JPH0143549B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヒトに由来する細胞を利用して、高
収率でプラスミノーゲン活性化因子を製造する方
法に関するものである。 プラスミノーゲン活性化因子としては今日、尿
または培養腎細胞から分離精製されたウロキナー
ゼ、およびストレプトコツキより採取されるスト
レプトキナーゼが血栓溶解剤として実用に供され
ている。 しかし、これらはフイブリンに対する親和性の
点で劣るので、治療に際し必要な効果を得るには
大量に投与する場合が多く、内出血等の副作用が
発現することが知られている。すなわち、これら
によつて循環血液中で生成されるプラスミンは、
血中のプラスミンインヒビターと結合して速やか
に失活するため、治療効果をあげるためには、こ
れらを大量に投与して、血中のプラスミンインヒ
ビターの量を上回るプラスミンを生成する必要が
ある。しかし、大量のプラスミンが生成されると
フイブリノーゲンを分解して、出血傾向という副
作用を引き起すことになる。これに対してフイブ
リンに親和性が高く、フイブリン上でプラスミン
を生成することができれば、循環血液中のプラス
ミンインヒビターの影響を受けることなく、少量
でフイブリンを分解することができ、循環血液中
のフイブリノーゲンを分解する作用も弱くなる。
かかる実情から、フイブリン親和性が高く、少量
でかつ血栓溶解活性が高く、副作用の少ない血栓
溶解剤が望まれている。 一方、本発明者らの一人は、人の正常組織由来
細胞の組織培養液中に、下記の性質を有する新プ
ラスミノーゲン活性化因子を見出し、すでに特許
出願した（特願昭57−133633号）。 (a) 分子量：50000〜80000 (b) 等電点：7.0〜8.5 (c) フイブリンに対する親和性：あり (d) コンカナバリンＡに対する親和性：あり (e) 至適PH：７〜9.5 (f) 安定性：60℃、10時間で失活せず、PH２〜
３、98℃、１分で約５％失活 この新プラスミノーゲン活性化因子は、フイブ
リン親和性が高く、少量で効果を有する特徴を持
つている（以下、新プラスミノーゲン活性化因子
と呼ぶ）。 本発明者らは、新プラスミノーゲン活性化因子
を効率的に製造する方法について鋭意研究を重ね
た結果、ヒトに由来する二倍体細胞と接触して新
プラスミノーゲン活性化因子を生成せしめる溶液
に、多量の動物肉酵素分解ペプトンを存在させる
ことによつて、該因子の生成量が飛躍的に増加す
ることを見出し、この知見に基づいて本発明をな
すに至つた。 本発明は、ヒトに由来する正常二倍体細胞であ
つて新プラスミノーゲン活性化因子を生成する能
力を有する細胞を、動物肉酵素分解ペプトンを含
有する溶液と接触させることを特徴とする新プラ
スミノーゲン活性化因子の製造方法である。さら
に、本発明で用いられる動物肉酵素分解ペプトン
の濃度は、0.1ないし4.0％（wt／ｖ）の範囲であ
ることがより好ましい。 本発明で用いられる細胞は、ヒトに由来する正
常二倍体細胞であつて、新プラスミノーゲン活性
化因子を生成する能力を有する細胞が対象とな
る。このようなものとしては、たとえば、ヒトの
腎、腸、肺、心臓、輸尿管、皮膚、包皮、舌、甲
状腺、胎盤、子宮由来の細胞および全胎児由来の
細胞をあげることができる。より好ましい細胞と
しては、ヒト肺または包皮由来の正常二倍体細胞
があげられる。ここでヒト由来の細胞とは、胎児
および新生児由来の細胞を含む。 これらの細胞は通常の細胞の培養に用いられる
培養方法、たとえば「組織培養」（中井準之助他
編集昭和51年刊朝倉書店）記載の方法で増殖させ
た後、本発明に供することが好ましい。 細胞は炭素類、窒素類および必要な場合は、無
機塩類または／およびその他の添加物を含む溶液
と接触させることによつて、新プラスミノーゲン
活性化因子を生産せしめることができる。さらに
本発明の方法にしたがつて、動物肉酵素分解ペプ
トンを添加することにより、新プラスミノーゲン
活性化因子の生成量を飛躍的に向上させることが
できる。 本発明において用いられる動物肉酵素分解ペプ
トンは、一般に細菌の培養培地に用いられるもの
であり、通常プロテオースペプトン、プロテオー
ゼペプトン、獣肉ペプトンと呼ばれるものであ
る。この動物肉酵素分解ペプトンの調製法は公知
であり、たとえば「細菌培地学講座第二集」（坂
崎利一著、納谷書店、1967年刊）記載の方法にし
たがえばよい。すなわち、動物肉としては、牛、
豚、ニワトリ、羊、クジラなどの肉または内蔵が
用いられるが、このうち牛肉が最もふつうに用い
られる。分解用の酵素としては、トリプシン、パ
パイン、ペプシン、パンクレアチンなどがある。
これらの動物肉は細挫され、水と混合され、炭酸
ナトリウム、濃塩酸などで酵素分解に適したPHに
調整される。これに酵素を加え、20〜40℃で１〜
20日間、通常は37℃で２〜３日間酵素分解を行な
う。消化後は分解酵素を不活性化するためと、未
消化のタンパクを熱凝固させるために100℃以上
に加熱し、過によつてこれを除去したのち、濃
縮、乾燥、細末化する。濃縮、乾燥の方法には、
煮つめて粉末にするのと、真空装置を用いて低温
で濃縮後細末化するのがある。市販品としてはデ
イフコ（Difco）社のプロテオースペプトン
（Proteose Peptone）、プロテオースペプトンNo.
