: 1978-02-10
Publication date: 1987-03-05
Also published as: JPS54107511A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、動物に由来する細胞を利用して、高
収率でプラスミノーゲン活性化因子を製造する方
法に関するものである。

従来、プラスミノーゲン活性化因子の工業的製
造方法としては、人尿より単離精製する方法がよ
く知られている。

しかしながら、人尿を原料とする従来の方法
は、原料の品質が不安定であり、衛生上問題も大
きく、かつ健康人の尿を大量に入手することが困
難である等の欠点を有していた。そこで、このよ
うな欠点を解決する方法として、本発明者らは、
動物に由来するプラスミノーゲン活性化因子を生
成することが知られていることに注目した。この
方法は一定した品質の原料を大量に、汚染の危険
なく供給することが可能であり、その工業化技術
の確立が期待される。

本発明者らは、これらの問題を解決すべく細胞
を用いてプラスミノーゲン活性化因子を製造する
方法について鋭意研究を重ねた結果、動物に由来
する細胞と接触してプラスミノーゲン活性化因子
を生成せしめる溶液に、多量のスレオニンを存在
させることによつて、該因子の生成量が飛躍的に
増加することを見出し、この知見に基づいて本発
明をなすに至つた。

本発明は、動物に由来する細胞であつてプラス
ミノーゲン活性化因子を生成する能力を有する細
胞を、0.1ないし4.0％（wt／ｖ）のスレオニンを
含有する溶液と接触させることを特徴とするプラ
スミノーゲン活性化因子の製造方法である。

本発明で用いられる細胞は、動物に由来する細
胞であつてプラスミノーゲン活性化因子を生成す
る能力を有する細胞が対象となる。このようなも
のとしては、たとえば、マウス胎児の肺由来の細
胞、マウスの全胎児由来の細胞、アフリカミドリ
ザルの腎由来の細胞、赤毛猿の腎由来の細胞、人
胎児の腎由来の細胞、人胎児の肺由来の細胞、人
の全胎児由来の細胞、人胎児の皮膚由来の細胞、
人の胎盤由来の細胞、豚の腎由来の細胞、人成人
の脾臓由来の細胞、人成人の腎由来の細胞、人成
人の肺由来の細胞、人成人の甲状線由来の細胞、
人胎児の心臓由来の細胞、人胎児の輸尿管由来の
細胞、人成人の心臓由来の細胞、人成人の輸尿管
由来の細胞、犬の腎由来の細胞、人の表皮ガン由
来の細胞をあげることができる。これらの細胞は
通常の動物細胞の培養に用いられる培養方法、た
とえば「組織培養」（中井準之助他編集昭和51年
刊朝倉書店）記載の方で増殖させた後、本発明に
供することが好ましい。

細胞は炭素源、窒素源および必要な場合は、無
機塩類または／およびその他の添加物を含む溶液
と接触させることによつて、プラスミノーゲン活
性化因子を生産せしめることができる。この方法
は既に公知であつて、たとえばエム・ビー・ベル
ニクらの報告（J.Lab.＆Clin.Med.70巻650頁1967
年）などで知られているが、さらに本発明の方法
にしたがつてスレオニンを0.1ないし0.4％（wt／
ｖ）添加することによつて、プラスミノーゲン活
性化因子の生成量を飛躍的に向上させることがで
きる。

該因子の生産は15℃ないし45℃、好ましくは25
℃ないし40℃の範囲で行われる。生産のPHは５な
いし９、好ましくは６ないし８に調節される。生
産の日数は通常４日ないし30日であるが、30日を
超えることも可能である。該因子の生産速度は、
生産の後半では次第に遅くなるので、工業的生産
の場合は最も効率の良い日数が選ばれる。

プラスミノーゲン活性化因子は、前記の条件下
で細胞から溶液中に放出される。その生成量は、
西崎・川村の方法（医薬品研究第５巻295頁1974
年）の平板法によつて測定され、所望の生成量ま
たは日数に達した時に溶液を採集して該因子を回
収する。

