JPS615727A - 植物組織培養増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、植物組織の培養増殖方法に関するものである
。

更に詳しく述べるならば、本発明は、「試験管内」増殖
培地で作られた新芽のがたまりを無菌状態で、かつ、す
くなくとも半自動的に分離したのち、成長ないしは増殖
培地へ無菌状態で移転させることを含む方法に関するも
のである。

植物組織を培養増殖させるための従来方法は、文献類で
広範に実施、再検討が行われている。例えば、現在実施
されている方法は、Ｗｅｔｈｅｒｅｌ　１著　−「試験
管内増殖Ｊ　（Ａｖｅｒｙ　１９８２　）や、Ｂ　、　
Ｖ、　Ｃｏｎｇｅｒ編「試験管内技法による農作物のク
ローニング」（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　１９８１　）や、
Ｔ、　Ａ、　Ｔｈｏｒｐｅ著「植物組織の培養−農業に
おける方法と応用」（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　
、　１９８１　）　　に記載されている。

単純に見た場合、「試験管内」増殖は、植物の一部を無
菌的に除去したのち、成長および／または増殖を起させ
る養素培地に該植物を置くことからなっている。更に詳
しく言えば、植物組織培養を３つの主要な段階順に分け
ることができる。第１段階の目的は、急速に発育する無
菌培養を開始させることにある。この培養は、多数の植
物器官よシ開始させることができる。

典型的には、外植を表面殺菌してから、無菌状態で取扱
う。殺菌処理後、外植を無菌蒸溜水で数回水洗いし、′
無菌の道具を用いて所望の区分に切断する。次いで、外
植を培養容器内に培地と接触させて配置し、該容器は光
量、光周期、および、温度を制御した培養室内に置く。

培養室内で約６ないし８週間を経た後、発育した外植品
を使用して「試験管内」増殖段階を開始させる。ここで
、発育した外植は、培養容器から無菌的に取出し、必要
に応じて、トリミングや分割を行う。その後、増殖を誘
起させるのに適したホルモン組成物および他の組成物を
含む、培養容器内の、培地上に置き、該容器を培養室に
戻す。

培養室内の培地上で更に６ないし８週間程経過させた後
、該組織を無菌的に培養容器から取出し、分割し、新し
い培地に移し、再び培養室に戻す。

この転地は、根の有無にかかわらず、温室環境への移転
に耐えるような新芽の発育を誘起させるように調製され
た成育培地に対するもの、あるいは、更に増殖を行わせ
るため再度増殖培地に対するもの、いずれであってもよ
い。該増殖段階（第■段）を経て組織培養を繰返し循還
させることにより急速な増殖を行うことができる。これ
は「試験管内」増殖の主たる利点の一つである。しかし
ながら、この手順は極めて労働集約的な作業であり、「
試験管内」で植物を栽培するコストの６０ないし６５チ
が賃金、給料ならびに付帯費用として費されると算定さ
れている（参考文献：　Ｗ、　Ｃ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ　
。

Ｇ、　Ｗ、　Ｍｅａｇｈｅｒ　、　Ａ、　Ｇ、　Ｎｅ１
ｓｏｎ共著［組織培養によるブロッコリ植物の増殖コス
トについて」−Ｈｏｒｔｓｃｉｅｎｃｅ　１２．　ｐｐ
５４３〜５４４．１９７２　；　Ａ。

Ｄｏｎｎａｎ　、　Ｊｒ、　、　Ｓ、　Ｅ、　Ｄａｖｉ
ｄｓｏｎ　、　Ｃ，Ｌ、　Ｗｉ　１１　ｉａｍｓ共著「
温室環境における組織成育植物の確立」−Ｐｒｏｃ、　
Ｆｌａ、　５ｔａｔｅ、　Ｈｏｒｔ、　Ｓｏｃ、　、　
９１．　ｐｐ２３５〜２３７゜１９７８）。したがって
、労務関係の出費を減らそうとする試みが多々行われて
きた。

このよう力試みの一つとしては、Ｒｏｎ　Ｃ，Ｃｏｏｋ
ｅによる「プラチセリウムおよびダバリアの組織培養増
殖における一助としての均質化」　−Ｈｏｒｔｓｃｉｅ
ｎｃｅ　１４．　ｐｐ２１〜２２．１９７９という研究
がある。この研究では、シダの組織培養の増殖段階で行
う手作業による金製と転移に代えて、無菌状態での均質
化と新鮮な培地への容積移転を行った。

最初、これらの知見は、成る形式のブレンデングおよび
チョッピング作業が部分的に自動化された「試験管内」
増殖計画の基礎になシ得るという可能性を生じさせたが
、実験室での試験、研究の結果、Ｃ００ｋｅの作業手順
は次に述べるような理由　。

てこの目的にそぐわないことを示した。

■、ホモジネートの汚染が起りやすい。

■、成る原種（シダ類、フィクス、リリウム、および、
フィロプントロンについて試験した）にとっては、培養
容器内で高密度の成育を行わせるに充分な濃度としたホ
モジネートは粘度が高すぎて容積的分配を行ない得ない
。このホモジネートを「へら」で取除くことは充分に自
動的な作業で、もなく、また、充分に無菌状態の作業で
も々い。

Ｃｏｏｋｅの研究（１９７８年）におけるように、この
ホモジネートを媒体を用いて希釈すると、植物原料の大
部分が培養容器の底部に沈澱してしまって、成育しなく
なる。無菌水を使用してホモジネートを希釈し、固６体
寒天培地の表面に接種を行う（これにＣｏｏｋｅの行っ
た作業手順のうちの別の作業手順である）と、本発明者
がしらべた種については、培養容器内での成育がまばら
であった。

■、検討対象とした種の均質化によって、充分に均一な
接種材料は得られない。このことは更に培養容器内での
成育が均一性を欠くということになる。

■、均質化を行うと植物毒素化合物を放出させることが
できる。

更に研究を進めた結果、多数の稠密に充填された分裂組
織区域を包含する植物組織培養を準備し、前記組織を自
動的に分離、細分化して分裂組織のクラスターを形成し
、前記分離した組織を無菌的に分離装置へ嵩（カサ）輸
送し、該分離装置内で前記組織を洗浄して、実質的に均
一な寸法で、かつ、実質的に植物毒素細胞破片の入って
いない珠芽（むかご）ｆ：得たのち、前記珠芽を培養容
器へ無菌的に輸送し、かつ、前記珠芽を培養基の表面に
分配する、少なくとも半自動化した、かつ、最終的には
完合自動化した植物組織の培養増殖方法、が本発明によ
って開発された。

好ましくは、前記分離した組織を篩分は装置へ無菌的に
嵩輸送し、篩分けと洗浄を行って、実質的に均一な寸法
で、かつ、実質的に植物毒素細胞破片の入っていない珠
芽を得る。また、本発明の特に好ましい態様においては
、前記篩分けした珠芽を表面に保持する篩目寸法のスク
リーン部材を備え、かつ、前記珠芽に接触する高さまで
培養基を充填した、本願と同時に提出した特許出願に記
・載し、かつ、権利請求した形式の培養容器へ、該珠芽
を無菌的に輸送し、それによシ前記珠芽は、該培養基と
最適接触状態で、前記スクリーン部材上に支持される。

このようにして、本発明は上述の諸問題を解決し、よっ
て、「試験管内」増殖から得られた植物珠芽を分離し、
成育または増殖培地へ該珠芽を転送するという実質的に
自動化された一般的な方法を提供するものである。その
結果生ずる労務費の低減によシ、現在「試験管内」で増
殖される作物のコストを著しく低減することが可能とな
る。また、本発明は、従来方法によって現在でも余りコ
スト高にならずに増殖させている諸作物の組織培養増殖
をも可能にする。最後に、本発明は、成る種にツイテ、
親糸（ｐａｒｅｎｔ　１ｉｎｅｓ　）、混種（ｈｙｂｒ
ｉｄｓ　）、等の「試験管内」増殖とか、従来の「試験
管内」増殖方法では極めてコスト高になる、全植物レベ
ルにおける「試験管内」選択といった仕事を植物増殖者
（プラント・ブリーダー）が経済的に行えるようにする
こともできる。

