BRPI0610760A2 - métodos combinatório de otimização da embriogênese somática, de preparação de embriões, de múltiplos embriões vegetais e de embriões somáticos de conìfera para a produção de plantas e de obtenção de embriões germinantes, meio lìquido para o cultivo de tecido embrionário e equipamentos semi-automatizado para a coleta de embriões e de preparação de múltiplos embriões vegetais para a produção de plantas, embriões e planta - Google Patents

Abstract

Métodos Combinatório de Otimização da Embriogênese Somática, de Preparação de Embriões, de Múltiplos Embriões Vegetais e de Embriões Somáticos de Conífera Para a Produção de Plantas e de Obtenção de Embriões Germinantes, Meio Líquido Para o Cultivo de Tecido Embrionário e Equipamentos Semi-Automatizado Para a Coleta de Embriões e de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para a Produção de Plantas, Embriões e Planta. Resumo. São aqui descritos métodos e meios para facilitar a embriogénese somática e para coletar, acondicionar e transferir os embriões lavados sobre um substrato e para um ambiente apropriado para acondicionamento dos embriões durante um periodo pretendido de tempo, de forma que eles se tornem competentes por germinação para a produção de plantas. O equipamento e o método de limpeza de embriões de plantas descritos são usados para preparar embriões múltiplos de plantas para a produção de plantas. O equipamento e o método podem usar uma fonte de limpeza fluida, um sistema de acondicionamento de fluidos, uma estrutura de liberação de fluidos, uma estação de limpeza, um mecanismo de saída, uma fonte de pressão negativa e uma controladora.

Description

"Métodos Combinatório de Otimização da Embriogênese Somática,de Preparação de Embriões, de Múltiplos Embriões Vegetais e deEmbriões Somáticos de Conífera Para a Produção de Plantas e deObtenção de Embriões Germinantes, Meio Líquido Para o Cultivo deTecido Embrionário e Equipamentos Semi-Automatizado Para aColeta de Embriões e de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, Embriões e Planta"

Relatório Descritivo

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US sérien° 60/675.949, depositado em 29 de abril de 2005, e que é aquiincorporado em sua totalidade como referência.

Campo da Invenção

São descritos métodos e meios para facilitar a embriogênesesomática e para a coleta, condicionamento e armazenamento de umgrande número de embriões vegetais antes da germinação. São tambémdescritos um método e um aparelho para a preparação de embriõesvegetais para a produção de plantas.

Antecedentes

A coleta, armazenamento e condicionamento de embriõesvegetais, especialmente embriões somáticos, antes da germinação sãoprocessos chave em muitos aspectos da industria da agricultura. Asatividades necessárias para a realização destes processos, no entanto,usualmente são conduzidas manualmente. Por exemplo, embriõesindividuais são tipicamente transferidos para e a partir de vários meiose vasos e devem ser colocados em placa em meio gel, um por umutilizando-se fórceps e freqüentemente com orientação de um microscó-pio de dissecação.

Esses métodos "manuais de coleta" são trabalhosos, demorados,dispendiosos e susceptíveis a contaminação. Não apenas isto, masapenas um número limitado de embriões pode ser coletado e tratadopor uma única pessoa durante um dado período de tempo. Da mesmaforma, qualquer tentativa de aumentar o número de embriões que podeser coletado e subseqüentemente condicionado para germinaçãonecessariamente requer um aumento da mão de obra, o que em si podeser dispendioso e freqüentemente impraticável.

Uma preocupação adicional é a inclusão de polietilenoglicol nomeio de desenvolvimento do embrião como agente osmótico. O polieti-lenoglicol é incorporado em vários meios para amplificar o desenvolvi-mento embriogênico tendo em vista que se acredita que auxilie a iniciaro desenvolvimento do embrião. Ver Fowke e colaboradores, "SomaticCell Genetics and Molecular Genetics of Trees", Quebec, Canadá, agosto12-16, 1997, a qual é incorporada aqui como referência.

Um problema com o polietilenoglicol, entretanto, é que esteadere aos embriões, possivelmente interferindo com a germinação doembrião. Tradicionalmente, é realizada a remoção do polietilenoglicolpelo armazenamento dos embriões tratados com polietilenoglicol (PEG)num meio gel sem PEG a frio por algumas semanas. O polietilenoglicoleventualmente se difunde no meio separando-se dos embriões. Nãosurpreendentemente, este é um tratamento e uma estratégia de remo-ção demorados e trabalhosos, que provocam um retardo freqüentemen-te inaceitável no processo total de coleta e condicionamento.

A industria da agricultura e, em particular, as ciências flores-tais, desta forma, enfrentam um método trabalhoso, dispendioso eineficiente para a produção, coleta e preparação de embriões vegetais.Esses fatores são obstáculos quando se opera a níveis comerciais. Emesmo assim, a coleta manual é uma prática de rotina típica.

Conforme explicado acima, entretanto, a presente invençãoprovê um método robusto de "Coleta em Massa" que é rápido e barato.Uma vez que a "Coleta em Massa" (MH) minimiza a intervenção huma-na, é menos susceptível a contaminação. Além disto, a presenteinvenção provê também uma nova forma para a remoção de polietileno-glicol. Além disto, o método Coleta em Massa é altamente eficiente,permitindo a coleta simultânea de milhares e centenas de milhares deembriões vegetais durante um período de tempo, e pode ser facilmenteampliado para propósitos comerciais.

A este respeito, a presente invenção provê também uma aborda-gem combinatória para explorar e otimizar as interações genótipo portratamento de etapas múltiplas no processo de embriogênese somática.

Sumário

Num aspecto da invenção, é provido um método para a produçãode planta, o qual compreende (i) a lavagem simultânea de embriõesvegetais múltiplos, e (ii) transferência dos embriões lavados para umsubstrato e um ambiente adequado para o condicionamento dosembriões por um período de tempo desejado de tal forma que se tornemcompetentes para germinação para a produção de plantas. O métodopode adicionalmente compreender a separação de um ou mais dosembriões em qualquer ponto no tempo durante o período de tempodesejado.

Numa modalidade, os embriões vegetais são embriões somáticos.Em uma outra realização, os embriões são lavados sobre uma superfícieporosa. Em ainda uma outra realização, nenhum embrião único foiindividualmente colocado manualmente sobre a superfície porosa.

Numa modalidade, o substrato que é adequado para o armaze-namento dos embriões é um gel, que compreende maltose, glutamina eácido abscísico. O gel pode conter também outros ingredientes, taiscomo nutrientes inorgânicos. O especialista na técnica de armazena-mento e desenvolvimento de embrião sabe quais outros ingredientes sãoúteis para a manutenção e manipulação de embriões vegetais. Em umaoutra realização, o substrato é um papel de filtro saturado com umvolume de meio líquido, o qual compreende maltose, glutamina e ácidoabscísico. O gel pode conter também outros ingredientes, tais comonutrientes inorgânicos. Em uma outra realização, o volume do meiolíquido que é adicionado ao substrato é 1 ml ou 2 ml.

Outras realizações de condicionamento incluem, mas não selimitam a, o seguinte: embriões armazenados em meio gel a frio (1°C a12°C, idealmente de 3 a 6°C) por tempo variável (1 dia a 24 semanas,idealmente de 3 a 12 semanas). Durante este armazenamento a frio osembriões podem ser colocados em uma membrana de poliéster ou papelpara facilitar a transferência subseqüente. Os embriões na membranade poliéster ou papel são então transferidos como uma unidade inteirapara um vaso que é vedado com Nescofllm™ ou opcionalmente sãocolocados sobre um papel de filtro seco no interior do vaso que é vedadocom Nescofllm™. Os embriões no vaso vedado são mantidos à tempera-tura ambiente (15 a 30°C, idealmente 20 a 28°C) por um tempo variável(1 a 12 semanas, idealmente de 2 a 5 semanas dependendo da tempera-tura à qual os embriões foram expostos durante qualquer uma dasetapas acima deste método de condicionamento. Isto é, durante: a. frioem meio gel e b. calor em vaso vedado).

Numa modalidade, os embriões são armazenados por cerca de 1semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas,cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de8 semanas, cerca de 9 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 11semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 13 semanas, cerca de 14semanas, cerca de 15 semanas, cerca de 16 semanas, cerca de 17semanas, cerca de 18 semanas, cerca de 19 semanas, cerca de 20semanas, cerca de 21 semanas, cerca de 22 semanas, cerca de 23semanas, cerca de 24 semanas, ou mais de cerca de 24 semanas.

Outro aspecto da presente invenção é um meio líquido paracrescimento de tecido embriogênico que compreende uma alta concen-tração de caseína. Uma alta concentração de caseína pode ser de cercade 900 mg/l, cerca de 1.000 mg/l, cerca de 1.100 mg/l, cerca de 1.200mg/l, cerca de 1.300 mg/l, cerca de 1.400 mg/l, cerca de 1.500 mg/l,cerca de 1.600 mg/l, cerca de 1.700 mg/l, cerca de 1.800 mg/l, cercade 1.900 mg/l, cerca de 2.000 mg/l, cerca de 2.100 mg/l, cerca de2.200 mg/l, cerca de 2.300 mg/l, cerca de 2.400 mg/l, cerca de 2.500mg/l, cerca de 2.600 mg/l, cerca de 2.700 mg/l, cerca de 2.800 mg/l,cerca de 2.900 mg/l, cerca de 3.000 mg/l ou mais de 3.000 mg/l.

Numa modalidade, a concentração de caseína é entre 1.100 mg/l e3.000 mg/l.

Numa modalidade, o tecido embriogênico é de uma conífera.Numa modalidade preferida, a conífera é pinheiro. Numa modalidademais preferida, o pinheiro é o pinheiro Loblolly.

Noutra realização, a árvore conífera é selecionada do grupoconsistindo em pinheiro branco oriental, branco ocidental, pinheiroSugar, pinheiro vermelho, pinheiro Pitch, pinheiro Jack, pinheiro defolha comprida, pinheiro de folha curta, pinheiro Loblolly, pinheiroSlash, pinheiro da Virgínia, pinheiro Ponderosa, pinheiro Jeffrey,pinheiro Pond, e pinheiro Lodgepole, pinheiro Radiata e híbridoscruzados destes. Em uma outra realização preferida, a árvore conífera éselecionada do grupo consistindo em, mas não se limitando a, Abiesamabilis, Abies balsamea, Abies bornmuelleriana, Abies concolor, Abiesfraseri, Abies grandis, Abies koreana, Abies lasiocarpa, Abies nordman-niana, Abies procera, Araucaria angustifolia, Araucaria araucana,Araucaria bidwillii, Araucaria cunninghamii, Cedrus atlantica, Cedrusdeodara, Chamaecyparis lawsoniana, Chamaecyparis pisifera, Crypto-meria japonica, Cuppressocyparis Ieylandiif Larix decidua, Larix oceiden-talis, Metasequoia glyptostroboides, Picea abies, Pieea engelmannii, Piceaglauca, Picea mariana, Picea pungens, Pieea rubens, Pieea sitehensis,Pinus banksiana, Pinus earibaea, Pinus eontorta, Pinus eehinata, Pinusedulis, Pinus elliotii, Pinus jeffreyi, Pinus korariensis, Pinus lambertiana,Pinus merkusii, Pinus montieola, Pinus nigra, Pinus palustris, Pinuspinaster, Pinus ponderosa, Pinus rígida, Pinus radiata, Pinus resinosa,Pinus serotina, Pinus strobus, Pinus sylvestris, Pinus taeda, Pinusvirginiana, Pseudotsuga menziesii, Sequoia sempervirens, Sequoiaden-dron giganteum, Taxodium aseends, Taxodium distiehum, Taxus baeeata,Taxus brevifolia, Taxus cuspidata, Thuja occidentalis, Thuja plieata,Tsuga eanadensis, Tsuga heterophylla, e híbridos cruzados destas.

Os exemplos específicos de cada uma destas coníferas incluem:

Abies alba, abeto prateado europeu; Abies amabilis, abeto prateado doPacífico; Abies balsamea, abeto balsâmico; Abies bornmuelleriana, abetoturco; Abies concolor, abeto branco; Abies fraseri, abeto Fraser; Abiesgrandis, abeto grande; Abies koreana, abeto coreano; Abies lasiocarpa,abeto alpino; Abies nordmanniana, abeto Nordman; Abies procera, abetonobre; Araucaria angustifolia, pinheiro do Paraná; Araucaria araucana,árvore de Monkeypuzzle; Araucaria bidwillii, pinheiro Bunya; Araucariaeunninghamii, pinheiro Hoop; Cedrus atlantiea, cedro Atlas; Cedrusdeodara, cedro Deodar; Chamaecyparis lawsoniana, cedro de Port-Orford; Chamaecyparis pisifera, Sawara cypress; Cryptomeria japonica,cedro japonês (criptoméria japonesa^; Cuppressocyparis leylandii,cipreste Leyland; Larix decidua, lariço europeu; Larix oceidentalis, lariçoocidental; Metasequoia glyptostroboides, sequóia Dawn; Picea abies,abeto norueguês; Pieea engelmannii, abeto Englemann; Picea glauca,abeto branco; Pieea mariana, abeto negro; Pieea pungens, abeto azul doColorado; Pieea rubens, abeto vermelho; Picea sitehensis, abeto Sitka;Pinus banksiana, pinheiro Jack; Pinus earibaea, pinheiro caribenho;Pinus eontorta, pinheiro Lodgepole; Pinus echinata, pinheiro de folhacurta; Pinus edulis, pinheiro Pinyon; Pinus elliotii, pinheiro Slash; Pinusjeffreyi, pinheiro Jeffrey; Pinus korariensis, pinheiro coreano; Pinuslambertiana, pinheiro Sugar; Pinus merkusii, pinheiro da Sumatra;Pinus montieola, pinheiro branco ocidental; Pinus nigra, pinheiroaustríaco; Pinus palustris, pinheiro de folha comprida; Pinus pinaster,pinheiro marítmo; Pinus ponderosa, pinheiro Ponderosa; Pinus rígida,pinheiro Pitch; Pinus radiata, pinheiro Radiata; Pinus resinosa, pinheirovermelho; Pinus serotina, pinheiro Pond; Pinus strobus, pinheiro brancooriental; Pinus sylvestris, pinheiro de Scots (Scotch); Pinus taeda,pinheiro Loblolly; Pinus virginiana, pinheiro da Virgínia; Pseudotsugamenziesii, abeto Douglas; Sequoia sempervirens, sequóia; Sequoiaden-dron giganteum, sequóia Sierra; Taxodium aseends, cipreste Pond;Taxodium distichum, cipreste careca; Taxus baeeata, teixo europeu;Taxus brevifolia, teixo do Pacífico ou ocidental; Taxus euspidata, teixojaponês; Thuja oceidentalis, cedro branco do norte; Thuja plicata, cedrovermelho ocidental; Tsuga canadensis, cicuta oriental; Tsuga heterophylla, cicuta ocidental.