２、プロテオースペプトンNo.３、チオペプトン
（Thiopeptone）、オキソイド（Oxoid）社のプロ
テオースペプトンL46、ペプトンPL46、BBL社
のチオトン（Thiotone）、大五栄養化学社のプロ
テオースペプトンなどがある。 該因子の生産は15℃ないし45℃、好ましくは25
℃ないし40℃の範囲で行なわれる。生産のPHは５
ないし９、好ましくは６ないし８に調節される。
生産の日数は通常４日ないし30日であるが、30日
を超えることも可能である。該因子の生産速度
は、生産の後半では次第に遅くなるので、工業的
生産の場合は最も効率の良い日数が選ばれる。 新プラスミノーゲン活性化因子は、前記の条件
下で細胞から溶液中に放出される。その生成量の
測定は、次の方法で行なつた。 95％凝固フイブリノーゲン（プラスミノーゲン
含量約50カゼイン単位／ｇ凝固蛋白）を原料とし
て作製した寒天加フイブリン平板を用い、ウロキ
ナーゼを標準品とするプレート法で測定した。該
因子の溶液を、１％ゼラチン、0.1M塩化ナトリ
ウムおよび0.1％窒化ナトリウムを含む0.067Mト
リス塩酸緩衝液（PH8.0）で希釈し、フイブリン
平板上で10IU／mlのウロキナーゼと同じ溶解窓
を示す該因子溶液の濃度を10U／mlとした。ウロ
キナーゼが混入する溶液を測定する場合には、ウ
サギより得た抗ウロキナーゼIgGを100μｇ／mlに
なるように被験溶液に添加して測定した。 所望の生成量または日数に達した時に、溶液を
採集して該因子を回収する。 新プラスミノーゲン活性化因子の回収は、蛋白
質の回収方法として通常用いられる吸着法、塩析
法、透析法、クロマトグラフイー法、ゲル過法
などを単独であるいは組合せて適用すればよい。
そのような例としては、ハイドロキシアパタイ
ト、硫酸バリウム等を用いる吸着法、硫酸アンモ
ニウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化
アンモニウム等による塩析法、ジエチルアミノエ
チルセルロース等によるクロマトグラフイー法、
アクリルアミドゲル、修飾デキストランゲル等に
よるゲル過法などを挙げることができる。 新プラスミノーゲン活性化因子の具体的な分離
精製方法の一例を挙げれば、組織培養液あるいは
濃縮した培養液に硫酸アンモニウムを加えて生ず
る沈澱を分取し、塩化ナトリウムを加えたロダン
アンモニウム溶液に溶解させ、抗ウロキナーゼIg
−Ｇセフアロースカラムに通し、フイブリンセフ
アロースカラムに吸着させる。これをアルギニン
を溶出溶媒として用いて得られる溶出液を、凍結
乾燥処理し濃縮する。 濃縮液をセフアデツクスＧ−150（フアルマシア
社登録商標）を用いゲル過することにより、目
的のプラスミノーゲン活性化因子が得られる。本
物質はプラスミノーゲンを含まないフイブリンは
溶解せず、プラスミノーゲンを含むフイブリンを
溶解することから、プラスミノーゲン活性化因子
であることは明らかである。 かくして得られる本発明のプラスミノーゲン活
性化因子の物理化学的性質は、特願昭57−133633
号記載の方法で測定することができ、その性質は
先に述べた通りである。 かくして得られた新プラスミノーゲン活性化因
子の用途としては、血栓溶解剤としての医薬用途
以外に、たとえば、人工血管、人工臓器等の材料
に結合させ、血栓の形成を防止する薬剤として、
あるいは血栓症等の診断薬としての用途があげら
れる。 本発明の方法は、従来、プラスミノーゲン活性
因子の最も有力な製造法の欠点であつた尿中の該
因子の濃度が低いこと、健康な者の品質の安定し
た尿を大量に集めることが難かしいこと、取扱い
上で衛生上の問題があること等の難点が除かれ、
品質の安定した濃度の高い原料液を大量に安定供
給することができ、工業的なプラスミノーゲン活
性化因子の製造方法として好適である。 次に実施例によつて本発明をさらに詳細に説明