簡単に述べると、本発明による植物組織培養増殖の部分
的自動化は、下記の操作を無菌状態で行うことにより達
成される。すなわち、増殖段階の培養組織を均質化し、
蒸溜水で洗浄し、篩分けを行って均一寸法の珠芽を得る
。次いで、珠芽を培地と混ぜ合せ、該植物原料が培養基
上部の平坦層上に在るように培養容器に分配する。この
分配作業は、植物組織と培養基の混合物を底部から１６
ｎ上方にスクリーン挿入体を設けた培養容器に分配する
ことにより達成される。このスクリーンは培養基を通過
させるが、珠芽はその上に保持する。

該混合物の添加は、培養基の高さがスクリーンの高さに
達し、植物原料の平坦層が培養基の頂部に位置するよう
になるまで続けられる。

本発明は、いくつかの・点での認識に基づいている。こ
れら諸点の一つは、均質化の手順が大抵の種に適用可能
であって、シダ類の場合と同様に、増殖段階で、新芽に
発育し得る分裂組織の稠密な集合体からなる培養組織を
形成するために導入できたということである。もう一つ
の点は、上述したとおり、Ｃｏｏｋｅの均質化手順に関
連した諸問題が、無菌状態でホモジネートを希釈し、−
該ホモジネートを容積的に分配して処理できるようにし
、次いで、濃縮した接種材料を培養容器内の培地表面上
で元に戻すことができるようにすることにより解決可能
になるということである。

これらの点を認識することは、植物組織の培養生産を部
分的に自動化する方法の発明にとっての中心課題である
。しかしながら、このような認識は広範な実験を行った
後でのみでてくるものである。まず最初に、リリウム、
フィクス、および、フィロプントロンのような種が均質
化作業によって効率良く分離できるかどうかを確める必
要があった。もし、これらの変種を無菌水で均質化した
場合、ホモジネートが水を戸田して除去し、植物原料が
固化した培地の表面に広がり、次いで稠密な成育が得ら
れ不ことが分った。更に、戸田に先立って、ホモジネー
トを水洗して植物毒素細胞破片全除去すれば、増殖率は
従来の組織培養によって得られるものよシ低くはない。

しかしながら、他方では、稠密な成１育を行うのに充分
な濃度のホモジネートハ、容積分配のためには粘度が高
すぎること、また、汚染が依然として主要な問題である
ことが分った。

汚染問題を解決するための試みに於て、この汚染源が植
物原料の潜在的な汚染と、標準的な無菌状聾においても
、開放容器で作業を行うことによる汚染の両者によるも
のであることが判明した。

更に、この汚染は、糸状菌発育阻止化合物ならびに制菌
化合物によって有効に制御できなかった。

しかしながら、増殖ストックを指定し、植物原料を閉鎖
型プレンダー内で混合し、かつ、該ホモジネート’ｔぜ
ん動ポンプを介して培養容器へ容積分配により輸送する
ような培地を使用することにより、プラチセリウムのよ
うなシダ類の増殖を首尾よく行うことができた。

それにもかかわらず、稠密な成育に必要なホモジネート
が容積分配を行うには粘度が高すぎるという状況をどの
ように取扱うかという問題が残った。

前記の問題は、分離した組織を無菌的に分離装置へ嵩（
カサ）輸送し、該分離装置内で前記組織を洗浄して、実
質的に均一な寸法で、かつ、実質的に植物毒素細胞破片
の入ってい力い珠芽（むかご）奢得たのち、前記珠芽を
培養容器へ無菌的に輸送し、かつ、前記珠芽を培養基の
表面に分配することによって解決された。

このようにして、上述の問題はすべて解決されて、植物
組織増殖のための少なくとも半自動化された商業的方法
が出現した。

この方法の利点は、長い間求められていた必要を満たす
とともに、繁殖゛および増殖を業とする者にとって、そ
の生産コス）１著し”く低減させるということである。

本発明は、増殖段階の培養組織を循還させる費用、およ
び、温室に移転させ得る小植物の生産に要する費用を７
５チも削減することができると算定されている。

更に研究、開発を行った結果、培養容器に該容器の基部
から数センチメートル上方にスクリーンを設け゛れば、
植物組織と培養器との混合体を、植物原料の粘性層を培
養基の頂部にそれと充分な接触を保った状態で分配でき
るということもわかった。このことは、＝好な成長と発
育ができるようにして、ホモジネートを容積的に分配す
ることを可能とするものである。この方法は成功を収め
たので、本発明の好ましい態様に加えである。

本発明の好ましい態様の別の利点は、環境的なストレス
に対する抵抗性を与えるために全植物の「試験管内」ス
クリーニング（選別）を低床かつ大規模で行うことがで
きるようにすることである。

すなわち、小植物はスクリーン上で成長するので、該成
長植物を、例えば菌性の委福病に対する抗性を持つよう
選択される剤を含む培養基へ大量に移転させることがで
きる。よシ簡単に言えば、スクリーン下の液体培養基は
容易に変えることができると共に、抗性を持つよう選択
される剤を新しい培養基と共に導入することもできる。

この発明の一面によれば、分裂組織の密集塊よりなる無
菌で、培養組織を指定した増殖段階の培養組織を無菌の
プレンダーに導入して数秒間混合する。この発明の他の
面によれば、ホモジネートを蒸溜水によシ無菌的に希釈
し、ぜん動ポンプにより無菌篩分は工程へ転送する。こ
の工程は、希釈したホモシナイドを粗目篩にかけて組織
の大片を捕捉することからなり、捕捉した大片は最終的
には再混合される。粗目篩を通過した材料は細目篩に到
達し、こむで珠芽を捕捉するとともに、細か過ぎて再生
不可能な細胞破片と組織片とを通過させるようにする。

細目篩により捕捉された珠芽は、該篩上で蒸溜水を流す
ことによって無菌的に洗浄され、その後、一定容積の蒸
溜水を加えて攪拌することにより再懸濁させる。次いで
、この懸濁液を、ぜん動ポンプによって、濃縮液体培養
基あるいは濃縮寒天ベース培養基を含む保持タンクに移
転させ、定速度で攪拌して３７℃の温度に保持し同化を
防止する。該培養基は、後日温室へ移転させることがで
きる新芽の増殖を促進するよう、あるいは、その成長を
維持するよう調製されたものでよい。

植物ホモジネート懸濁液に定容積の水を加える場合には
、該保持タンク内の培養基濃度を通常の濃度とするよう
計算する。珠芽を該保持タンク内で完全に混合したのち
、植物と培養基の混合体〜を、ぜん動ポンプにより、篩
目の細かいスクリーン挿入体を取付けた培養容器に無菌
的に分配する。これらのスクリーン挿入体は、該培養容
器の底部の上方に設けた支持部上にあり、珠芽を保持し
たままで培養基がスクリーンを通過するようＫする。

該混合体は培養容器に均一に分配し、該培養基がスクリ
ーンの高さに達するまで該容器に充填される。この工程
により、培養基と良好な接触を保った植物原料の濃密な
薄層ができる。

培養容器に充填し終ったのち、該容器を、光量、光周期
、および、温度調節した標準培養室に移す。

この培養室で６乃至８週間を経たのち、増殖段階の培養
組織を均質化工程により循還させる。しかしながら、混
合に先立って、この培養組織を、汚染を容易に示す培養
基に数週間移転させる。この移転処置は、該培養基が無
菌であることをテストするためのものであシ、シたがっ
て、保持タンクから生成してくる培養基のすべてを廃棄
させてしまうような該保持タンク内への汚染の導入を防
止するものである。成長促進培養基上の培養組織は、培
養室内で約６〜８週間経過させたのち、単に温室へ移転
させる。