A presente invenção contempla a Coleta em Massa de embriõessomáticos de quaisquer árvores coníferas. A presente invenção não estálimitada, no entanto, à Coleta em Massa de apenas tecidos de árvoresconíferas e embriões somáticos.

Noutra realização, desta forma, o tecido vegetal, tal como tecidoembriogênico ou um embrião somático, é de uma árvore selecionada dogrupo consistindo em castanheira, freixo, faia, tília americana, bétula,cerejeira, nogueira negra, castanheira da Califórnia, choupo do Canadá,olmo, eucalipto, olmo americano, nogueira norte-americana, azevinho,alfarrobeira, magnólia, bordo, carvalho, álamo, amieiro vermelho,paulônia real, sassafrás, liquidambar, plátano, tupelo, salgueiro, eálamo amarelo, e híbridos cruzados intra e interespécies destas. Umacastanheira particularmente preferida para uso na presente invenção éa castanheira americana.

Numa modalidade, a concentração de caseína no meio líquido éde cerca de 400, cerca de 500, cerca de 600, cerca de 700, cerca de800, cerca de 900, cerca de 1.000, cerca de 1.100, cerca de 1.200, cercade 1.300, cerca de 1.400, cerca de 1.500, cerca de 1.600, cerca de1.700, cerca de 1800, cerca de 1.900, cerca de 2.000, cerca de 2.100,cerca de 2.200, cerca de 2.300, cerca de 2.400, cerca de 2.500, cerca de2.600, cerca de 2.700, cerca de 2.800, cerca de 2.900 ou cerca de 3.000mg/l, ou qualquer integrador entre estas concentrações.

Numa modalidade, a caseína é hidrolisado de caseína.

Outro aspecto da presente invenção é um método para a obten-ção de embriões germinantes, compreendendo (i) a colocação de cultu-ras embriogênicas de crioarmazenagem sobre meio de crio-recuperaçãopor um período de tempo e depois crescimento do tecido embriogênicoem meio líquido, (ii) transferência do tecido embriogênico para meio dedesenvolvimento de embrião para gerar embriões, (iii) lavagem de umamassa de embriões gerados com água, (iv) colocação da massa deembriões lavada em um substrato que é saturado com meio de condi-cionamento, e (ν) germinação dos embriões, onde (a) o meio de crio-recuperação compreende pelo menos uma alta concentração de caseínaou uma quantidade de brassinolide, (b) o meio líquido apresenta umaalta concentração de caseína, (c) o meio de desenvolvimento de embriãocontém uma quantidade desejada de polietilenoglicol, e (d) o meio decondicionamento é líquido.

Neste método, o meio líquido compreende uma concentração decaseína que é de cerca de 1100, cerca de 1200, cerca de 1300, cerca de1400, cerca de 1500, cerca de 1600, cerca de 1700, cerca de 1800,cerca de 1900, cerca de 2000, cerca de 2100, cerca de 2200, cerca de2300, cerca de 2400, cerca de 2500, cerca de 2600, cerca de 2700,cerca de 2800, cerca de 2900, ou cerca de 3000 mg/l ou qualquerintegrador entre estas concentrações.

Em uma outra realização, a percentagem de polietilenoglicol nomeio de desenvolvimento de embrião é de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%,8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ou20%. Numa modalidade, a percentagem de polietilenoglicol no meio dedesenvolvimento de embrião é de 7%. Em uma outra realização, apercentagem de polietilenoglicol no meio de desenvolvimento de embriãoé de 13%.

Numa modalidade, o meio de crio-recuperação compreende umaquantidade de brassinolide. Numa modalidade, a quantidade debrassinolide é de 0,01 μΜ, 0,02 μΜ, 0,03 μΜ, 0,04 μΜ, 0,05 μΜ, 0,06μΜ, 0,07 μΜ, 0,08 μΜ, 0,09 μΜ, 0,10 μΜ, 0,11 μΜ, 0,12 μΜ, 0,13 μΜ,25 0,14 μΜ, 0,15 μΜ, 0,16 μΜ, 0,17 μΜ, 0,18 μΜ, 0,19 μΜ, 0,20, ou 0,50μΜ. Numa modalidade, a concentração de brassinolide é de 0,10 μΜ.

Em um outro aspecto, é provido um método para a identificaçãode condições específicas do genótipo ótimas para o crescimento detecido embriogênico, compreendendo (i) o crescimento de tecido embrio-gênico que foi separado do crioarmazenagem em um meio que compre-ende uma quantidade de brassinolide e (ii) comparação do crescimentodo tecido embriogênico com o crescimento de tecido embriogênico domesmo genótipo em meio que compreende pelo menos uma quantidadediferente de brassinolide.

Em um outro aspecto, é provido um método para a identificaçãode condições específicas de genótipo ótimas para a produção de embri-ão, compreendendo (i) o crescimento de culturas embriogênicas em ummeio de desenvolvimento de embrião que compreende uma quantidadede polietilenoglicol e (ii) comparação do crescimento das culturasembriogênicas a embriões com o crescimento de embriões do mesmogenótipo em meio de desenvolvimento de embrião que compreende pelomenos uma quantidade diferente de polietilenoglicol.

Em um outro aspecto do método descrito aqui, estes são combi-nados para produzir um método para a identificação das condiçõesótimas específicas para genótipo para crescimento de tecido embriogê-nico e produção de embrião para um genótipo vegetal particular.

Numa modalidade, após a Coleta em Massa de acordo comqualquer um destes métodos, os embriões são colocados em umsubstrato que foi saturado com um volume de líquido contendo meio decondicionamento, o qual contém nutrientes necessários para prepararos embriões para a germinação. O substrato pode ser um papel defiltro.

Numa modalidade, o papel de filtro saturado sobre o qual osembriões são colocados é retido em uma placa, tal como uma placa dePetri. Em uma outra realização, a placa é embrulhada com fita oumaterial de embalagem poroso de maneira a controlar a perda deumidade da placa. Em uma outra realização, a placa, que contém opapel de filtro e os embriões é armazenada no frio por um período detempo.

A extensão de tempo em que um embrião somático coletado emmassa pode ser armazenado a frio é de 1 a 5 semanas, por pelo menos5 semanas, por pelo menos 8 semanas, por pelo menos 10 semanas,por pelo menos 12 semanas, por pelo menos 13 semanas, por pelomenos 14 semanas, por pelo menos 15 semanas, por pelo menos 16semanas, 18 semanas, 20 semanas, 22 semanas, 24 semanas, ou pormais de 24 semanas.

Por exemplo, um embrião somático coletado em massa pode serarmazenado a frio sob as condições descritas aqui por 1 semana, 2semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13semanas, 14 semanas, 15 semanas, 16 semanas, 17 semanas, 18semanas, 19 semanas, 20 semanas, 21 semanas, 22 semanas, 23semanas, 24 semanas, 25 semanas, 26 semanas, 27 semanas, 28semanas, 29 semanas, 30 semanas, 31 semanas, 32 semanas, 33semanas, 34 semanas, 35 semanas, 36 semanas, 37 semanas, 38semanas, 39 semanas, 40 semanas, 41 semanas, 42 semanas, 43semanas, 44 semanas, 45 semanas, 46 semanas, 47 semanas, 48semanas, 49 semanas, 50 semanas, 51 semanas, ou 52 semanas, oumais de 52 semanas.

Num aspecto da presente invenção, é provido um métodocombinatório para a otimização da embriogênese somática, compreen-dendo (i) iniciar a embriogênese de um tecido embriogênico vegetal emum meio de iniciação que compreende uma alta concentração decaseína, (ii) manutenção do tecido embriogênico iniciado em um meio demanutenção que compreende uma alta concentração de caseína antesda crioarmazenagem, (iii) recuperação do tecido embriogênico dacrioarmazenagem em um meio que compreende pelo menos um de (a)alta concentração de caseína ou (b) uma quantidade de brassinolide, e(iv) desenvolvimento dos embriões a partir do tecido embriogênicorecuperado em um meio de desenvolvimento de embrião que compreen-de uma percentagem de polietilenoglicol que é ótima para o genótipo dotecido embriogênico a partir do qual os embriões devem ser desenvolvidos.

Numa modalidade deste método, a percentagem de polietileno-glicol no meio de desenvolvimento de embrião é de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%,19%, ou 20%. Numa modalidade, a percentagem de polietilenoglicol nomeio de desenvolvimento de embrião é de 7%. Em uma outra realiza-ção, a percentagem de polietilenoglicol no meio de desenvolvimento deembrião é de 13%.

Em uma outra realização, o meio no qual o tecido embriogênicoé recuperado após a crioarmazenagem compreende uma alta concentra-ção de caseína e uma quantidade de brassinolide.

Numa modalidade, a quantidade de brassinolide é de 0,01 μΜ,0,02 μΜ, 0,03 μΜ, 0,04 μΜ, 0,05 μΜ, 0,06 μΜ, 0,07 μΜ, 0,08 μΜ, 0,09μΜ, 0,10 μΜ, 0,11 μΜ, 0,12 μΜ, 0,13 μΜ, 0,14 μΜ, 0,15 μΜ, 0,16 μΜ,0,17 μΜ, 0,18 μΜ, 0,19 μΜ, ou 0,20 μΜ. Numa modalidade, a concen-tração de brassinolide é de cerca de 0,10 μΜ.

Em uma outra realização, o meio de iniciação compreendeadicionalmente uma baixa concentração de maltose. Numa modalida-de, a concentração de maltose é de cerca de 1 g/l, 2 g/l, 3 g/l, 4 g/l, 5g/l, 6 g/l, 7 g/l, 8 g/l, 9 g/l, 10 g/l, 11 g/l, 12 g/l, 13 g/l, 14 g/l, 15g/l, 16 g/l, 17 g/l, 18 g/l, 19 g/l, ou 20 g/l. Numa modalidade, aconcentração de maltose é de cerca de 15 g/l.

Em um outro aspecto da presente invenção, é provido ummétodo para a preparação de embriões para armazenamento, compre-endendo (i) lavagem simultânea de embriões vegetais múltiplos, e (ii)transferência dos embriões lavados para um substrato adequado paracondicionamento dos embriões para armazenamento em um vaso porum desejado período de tempo. Numa modalidade, onde os embriõesvegetais são embriões somáticos. Numa modalidade, os embriõesvegetais são lavados em uma malha que permite a passagem de frag-mentos celulares e líquido, mas não a passagem dos embriões. Destaforma, Numa modalidade, os embriões são lavados em uma superfícieporosa e onde nenhum embrião é colocado manualmente sobre asuperfície porosa. Numa modalidade, a etapa de transferência dosembriões lavados compreende a inversão da malha sobre a qual osembriões foram lavados diretamente sobre o substrato, onde o substra-to ou já se encontra no vaso ou é subseqüentemente movido para umvaso ou ambiente para o condicionamento e armazenamento adequa-dos. Desta forma, os embriões podem ser invertidos a partir da malhade lavagem sobre um substrato de condicionamento.

Em uma outra realização, o substrato de condicionamento é umgel compreendendo maltose, glutamina, e ácido abscísico. Em umaoutra realização, o substrato de condicionamento é um papel de filtrosaturado com um volume de meio líquido, o qual compreende maltose,glutamina e ácido abscísico. Numa modalidade, o volume do meiolíquido é de 1 ml ou 2 ml.

Numa modalidade, o condicionamento ocorre em um ambientede umidade relativa alta sem armazenamento a frio. Em uma outrarealização, o condicionamento compreende o armazenamento dosembriões em um meio gel a frio por um período de tempo. Em umaoutra realização, o método compreende adicionalmente a colocação dosembriões em uma membrana de poliéster ou papel, transferência damembrana para um vaso, que então é vedado, manutenção do vaso auma temperatura quente por um período de tempo.

Um aspecto da presente invenção refere-se a um aparelho para apreparação de embriões vegetais múltiplos para a produção de plantas.

O aparelho inclui uma estrutura de liberação de fluido para a liberaçãode líquido de entrada para os embriões vegetais múltiplos, uma estaçãode limpeza em comunicação fluida com a estrutura de liberação defluido e configurada para manter os embriões vegetais múltiplos demaneira a que recebam o líquido de entrada a partir da estrutura deliberação de fluido para limpeza dos fragmentos celulares dos embriõesvegetais múltiplos, um mecanismo de saída em comunicação fluida coma estação de limpeza e configurado para receber o líquido de saída daestação de limpeza, e um controlador configurado para controlar pelomenos a estrutura de liberação de fluido, a estação de limpeza, ou omecanismo de saída.

Numa modalidade, a estrutura de liberação de fluido podeincluir um mecanismo de aspersão para aspergir os embriões vegetaismúltiplos.