プラスミノーゲン活性化因子の回収は、該因子
の回収方法として通常用いられる吸着法、塩析
法、透析法、クロマトグラフイー法、ゲル過法
などを単独であるいは組合せて適用すればよい。
そのような例としては、ハイドロキシアパタイ
ト、硫酸バリウム等を用いる吸着法、硫酸アンモ
ニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化
アンモニウム等による塩析法、ジエチルアミノエ
チルセルロース等によるクロマトグラフイー法、
アクリルアミドゲル、修飾デキストランゲル等に
よるゲル過法、あるいは特公昭48−10232号、
特開昭52−7485号で開示された方法などを挙げる
ことができる。

このようにして得られた物質は、プラスミノー
ゲンを含まないフイブリンを溶解せず、プラスミ
ノーゲン活性化因子であることを示す。

本発明の方法は、従来法の欠陥である原料尿の
濃度が低いこと、健康な者の品質の安定した尿を
大量に集めることが難かしいこと、取扱い上で衛
生上の問題があること等の難点が除かれ、品質の
安定した濃度の高い原料液を大量に安定供給する
ことができ、工業的なプラスミノーゲン活性化因
子の製造方法として好適である。

次に実施例によつて本発明をさらに詳細に説明
する。

実施例１十分に生育したマウス胎児の肺細胞に、表１に
示す組成の溶液を与え、５％の炭酸ガスを含む空
気中で37℃に10日間保持し、溶液のプラスミノー
ゲン活性化因子を測定した。スレオニンを23.8
mg／Ｌ含む対照区の該因子生成量が60CTA※／
mlであるのに対して、スレオニンを5000mg／Ｌ含
む場合は130CTA／mlの生成量を示し、その効果
は顕著であつた。

表１アミノ酸 mg／ＬＬ−アルギニン塩酸塩 21.1 Ｌ−シスチン 12.0 Ｌ−グルタミン 292.0 Ｌ−ヒスチジン塩酸・１水塩 10.5 Ｌ−イソロイシン 26.2 Ｌ−ロイシン 26.2 Ｌ−リジン塩酸塩 36.5 Ｌ−メチオニン 7.5 Ｌ−フエニルアラニン 16.5 Ｌ−トリプトフアン 4.0 Ｌ−チロシン 18.1 Ｌ−バリン 23.4 Ｌ−スレオニン 5000.0 ビタミンＤ−ビオチン 1.0 Ｄ−Ca−パントテン酸 1.0 塩化コリン 1.0 葉酸 1.0 ｉ−イノシトール 1.8 ニコチンアミド 1.0 ピリドキサール塩酸塩 1.0 リボフラビン 0.1 チアミン塩酸塩 1.0 ※CTA ザ・コミテイー・オン・スロンボリテ
イツク・エージエンツ・オブ・ザ・ナシヨナ
ル・ハート・インステイチユートによる単位実施例２十分生育したアフリカミドリザルの腎臓細胞
（フロー・ラボラトリーズ社製）に、表２に示す
栄養液を与え、５％の炭酸ガスを含む空気中で37
℃に10日間保持した。栄養液中のプラスミノーゲ
ン活性化因子を測定した結果を第１図に示した。
スレオニン濃度が0.1ないし４重量％の範囲で
は、含有しないものゝ1.5〜2.5倍の生成量を示し
た。

表２ mg／Ｌ NaCl 8000.0 KCl 400.0 Na₂HPO₄・2H₂O 60.0 KH₂PO₄ 60.0 MgSO₄・7H₂O 100.0 CaCl₂（無水） 140.0 グルコース 1000.0 MgCl₂・6H₂O 100.0 NaHCO₃ 350.0 ラクトアルブミン加水分解物 5000.0 Ｌ−スレオニン０〜50（ｇ／Ｌ）実施例３十分生育したヒトの腎臓細胞（フロー・ラボラ
トリーズ社製）に、表２で示した栄養液を与え、
５％の炭酸ガスを含む空気中で37℃に10日間保持
した。栄養液中のプラスミノーゲン活性化因子を
測定した結果を第２図に示す。スレオニンの含量
0.1ないし4.0％の範囲では、特に著しい生成量の
増加がみられる。