大雑把に言って、本発明の方法は以下にのべる作業工程
よシなる。

■、多数の濃密に充填された分裂組織区域を含む植物組
織培養を、均質化、細分断、あるいは、他の作業手順に
よって、自動的に分離、細分化して分裂組織の小集団（
クラスター）ｔｌ−形成する。

■、この分離した組織を、該組織を洗浄して、実質的に
均一な寸法で、かつ、実質的に植物毒素細胞破片を含ま
ない珠芽を得る装置に無菌状態で大量輸送する。

■、これらの珠芽を培養容器に無菌状態で輸送するとと
もに、該珠芽を培養基の表面上に均一に分配する。

更に詳しく述べると、本発明の好ましい方法は以下の工
程からなる。

α）濃密に充填された多数分裂組織を含む植物組織培養
を準備し、 ｈ）前記組織を自動的に分離、細分化して分裂組織の小
集団（クラスター）ｔｌ−形成し、Ｃ）前記分離した組
織を篩分は装置へ無菌的に嵩輸送し、篩分けと洗浄を行
い、所定の寸法範囲で、かつ、実質的に植物毒素細胞破
片を含まない珠芽を得、 ｄ）前記篩分けした珠芽を液体培養基と無菌的に混ぜ合
せ、 Ｓ）該珠芽を表面に保持したま＼で、該培養基が通過で
きるような篩目を有するスクリーン部材を備えた′培養
容器に、前記混合物を分散させ、かつ、 ｆ）前記培養基の表面が前記珠芽と接触する高さまで前
記培養容器に充填し、それによって、前記珠芽が、該培
養基と最適の接触を保って、前記スクリーン部材に支持
される。

好ましくは、上記工程ｂ）で形成される分裂組織のクラ
スターは、容積（嵩）輸送をたやすく行えるよう、無菌
の水性媒体で稀釈し、次いで前記篩分は装置にポンプ給
送し、かつ、上記工程Ｃ）で篩分けと洗浄を行った前記
珠芽を、°容積（嵩）輸送を容易にするべく無菌の水性
媒体で希釈してから、保持タンクにポーンプ給送する。

本発明の方法の好ましい一態様において、保持タンク中
の前記珠芽は液体培養基と無菌的に混合されて、均一な
混合体を形成し、前記培養基は、好ましくは、温度を３
７℃に保つことによって液状を維持する寒天ベースの培
養基であシ、かつ、前記珠芽と培養基の混合体はポンプ
給送によシ培養容器に容積的に分配される。

本発明の方法において、組織培養の開始と、増殖段階へ
の移転は、ともに、先に簡単に記述した従来の方法を用
いて行われる。この培養組織のための培養基は液体でも
固体でよく、また、作業手順は静置培養でも振とり培養
でもよい。しかしながら、すべての増殖段階培養は、分
離と細分化に先立って数週間液体培養基上に置き、該培
養基が汚染されるかどうかテストできるようにするのが
良い。

前記分離と細分化は、回転刃を有するプレンダーあるい
はホモジナイザーを用いて行うのが良く、該ブレンダー
あるいはホモジナイザーは、約４ないし９秒の周期で、
組織を分離、細分化して分裂組織の小集団を形成するも
のである。この好ましい作業手順を、以後、均質化（ホ
モジナイザーシヨン）と称し、この工程から出てくる液
体をホモジネートと称する（真のホモジネートが以後に
説明、記載のとおり生成する前にホモジナイザーあるい
はブレンダーを故意に停止させた場合でもホモジネート
と呼ぶ）。

したがって、要約すると、この工程は、好ましくは、無
菌状態で以下の工程を踏むことによって植物組織培養増
殖を少なくとも半自動化するものである。

α）分裂組繊の塊からなる増殖段階の植物組織培養を均
質化する。

ｂ）ホモジネートを稀釈してから、篩分は装置へ容積的
に移転する。

Ｃ）ホモシネ−１ｔ−洗浄、篩分けして、所定寸法範囲
の珠芽を得る。

ｄ）珠芽を稀釈してから、培養基を含む保持タンクに移
転する。

８）珠芽と培養基の混合体を、スクリーンを備えた培養
容器に分配し、該植物原料が培養基を覆うスクリーン上
で層を形成するようにする。

上述のとおり、均質化を行う数週間前、増殖段階にある
培養組織を、以下に記載するようにして、汚染の可能性
の有無をしらべてみるのが良い。

増殖段階の培養組織を入れたフラスコを無菌室に運び、
層流清浄作業台上で開け、ピペットを使って約３−の液
体培養基を無菌的に取シ出す。この培養基の分別量０．
５　ｒｎｌ、を無菌の試験用培養基５−に加える。３種
類の別個のインデックス培養基を使用する＝（１）イー
スト・エキストラクトとテキストロ！ズ（１０φ）のブ
ロス；（２）サブロード液とＡＣのブロス；および、（
３）トリブチカーゼと大豆のブロス。各々の増殖段階フ
ラスコはこれらの培養基の各々を使用して来復テストヲ
行う。インデックス培養基を２７℃で２週間培養した後
、その状態をしらべる。汚染されていることを示す培養
フラスコを廃棄し、残るフラスコを均質化する。

均質化工程に先立って、植物組織と接触するすべての器
具をオートクレーブに入れ、１２１℃で２０分間殺菌す
る。器具はスチ′−ムに開放されている容器内で殺菌処
理する。オートクレーブを開□けると該容器は閉鎖され
る。これらの封止容器を無菌室に運び、層流清浄作業台
内でのみ開放する。

この手順の例外は、自己殺菌を行う保持タンクである。

全作業過程で無菌作業衣と手袋を身につけた作業者は層
流清浄作業用おおい（フード）の中で配管類を各種器具
に無菌的に接続する。

以下、本発明を添付の図面ならびに下記の実施例を参照
して、いくつかの好ましい態様に関連して説明し、より
充分に発明を把握できるようにする。しかし７ながら、
図示ならびに説明される詳細は例示として出すものであ
り、また、具体的な解説のためのみであって、本発明の
原理と着想面の最も有用で、かつ、理解容易な記述と考
えられるものを提供する目的で開示するものであること
を強調しておく。これに関連して、権利請求した方法で
使用できる装置の構造を本発明の基本的な理解に必要と
される以上に詳しく示すということはしなかった。図面
を参照して明細書の記載を読めば、本発明のいくつかの
形を実際に具現化するにはどうすればよいかが当業者に
は明らかとなる。

均質化工程は、保持タンクに倍濃度培養基を充填するこ
とから始まる。使用する保持タンクは、商業的に入手可
能な　“ＥＧＭＯＥＳ−８″型、８リツトル容量の培養
基殺菌兼分配器で、植物／培養基混合体の分配が可能な
ように改造したものである。これらの改造は次の項目か
らなる。

Ａ）取出口を９．５　ｗｍ　（内径）から１２門（内径
）に拡大する。

Ｂ）元の取出弁を°空気作動ボール弁と交換する。

Ｃ）弁内部の無菌状態を確保するために、下記２項目の
特別な手配を行う。

１）殺菌作業中、取出弁を開けたｆｓにしておき、取出
口自体をネジ付きキャップで閉鎖する。

２）弁に５０Ｗの加熱素子を取付けて、殺菌温度に到達
できるようにする。

Ｄ）攪拌機がタンク室の基部数ミリメートル内まで届く
ようにして、少量でもうまく混合できるようにする。

充填が終ると、保持タンクの殺菌サイクルが開始する。

培養基を１２１℃に加熱し、この温度で２０分間維持し
たのち、３７℃まで冷却し、この温度で無菌的に維持す
る。このサイクルが完了（（大体７５分かかる）した後
、保持タンクは、装置の残シの部分に無菌的に接続する
ことができる。