Em uma outra realização, a estação de limpeza pode incluir umaunidade de lavagem para a lavagem dos embriões vegetais múltiplos, euma unidade de enxágüe para o enxágüe dor embriões vegetais múlti-plos.

Em ainda uma outra realização, a unidade de enxágüe podeincluir um material poroso para manter os embriões vegetais múltiplose apresentar um tamanho de poro em uma faixa de 15 micra a 65micra. O material poroso pode ser configurado para manter os embri-ões vegetais múltiplos, o material poroso sendo removível para removeros embriões vegetais múltiplos da unidade de enxágüe.

Em ainda uma outra realização, a estação de limpeza podeincluir uma unidade de suporte que transporta os embriões vegetaismúltiplos da unidade de lavagem para a unidade de enxágüe. Aunidade de suporte pode incluir um material poroso no qual o tamanhodo poro pode estar na faixa de 400 micra a 900 micra. A unidade desuporte pode incluir um primeiro material poroso configurado para fixaros embriões vegetais múltiplos e apresentar um primeiro tamanho deporo. A unidade de enxágüe pode incluir um segundo material porosoconfigurado para fixar os embriões vegetais múltiplos. Preferivelmente,o segundo tamanho de poro é menor que o primeiro tamanho de poro.

Em ainda uma outra realização, pelo menos um de estrutura deliberação de fluido, unidade de lavagem, e unidade de suporte, incluiuma carcaça substancialmente transparente para permitir a monitora-ção de pelo menos uma de lavagem e enxágüe através da carcaçasubstancialmente transparente.

Em ainda uma outra realização, o aparelho inclui uma estruturacontrolada pelo controlador para movimentar a unidade de suporte daunidade de lavagem para a unidade de enxágüe.

Em ainda uma outra realização, o mecanismo de saída podeincluir uma primeira saída em comunicação fluida com a unidade delavagem e configurada para receber o líquido de saída da unidade delavagem, e uma segunda saída em comunicação fluida com a unidadede enxágüe e configurada para receber líquido de saída da unidade deenxágüe.

Em ainda uma outra realização, o aparelho pode incluir umafonte de pressão negativa em comunicação fluida com o mecanismo desaída para prover uma pressão negativa. A fonte de pressão negativapode incluir um sistema a vácuo compreendendo uma válvula eletrôni-ca conectada a uma bomba de vácuo. A fonte de pressão negativa podeincluir uma válvula de verificação em comunicação fluida com a estaçãode limpeza e configurada para operar como função do peso do líquido desaída e uma força da pressão negativa.

Em uma outra realização, preferivelmente, o controlador éconfigurado para controlar o fluxo de líquido de entrada através daestrutura de liberação de fluido. O controlador pode ser configuradopara controlar a pressão do líquido de entrada liberado pela estruturade liberação de fluido. O controlador pode ser configurado para mantera pressão do líquido de entrada na faixa de 0,000356 a 0,00014 qulilo-gramaforça por centímetro quadrado a uma distância padrão normali-zada de trinta centímetros.

Ainda noutra realização, o aparelho pode incluir uma fonte depressão negativa em comunicação fluida com o mecanismo de saída,onde o controlador é configurado para controlar uma pressão do líquidode entrada liberado pela estrutura de liberação de fluido e para contro-lar uma pressão fornecida pela fonte de pressão negativa para o meca-nismo de saída.

Em ainda uma outra realização, a estação de limpeza podeincluir uma unidade de lavagem, e uma unidade de enxágüe configura-da para fixar os embriões vegetais múltiplos. O mecanismo de saídapode incluir uma primeira saída em comunicação fluida com a unidadede lavagem e configurada para receber o primeiro líquido de saída daunidade de lavagem, e uma segunda saída em comunicação fluida coma unidade de enxágüe e configurada para receber o segundo liquido desaída da unidade de enxágüe. O aparelho pode adicionalmente incluiruma fonte de pressão negativa em comunicação fluida com as primeirae segunda saídas para fornecer pressão negativa para as primeira esegunda saídas, onde o controlador é configurado para controlar aestrutura de liberação de fluido e a fonte de pressão negativa.

Ainda noutra realização, o aparelho pode incluir um sistema decondicionamento de fluido em comunicação fluida com a estrutura deliberação de fluido e configurado para pelo menos filtrar o líquido deentrada ou esterilizar o líquido de entrada. O sistema de condiciona-mento de fluido pode incluir um filtro de membrana e um esterilizador UV.

Em ainda uma outra realização, a estação de limpeza pode serconfigurada para remover polietilenoglicol dos embriões vegetaismúltiplos.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um métodopara a preparação de embriões vegetais múltiplos para a produção deplantas. O método inclui o fornecimento de embriões vegetais múltiplosa uma estação de limpeza, lavagem dos embriões vegetais múltiplospela liberação de um líquido de entrada para os embriões vegetais, econtrole com um controlador de um fluxo de líquido de entrada liberadopara os embriões vegetais.

Numa modalidade, a pressão do líquido de entrada pode sermantida na faixa de 0,000356 a 0,00014 qulogramaforça por centímetroquadrado a uma distância padrão normalizada de trinta centímetros.

Noutra realização, o método pode incluir adicionalmente ofornecimento de uma pressão negativa para a estação de limpeza para ocontrole do fluxo de líquido de saída, e controle com o controlador dapressão negativa fornecida para a estação de limpeza.

Ainda noutra realização, o método pode incluir adicionalmentepelo menos um de: filtragem do líquido de entrada e esterilização dolíquido de entrada.Ainda noutra realização, o método pode incluir a remoção depolietilenoglicol dos embriões vegetais múltiplos na etapa de lavagem.

Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se a ummétodo para a preparação de embriões vegetais múltiplos para aprodução de plantas. O método inclui o fornecimento de embriõesvegetais múltiplos a uma unidade de lavagem, lavagem dos embriõesvegetais múltiplos pela liberação de um primeiro líquido de entrada emuma unidade de lavagem, transporte dos embriões vegetais múltiplospara uma unidade de enxágüe, enxágüe dos embriões vegetais múlti-pios pela liberação de um segundo líquido de entrada na unidade deenxágüe, e controle com um controlador de pelo menos uma das etapasde lavagem, transporte e enxágüe.

Numa modalidade, o método pode incluir adicionalmente aaplicação de uma primeira pressão negativa à unidade de lavagem paracontrolar o fluxo do primeiro líquido de saída da unidade de lavagem, eaplicação de uma segunda pressão negativa à unidade de enxágüe paracontrolar o fluxo do segundo líquido de saída da unidade de enxágüe.

Em uma outra realização, o método pode incluir adicionalmentepelo menos um de: filtragem dos primeiro e segundo líquidos de entradae esterilização dos primeiro e segundo líquidos de entrada.

Em ainda uma outra realização do método, o primeiro líquido deentrada e o segundo líquido de entrada podem apresentar a mesmacomposição. Alternativamente, o primeiro líquido de entrada e osegundo líquido de entrada podem apresentar composições diferentes.

Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se a ummétodo para a preparação de embriões somáticos de conífera múltiplos.

O método inclui posicionar-se os embriões somáticos de coníferamúltiplos sobre um material poroso apresentando um tamanho de porona faixa de 400 micra a 900 micra, e liberação de fluido para os embri-ões somáticos de conífera múltiplos sobre o material poroso para limparos embriões somáticos de conífera. Em um refinamento adicional, otamanho de poro do material poroso pode estar na faixa de 560 micra a710 micra ou na faixa de 600 micra a 670 micra.

Numa modalidade da presente invenção pelo menos uma dasetapas de lavagem e transferência é automatizada. De fato, qualquerum dos métodos descritos aqui pode compreender etapas que sãocompletamente ou parcialmente automatizadas e/ou operadas porcomputador por meio de programas que podem ou não requerer interfe-rência, intervenção ou interação humana. Neste aspecto, a presenteinvenção contempla também aparelhos ou máquinas completamenteautomatizados ou semi-automatizados para a coleta de embriões. Taisaparelhos de acordo com a presente invenção realizam várias funçõesautomatizadas pertinentes às técnicas de coleta da presente invenção.

Desta forma, um aparelho completamente ou semi-automatizado dapresente invenção pode realizar funções compreendendo (1) carga deembriões sobre uma superfície, (2) lavagem dos embriões, (3) enxágüedos embriões, e (4) retirada ou transferência dos embriões da superfíciepara uma outra superfície ou vaso ou recipiente para manipulaçãoposterior. O aparelho pode transferir os embriões tratados por meio deum braço mecânico ou uma superfície móvel, por exemplo, para umambiente de condicionamento sem a intervenção humana. Destaforma, a intervenção humana pode ser requerida apenas na etapa decolocar os embriões no aparelho e colocá-los na ou sobre a superfícieapropriada do aparelho. A partir deste ponto em diante, nenhumaintervenção humana é necessária até que os embriões estejam condi-cionados por um desejado período de tempo. Neste ponto, um humanopode remover um ou mais embriões do ambiente de condicionamentopara saber se é competente quanto a germinação e o deslocamento paraa plantação deste embrião pronto para a germinação para a propagaçãovegetal. Mesmo então, esta etapa, a etapa de remoção de embriõescompetentes quanto a germinação pode ser automatizada. Isto é, oaparelho pode ser projetado de tal forma que os embriões são automati-camente removidos do ambiente de condicionamento após um períodode tempo que se sabe produz embriões competentes quanto a germina-ção, e colocados em uma superfície apropriada para a semeadura ouenraizamento de maneira a promover a germinação e crescimento debrotos.

Um aparelho semi-automatizado que realiza tais funções podeser semi-automatizado no sentido de que pode requerer intervençãohumana em certos pontos no processo, tais como levar os embriõespara o aparelho, permitindo a intervenção humana aumentar oudecrescer uma etapa de lavagem ou enxágüe, ou simplesmente iniciar oprograma de computador que controla a operação dos componentes doaparelho. Desta forma, a presente invenção contempla o aparelho que édescrito aqui e que realiza as funções delineadas acima. Ver também o

Exemplo 23 abaixo.

A presente invenção reconhece e estima também que certascaracterísticas deste aparelho podem ser modificadas ou alteradasdurante e em resposta à tarefa de coleta de embriões desejada. Destaforma, o aparelho pode ser modificado de forma a aumentar o númerototal de embriões que pode ser tratado de acordo com os protocolos decoleta e lavagem descritos aqui. Por exemplo, o aparelho descrito noExemplo 23, pode incluir mais de três unidades nas quais os embriõessão lavados. Isto é, o aparelho pode ser adaptado para incluir maisunidades ou unidades de maior capacidade. Além disto, a presenteinvenção contempla a manipulação do programa de computador queaciona e opera o aparelho. Neste aspecto, a presente invenção contem-pia o fato de um aparelho automatizado da presente invenção sercontrolado por programa de computador que segue e implementa, emtermos computacionais, o diagrama de fluxo do processo mostrado naFigura 11. Por exemplo, o aparelho descrito aqui pode ser operado pore sob o controle de programa de computador que implementa o proces-so da Figura 11. O especialista na técnica percebe que quaisquerdestes parâmetros são abertos à manipulação. Desta forma, a presenteinvenção contempla o programa que controla sensores, os quais deter-minam a carga aproximada de embriões que é colocada sobre a superfí-cie de carga. Dependendo desta determinação, o programa poderealizar e enviar comandos para aumentar ou reduzir o tempo dasetapas de lavagem e enxágüe, por exemplo. Desta forma, se umabatelada subseqüente de embriões for duas vezes maior que a cargaprévia, os sensores irão aumentar a duração da etapa de lavagem quese segue ou torná-la mais potente, ou pode requerer que as etapas delavagem ou enxágüe sejam repetidas por um número de vezes. Damesma forma, o aparelho automatizado da presente invenção para aimplementação das novas técnicas de coleta descritas, é adaptável,conveniente, e útil para o processamento simultâneo de embriõesmúltiplos. Por embriões múltiplos, a presente invenção contempla ofato de 5.000, 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000, 70.000,80.000, 90.000, 100.000, 110.000, 120.000, 130.000, 140.000,150.000, 160.000, 170.000, 180.000, 190.000, 200.000, 210.000,220.000, 230.000, 240.000, 250.000, 260.000, 270.000, 280.000,290.000, 300.000 ou mais ou qualquer integrador entre estes, embriõespoderem ser processados, por exemplo, lavados e enxaguados, por diapela utilização dos métodos e aparelhos descritos aqui.

A presente invenção contempla também embriões que sãopreparados por qualquer dos métodos descritos aqui. Em um outroaspecto, a presente invenção engloba uma planta que é crescida a partirde qualquer dos embriões tratados descritos aqui.

Deve ser entendido que tanto a descrição genérica acima quantoas descrições detalhadas a seguir são típicas e explicativas apenas, enão são restritivas da invenção reivindicada.

Breve Descrição dos Desenhos

Os desenhos anexos, os quais são incorporados e constituemparte deste relatório, ilustram realizações da invenção e em conjuntocom a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.

A Figura 1 é um esquema mostrando as etapas da iniciaçãoembriogênica, intumescimento em líquido, desenvolvimento de embrião,Coleta em Massa, armazenamento a frio, pré-germinação, e germinação.

A Figura 2 é um desenho esquemático de uma realização de umaparelho de limpeza de embrião vegetal de acordo com a presenteinvenção.

A Figura 3 é um desenho esquemático de uma fonte de fluido delimpeza, de um sistema de condicionamento fluido, e um mecanismo deaspersão do aparelho de limpeza de embrião vegetal da Figura 2.

A Figura 4 é um desenho esquemático de uma estação delimpeza do aparelho de limpeza de embrião vegetal da Figura 2.

A Figura 5 é um desenho esquemático de um mecanismo desaída e fonte de pressão negativa do aparelho de limpeza de embriãovegetal do Figura 2.