する。 実施例 １ よく細挫した牛肉500ｇを精製水1000ml中に入
れ、濃塩酸12.5mlを加えたのち、ペプシン６ｇを
加えて37℃で２日間、ときどき振りながら消化し
た。この消化液を100℃に５分間加熱し、過後、
水酸化ナトリウムを用いてPHをほぼ中性とした。
この液を45℃に保ちながらロータリーエバポレー
ターで濃縮、乾燥して、淡黄かつ色の牛肉ペプシ
ン分解ペプトン130ｇを得た。 次に、ヒト胎児肺由来の正常二倍体細胞（フロ
ー・ラボラトリー社）に対する牛肉ペプシン分解
ペプトンの新プラスミノーゲン活性化因子生成促
進効果について調べた。直径100mmのプラスチツ
クシヤーレ（フアルコン社）の中で十分生育した
ヒト胎児肺細胞に、表１に示す組成の溶液を与
え、５％の炭酸ガスを含む空気中で37℃に保持
し、溶液の新プラスミノーゲン活性化因子を測定
した。その結果を表２に、牛肉ペプシン分解ペプ
トンを含まない対照試験と共に示した。牛肉ペプ
シン分解ペプトンを含有する場合は、無添加に比
べ生成量が著しく向上した。 表 １ アミノ酸 mg／Ｌ Ｌ−アルギニン塩酸塩 21.1 Ｌ−シスチン 12.0 Ｌ−グルタミン 292.0 Ｌ−ヒスチジン塩酸・１水塩 10.5 Ｌ−イソロイシン 26.2 Ｌ−ロイシン 26.2 Ｌ−リジン塩酸塩 36.5 Ｌ−メチオニン 7.5 Ｌ−フエニルアラニン 16.5 mg／Ｌ Ｌ−スレオニン 23.8 Ｌ−トリプトフアン 4.0 Ｌ−チロシン 18.1 Ｌ−バリン 23.4 Ｌ−セリン 30.2 ビタミン Ｄ−ビオチン 1.0 Ｄ−Ca−パントテン酸 1.0 塩化コリン 1.0 葉 酸 1.0 ｉ−イノシトール 1.8 ニコチンアミド 1.0 ピリドキサール塩酸塩 1.0 リボフラミン 0.1 チアミン塩酸塩 1.0 その他 NaCl 8000.0 KCl 400.0 Na₂HPO₄・2H₂O 60.0 KH₂PO₄ 60.0 MgSO₄・7H₂O 100.0 CaCl₂（無水） 140.0 グルコース 1000.0 MgCl₂・6H₂O 100.0 NaHCO₃ 350.0

【表】 実施例 ２ 十分生育したヒト胎児包皮由来の正常二倍体細
胞（フロー・ラボラトリー社）に、牛肉ペプシン
分解ペプトンを種々濃度添加した表３に示す栄養
液を与え、５％の炭酸ガスを含む空気中で37℃に
７日間保持した。栄養液中の新プラスミノーゲン
活性化因子を測定した結果を図面に示す。ペプト
ン含量1.0ないし4.0％の範囲で著しい生成量の増
加が見られた。 表 ３ アミノ酸 mg／Ｌ Ｌ−アラニン 25.0 Ｌ−アルギニン塩酸塩 70.0 Ｌ−アスパラギン酸 30.0 Ｌ−システイン塩酸塩 0.1 Ｌ−シスチン 20.0 Ｌ−グルタミン酸 67.0 Ｌ−グルタミン 100.0 Ｌ−グリシン 50.0 Ｌ−ヒスチジン塩酸・１水塩 22.0 Ｌ−ヒドロキシプロリン 10.0 Ｌ−イソロイシン 20.0 Ｌ−ロイシン 60.0 Ｌ−リジン塩酸塩 70.0 Ｌ−メチオニン 15.0 Ｌ−フエニルアラニン 25.0 Ｌ−プロリン 40.0 Ｌ−トリプトフアン 10.0 Ｌ−チロシン 40.0 Ｌ−バリン 25.0 Ｌ−スレオニン 30.0 Ｌ−セリン 25.0 ビタミン mg／Ｌ ｐ−アミノ安息香酸 0.050 アスコルビン酸 0.050 Ｄ−ビオチン 0.010 カルシフエロール 0.100 Ｄ−Ca−パントテン酸 0.010 コレステロール 0.200 塩化コリン 0.500 葉 酸 0.010 ｉ−イノシトール 0.050 メナジオン 0.010 ニコチンアミド 0.025 ニコチン酸 0.025 ピリドキサール塩酸塩 0.025 ピリドキシン塩酸塩 0.025 リボフラビン 0.010 チアミン塩酸塩 0.010 DL−α−トコフエロール燐酸（Na₂） 0.010 ツウイン80 5.000 ビタミンＡ 0.100 その他 mg／Ｌ アデニン塩酸・２水塩 12.10 AMP 0.20 