装置の各部分を互に接続する要領は第１図で明瞭である
。清浄作業台上には、Ｗａｒｉｎｇ　　型無菌分配兼混
合機（１，−取出口の内径を９．５調から１２調に拡大
して改造したもの−がその容器から取り出されて基台１
２・に据えられる。混合機１をその取入口３と取出口４
に取付けたシリコーン製接続管、ならびに、該接続管の
他側に接続された器具とともにオートクレーブに入れる
。０．２２ミクロンの列形フィルター６が取入弁５を介
して取入口ヘッドＡ７０１８−２０に取付は撃＜−マー
・マスターフレックス型ぜん動ポンプＡ７５３４　１０
　７１介して蒸溜水の入った４５リツトル容量のかご巻
き瓶に接続され、無菌水の供給源を準備する。取出口か
らの接続管は取出弁９に接続され、この弁は更に篩分は
装置１０のカバーの取入口に接続される。この接続管は
、後程、ヘッド扁７０１９　１１ｔ［付けたコールパー
マー・マスターフレックス型ぜん動ポンプＡ　Ｋ　７５
４９−１９　ｆ通過する。

篩分は装置の構造は第２図から明らかである。

簡単に述べると、この装置はステンレス鋼製の粗目篩１
２からなり、ステンレス鋼製細目篩１３上に位置してい
る。この細目篩はステンレス鋼製容器１４内にラシ、こ
の容器から取り出せるようになっている。この容器は、
閉止可能な流出弁１５を有する構造となっている。

該篩分は装置は、その容器から無菌的に取出されて、磁
気攪拌機１６上にある混合機に隣接して組立てられる。

細目篩が入っている容器を、その内部の磁気撹拌棒なら
びにシリコーン製接続管に接続された流出弁とともに、
オートクレーブに入れる。接続管の他側は、ヘッドＡ７
０１９　１７を取付ケア’ｃコールパーイー・マスター
フレックス形セん動ボ、ンプＡＫ７５４９−１９を介し
て二方弁１８に接続される。この二方弁の一足は、保持
タンク１９の取入口に取付けられることになる管に接続
される。該弁の他足は、篩分は装置から空のがご巻き瓶
２０へ洗浄水を運搬することになる管に接続される。該
二方弁を含む管全体を、篩分は装置とともにオートクレ
ーブに入れる。

装置を無菌テーブルに設置したのち、保持タンクに無菌
接続する。保持タンクはカート（台車）２１にあり、こ
のカートは清浄作業台の空気層流中へ該保持タンクを送
シ込めるようになっている。

ここで、篩分は装置からの接続管を保持タンクの取入口
に取付ける。また、無菌のシリコーン製接続管を分配口
２２の弁に取付ける。この管は、ヘッドＡ７０１８−２
０　２３を備えたコールパーマ−・マスターフレックス
形ぜん動ポンプＡ７５３４−１０を通過して無菌テーブ
ルに戻る。管２４の分配端は受取容器２５が一杯になる
までテーブル上に残っている。一旦、全接続が完了する
と、保持タンクをテーブルから取り去って、均質化作業
を実際に開始することができる。

この作業手順は、無菌の増殖段１階培養組織を混合機に
入れることから始まる。通常、約１６０グラムの植物原
料と約４００−の液体が混合機に導入されるが、成る程
度の変更は可能である。該植物原料は直接秤量するので
はなく、むしろ、経験のある技術者が培養基の体積によ
ってその重量を判断するのである。一般に、フラスコ内
の培養基は充分な液量を供給しないので、混合機に水を
加えて、再度水の必要量を算定すゑ。次に、混合機をし
っか９と閉鎖し、該植物原料を低速で３ないし９秒間程
混合する。混合時間も数多くの条件で変ってくるが、最
適時間は予備実験で決められる。

注意すべきことは、余シ長時間混合、を行うと、過度の
組織変化と低成長が起るということである。

また、混合時間が短か過ぎると、培養基の分割が行われ
なくなる。混合を行ったのち、流入・流出弁を開放にし
て、無菌水を混合機内に運び、該混合機からでてくるホ
モジネートを稀釈するためのせん動ポンプを作動させる
。これらのポンプの流量は、流入体積が流出体積と等し
くなるよう調整される。流入、流出は混合・機内に植物
原料がなくなるまで続けられる。そののち、流入用ぜん
動ポンプを閉め、混合機をカラにしてから流出ポンプを
閉める。つぎに、流入、流出弁を閉め、混合機を開いて
、工程を繰返した。植物原料の充分量を処理して保持タ
ンクに充填するまで、混合を続ける。使用する植物原料
の特定量は、もちろん、種（５ｐｅｃｉｅｓ　）や、培
養容器内の所望濃度、など諸々の要因によって変ってく
る。

該混合機から、稀釈ホモジネートヲポンプによって取出
し、篩分は装置に送シ込む。粗目篩は植物組織の塊を捕
捉するが、殆んどのホモジネートを通過させる。時折、
粗目フィルターの内容物を混合機に戻してやる。この操
作は、フィルターを無菌のステンレス、鋼製ビーカー上
で逆にして、植物゛原料を流出用混合機から出てくる無
菌の蒸溜水でビーカー内に洗い落してやることにより達
成される。ついで、粗目篩を通常の位置に戻して処理を
続ける。

細目篩に到達するホモジネートは、増殖原料と、細胞破
片と、細かすぎて迅速に植物再生ができない植物組織片
との混合体を含んでいる。該細目篩は植物の珠芽を捕捉
する一方、細胞破片と植物組織の小片を、該篩を支えて
いる容器内に通す。そののち、この容器の出口弁を開き
、ぜん動ポンプを作動させ、二方弁を通って流れる液体
を洗浄水を保持しているかと巻き瓶へ送る。該かご巻き
瓶に通ずるピンチクランプをも開いて、洗浄水をかご巻
き瓶に流し始める（このピンチクランプの目的は、水が
流れていない場合に、時折、空気の逆流で装置を汚染し
ないようにするためのものである）。

混合を完了したのち、洗浄水が清澄になるまで、系全体
に水を流しつづける。ついで、篩保持容器の出口弁と同
様、゛ピンチクランプを閉める。次に、４リツトルの無
菌蒸溜水を容器内に流す。それから、磁気攪拌機を作動
させ、細目篩を手操作によシ容器内で逆にして、該容器
内の水に珠芽を再懸濁させる。該容器からの液流は保持
タンクの取入口へと向けられる。該容器の出口弁を開い
て、懸濁液を保持タンク内へゆっくりとポンプ給送し、
培養基の温度が下らないようにする。懸濁液を移送して
培養基と混合し、該培養基濃度を通常の濃度にすれば、
植物／培養基の混合体は培養容器内に分配することがで
きる。

スクリーン挿入体と支持部材を含む培養容器は、装置と
同じ要領で、オートクレーブに入れ、封入容器内の層流
清浄作業台に運ばれる。この培養容器は、１ｃｒｎの高
さのポリカーボネート製支持部材ヲ備工た１００−のポ
リカーボネート製容器で、その上に５００ミクロン・メ
ツシュ開口を有する開放し、一つ一つ充填して行く。充
填操作においては、ぜん動ポンプを使用し、該植物／培
養基混合体をゆっくり、均一にスクリーン上に分配する
。

培養基がスクリーンを通過する間、珠芽はスクリーンに
より捕捉される。培養基がスクリーンの高さに達するま
で分配を続ける。この高さに達したところで、Ｊ＠養、
基と良好な接触を保った植物原料の薄層が生成する。保
持タンクが空になると、分配段階が完了する。保持タン
クを清浄作業台に戻し、取入れ口と分配口間の接続を無
菌的に断って、５タンク金取りはすし、再使用のために
洗浄する。

３７℃に保った２倍濃度の培養基を含む新しい保持タン
クを清浄作業台に運び込み、該装置と無菌的に接続し、
処理工程を繰返す。

充填した容器をパラフィルムで封じ、培養室に移す。最
適成育条件は数多くの要因によって変るが、一般的には
、均質化後の環境条件は従来の組織培養が必要とするも
のと同じである。