A Figura 6 é uma vista em perspectiva do aparelho de limpezade embrião vegetal do Figura 2.

As Figuras 7A a 7F são vistas em perspectiva do aparelho delimpeza de embrião vegetal do Figura 2 em operação.

As Figuras 8A e 8B são uma vista em seção transversal e umavista lateral, respectivamente, de um mecanismo de aspersão, umsuporte de montagem, e um cilindro pneumático do aparelho de limpezade embrião vegetal do Figura 2.

As Figuras 9A e 9B são uma vista plana e uma vista em seçãotransversal, respectivamente, de unidades de suporte, um suporte demontagem, um dispositivo rotativo, e um cilindro pneumático doaparelho de limpeza de embrião vegetal do Figura 2.

A Figura IOA é uma vista plana de unidades de lavagem,unidades de enxágüe, duas válvulas eletrônicas, e uma estrutura móvelhorizontal do aparelho de limpeza de embrião vegetal do Figura 2.

A Figura IOB é uma vista lateral das unidades de enxágüe, ummanifold a vácuo, funis de saída do aparelho de limpeza de embriãovegetal do Figura 2.

A Figura 10 C é uma vista seção transversal mostrando asunidades de lavagem, os funis de saída, o manifold a vácuo, e um trilhohorizontal do aparelho de limpeza de embrião vegetal do Figura 2.

A Figura 10D é uma vista seção transversal mostrando aunidade de enxágüem o manifold a vácuo, a o trilho horizontal doaparelho de limpeza de embrião vegetal do Figura 2.

A Figura 11 é um fluxograma do processo da máquina de Coletaem Massa intermediário.

Descrição Detalhada

O presente método de "Coleta em Massa" é rápido, barato ealtamente eficiente. O método engloba a lavagem e enxágüe de grandesnúmeros de embriões vegetais en masse, em vez de individualmente.

Após a lavagem, os embriões são transferidos para um meio, oqual foi formulado para aumentar a integridade e viabilidade dosembriões lavados por períodos de tempo prolongados. Além disto,conforme descrito aqui, muitas das etapas da Coleta em Massa econdicionamento podem ser realizadas com meio líquido, desta formaeliminando certas etapas de plaqueamento em gel e certas exigências dearmazenamento.

É provido também um aparelho para implementar o material deColeta em Massa. Este é adaptável e pode ser modificado para atuarautomaticamente, conforme será descrito com maiores detalhes abaixo.Em resumo, no entanto, o aparelho de Coleta em Massa pode aumentara taxa de produção de coleta de embrião em um mínimo de muitasdezenas de milhares de embriões por pessoa/dia de cerca de 2.000 pordia via coleta manual. Isto leva a um aumento significativo na eficiên-cia e um aumento do número de mudas germinadas e plantáveis porgrama de cultura de célula embriogênica. Abaixo são descritos métodospara a coleta em massa cerca de 100.000 e mesmo mais de um milhãode embriões por pessoa por dia.

Qualquer coleção de embriões pode ser tratada de acordo com ométodo e aparelho de Coleta em Massa. Desta forma, os presentesmétodos não requerem pré-tratamento dos embriões antes das etapasde lavagem, enxágüe e armazenamento. É útil, entretanto, se observarcertas etapas e substâncias pertinentes que auxiliam o desenvolvimentode embriões. O processo completo a partir da coleta da pinha, no casode tratamento de conífera, até a produção, armazenamento e germina-ção do embrião, pode também ser resumido como se segue:

1. Coleta e armazenamento da pinha, usualmente a frio.

2. Iniciação embriogênica somática em meio de iniciação.

3. Manutenção do tecido embriogênico em meio de manu-tenção.

4. Armazenamento criogênico do tecido embriogênico esubseqüente crio-recuperação.

5. Crescimento do tecido embriogênico.

6. Desenvolvimento dos embriões somáticos em meio dedesenvolvimento de embrião.

7. Coleta, por exemplo, por meio manual ou por meio deColeta em Massa.

8. Condicionamento dos embriões coletados, pode incluiretapas de pré-germinação.

9. Germinação.

Muitos fatores nestas condições de cultivo afetam a produção deembriões, tais como o material de partida (genótipo, fonte, estágiofisiológico do explante), meio (minerais, reguladores de crescimentovegetal, agentes de suporte), ambiente (temperatura, propriedades deiluminação, recipientes), tempo e finalmente a interação entre todosestes fatores.

A este propósito, hormônios vegetais representam um papelimportante na embriogênese. Certas substâncias importantes a esterespeito são auxina e citoquinina.

O ácido abscísico (ABA) foi há muito proposto como represen-tando um papel importante na maturação da semente e na supressãode germinação precoce. NO desenvolvimento de sementes, estimula oacúmulo de substâncias de reserva e prepara os embriões para umadormência. Também aumenta e tolerância à dissecação dos embriões.Em sementes em maturação de P. glauca, o teor de ABA é mais alto emmegagametófitos que precedem a deposição de reserva. Embriõeszigóticos se desenvolvem em um ambiente com altos níveis de ABA, eeste hormônio pode ser transportado dos megagametófitos para osembriões. O teor de ABA varia entre 7-20 μΜ no embrião e em célulasde revestimento de semente durante o desenvolvimento da semente.

Uma redução na sensibilidade a ABA exógeno bem como umaumento da sensibilidade a GAs foram observados no final do desenvol-vimento do embrião. ABA adicionado de forma exógena inibe a germi-nação, no entanto, durante o desenvolvimento da semente os embriõessão capazes de germinar apesar dos altos níveis de ABA. Uma secagemparcial irá aumentar a germinação e reduzir o nível de ABA. Secagemadicional continua a acelerar a germinação, no entanto, não reduzadicionalmente a concentração de ABA. A disponibilidade de água podeafetar a sensibilidade. Estas alterações na sensibilidade a hormôniopodem representar um papel na germinação.

O ABA também representa um papel importante durante aembriogênese somática. Em embriões somáticos de Picea glauca, porexemplo, o ABA estimula o crescimento embrionário e inibe a germina-ção precoce, e em embriões somáticos de P. glauca χ Ρ. engelmannii, otratamento com ABA aumenta o acúmulo de proteína de armazenamen-to. O ABA exógeno é também capaz de induzir a expressão de genesque codificam algumas proteínas LEA em embriões somáticos de Piceaglauca e Pinus edulis. Algumas vezes, sem tratamento com ABA, podese desenvolver um crescimento de embriões somáticos anormal. Estetipo de embrião somático é usualmente não germinável por causa dapreparação inadequada para a germinação.

Algum desenvolvimento espontâneo de embriões somáticos deconífera pode ocorrer em um meio livre de hormônio ou com tratamentocom PEG, no entanto, em um meio contendo ABA, na metade dodesenvolvimento embrionário, os embriões começam a acumulartriglicerídeos e proteínas de armazenamento e se desenvolver a embri-ões somáticos cotilédones maduros. A primeira maturação não espon-tânea de embriões somáticos de coníferas de P. abies utilizando-se umbaixo nível de ABA exógeno (0,1-1 μΜ) foi reportado por Becwar M.R.,e colaboradores, "A method for quantification of the levei of somaticembryogenesis among Norway spruce callus IinesT, Plant Cell Reports,6:35-38, 1987, que é incorporado aqui como referência. Ver tambémPatente US 5.183.757, que é aqui incorporada como referência.

Níveis mais altos de ABA foram posteriormente utilizados namaturação de embrião de P. abies e P. sitchensis e níveis de até 100 μΜde ABA são utilizados em culturas de embrião de conífera. Ver, porexemplo, von Arnold S. & Hakman I., uRegulation of somatic embryodevelopment in Picea abies by abscisic acid (ABAf, J. Plant Physiol.,132:164-169, 1988, Boulay e colaboradores, "Development of somaticembryos from cell suspension cultures of Norway spruce (Picea abiesKarst.)", Plant Cell Rep., 7:134-137, 1988, e Attree S.M. & Fowke L.C.,aEmbryogeny of gymnosperms: advances in synthetic seed technology ofconifers?, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 35:1-35, 1993.

O ABA pode ser utilizado em meio de iniciação padrão. Umaconcentração de 10 mg/l de ABA não é atípica. Ver, por exemplo,patente US 5.677.185, a qual é incorporada aqui como referência.

As giberelinas também representam um papel importante naembriogênese. Mais de 12 GAs foram identificadas em coníferas (Wange colaboradores 1996). GAs adicionadas de forma exógena não apre-sentam qualquer influência aparente no desenvolvimento de embriõessomáticos provavelmente devido à síntese suficiente de GAs endógenas.

De acordo com a presente invenção, uma alta concentração decaseína, que é uma fonte de nitrogênio bem conhecida, também ébenéfica no meio de iniciação, meio de manutenção e meio de "intumes-cimento" líquido. Outras fontes de nitrogênio podem ser tambémbenéficas em tais meios tais como glutamina.

Na embriogênese somática assexuada, as células somáticaspodem se desenvolver em brotações após as mesmas etapas morfológi-cas como zigotos. Os embriões somáticos in vitro são induzidos direta-mente a partir do explante ou indiretamente pelos calus subcultivadosou estágio de cultura em suspensão.

O primeiro sucesso em embriogênese somática entre coníferasfoi reportado em 1985 para Picea abies (abeto norueguês). Ver HakmanI. & von Arnold S., "Plantlet regeneration through somatic embryogenesisin Picea abies (Norway sprucef, J. Plant Physiol, 121:149-158, 1985, eChalupa V., "Somatic embryogenesis and plantlet regeneration fromcultured immature and mature embryos of Picea abies (L.) Karsf, Comm.Inst. Forest Chech., 14:57-63, 1985.

A embriogênese somática para Pinus é descrita em Gupta P.K. &Durzan D.J., uSomatie polyembryogenesis from eallus of mature sugarpine embryos?, Bio/Teehnol., 4:643-645, 1986.

Tratamentos similares possibilitaram a embriogênese somáticaem várias outras espécies de coníferas. Ver Minocha S.C. & MinochaR., " Historical aspects of somatic embryogenesis in woody plants", emSomatic Embryogenesis In Woody Plants, Vol. 1:9-22, Kluwer AcademicPublishers, Holanda. ISBN 0-7923-3035-8, 1995.

A proliferação in vitro de culturas embriogênicas de coníferausualmente ocorre em meio de cultura contendo auxina e citoquinina.Nitrogênio orgânico, algumas vezes na forma de caseína, é tambémfreqüentemente necessário para manter a capacidade embriogênica dasculturas. Eventos no início do desenvolvimento de um embrião somáti-co de conífera estão atualmente sendo calorosamente debatidos. Asobservações variam desde a iniciação do desenvolvimento do embrião apartir de células citoplasmáticas vacuoladas longas ou densas peque-nas, por meio de divisão desigual a iniciais embriogênicos e suspenso-res.

Para a produção efetiva de embriões, culturas de tecido embrio-gênico de coníferas são usualmente mantidas em um meio contendoauxina e citoquinina, diferentemente de muitas culturas embriogênicasde dicotiledôneas, onde apenas a auxina (usualmente 2,4-D) é freqüentemente necessária para induzir a embriogênese.

Para discussões adicionais sobre embriogênese, ver o Capítulo 2de Santanen, A., uPolyamine Metabolism During Development of Somaticand Zygotic Embryos of Pieea Abies (Norway Sprueef DissertaçãoAcadêmica, Universidade de Helsinki, Faculdade de Ciência, Depart-mento de Biociências, Divisão de Fisiologia Vegetal, novembro 2000.

Da mesma forma, é bem conhecido como estimular apropriada-mente culturas embriogênicas e a produção de embriões a partir deuma variedade de espécies vegetais, e as substâncias que são úteis paraaumentar ou facilitar estes desenvolvimentos biológicos.

A este propósito, observou-se que a lavagem e enxágüe da Coletaem Massa remove substancialmente as moléculas de polietilenoglicolque se aderem às superfícies do embrião durante sua exposição ao meiode desenvolvimento embriogênico. Esta é uma observação significativa,porque a remoção do polietilenoglicol por meio de lavagem e enxágüeelimina várias etapas demoradas e trabalhosas no protocolo de coletatradicional. Por exemplo, não é necessário se armazenar os embriõescoletados em massa em meio gel no frio por 3-4 semanas para permitira difusão do polietilenoglicol dos embriões.

Em certas situações anteriores à Coleta em Massa, é desejável se"intumescer" o tecido embriogênico antes de sua transferência para ummeio de desenvolvimento de embrião. Tradicionalmente, as culturas detecido embriogênico que foram armazenadas por criogenia, por exemplo,são colocadas em meio gelificado e incubadas por um período de tempoaté que haja crescimento suficiente para justificar sua transferênciapara um meio de desenvolvimento. Por exemplo, o tecido embriogênicopode ser cultivado em cestas de poliéster colocadas sobre a superfíciedo meio gelifícado. O tecido, juntamente com a cesta, pode ser transfe-rido com freqüência para meio fresco, por exemplo, a cada duas sema-nas, até que uma massa de tecido adequada tenha sido obtida. Asculturas podem ser tipicamente incubadas no escuro a 25°C. Osmétodos podem ser utilizados a partir de tecido em crescimento deriva-do de explantes semente imaturos, ou a partir de tecido recuperado dacrio-preservação. Os meio adequados são descritos nas Tabelas 1 e 2.

A crioarmazenagem de culturas pode utilizar meio do métodopadrão (utilizando-se meio líquido DCR) ou o método alternativoformulado aqui utilizando-se o meio líquido Mi3 com alto teor decaseína e, opcionalmente alto teor de glutamina. A utilização de meioMi3 com teor de caseína aumentado e alto teor de glutamina resulta emum aumento significativo do crescimento em culturas nos métodospadrão. O meio de crioarmazenagem pode conter também dois suple-mentos de sorbitol 0,4 M e DMSO (dimetil sulfóxido) 10% em volume.Ver, por exemplo, Patente US 5.413.930.