実施例４十分生育したヒトの肺細胞（フロー・ラボラト
リーズ社製）に、表３に示す栄養液を与え、５％
の炭酸ガスを含む空気中で37℃に10日間保持し
た。栄養液中のプラスミノーゲン活性化因子を測
定した結果を第３図に示す。スレオニン含量0.1
ないし4.0％の範囲で特に著しい生成量の増加が
みられる。

表３アミノ酸 mg／ＬＬ−アラニン 25.0 Ｌ−アルギニン塩酸塩 70.0 Ｌ−アスパラギン酸 30.0 Ｌ−システイン塩酸塩 0.1 Ｌ−シスチン 20.0 Ｌ−グルタミン酸 67.0 Ｌ−グルタミン 100.0 Ｌ−グリシン 50.0 Ｌ−ヒスチジン塩酸・一水塩 22.0 Ｌ−ヒドロキシプロリン 10.0 Ｌ−イソロイシン 20.0 Ｌ−ロイシン 60.0 Ｌ−リジン塩酸塩 70.0 Ｌ−メチオニン 15.0 Ｌ−フエニルアラニン 25.0 Ｌ−プロリン 40.0 Ｌ−トリプトフアン 10.0 Ｌ−チロシン 40.0 Ｌ−バリン 25.0 Ｌ−セリン 25.0 Ｌ−スレオニン０〜50ｇ／Ｌビタミン mg／ＬＰ−アミノ安息香酸 0.050 アスコルビン酸 0.050 Ｄ−ビオチン 0.010 カルシフエロール 0.100 Ｄ−Ca−パントテン酸 0.010 コレステロール 0.200 塩化コリン 0.500 葉酸 0.010 ｉ−イノシトール 0.050 メナジオン 0.010 ニコチンアミド 0.025 ニコチン酸 0.025 ピリドキサール塩酸塩 0.025 ピリドキシン塩酸塩 0.025 リボフラビン 0.010 チアミン塩酸塩 0.010 DL−α−トコフエロール燐酸（Na₂） 0.010 ツウイン80 5.000 ビタミンＡ 0.100 その他 mg／Ｌアデニン塩酸・２水塩 12.10 AMP 0.20 ATP 1.00 デオキシリボース 0.50 デキストロース 1000.00 Ｌ−グルタチオン 0.05 グアニン塩酸・１水塩 0.33 ハイポキサンチン 0.30 リボース 0.50 酢酸ナトリウム・３水塩 83.00 チミン 0.30 ウラシル 0.30 キサンチン 0.30 Fe（NO₃）₃・9H₂O 0.70 NaCl 8000.00 KCl 400.00 Na₂HPO₄・2H₂O 60.00 KH₂PH 60.00 MgSO₄・7H₂O 100.00 CaCl₂（無水） 140.00 MgCl₂・6H₂O 100.00 NaHCO₃ 350.00

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２の結果を示すグラフで、横軸
がスレオニンの濃度、縦軸がプラスミノーゲン活
性化因子の生産量を示す。第２図は実施例３の結
果を示すグラフで、横軸がスレオニンの濃度、縦
軸がプラスミノーゲン活性化因子の生産量を示
す。第３図は実施例４の結果を示すグラフで、横
軸がスレオニンの濃度、縦軸がプラスミノーゲン
活性化因子の生産量を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１動物に由来する細胞であつてプラスミノーゲ
ン活性化因子を生成する能力を有する細胞を、
0.1ないし4.0％（wt／ｖ）のスレオニンを含有す
る溶液と接触させることを特徴とするプラスミノ
ーゲン活性化因子の製造法。