培養室で６乃至８週間後、成育培養基上の培養組ａを温
室へ移すことができ、また、増殖段階培養を均質化処理
を経て循還させることができる。

均質化処理を利用して増殖段階での植物原料を副次培養
する際の第１工程はこの原料が液体培養基上にない場合
には、該液体培養基へ無菌的に移転することである。こ
の移転は培養容器を無菌室内にある層流清浄作業台へ運
ぶことによシ達成される。ここで、各容器を開け、培養
組織が付着しているスクリーンを取りはずす。該培養組
織を無菌の「へら」でスクリーンから分離し、無菌水の
ビーカーに入れる。この無菌水を磁気攪拌機で攪拌して
植物原料から寒天を洗い落し、ステンレス鋼製の粗目篩
を通して混合体を注ぎ入れる。ついで、篩をステンレス
鋼製ビーカー上で逆にし、液体増殖段階培養基を篩を通
して注ぎ入れ、該培養基に付着したま＼になっている培
養組織を水洗によシ取除く。植物組織が懸濁している培
養基を無菌フラスコに注ぎ入れ、栓をして培養室に戻す
。培養室では、フラスコを棚の上、あるいは、軌道振と
う機の上、または１．往復振とう様の上に置き、その条
件によって特定の培養組織のための最良の結果が得られ
る。培養室で数週間を経たのち、液体培養基を上述の手
順に従って無菌検査する。培養基の汚染が見つからなけ
れば、再び均質化処理を施すことができる。理想的には
、表現型安定性の園芸学的試験は大規模な商業生産を開
始する前に行わなければならない。このようにして、最
初の培養組織から生じる少なくとも数百の小植物と、そ
の後に生ずる数多の副次培養組織は、温室条件に適合し
、成熟状態まで成長し、増殖させようとする変種にとっ
て経済的重要性を有する表現型特性についての試験を行
ったものでなければならない。均質化処理が商業的増殖
に有用であるためには、容認し難い程度の表現型弁型（
ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｏｆｆ＝ｔｙｅｓ　）が初期培養
組織あるいは最初の数種類の副次培養組織中に発生して
はならない。万一、最初の数種類の副次培養組織中に容
認し難い程度の表現型弁型が現れた場合には、使用した
外植原料におけ不変化、あるいは、増殖培′養基のホル
モン含有量のような「試験管内」作業手順の成るものに
変更を加えて当該状況を矯正してやればよい。

しかしながら、表現型の変異性を容認可能な程度まで減
少させることができない場合には、その変種の特定の変
種あるいはクローンは均質化作業によって増殖させるの
に不適当となる。数多の副次培養を行ったのちに現われ
る容認し難い程度の表現型弁型は、その時点で副次培養
を停止して、培養を外植原料から再度開始しなければな
らないことを示す。

実施例１ フィロプントロン・バーガンディの組織培養を開始し、
ついで、上記の工程を用いて、８世代にわたる副次培養
と増殖を行った。最初の培養から２００個の小植物を、
また、各々の副次培養から４５００個の小植物を温室に
移転し、６チ月間成育させた。これらの植物で容認不可
能な表現型の変異性を示したものは一つもなく、すべて
市場へ出荷された。

保存植物の維持 １才になるフィロプントロン・バーガンディの母植物５
００個から外植組織を得た。これらの植物は非汚染外植
を容易に得ることができる条件下で少なくとも６チ月間
維持したものである。より詳しく言えば、これらの植物
は、比較的低湿度（約７０チＲ，Ｈ，）で比較的高温度
（約２５℃）の温室内の個々のポットに収容した。これ
らの植物はその基部にのみ水をやり、１週間に１度、殺
菌剤ベンレート（１ｆ／ｌｉｔ　）およびカプタン（２
ｒ／ｌｉｔ　）を予防的に散布し、１０日に１度、殺虫
剤アザドリン（３＋＋＋ｔ／１ｉｔ）　　を予防的に散
布した。

「試験管内）培養の開始 植物に殺菌剤を散布して数日を経たのち、母植物から６
００本の新芽（４〜δα長）をつみと９、実験室に運ん
だ。外植を、まず、１．０１のプロセプテイルに３０分
間、ついで、０．２％のカブクンと０，１チのベンレー
トに３０分間、最後に、１．０チの次亜塩素酸ソーダ溶
液に２０分間浸漬することにより表面殺菌を行った。つ
いで外植を無菌室に入れ、層流清浄作業台にのせ、無菌
の無滴水中で３回洗浄した。そののち、新芽を長さ３な
いし５霞に無菌的状態でトリムを行い、垂直に配置した
試験管内の開始段階培養基１０ｔｎｔ中に入れた。

コノ培養基は、ＭＳ塩（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＦ、　
Ｓｋｏｏｇ著「タバコ組織培養を用いて急速成長と生物
検定を行うための修正培養基Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐ
ｌａｎｔ、　１５．　ｐｐ４７３〜４９７．１９６２参
照）、マイオイノシトールｉ　ｏ　ｏ　ｖｑ７ｔ、グリ
シン２η／１．ニコチン酸５１１１／ｌ。

ピリドキシン５　ｙｑ／ｌ、チアミン１０フη／ｌ、Ｂ
Ａｌ　０　ｍ９／ｌ、蔗糖３０１！／ｌ、　Ｄｉｆｃｏ
　Ｂａｃｔｏ寒天１０危からなシ、オートクレーブに入
れる前にｐＨ７，５に調整されたものである。そののち
、該試験管をキンプル透過膜（Ｋｉｍｂｌｅ　ＰＭ　）
製のキャップ　。

で羽止し、培養室内に置いた。培養室は４．０００ルツ
クスの冷感白色螢光照明ならびに１６時間光周期の下で
２６℃±１に維持された。培養組織を毎週検査して、汚
染された試験管を取除いて廃棄した。

」１１丞潰’ｏｎ頻− 培養室で約６週間経過したのち、外植を移転するため無
菌室に戻した。６６０個の原外植のうち、３００個は発
育し、目に見えるような汚染はなかった。これらの外植
を無菌的にトリムを施し、分離したのち新しい増殖段階
培養基の入った試験管に入れた。この新しい培養基の組
成は開始培養基の組成と同じであった。試験管を再び封
じ、培養室に戻して更に６ないし８週間経過させた。該
増殖段階培養組織の移転準備が完了したとき゛、それを
もう一度無画室に運んで層流清浄作業台上に置き、無菌
的に操作した。約５０本の試験管から集めた増殖段階培
養組線を従来からある組織培養技法によって分割し、各
々１０ｒｎｔの成長段階培養基の入った２００本の試験
管に移した。この培養基は１／２濃度のＭＳマクロ栄養
分、全濃度のＭＳマイクロ栄養分、マイオイノシトール
１００η／ｌ。

グリシン２　ｔｑ／ｌ、ニコチン酸５■／ｌ、ピリドキ
シン５■／ｌ、　　ＩＡＡ　２　Ｗ／ｌ、　　チアミン
１０グ／ｌｘｔ　。

硫化アゾ＝　７２０　ｒｎｆ／ｌｉｔ、蔗糖３０　ｔ／
ｌ、　Ｄｉｆｃ。

Ｂａｃｔｏ寒天１０　Ｗ／ｌからなり、オートクレーブ
に入れる前にｐＨ価を５．７に調節したものでちる。つ
いで、試験管をキンベル透過膜製キャップで封じ、培養
室に戻した。この成長段階培養組織は小植物に発育し、
このものを園芸試験のため温室に移した。

残りの増殖段階培養組織（試験管約２５０本分）を増殖
段階液体培養基の入った１２本のフラスコに移した（こ
の培養基は寒天を使用せず、また、オートクレーブに入
れる前のｐＨ価が５．１であるという点のみで固体培養
基とは異なる）。試験管約２０本分の内容量（植物組織
約２０グラム）を１５０ｍ１の増殖段階培養基を入れた
各５００−容貴のフラスコに入れた。フラスコを無菌の
綿プラグを用いて封止し、先に述べたと同一の環境条件
の培養室に配置した１　２５　ｒｐｍで回転する軌道振
とう機に置いた。約６週間経過とう機上に置いたのち、
該培養基の無菌状態を３種類の個別インデックス培養基
を使用して先に記載の要領で検査した。培養基のサンプ
ルを取り出したのち２週間を経過してから、汚染されて
いると判明した増殖段階培養組織の入っているフラスコ
を廃棄し、残シのフラスコについて均質化作業を行った
。