Pode-se também incluir ABA (10 mg/l) no meio de crio-recuperação. Ver Patente US 6.682.931.

De acordo com a presente invenção, no entanto, o tecido embrio-gênico pode ser "intumescido" ou crescido em uma versão líquida domeio gel tradicional. Conseqüentemente, a eliminação da etapa deplaqueamento auxilia na corrente do processo de desenvolvimento doembrião e reduz os custos associados com a produção de placas em gel,por exemplo. Neste método alternativo, são inicialmente estabelecidasculturas em suspensão líquida dispersando-se o tecido embriogênicoem meio líquido em um frasco ou vaso de cultivo de tamanho apropriado.

As culturas em suspensão são incubadas no escuro a 25°C emuma mesa de agitação. Meio de suspensão líquido pode ser rotineira-mente adicionado durante o período de incubação. As culturas podemser monitoradas semanalmente até que tenham crescido para umamassa que seja adequada para o plaqueamento para o desenvolvimentoembrionário. A este propósito, o "volume celular sedimentado" (SCV) éum indicador da massa celular suspensa no líquido. Neste caso,quando o SCV atinge pelo menos 50% do volume total da suspensão, otecido embriogênico está com uma massa adequada para o plaquea-mento. Se for necessário tecido adicional, as culturas em suspensão defrascos individuais podem ser utilizadas para estabelecer frascosadicionais. Os meios adequados são descritos nas Tabelas 1 e 2.

Os tecidos embriogênicos que foram intumescidos a partir ou dogel tradicional ou do meio em suspensão líquido alternativo, podem serutilizados para desenvolver embriões somáticos. Uma quantidade dotecido intumescido pode ser transferida para uma cesta de poliéster ecolocada sobre a superfície do meio de desenvolvimento de embrião. Otecido e as cestas podem ser transferidas para meio fresco após umperíodo de tempo. Tipicamente, o tecido intumescido pode ser armaze-nado em meio de desenvolvimento de embrião por 4-6 semanas no frio.Após este tempo, os embriões podem ser coletados em massa de acordocom os protocolos descritos aqui.

A produção de embrião para linhagens celulares individuaispode variar dependendo do desenvolvimento de embrião particularutilizado. Por esta razão, é possível otimizar-se apropriadamente o meiode desenvolvimento de embrião para embriões em desenvolvimento decertas espécies e/ou se aumentar a proporção de linhagens celularesque produzem embriões. A este propósito, são aqui descritas diferentespercentagens de polietilenoglicol que se observou aumentam o desen-volvimento de embriões de diferentes genótipos de coníferas.

Embora estas etapas particulares de intumescimento e desen-volvimento de embriões exemplifiquem como o tecido embriogênico podeser tratado antes da Coleta em Massa, o presente método de Coleta emMassa pode ser utilizado para processar qualquer coleção de embriõesindependentemente de suas condições anteriores de desenvolvimento earmazenamento.

O procedimento e aparelho de Coleta em Massa podem englobara colocação de embriões sobre uma peneira, filtro, ou qualquer outrotipo de malha. As espécies e condições dos embriões podem ser levadasem consideração quando da escolha do tamanho da malha a serutilizada, de maneira a capturar apropriadamente os embriões. Asdimensões do embrião somático de pinheiro são em geral de cerca de1,0 mm a cerca de 5,0 mm de comprimento e o diâmetro variando decerca de 0,5 mm a cerca de 2,0 mm. Da mesma forma, o especialistana técnica saberá quais seriam os tamanhos de malha adequados autilizar de maneira a manipular embriões, mas prevenir a perda de umnúmero inadequado de embriões em virtude de sua passagem atravésde aberturas de malha muito grandes. Tamanhos de malha comerciaistípicos apresentam uma rede com aberturas variando de 500 a 1000micra. Tamanhos menores podem ser também utilizados, tais como oscom tamanhos de poros de 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450,500, 550, 600, 650, 670, 700, 710, 750, e 800 micra ou qualquerintegrador entre estes. Em certos casos, 800 micra é um tamanhomuito grande para certas linhagens de células de coníferas. Uma vezque altas concentrações de polietilenoglicol produzem embriões meno-res, pode, desta forma, ser desejável se utilizar tamanho(s) de peneiracom poros abaixo de 670 micra.

Água esterilizada é aspergida ou derramada sobre os embriõesna peneira para lavar os embriões de meio de desenvolvimento efragmentos celulares embriogênicos. Esta etapa de lavagem pode serrepetida qualquer número de vezes. Os embriões lavados podem ser,então, transferidos para o meio adequado para armazenamento ougerminação.

Contrastando este método com o método tradicional de coletamanual, que utiliza a coleta manual de embriões individuais e colocaçãodestes sobre uma placa com meio gel, a qual é então armazenada a friopor 3-4 semanas. A este propósito, o método "padrão" tipicamenteutilizado para armazenar e germinar embriões coletados pode serdescrito como se segue:

Método padrão: O método padrão compreende duas etapasprincipais, AeB, que são:

Etapa A (i) os embriões somáticos são coletados de placasde desenvolvimento de embrião e colocados em meio geliflcado por umperíodo de tempo de armazenamento a frio, onde as placas contendo osembriões são seladas para prevenir ou reduzir a perda de umidade dasplacas, (ii) as placas com embrião são então colocadas em um ambientede umidade relativa alta por um período de tempo; e Etapa B, subse-qüentemente transferidos para meio de germinação de embrião eindividualização de embrião somático em placas de germinação novas.Os embriões germinados são então transferidos para um vaso paraconservação.

Conforme evidenciado a partir dos dados relatados nos Exem-plos a seguir, o presente método de Coleta em Massa torna certasetapas deste método padrão, tais como a colocação em um ambiente dealta umidade relativa, desnecessárias.

A lavagem e enxágüe de uma massa de embriões podem serfacilitadas conectando-se vários vasos a uma fonte de água e a umabomba a vácuo, a qual pode adicionar um fluxo contínuo e homogêneode água esterilizada sobre os embriões. O Vacuum Manifold, produtoNalgene n° DS0345-0001 é um exemplo de um tipo de sistema a vácuoútil para a presente invenção.

Da mesma forma, pode-se delinear uma "unidade de lavagem deembrião", a qual compreende orifícios ou pelo menos uma membranaporosa ou lateral ou superfície sobre os quais os embriões podem sercolocados e através dos quais pode fluir água. Por exemplo, a unidadede lavagem de embrião pode ser um cilindro no interior do qual estálocalizada uma peneira ou malha ou algum tipo de filtro sobre o qual otecido embriogênico é colocado. Ver a "unidade de coleta" descrita emconexão com o Exemplo 23.

A unidade pode ser conectada a uma bomba de vácuo. A estepropósito, a unidade pode ser conectada a um outro dispositivo, talcomo um funil, o qual por sua vez é apropriadamente conectado a umaporta em manifold tipicamente utilizada para retirar um vácuo e/oufluido de uma fonte de água.

Neste caso, com o vácuo estabelecido, pode-se direcionar umbocal de aspersão para os embriões acondicionados na unidade delavagem de embrião e se iniciar a lavagem dos embriões. Fragmentos eoutros materiais serão retirados através da peneira ou filtro e a superfí-cie porosa ou orifício da unidade e direcionado para um dreno ourecipiente juntamente com a água utilizada. Os fragmentos celularespodem ser enviados diretamente para um dreno em vez de seremcoletados em uma armadilha de poliéster colocada no interior domanifold a vácuo.

Uma vez esteja claro que a lavagem removeu a maior parte dosfragmentos associados com a massa de embriões e os embriões foramtotalmente lavados, os embriões podem ser removidos para um papel defiltro limpo e enxaguados com água esterilizada.

A Coleta em Massa resultou em um aumento de 12 vezes naeficiência da coleta de embrião em relação à coleta manual. Umapessoa pode agora facilmente coletar 30 placas de desenvolvimento deembrião por hora ou 240 placas por dia. Assumindo-se que cada placacontém 100 embriões somáticos, serão 24000 embriões coletados poruma pessoa por dia utilizando-se o procedimento de Coleta em Massaem comparação com os 2000 embriões manipulados por uma pessoapor dia com o procedimento de coleta manual.

Além disto, qualquer número unidades de lavagem e enxágüepodem ser operacionalmente ligadas ou conectadas a um manifold avácuo e fornecimento de água. Em um exemplo, o aparelho de Coletaem Massa contém 3 unidades de lavagem e 3 unidades de coleta queoperam simultaneamente (ver Exemplo 23). A água de lavagem éprovida por um sistema de torneira de água fria que passa através deuma válvula solenóide elétrica e um esterilizador UV. A válvula solenói-de é controlada por um temporizador ajustável que é ativado com umpedal pelo operador. A água de rejeito é manipulada por uma linha dedrenagem a vácuo conectada para conter vácuo através de um separa-dor água/ar (Vac-Stack). O Vac-Stack coleta água e a drena para osistema de drenagem sem a intervenção do usuário. O vácuo é utilizadoem ambas as etapas de lavagem e de coleta.Tal disposição é útil para uma Coleta em Massa eficiente deembriões para um trabalho de clonagem em pequena escala e produçãoem plantas de 100K-500K de escala média. Segue-se que diferentesmagnitudes de produção de embrião e planta podem ser obtidasdependendo do número de disposições e aparelhos discretos e donúmero de trocas por dia de 24 horas empregados em qualquer períodode tempo dado. O sistema é compatível com os métodos de desenvolvi-mento e condicionamento atuais. A eficiência deste sistema é de100000 embriões por pessoa por dia com uma linha que produz cercade 100 embriões por placa.

O aparelho pode ser também facilmente adaptado para automa-ção. Desta forma, um ou mais sistemas podem coletar em massamilhões de embriões por dia por pessoa e automaticamente prepararestes embriões para o condicionamento. O sistema consiste em umacorreia de transporte sobre a qual a lama de tecido e embrião é gradu-almente liberada utilizando-se uma bomba. Os embriões são entãoseparados do tecido utilizando-se a aspersão de água esterilizada. Osembriões lavados são secados ao ar utilizando-se um vácuo e desaloja-dos em uma unidade de condicionamento.

Em qualquer uma destas disposições, a unidade de lavagem deembrião pode ser invertida e os embriões transferidos para uma cestade poliéster pré-existente noutra unidade que está conectada com omesmo manifold a vácuo. Isto pode ser obtido manualmente ou pormeio de automação de função única (por exemplo, rígida) ou funçãomúltipla (por exemplo, programável ou flexível). Os embriões na cestade poliéster podem ser então enxaguados com água esterilizada.

Uma vez satisfatoriamente enxaguada, a cesta carregada comembriões pode ser então transferida para uma placa de armazenamentorotulada ou meio de condicionamento. Um meio de condicionamentoparticularmente útil é o 2M21. Ver Tabelas 1 e 2 para a composição do2M21.

Tipicamente, o meio de condicionamento é um gel colocado emuma placa, tal como uma placa de Petri. O presente método inventivo,no entanto, emprega uma nova versão em base líquida do meio, onde osembriões são colocados sobre um papel de filtro que foi saturado commeio líquido. Os embriões podem ser colocados diretamente sobre opapel de filtro saturado. Alternativamente, os embriões podem sercolocados sobre uma membrana, por exemplo, a qual é então colocadasobre o papel de filtro saturado, onde a membrana é permeável aolíquido ou ã umidade no papel de filtro. Em distinção aos procedimen-tos de condicionamento típicos, desta forma, a presente abordageminventiva rica em nutrientes em base líquida não disseca e alimenta osembriões.

De maneira a evitar a perda de umidade dos embriões da placade Petri, a placa pode ser vedada com qualquer de um número demateriais de embalagem. Por exemplo, as placas podem ser vedadascom Nescofilm™ quando a coleta é terminada. Estas placas entãopodem ser armazenadas por um período de tempo desejado a frio, istoé, a 4°C, embora o armazenamento sob estas condições não seja semprenecessário. Por exemplo, pode ser desejável se evitar uma etapacompleta de armazenamento a frio e se prosseguir diretamente para agerminação. Não é necessário se manter "em jejum" os embriõesdurante o armazenamento a frio ou em qualquer outro ponto nesteprocesso.

Este procedimento genérico de lavagem, enxágüe e transferênciapara meio de armazenamento ou condicionamento em massa dosembriões pode ser repetido para cada coleta de embriões, embora deva-se ter cuidado para assegurar que as novas unidades de lavagem deembrião e conexões a vácuo sejam substituídas a cada nova linhagemcelular.

Retornando para o processo geral de nove etapas para levar umapinha de conífera à embriogênese e à germinação somáticas descritasacima, a Tabela 1 provê o meio pertinente que pode ser utilizado emcada etapa particular.No método padrão para a iniciação e manutenção do tecidoembriogênico, são utilizados os meios "WV5" e "DCR gelificado e líquido.O meio de desenvolvimento de embrião é notado como "MSG". Asetapas de condicionamento, pré-geminação e germinação são conduzi-das em meios designados como "2M21" e "MODMS". Da mesma forma,o processo genérico pode ser reescrito da seguinte forma:

1. Coleta e armazenamento de pinhas, usualmente a frio.

2. Iniciação embriogênica somática em meio de iniciação(gel WV5).

3. Manutenção do tecido embriogênico em meio de manu-tenção (gel DCR).

4. Armazenamento criogênico do tecido embriogênico (emDCR líquido) e recuperação deste.

5. Crescimento de tecido embriogênico (em gel DCR).

6. Desenvolvimento de embriões somáticos em meio dedesenvolvimento de embrião (em MSG).

7. Coleta, por exemplo, manual ou via Coleta em Massa.

8. Condicionamento dos embriões coletados (em gel2M21).

9. Germinação (em gel MODMS).

Um método aperfeiçoado, que é descrito aqui, inclui um meio de"intumescimento líquido" e outros meios ricos em caseína, "Mi3", queaumentam a embriogênese. Da mesma forma, o novo método em noveetapas pode ser reescrito como:

1. Coleta e armazenamento de pinhas, usualmente a frio.

2. Iniciação embriogênica somática em meio de iniciação(gel WV5 com alta concentração de caseína).

3. Manutenção do tecido embriogênico em meio de manu-tenção (gel Mi3 com alta concentração de caseína).

4. Armazenamento criogênico do tecido embriogênico (emMi3 líquido com alta concentração de caseína opcio-nalmente com uma quantidade específica para o genótipo de brassinolide).