ATP 1.00 デオキシリボース 0.50 デキストロース 1000.00 Ｌ−グルタチオン 0.05 グアニン塩酸・１水塩 0.33 ハイホキサンチン 0.30 リボース 0.50 酢酸ナトリウム・３水塩 83.00 チミン 0.30 ウラシル 0.30 チサンチン 0.30 Fe（NO₃）₃・9H₂O 0.70 NaCl 8000.00 KCl 400.00 Na₂HPO₄・2H₂O 60.00 KH₂PO₄ 60.00 MgSO₄・7H₂O 100.00 CaCl₂（無水） 140.00 MgCl₂・6H₂O 100.00 NaHCO₃ 350.00 実施例 ３ 本実施例では、種類の異なる動物肉酵素分解ペ
プトンのヒト胎児肺由来正常二倍体細胞またはヒ
ト胎児包皮由来正常二倍体細胞に対する新プラス
ミノーゲン活性化因子生成促進効果について調べ
た。 クジラ肉ペプシン分解ペプトンは実施例１と同
様の方法で、500ｇのクジラ肉から84ｇの同ペプ
トンを作製した。 牛肉パンクレアチン分解ペプトンは、細挫した
牛肉500ｇを精製水1000ml中に入れ、炭酸ナトリ
ウムでPHを約８としたのち、パンクレアチン15ｇ
を加えて37℃で２日間消化して作製した。消化後
の処理は実施例１の同じ方法で、同ペプトン110
ｇを得た。 市販の動物肉酵素分解ペプトンであるプロテオ
ースペプトンおよびラクトアルブミン加水分解物
は、デイフコ社より購入した。 これらのペプトンをそれぞれ１％（wt／ｖ）
含有する表３に示す組成の培地を準備した。 ヒト胎児肺細胞またはヒト胎児包皮細胞を直径
100mmのプラスチツクシヤーレ（フアルコン社）
中で十分増殖させた後、上記培地におきかえ、５
％の炭酸ガスを含む空気中で37℃に10日間保持
し、新プラスミノーゲン活性化因子生成量を測定
し、結果を表４に示した。 動物肉を原料としないタンパク分解物であるラ
クトアルブミン加水分解物（デイフコ社）でも新
プラスミノーゲン活性化因子生成促進効果は見ら
れたが、動物肉を原料とするペプトン類は、これ
をさらに上回る著しい効果が見られた。

【表】 実施例 ４ 本実施例では、種類の異なる細胞に対する牛肉
パンクレアチン分解ペプトンの新プラスミノーゲ
ン活性化因子生成促進効果について述べる。 方法は種々の細胞を100mmプラスチツクシヤー
レで十分増殖させた後、表１に示した組成の栄養
液、またはこれに１％ラクトアルブミン加水分解
物あるいは１％牛肉パンクレアチン分解ペプトン
を添加した栄養液におきかえ、５％炭酸ガスを含
む空気中で、37℃で７日間保持した。栄養液中の
プラスミノーゲン活性化因子を測定した結果を表
５に示す。 いずれの細胞においても著しい生成量の増加が
見られる。

【表】 【図面の簡単な説明】

図面は実施例２において栄養液中の新プラスミ
ノーゲン活性化因子を測定した結果を示すグラフ
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒトに由来する正常二倍体細胞であつて、下
   記の性質を有するプラスミノーゲン活性化因子を
   生成する能力を有する細胞を、動物肉酵素分解ペ
   プトンを含有する溶液と接触させることを特徴と
   する該プラスミノーゲン活性化因子の製造法。 (a) 分子量：50000〜80000 (b) 等電点：7.0〜8.5 (c) フイブリンに対する親和性：あり (d) コンカナバリンＡに対する親和性：あり (e) 至適PH：７〜9.5 (f) 安定性：60℃、10時間で失活せず、PH２〜
   ３、98℃、１分間で約５％失活 ２ 動物肉酵素分解ペプトンを含有する溶液の該
   ペプトン濃度が0.1〜４％（wt／ｖ）である特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ 正常二倍体細胞がヒト由来の肺細胞または包
   皮細胞である特許請求の範囲第１項記載の製造
   法。