均質化および分配作業 均質化作業に先立って、前に述べたように、すべての器
具をオートクレーブに入れてから、無菌室に配置した。

保持タンクに２リツトルの増殖段階培養基を、充填し、
殺菌サイクルを開始した。保持タンク中の培養基を３７
℃に冷却したのち、該タンクを残りの器具に無菌的に接
続し、均質化作業を開始した。フラスコ２本分の無菌増
殖段階培養組織と約２００　Ｊの無滴水を混合機に注き
′入れた。混合機を封してから低速で７秒間運転した。

ついで、流入弁と流出弁を開さ、がっ、ぜん動ポンプを
作動させた。このせん勤ボング１げ無菌水を混合機内に
運び入れるとともに稀釈ホモジネートヲ篩分は装置にポ
ンプ給送する。稀釈ホモジネートは篩分装置に入った。

組織の大片を粗目篩（３，１５０ミクロン　メソシー開
口のもの）で捕捉し、珠芽（すなわち、比較的短期間に
再生可能な組織片）を細目篩（５００ミクロン　メツシ
ュ開口のもの）で捕捉し、か一つ、すべての屑破片を細
目篩下の受取容器へ通過させ訳。該受取容器からこの廃
液を処理するためにカゴ巻き瓶へポンプ給送した。混合
機に植物原料がなくなったとき、ぜん動ポンプを停止さ
せ、流入弁と流出弁を閉じ、混合機を開いた。粗目篩に
よって捕捉された植物原料を、更にフラスコ２本分の増
殖段階培養組織の内容物とともに混合機へ再導入して、
上記工程を繰返した。

フラスコ８本分（約４６０グラムの植物原料に相当ンを
処理する捷で均質化作業をつづけた。そののち、Ｉｉ！
（ｌｌ目篩の珠芽を洗浄し、２リツトルの無菌無滴水中
に懸濁させ、保持タンクへポンプ給送し、先に詳述した
手順によって、２６個の１００扉培養容器へ分配した。

充填した培養芥器をパラフィルムで封じたのち、従来の
組織培養について記載したと同一の環境条件で培養室へ
移転した。この培養室で約６週間経過したのち、増殖段
階培養組織を振とう済みの液体培養組織へ無菌的に移転
した。この移転工程は、先に記載したように、植物原料
を各培養容器から無菌的に取り出し、寒天を洗い落Ｉ２
てから１５０ｍ１の増殖段階液体培養基が入っている５
　００　ｍｌ！容量のフラスコ（（移すことによって達
成される。ついで、これらのフラスコ全殺菌した綿プラ
グで封じ、培養室におい”ｔ　１２５　ｒｐｍで回転す
る軌道振とう機上に載置した。３週間後、２本のフラス
コの液体培養基が汚染していだので、これを廃棄し、１
６本のフラスコを再度無菌室に入れて分離を行うととも
に、均質化工程により新しい培養器への移転を゛行った
。８本のフラスコを再度増殖段階培養基へ移転させて副
次培養を行った。この処理により、増殖段階の培養組織
の入ったＬ　００　ｎ？培養容器が２６本できた。他の
８本のフラスコも１００１ｒ？培養容器２６本をつくり
だしたが、これらは成長培養基上に載置した。培養室で
６ないし８週間を経たのち、この培養組織は、１容器あ
たり、約１００個の小植物を産出し、この小植物は［ｌ
ｆｌ芸試駒のために温室へ移された。このようにして、
この副次培養ならびにその後の７回に亘る副次培グによ
り、増殖用の培養容器２６個（そのうち１６個が使用さ
れた）と、約２．５００個の小植物を含む培養容器２６
個ができ、この小植物はすべて温室へ移された。

表現型安定膜の確認 最初の培養組織から得られたフィロプントロン・パーガ
ンディの小植物（小植物２００個）と、その後８回に亘
って得た副次培養組織（各々の副次培養から２，５００
個の小植物を得た）を温室に移し、温室条件に適合させ
、６チ月間成長させたのち、表現型の安定性をしらべた
。温室に収容した小植物を洗浄して寒天を落し、個々の
植物に分離し、９６チの着根ホルモ７　（Ｓｔｉｍ　Ｒ
ｏｏｔ　Ａ　２（０，１チ　Ｉ　ＢＡ　））および４％
のＴＥＣＯ６０（６０チ２−（４’−ｆアゾール）ペン
ジニタソール）の混合物中に浸漬した。そののち、これ
らの植物を、完全にしめらせた泥炭と発泡スチロールの
ビーズの２：１混合物内に２５インチ（約６．１　ｃｍ
　）に仕切った小室を複数個有する「スピードリング」
皿に植えた。次に、これらの皿を温室内の台上に置き、
植物の周辺に湿潤環境を維持するよう設計されたポリカ
ーボネート製のトンネルでおおった。

一方、この台上で、該植物は毎日１分間頭上噴霧により
水分を受けた。この条件の下で３週間経過後、該植物は
確実に根付いたので、除々にポリカーボネート製トンネ
ルを開けて植物が温室全体の環境にゆっくりとなじむよ
う、にした。

「スピードリング」皿で数ケ月を遇したのち、該植物を
扁１２ボットに移し、６チ月間標準的温室条件で成長さ
せた。成長過程で、植物の成長速度と成長習慣、および
、葉の形状と色彩を評価した。いずれの副次培養から得
られた植物も、商業的に容認可能な表現型と顕著に異な
るところはないことが判明した。したがって、すべての
植物を販売した。

実施例２ ネフロレブシス・ボストニエンシスΦエクサルクータ（
ボストン　シダ）の組織培養を開始し、引続いて、上記
の工程を使用して副次培養全行い、６世代に亘って増殖
した。最初の培養から得られた２００個の小植物と、各
副次培養から得られた４、（１００個の小植物とを温室
に移し、約４ケ月間成長させた。第１枚目の初めに容認
不能の表現型変化が観察されたので、副次培養を打切っ
た。

保存植物の維持 １才のボストン　シダの母植物２５０株から外植組織を
得た。これらの植物を非汚染外植が容易に得られる条件
で、少なくとも６チ片維持した。

よシ詳しく述べると、これらの植物は、比較的湿度が低
く（約７０チ）て、比較的温度の高い（約２５℃）温室
内で個別のポットを用いて成長させた。これらの植物は
、その基部にのみ水を与えられ、週１回、殺菌剤ベンレ
ート（１ｆ／ｌ　）とカブタン（２−ｆ／ｌ　）を予防
的に散布した。

「試験管内」培養の開始 該植物に殺菌剤を散布してから数日後、母植物から８０
０個の繊匍枝先端部（３〜４−長）を切夛とって実験室
に運んだ。外植を、まず、０，５％次亜塩素酸ソーダに
２０分間浸漬して表面殺菌を行い、ついで、７０チエタ
ノール溶液に浸した。

そののち、外植を無菌室に運び、層流清浄作業台上に置
き、無菌蒸溜水で３回水洗いした。ついで、繊勿枝先端
部を長さ１−の細片に無菌的にトリムし、試験管中の開
始段階培養基２０−に入れた。

この培養基に、通常の半分のレベルのＮＨ４ＮＯ３゜Ｋ
ＮＯ３，ＣａＣｌ□、２Ｈ２０−２Ｈ２Ｏ−，７Ｈ２０
−ＨＫ２ＰＯ，と、標準レベルの残９の無機成分を含む
無機塩類から蔗糖（２０？／Ｌ　）、Ｄｉｆｃｏ　Ｂａ
ｃｔｏ寒天（１０？／７）ｅ含み、この培゛養基はオー
トクレーブに入りる前にｐ■■価ｔ−５，７に調節され
たものである。ついで、試験管をキンベル透過膜製キャ
ップで封をし、培養室に置いた。培養室は、４，０００
ルツクスの冷感白色螢光照明ならびに１６時間光周期の
下で２６℃±１に維持された。培養組織を毎週検査し、
汚染した試験管を取除いて廃棄した。