5. Crescimento do tecido embriogênico em meio de crio-recuperação (em gel Mi3 com alta concentração de ca-seína).

6. Intumescimento líquido para aumentar o crescimentodo tecido embriogênico (em Mi3 líquido).

7. Desenvolvimento de embriões somáticos em meio dedesenvolvimento de embrião (em gel NSG opcionalmen-te com concentrações específicas para o genótipo depolietilenoglicol).

8. Coleta, por exemplo, manual ou via Coleta em Massa.

9. Condicionamento dos embriões coletados (em umsubstrato saturado com 2M21 líquido).

10. Germinação (em gel MODMS).

O meio Mi3 contém um nível base de 500 mg/l de caseína, noentanto a quantidade total de caseína no meio Mi3 pode ser de 0,5, 1,0,-1,5, 2,0, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, ou até 3,0 gramas por litro.

Em segundo, o meio MSG, que é utilizado para o desenvolvimen-to de embrião pode conter níveis variáveis de polietilenoglicol. Foiobservado que diferentes níveis de polietilenoglicol afetam diferentemen-te diferentes genótipos de pinheiro. Da mesma forma, pode ser neces-sário se otimizar o nível de polietilenoglicol no meio MSG para secombinar com as características de desenvolvimento do crescimento dogenótipo em questão.

A este propósito, o meio Mi3 pode conter também uma quanti-dade ótima de brassinolide. O brassinolide, que foi primeiramenteisolado a partir de pólen de colza (Brassica napus L.), é um esteróidevegetal de ocorrência natural que promove o crescimento, aumenta orendimento de cultivares de grãos e frutos, e torna a planta maisresistente à seca e ao frio. Os compostos relacionados, chamados debrassinosteróides, podem ser encontrados em uma ampla variedade deplantas, e também podem ser utilizados para melhorar o meio dedesenvolvimento de embrião.

Em terceiro lugar, o condicionamento de embriões coletados éútil para a preparação dos embriões para a germinação e armazena-mento prolongado é conduzido em um substrato, tal como um papel defiltro, que é saturado com 2M21 líquido. Esse método envolve condicio-namento a frio e perda de umidade lenta de um substrato de papel defiltro úmido durante a exposição ao frio. Isto foi efetivo de 8 a 16semanas. A germinação e as taxas de conversão mais elevadas foramobtidas quando os embriões foram condicionados no frio por 8 semanasem papel de filtro úmido com 1 ml de meio 2M21 líquido.

De acordo com a presente invenção, todas as etapas de pré-germinação podem ser conduzidas via um meio em uma placa únicasem se tocar os embriões. Desta forma, os embriões serão tocadosapenas uma vez quando são transferidos para um vaso estéril ou nãoestéril de maneira a induzir a conversão fotoautotróflca em estoques deplântulas. A conversão não é limitada a um tipo particular de vaso. Defato, os embriões podem ser colocados em qualquer ambiente queinduza sua conversão fotoautotróflca em estoques de plântulas adequa-dos. Pela redução da extensão da interação manual com os embriõesdesta maneira, se irá reduzir significativamente os meios e custos demão de obra para o processo de germinação de embrião.

As etapas 8 e 9 do processo modificado precedente podem sertambém elaboradas como se segue:

Condicionamento por Coleta em Massa: (A) embriõessomáticos maduros coletados em massa são colocados sobre papel defiltro que foi saturado com um volume apropriado de meio 2M21 líquidopara facilitar a saturação e colocados em armazenamento a frio por umnúmero desejado de semanas, com um mecanismo para o controle daperda de umidade do papel de filtro no tempo, e (B) transferência dosembriões para o meio de germinação em gel de embrião e individualiza-ção dos embriões somáticos em placas de germinação novas. Osembriões germinados são então transferidos para um vaso para aconservação.

Outras modalidades incluem (1) alta concentração de caseínanos meios de iniciação, manutenção, intumescimento e crio-recuperação; (2) brassinolide no meio de crio-recuperação; (3) armaze-namento dos embriões coletados em massa em umidade relativa altasem uma etapa de armazenamento a frio; (4) armazenamento dosembriões coletados em massa sobre papel de filtro saturado com meiolíquido a frio, com vários métodos para alterar a taxa de remoção deumidade da placa de Petri/papel de filtro umedecido; (5) o desenvolvi-mento do meio de desenvolvimento de embrião específico para o genóti-po com percentagens ótimas de polietilenoglicol e/ou brassinolide.

Exemplos de meios que podem ser utilizados de acordo com apresente invenção são descritos em detalhes na Tabela 1, no entantoseus ingredientes mais pertinentes podem ser resumidos como sesegue. Todos os meios descritos aqui contêm sais inorgânicos e vitami-nas conforme detalhado na Tabela 2. Onde é utilizado "hidrolisado decaseína" o é em uma alta concentração desejada. Isto é, a concentraçãode hidrolisado de caseína que é detalhada na Tabela 1 é de 500 mg/l,mas isto é uma quantidade base. Mais hidrolisado de caseína é tipica-mente adicionado, por exemplo, um adicional de 0,5 a 2,5 mg/l, aomeio base para prover a alta concentração. A escolha de quanto decaseína extra é adicionada depende da condição dos embriões e dogenótipo sendo tratado, o que pode ser deduzido empiricamente.

Meio de iniciação (gel): mioinositol, hidrolisado de caseína,maltose, 2,4-D, BAP, ABA.

Meio de manutenção (gel): mioinositol, hidrolisado de caseína,sacarose, 2,4-D, BAP, glutamina, glicina.

Meio de manutenção (líquido): mioinositol, hidrolisado decaseína, sacarose, 2,4-D, BAP, glicina, carvão ativado.

Meio de intumescimento (gel e líquido): mioinositol, hidrolisadode caseína, sacarose, 2,4-D, BAP, ABA, glutamina, glicina, carvãoativado.Meio de desenvolvimento de embrião (gel): maltose, ABA, gluta-mina, polietilenoglicol, carvão ativado.

Meio de condicionamento (gel e líquido): maltose, ABA, glutamina.

Meio de germinação (gel): sacarose, carvão ativado.

Certamente, quaisquer meios adequados e métodos para ocondicionamento e germinação de embriões coletados em massa podemser utilizados, não apenas os meios e métodos descritos aqui. Similar-mente, e como previamente apontado, qualquer método de obtenção deembriões, particularmente embriões somáticos, pode ser utilizado paraprover embriões para o tratamento de acordo com a metodologia deColeta em Massa e com o aparelho aqui descrito.

No sul dos Estados Unidos aproximadamente 1 bilhão de mudasde pinheiro do sul são produzidas anualmente. Estas mudas sãoatualmente derivadas de mudas de viveiros que utilizam 50 anos demelhoramento vegetal. Mesmo com o ganho genético aumentado apartir desta abordagem de melhoramento vegetal tradicional, a indús-tria de papel e produtos florestais necessita de árvores de maior rendi-mento com propriedades de madeira aperfeiçoadas. De maneira aatender as necessidades da indústria e requer que seja implementadoem larga escala o pinheiro loblolly clonal. A embriogênese somática(SE) é a única tecnologia de propagação em larga escala capaz de tantocapturar o ganho genético do melhoramento vegetal tradicional quantoatender as necessidades da produção clonal em larga escala da indus-tria de papel e produtos florestais.

Embora tenham sido realizados melhoramentos na embriogêne-se somática (SE) de coníferas, nenhuma abordagem abrangente foiformulada ou desenvolvida em uma escala operacional que assegure acaptura eficiente de genótipos de espécies coníferas. Em particular,esta limitação ou falta de captura eficiente de genótipos impacta aimplementação da SE com a espécie Pinus que provou ser recalcitrantena propagação clonal eficiente por SE.Desta forma, a presente invenção provê uma abordagem combi-natória que possibilita se tirar vantagem de muitos genótipos portratamento das interações de uma forma seqüencial em etapas. Oresultado desta abordagem é um protocolo otimizado para a produçãoem larga escala que é individualizada para cada genótipo.

A embriogênese somática de coníferas é um processo em múlti-plas etapas conforme descrito acima e conforme ilustrado na Figura 1.As etapas podem ser classificadas de acordo com a seguinte ordemseqüencial: iniciação da cultura, manutenção ou estabelecimento dacultura, armazenamento criogênico, crio-recuperação, multiplicação ouintumescimento do tecido, produção de embriões, coleta e condiciona-mento de embriões, germinação de embriões e conversão a estoques deplântulas.

A otimização de parâmetros particulares de qualquer etapa dadaaumenta a eficiência desta etapa particular no processo de regeneração.E é sabido que o genótipo por interações de tratamentos existe paraetapas específicas no processo de embriogênese somática apontadoacima.

A presente invenção provê a aplicação seqüencial de umaabordagem combinatória para a exploração do genótipo por interaçõesde tratamentos em múltiplas etapas no processo de embriogênesesomática. Os resultados reportados aqui mostram que se pode realizaraumentos muito significativos na captura e eficiência pela utilização deuma abordagem combinatória de varredura de genótipos para aperfei-çoar o processo de SE em coníferas.

Exemplos

O que se segue é um resumo dos experimentos descritos nosExemplos.

1. Foi demonstrado que para embriões somáticos cole-tados em massa, o meio 2M21 gelificado utilizado para o tratamento afrio e a remoção do bloco PEG pode ser substituído por 2 ml de meio2M21 líquido.2. O condicionamento pré-germinação de embriões so-máticos na presença de meio 2M21 líquido à temperatura ambiente ouem frio pode servir como um substituto para a tratamento atual aumidade relativa alta.

3. A utilização de fita filtro 3M permitiu o condiciona-mento pré-germinação de embriões somáticos evitando-se a condensa-ção de umidade nas placas de Petri tanto à temperatura ambientequanto em frio.

4. Embriões somáticos tratados a frio condicionados napresença de meio 2M21 líquido podem ser efetivamente induzidos parainiciarem o processo de germinação pela adição de 2 ml de meio degerminação MODMSl líquido.

5. O armazenamento a frio de embriões em um novomeio 2M21 líquido mostrou potencial para estender o armazenamentodos embriões para pelo menos 24 semanas enquanto mantendo boaqualidade do embrião, enquanto o armazenamento de embriões emmeio 2M21 gelificado pelo método padrão reduziu a qualidade doembrião após 16 semanas ou mais.

6. Os embriões somáticos apropriadamente condicio-nados para germinação suportam armazenamento a frio estendido porembalagem dupla com fita filtro 3 M e embalagem Saran.

7. Um experimento comparando diferentes métodos decondicionamento de embrião mostrou que um "novo" método de condi-cionamento a frio provê uma alternativa razoável ao protocolo padrão decondicionamento a frio mais umidade relativa alta.

8. O armazenamento de embriões coletados em meiogelificado durante a fase de condicionamento a frio seguido da manu-tenção dos embriões em vaso vedado a temperaturas mais elevadasfuncionou tão efetivamente quanto um método padrão que necessita amanutenção dos embriões em água em vasos durante a fase quente. Onovo método alternativo é mais simples e mais acessível para condicio-namento em larga escala para produção comercial.9. A germinação e a conversão foram semelhantes ouligeiramente mais altas para vários novos tratamentos de condiciona-mento a frio em comparação com o método padrão.

10. A adição de 1 ml de meio 2M21 líquido ao papel defiltro pode ser melhor que a adição de 2 ml para a duração de 8 sema-nas do condicionamento a frio.

11. O método de condicionamento a frio mostrado aquiresulta em menor perda de umidade durante a extensão (8 para 16semanas) dependendo do volume de água adicionado ao papel de filtro.Isto permite flexibilidade no planejamento de quando passar para agerminação.

12. Um meio líquido para tecido embriogênico em cres-cimento que compreende uma alta concentração de caseína.

13. Um método aperfeiçoado para a recuperação de teci-do embriogênico da crioarmazenagem pela inclusão de alta concentra-ção de caseína ou brassinolide ou ambos no meio de recuperação detecido e meio de intumescimento de tecido.

14. Utilização de uma bateria de meios em várias etapasseqüenciais, resulta em uma abordagem combinatória para aumentar apossibilidade de maximização do número de linhagens celularescandidatas comerciais para aumento de escala, e também aumento daeficiência e redução de custos para a implementação do processo deembriogênese somática.

Todos os meios aos quais se faz referência abaixo, por exemplo,"WV5", "DCR", "Mi3", "MSG", "2Μ2Γ e "MODMS" são detalhados nasTabelas 1 e 2.

Exemplo 1

Coleta em Massa de Embriões Somáticos

Procedimento

O que se segue é uma estratégia para coleta, lavagem e enxágüede embriões de acordo com o conceito "coleta em massa" descritopresentemente.Coloca-se a unidade de lavagem de embrião no funil no lado delavagem (os lados de lavagem e enxágüe são determinados por preferên-cia) da porta em manifold.

Trabalha-se com uma única linhagem por vez, carrega-se osembriões na unidade de lavagem utilizando-se uma espátula.

Liga-se a porta de vácuo ao lado de lavagem do manifold.

Posiciona-se o bocal de aspersão sobre a unidade de lavagem deembrião e pressiona-se o pedal de controle para iniciar-se a lavagem.

Lava-se os embriões até que todo o tecido suspensor sejaseparado dos embriões (os embriões permanecem na superfície damalha da unidade de lavagem de embrião enquanto o tecido é lavadopara uma garrafa de drenagem. Libera-se o pedal e desliga-se o vácuo.

Coloca-se uma cesta de poliéster no funil no lado de enxágüe daporta em manifold.

Uma vez a lavagem esteja completa e o excesso de água tenhasido drenado, inverte-se a unidade de lavagem e se transfere o conteúdopara o lado de enxágüe do manifold.

Posiciona-se o bocal de aspersão sobre a unidade de lavagem deembrião e pressiona-se o pedal de controle para se iniciar o enxágüedos embriões na cesta de poliéster.

Levanta-se a cesta de poliéster carregada com embriões e atransfere-se para uma placa rotulada de meio 2M21.

Embrulha-se as placas com Nescofilm™ quando a coleta estiverterminada.

Repete-se este procedimento para as demais placas.

Troca-se os topos do funil e a unidade de lavagem de embrião acada nova linhagem celular.

Meio

Ver Tabelas 1 e 2 para as receitas completas dos vários meiosutilizados na presente invenção.

Materiais

Suportes de cesta de poliéster circular de 2,95 polegadas comporos de 35 micra (SEFAR 07-33/10).

Dispositivo de esterilização por calor Steri 350™.

Fórceps com ponta não magnética Dumont SS, 5,5" de compri-mento, fórceps de dissecação de 6 polegadas e espátula.

Fitas de Nescofilm™ ou embalagem plástica Saran 6"x5" perfu-rada.

Funis de Buchner de polipropileno - 90 mm I.D. topos (cortepara 1/2 polegada de altura) com cabos de 71 mm de comprimento(ajustados com rolhas de borracha preta #8)

Manifold de aço inoxidável de 3 portas Nalgene que fixa 3 cabosde funil de Buchner simultaneamente (a porta central não é utilizada) econtém válvulas de controle individuais para a aplicação de vácuo(equipadas com a tubulação apropriada para conexão Carbpy de rejeitoe suprimento de vácuo).

Dispensador Manostat "Kate" Varistaltic com tubulação apropri-ada conectada a fonte Carboy de água RO.

Filtro Pall μm em linha re-autoclavável e tubulação apropriada.Unidade de lavagem de embrião.

Bocal de aspersão SprayDoc modificado e ponta de aspersão deventoinha.

Garrafa Corning de 1 L para o bocal de aspersão.

Placa de Petri descartável para a colocação de cesta de poliéster.

Outros materiais típicos requeridos para cultura de tecidopodem ser também necessários, tais como esponjas de gaze de 3"x3"saturadas com EtOH 95%, EtOH 70%, máscaras, luvas, etc.

Exemplo 2

Germinação de Embrião: Comparação da Coleta em Massa comMétodos de Coleta Manual Para Pinheiro Loblolly

De maneira a testar a utilidade e eficiência do procedimento decoleta em massa, estabeleceu-se um experimento para se realizar umacomparação lado a lado do método de Coleta Manual com método deColeta em Massa na germinação e conversão de embriões. Uma vez queo procedimento de lavagem utilizado para a Coleta em Massa de embri-ões auxilia na remoção de PEG, neste experimento está-se tambémpesquisando a possibilidade de eliminação do tratamento de remoçãodo bloco de PEG para futura simplificação do procedimento e reduçãode custo.

Método padrão: (A) (i) embriões somáticos maduros são coletadosde placas de desenvolvimento de embrião e colocados em meio 2M21gelificado por 4 semanas de armazenamento a frio, onde os comparti-mentos das placas de embriões são vedados para evitar ou reduzir aperda de umidade das placas, (ii) as placas de embrião são entãocolocadas em um ambiente de umidade relativa alta por 3 semanas, e(B) os embriões são então transferidos para placas com meio de germi-nação de embrião gelificado e realiza-se a individualização do embriãosomático em placas de germinação novas. Os embriões germinados sãoentão transferidos para um vaso para a conversão.

O experimento consiste em quatro tratamentos.

Tratamento 1. Coleta manual dos embriões para cesta depoliéster colocada em meio 2M21.

Tratamento 2. Coleta manual do embriões para papel de filtroúmido em placas de Petri estéreis.

Tratamento 3. Coleta em massa de embriões para cesta depoliéster colocada em meio 2M21.

Tratamento 4. Coleta em massa de embriões para papel de filtroúmido em placas de Petri estéreis.

Os embriões utilizados neste experimento foram coletados deplacas de desenvolvimento com 10-12 semanas de idade de 20 linha-gens celulares diferentes. Cada tratamento consiste em quatro placasreplicadas para cada linhagem celular. Após quatro semanas detratamento a frio a 4°C, os embriões de cada tratamento são levados àconversão de acordo com o método padrão. As observações foramregistradas no que diz respeito à germinação dos embriões e eficiênciade conversão.Para este experimento, os dados de germinação de embrião sãoapresentados na Tabela 3. O número real de germinantes transferidospara caixas magenta foi contado para cada replicata. Este número foientão multiplicado por um fator apropriado para se obter o númerototal de germinantes por grama de tecido utilizado para as placas degerminação de embrião.

A comparação entre os procedimentos de coleta manual (Trata-mento 1) e coleta em massa (Tratamento 3) mostra claramente umaumento significativo no número de germinantes transferidos para ascaixas magenta quando foi utilizado o procedimento de coleta emmassa. É também óbvio a partir dos dados que a utilização de papel defiltro úmido na placa de meio 2M21 resultou em um declínio acentuadono número de germinantes transferidos para as caixas magenta emambos os procedimentos de coleta manual e coleta em massa. Noentanto, vale notar que uma combinação de coleta em massa e papel defiltro úmido produziu tantos germinantes quanto no controle (Trata-mentos 1x4).

A Tabela 3 mostra que a quebra no número de germinantestransferidos para as caixas magenta para todas as 20 linhagens celula-res utilizadas. No total, a coleta em massa produziu um número maisalto de germinantes por grama de tecido em 16 das 20 linhagenscelulares testadas.

Exemplo 3

Conversão de Embriões: Comparação Entre os Métodos de Coletaem Massa e Coleta Manual Para Pinheiro Loblolly

Este experimento foi desenhado para comparar a eficiência doprocedimento de coleta em massa com o de coleta manual de embriõessomáticos de pinheiro loblolly de 20 linhagens celulares diferentes.Cada tratamento consistiu em quatro placas replicadas para cadalinhagem celular. Foram coletados embriões somáticos de cada placautilizando-se ambos os procedimentos e tratados como no métodopadrão conforme exemplificado nas etapas AeB descritas acima.As observações foram registradas quanto ao número real degerminantes enraizados transferidos para as caixas magenta para cadareplicação. Os germinantes foram então deixados crescer nas caixasmagenta em viveiro a temperatura ambiente e condições de iluminaçãopor 12-14 semanas para se obter as mudas somáticas plantáveis. Após14 semanas, todas as mudas foram retiradas das caixas magenta paracada réplica e divididas em duas categorias, isto, mudas somáticasplantáveis e não plantáveis.

As mudas plantáveis apresentavam um sistema radicular bemdesenvolvido e um crescimento de ramos visível distinto. As mudas nãoplantáveis eram aquelas que ou não cresceram ou não apresentavamramos visíveis e crescimento radicular. As mudas somáticas queapresentavam um ramo curvo ou dobrado foram classificadas comomudas não plantáveis independente de suas brotações e crescimentoradicular.

As observações foram registradas quanto ao número total demudas para cada réplica (representando o número de germinantestransferidos para as caixas magenta) e o número de mudas plantáveis.O comprimento de raiz e brotação para cada muda somática plantávelfoi também determinado.

Os dados de germinação de embrião apresentados na Tabela 4mostram que na média o procedimento de coleta em massa resultou emum aumento de 1,7 vezes no número total de germinantes transferidospara as caixas magenta por grama de tecido embriogênico em compara-ção com a coleta manual. 16 das 20 linhagens celulares testadasproduziram um número maior de germinantes quanto foi utilizado oprocedimento de coleta em massa.

Os resultados das mudas somáticas plantáveis para cadatratamento são apresentados na Tabela 5. Fica evidente a partir dosdados que na média a coleta em massa resultou em um aumento de 1,3vezes no número de mudas somáticas plantáveis por grama de tecidoembriogênico. Com base na germinação de embriões e conversão degerminantes em mudas somáticas plantáveis, conclui-se que o proce-dimento de coleta em massa pode ser utilizado no lugar da coletamanual de embriões somáticos para produção em escala de mudassomáticas.

O procedimento de coleta em massa é adequado para a coleta deembriões de placas múltiplas de linhagem celular única.

O comprimento da brotação e raiz de cada muda coletada foitambém determinado. Não houve diferença na média do comprimentoda brotação para as mudas somáticas coletadas em massa em compa-ração com suas contrapartes coletadas manualmente. O comprimentoda brotação variou entre as linhagens celulares entre 3-6 centímetros.Para as mudas coletadas manualmente a média do comprimento dabrotação foi de 4,27 centímetros e para as mudas coletadas em massa amédia do comprimento da brotação foi de 4,26 centímetros.

Em média, as raízes das mudas somáticas plantáveis coletadasmanualmente eram ligeiramente mais longas em comparação com asmudas coletadas em massa, no entanto, a diferença não parece sersignificativa. Isto é, a média do comprimento das raízes para as mudascoletadas manualmente foi de 4,93 centímetros versus 4,45 centímetrospara as mudas coletadas em massa. Não há uma correlação positivaentre o comprimento da brotação e o da raiz das mudas somáticas paracada linhagem celular. Em geral, se uma linhagem celular apresentouum melhor crescimento de brotação, também apresentou raízes bemdesenvolvidas. Estes resultados demonstram que a coleta em massaproduz mudas somáticas plantáveis comparáveis em vigor e crescimen-to com aquelas obtidas com coleta manual.

Exemplo 4

Efeito da Coleta em Massa Sobre a Remoção de Bloco de PEG deEmbriões Somáticos de Pinheiro Loblolly

O polietilenoglicol (PEG) é um agente osmótico de alto pesomolecular, o qual se adere à superfície de embriões maduros. A utiliza-ção de PEG nos meios de embriogênese, desta forma, interfere com agerminação do embrião. De maneira a se focalizar esta preocupação esuperar a interferência na germinação de embrião por PEG, aqui, osembriões são transferidos para um meio livre de PEG e armazenados afrio por quatro semanas.

A coleta em massa envolve a lavagem dos embriões com águaesterilizada, a qual pode retirar qualquer PEG aderido à superfícieexterna do embrião somático. Conseqüentemente, a coleta em massaresulta em uma melhor germinação e uma melhor conversão de embri-ões:

Coleta Manual: embriões somáticos foram coletados manual-mente para cestas de poliéster colocadas sobre dois papéis de filtrosaturados com 2 ml de água. As placas de Petri contendo embriõesforam vedadas com Nescofilm™ e armazenadas a 4°C por 4 semanas.Os embriões foram então submetidos a umidade relativa alta por 3semanas antes da germinação. Ver patente US 5.183.757.

Coleta em Massa: embriões somáticos foram coletados em massapara cestas de poliéster. Os embriões bons (aproximadamente o mesmonúmero que na coleta manual) foram então tomados e colocados emdois papéis de filtro saturados com 2 ml de água esterilizada. As placasde Petri contendo embriões foram vedadas com Nescofilm™ e armaze-nadas a 4°C por 4 semanas. Os embriões foram então submetidos aumidade relativa alta por 3 semanas antes da germinação.

O experimento foi estabelecido com quatro linhagens celularesdiferentes. Cada tratamento consistiu em três placas replicadas paracada linhagem celular. Foram coletados dados quanto a percentagemde germinação de embriões.

Os resultados apresentados na Tabela 6 mostram que aspercentagens médias de germinação para a coleta manual e a coleta emmassa são comparáveis.

Os resultados indicam que o armazenamento a frio de embriõessobre papel de filtro úmido pode servir como tratamento de remoção dePEG.Exemplo 5

Efeito da Coleta em Massa Sobre a Remoção de PEG de Embriões

Somáticos de Pinheiro Loblolly

Um experimento seguindo o descrito no Exemplo 4 foi realizadosem a etapa de tratamento a frio:

Coleta manual, sem armazenamento a frio, com umidaderelativa alta: embriões somáticos foram coletados manualmente paracestas de poliéster sobre dois papéis de filtro úmidos. As cestas depoliéster foram marcadas a seco e submetidas a alta umidade relativapor 3 semanas antes da germinação.

Coleta em massa, sem armazenamento a frio, com umidaderelativa alta: embriões somáticos foram coletados em massa para cestasde poliéster. Os embriões bons (aproximadamente o mesmo númeroque na coleta manual) oram então tomados e transferidos para novascestas colocadas sobre papéis de filtro úmidos. As cestas foram marca-das a seco e submetidas a alta umidade relativa por 3 semanas antesda germinação.

O experimento foi estabelecido com quatro linhagens celularesdiferentes. Cada tratamento consistiu em quatro placas replicadas paracada linhagem celular. Foram coletados dados quanto a percentagemde germinação de embriões.

Os resultados apresentados na Tabela 7 mostram as médias daspercentagens de germinação de embriões para a coleta manual e para acoleta em massa. Na ausência de uma etapa de lavagem e sem a fasede armazenamento a frio, nenhum dos embriões coletados manualmen-te, de qualquer das linhagens celulares, germinou. Por outro lado, osembriões coletados em massa germinaram com freqüência razoavelmen-te alta mesmo embora os embriões não tenham sido armazenados afrio.