増殖段階の開始 培養室で約１２週１１Ｊ１ｆｃ経たのち、発育した外植
全移転させるため無菌室に戻した。８００個の原外植の
うち、約３５０個が発育し、目に見えるような汚染はな
かった。これらの外植を無菌的にトリムレ、分離してか
ら、新しい増殖段階培養基がはいっている６００本の試
験管に入れた。この培養基の組成は、ホルモンＩＡＡ（
０，３キ／ｌ）をＮＡＡおよびキネチンと置換したとい
う点においてのみ開始段階培養基と異なるものであった
。ついで、試験管を封じ、培養室に戻した。

約６週間後、培養組織は再び移転の準備がととのった。

増殖ならびに成長段階培養基は同一なので、この場合、
小植物を２００本の試験管から直接温室へ園芸試験のた
めに移転することは可能であった。残シの増殖段階培養
基（試験管約４００本分）を無菌室へ運び入れ、層流清
浄作業台上で開け、増殖段階液体培養基の入っている１
２本のフラスコに無菌的に移した。（この培養基は、寒
天を使用せず、オートクレーブに入れる前のｐＨ価が５
．１であるという点においてのみ先の増殖段階培養基と
異なるものであった。）試験管約２５本の内容物（植物
組織約２０グラムに相当）を、同じ＜１５０Ｔｎｔの増
殖段階培養基の入っている５００ｍｆ容量のフラスコお
のおのに入れた。フラスコを殺、菌した綿プラグで封止
し、先に記載したと同一の環境条件の培養室内にあって
１２５　ｒｐｍで回転する軌道振とう機上に載置した。

該振とう機上で４週間経過したのち、三種の個別インデ
ックス培養基を使用して、先に記載した要領で、該増殖
段階培養基が無菌であるかどうかを試験した。該培養基
のサンプルを取り出して２週間後、汚染していると判明
した増殖段階培養基のフラスコの１つを廃棄処分し、残
シのフラスコについて均質化処理を行った。

均質化ならびに分配作業 均質化処理に先立ち、すべての器具をオートクレーブに
入れてから、先に述べたようにして無菌室に配置した。

保持タンクに２リツトルの寒天をベースとした増殖段階
培養基を充填し、４殺菌サイクルを開始した。保持夕／
り内の培養基を３７℃に冷却したのち、該タンクを残り
の器具と無菌的に接続し、均質化作業を開始した。２本
のフラスコに入っている無菌の増殖段階培養基と約２０
０−の無滴水を混合機に注ぎ入れた。混合機を封止し、
低速で７秒間運転した。ついで、流入弁と流出弁を開き
、無菌水を混合機に運び、稀釈ホモジネートを篩装置に
ポンプ給送するぜん動ポンプを作動開始させ、稀釈ホモ
ジネートを篩分は装置へ入れた。シダ類を使用した場合
、粗目篩で捕捉されるような組織の大片はないので、す
べての植物原料は粗目篩を通過して細目篩に達した。再
生可鑓な組織片はこの細目篩により捕捉され、一方、細
胞の屑破片は篩をくぐって、その下にある受取容器に達
する。ここから、廃液がポンプ給送されてカゴ巻き瓶に
到り処理される。　　゛混合機に植物原料がなくなると
、ぜん動ポンプを停止し、流入弁と流出弁を閉じ、恨合
機を開けた。２またはそれ以上の本数のフラスコに入っ
ている増殖段階培養組織の内容物を混合機に導入し、処
理工程を繰返した。均質化処理は、８本のフラスコ（植
物原料約６４０グラムに相当）の処理が終るまで続けら
れた。そののち、細目篩中の植物原料を洗浄し、２リツ
トルの無菌類溜水に懸濁させ、保持タンクにポンプ給送
し、２６個の１００２ｊ８養容器に分配した。これらの
工程は、先に詳述した手順に従って行った。

充填した培養容器をバラフィルムで封じたのち、従来の
組織培養について記載したと同一の環境条件で培養室へ
移した。この培養室で約６週間経過したのち、増夕１ｎ
段階培養組織を振とう済みの液体培養組織へ無菌的に移
転した。この移転工程は、先に記載したように、植物原
料を各培養容器から無菌的に取り出し、寒天を洗い落し
てから、１５Ｑゴの増殖段階培養基が入っている５００
−容量のフラスコに移すことによって達成される。つい
で、これらのフラスコを殺菌した綿プラグで封じ、培養
室において１２５　ｒｐｍで回転する軌道振とう機上に
載置した。液体培養基で３週間経過後、３本のフラスコ
が汚染していたので、これを廃棄し、１６本のフラスコ
を再度無菌室に入れて分離を行うとともに、均質化処理
により新しい培養基への、移転を行った。１６本のフラ
スコを再度増殖段階培養基へ移転させて副次培養を行っ
た。この副次培養によシ、植物原料を含む１００ｃｆｌ
の培養容器５２個を得、このものを更に増殖あるいは温
室への移転・ρために使用することができた。該培養室
内で６ないし８週間経過したのち、各々約１５０個の小
植物を含んでいる２６°個の培養容器を園芸試験のため
に温室へ移した。１６個の培養容器の内容物を再度液体
培！基へ移して更に副次培養を行うとともに、残シの容
器を廃棄した。このようにして、この副次培養ならびに
引続く副次培養から増殖用の培養容器が２６個（このう
ち１６個全使用）、また、温室へ移転した約４．０００
個の小植物を含む培養容器２６個が得られた。

、　　表現型安定性の確認 初期培養から得られたボストン・シダの小植物（小植物
２００個）ならびに引続く副次培養（各々の副次培養か
ら／」・植物４．０００個）を温室に移し、温室条件に
適合させ、４チ月間成長させたのち、表現型の安定性を
しらべた。温室に収容した手植、物を洗浄して寒天を落
し、個々の植物に分離し、９６％の着根＊　ルモン（Ｓ
ｔｉｍ　ＲｏｏｔＡ２　（０，１チ　ＩＢＡ））　およ
び４チのＴＥＣＯ６０（６０％２−（４′−チアゾール
）ペンジニダゾール）の混合物中に浸漬した。そののち
、これらの植物を、完全に湿らせた泥炭・と発泡スチロ
ールのビーズの２；１混合物内に２５インチ（約６．１
　ｏｎ　）　Ｋ仕切った複数個の小室を有する「スピー
ドリング」皿に植えた。次に、これ゛らの皿を温室内の
台上に置き、植物の周辺に温湯環境を維持するよう設計
されたポリカーボネート製のトンネルでおおった。一方
、この台上で、該植物は毎日１分間頭上噴霧により水分
を受けた。この条件下で２週間経過後、該植物は確実に
根付いたので、除４にポリカーボネート製トンネルを開
けて植物が温室全体の環境にゆっくりとなじめるように
しだ。

「スピードリング」皿で２チ月間経過したのち、該植物
′ｌｋ４インチのポットに移し、標準的温室条件で更に
２チ月間成長させた。成長過程で、該植物の成長速度と
成長習慣、ならびに、葉の形状と色彩を評価した。最初
の５回に亘る副次培養からこのものを販売した。第６回
目の副次培養が始まると、植物の葉の形状および成長習
慣が容認不可能な逸脱を示したので、副次培養を打切っ
た。

以上から分るように、植物組織の培養による増殖をすく
なくとも部分的に自動化するという本発は、どんなもの
にも適用できる潜在的可能性を有している。このような
作物には、観葉植物、観、賞植物、花弁作物、水性植物
、および、野菜作物が含まれる。もちろん、組織培養方
法によって、現在、商業的に増殖される作物は、本方法
には特に適している。これらの作物は、元来、シダ、フ
ィロプントロン、フィクス、プロメリアシエ、などの観
賞植物でめるが、無病アスパラガスや親糸のブロッコリ
のような特別の目的で限定生産される一野菜作物をも含
み、更に２，３の本性種の限定生産をも含む。これらの
作物は、現在、労働集約的な従来の組織培養技法によっ
て生産されている。

このことは、労働生産高が１日１人当り１．０００ない
し２，０００植物を超えることができないことを意味す
る。本発明の方法では、１日１人当り７．０００ないし
１５，０００植物を生産できるはずであり、これは増殖
業者にとって著しい節約となる。

現在「試験管内」で増殖している収獲のだめの組織培養
の費用消滅に加えて、本発明の方法は単位当シコストが
低いため、現在、商業的組織培養が経済的に何の利点を
ももたらさないような作物にも適用可能となる。たとえ
゛ば、セントポーリアあるいはスト°レプトカルブスの
ような装飾植物の増殖に本発明の方法を用いれば、従来
の温室栽培方法によっ゛て増殖させるよシも低床なコス
トでその組織培養増殖が得られる。さらに、本発明の方
法は、これを使用して充分な経済規模のものができる。

こと、および、小植物の移植の自動化改良を近く行う場
合には、森林樹木や混種野菜のクローン増殖のようなプ
ロジェクトを実施可能にする。

本発明の方法は、また、植物育種（Ｐｌａｎｔｂｒｅｅ
ｄｉｎｇ　）においても、いくつかの応用面をもつ。

一応用例としては、商業的なＦ１混種野菜の徨子親（５
ｅｅｄ−ｐａｒｅｎｔ　）の増殖がある。種子親系はホ
モ接合体であってもよいが種子による増殖が困難である
（たとえば、遺伝的雄性不実（ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｌ
ｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙ　）。また、Ｌａｗｒｅｎｃｅ、
　Ｊ２他による米国特許第４，３２６，３５８　号明細
書に記載の方法により、ペテロ接合体であってもよい。

・植物育種の他の応用例としては、全植物レベルでの大
規模な「試験管内」選択に本発明の方法を用いる場合が
ある。

本発明は上述の具体的な態様ならびに実施例にのべた詳
細事項に限定されず、その本質的な属性から逸脱しない
限り、他の特定の形に具現化できることか当業者にとっ
て明かとなろう。したかって、本発明の諸態様ならびに
実施例は、あらゆる点で限定的なものではなく、例証と
して考慮すべきものでろシ、前述の記述説明よりもむし
ろ冒頭の特許請求の範囲を参照すべきである。それゆえ
、該クレームの意味と均等範囲にともなうすべての変更
はその範囲に包含されるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は均質化工程の経路図、第２図は篩分は装置の側
面図。 （主がる符号の説明） １・・・分配兼混合機　　２・・・基　台３・・・取入
口　　　　　４・・・取出口５・・・取入弁　　　　　
６・・・フィルター７・・・ぜん動ポンプ　　８・・・
かご巻き瓶９・・・取出弁　　　　１０・・・篩分は装
置１１・・・ポンプヘッド　　１２・・・粗目篩１３・
・・細目篩　　　　　１４・・・容　器１５・・・流出
弁　　　　　１６・・・磁気攪拌機１７・・・ヘッド　
　　　　１８・・・二方弁１９・・保持タンク゛ ２０・・・からのかご巻き瓶 ２１・・・カート（台車）　　２２・−・分配口２３・
・・ヘッド　　　　　２４・・・管２５・・・受取容器 特許出願人　　　ミララダ　　リミテッド。 代理人　　弁理士白木　量三（ほか１名）特許庁長官　
　　志　賀　　　　学　　殿１．事件の表示 昭和５９年特評願第１５６４６６号 ２、発明の名称 植物組織培養増殖方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　　イスラエル国２５２０１゜ モービル　ポスト　アシュラト（番地なし）名　称　　
ミララダ　リミテッド。 代表者　　シュロモ　ハラリ 国　籍　　イスラエル国　　− ４、代　理　人　郵便番号　１０３ 住　所　　東京都中央区日本橋人形町１＋目３１番６号
１Ｇ’）−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）多数の稠密に充填された分裂組織区域を含む植物組
   織培養を準備し、前記組織を自動的に分離、細分化して
   分裂組織のクラスターを形成し、前記分離した組織を無
   菌的に分離装置へ嵩（カサ）輸送し、該分離装置内で前
   記組織を洗浄して、実質的に均一な寸法で、かつ、実質
   的に植物毒素細胞破片の入っていない珠芽（むかご）を
   得たのち、前記珠芽を培養容器へ無菌的に輸送し、かつ
   、前記珠芽を培養基の表面に分配することを特徴とする
   、少なくとも半自動的に植物組織を培養増殖させる方法
   。 ２）前記分離した組織を篩分け装置へ無菌的に嵩輸送し
   、篩分けと洗浄を行って、実質的に均一な寸法で、かつ
   、実質的に植物毒素細胞破片の入っていない珠芽を得る
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の植物組織
   培養増殖方法。 ３）前記篩分けした珠芽を表面に保持する篩目寸法のス
   クリーン部材を備え、かつ、前記珠芽に接触するレベル
   まで培養基を充填した培養容器へ、該珠芽を無菌的に輸
   送し、それにより前記珠芽を、該培養基と最適接触状態
   で、前記スクリーン部材上に支持することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の植物組織培養増殖方法。 ４）ａ）稠密に充填している多数分裂組織を含む植物組
   織培養を準備し； ｂ）前記組織を自動的に分離、細分化して分裂組織の小
   集団（クラスター）を形成し； ｃ）前記分離した組織を篩分け装置へ無菌的に嵩輸送し
   、篩分けと洗浄を行い、所定の寸法範囲で、かつ、実質
   的に植物毒素細胞破片を含まない珠芽を得； ｄ）前記篩分けした珠芽を液体培養基と無菌的に混ぜ合
   せ； ｅ）該珠芽を表面に保持したまゝで、該培養基が通過で
   きるような篩目を有するスクリーン部材を備えた培養容
   器に、前記混合物を分散させ；かつ、 ｆ）前記培養基の表面が前記珠芽と接触するレベルまで
   前記培養容器を充填し、それによって、前記珠芽が、該
   培養基と最適の接触を保って、前記スクリーン部材に支
   持されていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の植物組織培養増殖方法。 ５）前記組織を自動的に分離、細分化し、ホモジナイザ
   ーに導入することにより、分裂組織の小集団（クラスタ
   ー）とすることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載
   の植物組織培養増殖方法。 ６）前記分裂組織の個々の小集団を体積輸送が容易に行
   えるよう無菌の水性媒体で希釈したのち、前記篩分け装
   置にポンプ給送することを特徴とする植物組織培養増殖
   方法。 ７）前記篩分けならびに洗浄を施した珠芽を体積輸送が
   容易に行えるよう無菌の水性媒体で希釈したのち、保持
   タンクへポンプ給送することを特徴とする特許請求の範
   囲第４項記載の植物組織培養増殖方法。 ８）該保持タンク中の前記珠芽を液体培養基と無菌的に
   混合して均一な混合物とすることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項記載の植物組織培養増殖方法。 ９）該液体培養基が約３６ないし３９度Ｃの温度に保持
   することにより液状を維持する寒天ベースの培地である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第８項記載の植物組織
   培養増殖方法。 １０）前記珠芽および培養基の混合体をポンプ給送によ
   って培養容器に容積的に分配することを特徴とする特許
   請求の範囲第４項記載の植物組織培養増殖方法。 １１）商業的に増殖させた観葉植物、観賞植物、草花作
   物、木性植物、および、野菜作物に利用される場合を特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の植物組織培養増殖
   方法。 １２）「試験管内」での撰択に用いられることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の植物組織培養増殖方法
   。