Exemplo 6

Efeito do Nível de Caseína Sobre o Crescimentode Culturas Embriogênicas Somáticas de PinheiroEste experimento otimizou a taxa de crescimento de culturaembriogênica como função da concentração de caseína. É importantese intumescer rapidamente as culturas SE de maneira a se ter tecidosuficiente para o armazenamento criogênico. É de conhecimentocomum que culturas de tecido vegetal, em particular culturas embrio-gênicas de conífera, perdem freqüentemente a capacidade regenerativadurante um tempo prolongado em cultivo. Por esta razão, o intumesci-mento rápido do tecido é altamente vantajoso. Um tratamento quemelhora o intumescimento: 1) provê mais tecido para a crio-preservação, onde amostras múltiplas são necessárias para agrupamen-to, e/ou 2) provê uma quantidade necessária de tecido em menortempo. Aqui foi quantificado o efeito do nível de caseína sobre ocrescimento de tecido após as fases de iniciação e manutenção docrescimento tissular. Os níveis de caseína foram testados variando de0,5 g/l (um nível utilizado pelos especialistas na técnica em embriogê-nese somática de coníferas) a até 2,5 g/l.

Foi observado que níveis mais altos de caseína (uma caseínahidrolisada enzimaticamente, uma das quais é Sigma #C4523 aN-Z-Case TT") apresentaram um efeito positivo sobre o crescimento detecido. Os critérios registrados para o julgamento dos efeitos daconcentração de caseína foram o peso da cultura e a freqüência dasculturas que atingiram 1 grama após 12 semanas de cultivo.

O efeito de um teor alto de caseína, entretanto, variou com afamília. Com a família H, os níveis ideais de caseína foram de 1,0 e 1,5g/l. Com a família H os níveis de caseína ideais foram de 1,5 e 2,0 g/l.Na família H um alto teor de caseína durante 8 semanas no meio deiniciação e 4 semanas no meio de manutenção aproximadamentedobraram a massa de tecido média e aumentaram a freqüência dasculturas que atingiram 1 grama de 46% (para o controle de baixacaseína de 0,5 g/l) para 78% para o tratamento de alta caseína de 2,0g/l (aumento de 70%).

Um relatório testou níveis mais altos de caseína em SE de umaespécie abeto e observou um crescimento aumentado com caseína a de1,0 a 1,5 g/l. Ver K. Szczygiel, Abstract, "International Conference on:wood, breeding, biotechnology and industrial expectations", 9th ConiferBiotechnology Working Group and IUFRO, 11-14 de junho, 2001.

As culturas foram iniciadas a partir de semente imatura dasfamílias IeH conforme descrito na patente US 5.677.185, a qual éincorporada aqui como referência. A formulação do meio de iniciaçãofoi a WV5 que é detalhada nas Tabelas 1 e 2. O meio WV5 é tambémdescrito na patente US 5.534.433, a qual é incorporada aqui comoreferência. Neste experimento, o meio WV5 apresentava uma concen-tração total de hidrolisado de caseína (Sigma #C4523 "N-Z-Case TT")como se segue: Trt 1 = 0,5 g/l (controle), Trt 2 = 1,0 g/l, Trt 3 = 1,5 g/l,Trt 4 = 2,0 g/l, Trt 5 = 2,5 g/l.

Após 8 semanas o tecido embriogênico dos explantes responsi-vos foi transferido para meio de manutenção para o intumescimento.Os dados de peso da cultura foram determinados após duas passagensde 2 semanas por passagem em tratamentos com meio de manutenção.

A formulação do meio de manutenção Mi3 está listada nasTabelas 1 e 2 com um dos cinco níveis de hidrolisado de caseína totalconforme utilizado na fase de iniciação deste experimento apontadoacima.

Neste experimento, as culturas embriogênicas de cada tratamen-to de iniciação foram divididas em duas partes iguais, com uma parteindo para o nível de controle de caseína (0,5 g/l) e a outra parte indopara o mesmo nível de caseína do qual proveio (ou um nível mais alto seproveio do controle). Por exemplo, as culturas de iniciação Trt 4 (2,0 g/lde caseína) foram divididas com a metade indo para o nível de controlede manutenção de caseína (0,5 g/l, Trt 1) e metade indo para o mesmonível de manutenção que a iniciação (2,0 g/l). Os procedimentos para adivisão foram no sentido de que o tecido foi disperso em 1 ml de diluen-te (meio Mi3 sem agente de geliflcação ou caseína) e dividido em duasalíquotas de 0,5 ml para transferência para cestas de poliéster no meiode manutenção gelificado apropriado. Após 4 semanas em meio demanutenção o peso de cada cultura foi determinado.

Os níveis mais altos de caseína durante a fase de manutençãocriogênica em geral apresentaram um efeito positivo sobre o peso médioda cultura e a freqüência com que as culturas atingiram 1 grama depeso fresco, em ambas as famílias testadas (Tabela 8). Observe-se ocomo culturas transferidas para um nível mais alto de caseína sempreapresentaram pesos mais altos e freqüências mais altas em alcançarpelo menos 1 grama. O efeito da caseína dependeu da família genética.

Com a família I foram obtidos as médias mais altas de peso decultura a partir de combinações de tratamento que continham ou 1,0ou 1,5 g/l de caseína tanto no meio de iniciação quanto no meio demanutenção.

Com a família H níveis mais altos de caseína apresentaram umefeito ainda mais pronunciado tanto sobre o peso da cultura quantosobre a freqüência de culturas atingindo 1 grama, em comparação coma família I.

Com a família H foram obtidos as médias mais altas de peso decultura a partir de combinações de tratamento que continham ou 1,5ou 2,0 g/l de caseína tanto na fase de iniciação quanto na fase demanutenção. As mesmas duas combinações de tratamento tambémapresentaram as freqüências mais altas de linhagens que atingiram 1grama com a família H.

Uma das mais efetivas combinações de tratamento com a famíliaH, que continha 2,0 g/l de caseína em ambas as fases de iniciação e demanutenção, aumentou significativamente (p<0,001) a freqüência deculturas atingindo 1 grama de 46 para 78% e aproximadamente dobrouo peso médio da cultura em comparação com o controle.

Da mesma forma, níveis altos de caseína podem aumentar tantoa iniciação quanto a manutenção em pinheiro loblolly. Os resultadossugerem que conter um nível alto de caseína é importante na pós-iniciação, isto é, na manutenção, fase de embriogênese.Exemplo 7

Efeito da Umidade Relativa Alta

O experimento consiste nos cinco tratamentos a seguir:

Coleta em Massa (Tratamento 1): foram coletados em massaembriões para cesta de poliéster como nas etapas A e B do métodopadrão.

Coleta em Massa com L2M21 e umidade relativa alta (Tratamen-to 2): os embriões foram coletados por coleta em massa para cesta depoliéster, colocados sobre duas folhas de papel de filtro saturadas com1,5 ml de meio 2M21 líquido, aplicou-se umidade relativa alta e tratou-se de acordo com a etapa B do método padrão.

Coleta em Massa com L2M21 sem umidade relativa alta (Trata-mento 3): os embriões foram coletados por coleta em massa para cestade poliéster, colocados sobre duas folhas de papel de filtro saturadascom 1,5 ml de meio 2M21 líquido, sem umidade relativa alta e tratou-sede acordo com a etapa B do método padrão.

Coleta em Massa sem L2M21. mas com umidade relativa alta(Tratamento 4): os embriões foram coletados por coleta em massa paracesta de poliéster, colocados sobre duas folhas de papel de filtro satura-das com 1,5 ml de água esterilizada, aplicou-se umidade relativa alta etratou-se de acordo com a etapa B do método padrão.

Coleta em Massa sem L2M21 e sem umidade relativa alta(Tratamento 5): os embriões foram coletados por coleta em massa paracesta de poliéster, colocados sobre duas folhas de papel de filtro satura-das com água esterilizada, sem umidade relativa alta e tratou-se deacordo com a etapa B do método padrão.

Foi utilizado um total de 10 diferentes linhagens celulares nesteexperimento. Apenas 9 linhagens celulares foram levadas até a germi-nação. Cada tratamento consistiu em quatro placas replicadas paracada linhagem celular utilizada. O número real de germinantes transfe-ridos para as caixas magenta foi contado para cada replicata. Estenúmero foi então multiplicado por um fator apropriado para se obter onúmero total de germinantes por grama de tecido utilizado para asplacas de desenvolvimento de embrião.

Em média, um número maior de germinantes foi produzido porgrama de tecido embriogênico quando o meio 2M21 gelificado foiutilizado durante a fase de tratamento a frio, em comparação com omeio 2M21 líquido para os embriões coletados em massa. Ver Tabela 9.Ver Tabelas 1 e 2 para os ingredientes do meio 2M21 (também chamadode "meio de condicionamento").

A utilização de água esterilizada no lugar de meio líquido 2M21reduziu ainda mais o número médio de germinantes por grama detecido. Isto sugere que os embriões não desenvolvidos coletados pormeio de coleta em massa se beneficiam do meio nutriente providodurante o tratamento a frio. Há uma linha por interação de tratamento,no entanto, em geral, estas diferenças são consistentes quando secompara as linhagens celulares individuais no que diz respeito a estestratamentos (Tabela 9).

É possível se substituir o meio 2M21 gelificado por meio líquidopara a coleta em massa. Além disto, uma vez que o meio líquido naplaca de Petri simula o ambiente de umidade relativa alta, é tambémpossível se eliminar o tratamento com umidade relativa alta. O suportepara esta observação vem da comparação dos tratamentos com umida-de relativa alta neste experimento. O tratamento com umidade relativaalta parece apresentar uma ligeira vantagem sobre o tratamento semumidade relativa alta para a germinação de embriões.

Exemplo 8

Germinação e Conversão de Embrião: Efeito dos TratamentosAlternativos Pré-Germinação Sobre a Germinação de EmbriõesSomáticos de Pinheiro LoblollyOs resultados do Exemplo 7 levaram a experimentos adicionaispara se determinar se a umidade relativa alta poderia ser eliminada doprotocolo de Coleta em Massa. Uma vez que apenas 1,5 ml de meiolíquido por placa foram utilizados, uma hipótese foi que a diferençaentre os tratamentos com meio gelificado e com meio líquido na germi-nação pode ser devida à menor quantidade de nutrientes e hormôniosdisponíveis para os embriões no meio líquido durante o tratamento afrio.

Foram utilizados 2,5 ml de meio 2M21 líquido para suplementara deficiência em nutrientes. Entretanto, esta quantidade de líquido,sem qualquer tratamento com umidade, deixou os embriões muitomolhados e estes falharam em germinar na transferência para meio degerminação.

Da mesma forma, se um volume maior de meio líquido é utiliza-do, os embriões necessitam condicionamento adicional para a elimina-ção da umidade extra das placas de Petri.

Esta etapa de condicionamento extra pode ser obtida pelatransferência de embriões tratados a frio para temperatura ambientepor duas semanas antes da germinação. Os resultados deste experi-mento preliminar são mostrados na Tabela 10.

Estes resultados sugerem que o condicionamento de embriõessomáticos à temperatura ambiente por 2 semanas após o tratamento afrio em meio 2M21 líquido foi mais efetivo para a geminação dosembriões que o condicionamento a temperatura ambiente antes dotratamento a frio. As seguintes condições testaram o efeito do condi-cionamento de embriões à temperatura ambiente e a frio como umaalternativa à umidade relativa alta:

Trt 1: controle, 4 semanas a frio em meio 2M21 gelificadocom 3 semanas a umidade relativa alta em caixas Microtip, seguindo-sea germinação.

Trt 2: 4 semanas a frio em meio 2M21 líquido com 2semanas à temperatura ambiente seguindo-se a germinação.

Trt 3: 4 semanas a frio em meio 2M21 líquido seguindo-se a germinação.

Os embriões para este experimento foram coletados de 6 linha-gens celulares diferentes. Cada tratamento consistiu em 4 placasreplicadas para cada linhagem celular. Os embriões foram coletadosem massa para todos os tratamentos. Para os tratamentos 2 e 3 ospoliésteres contendo embriões foram colocados em duas folhas de papelde filtro saturadas com meio 2M21 líquido. Todas as placas foramembrulhadas com Nescofilm™.

Os resultados apresentados na Tabela 11 mostram que asgerminações de embriões para todos os três tratamentos foram compa-ráveis. Isto confirmou nossa observação anterior de que o condiciona-mento de embriões tratados a frio (na presença de 2 ml de meio 2M21líquido) à temperatura ambiente por duas semanas pode ser comosubstituto para o tratamento com umidade relativa alta. É algo surpre-endente se observar que o condicionamento de embriões a frio napresença de 2 ml de meio 2M21 líquido foi igualmente efetivo nagerminação. Foi também observado que o condicionamento de embri-ões a frio ou à temperatura ambiente resulta na germinação sincroniza-da dos embriões. Os resultados preliminares de nosso experimento desondagem mais recente sugerem que embriões somáticos pré-condicionados a frio ou à temperatura ambiente podem ser efetivamentere-hidratados na mesma placa pela adição de 2 ml de meio de germina-ção MODMSl líquido. Ver as Tabelas 1 e 2 para detalhes do meioMODMS (também chamado de "meio de germinação").

Em todos os experimentos descritos acima os embriões somáti-cos foram coletados em massa. As placas de Petri contendo embriõessomáticos foram embrulhadas com Nescofilm™ e armazenadas a 4°Cem refrigerador para tratamento a frio. Mesmo embora se pudesseobter o condicionamento de embriões somáticos a frio com 2 ml de meio2M21 líquido o que resultou em freqüência de germinação comparávelcom o controle, a maior parte do líquido na placa de Petri condensounas bordas ou laterais. A taxa de condensação também variou de placapara placa criando diferentes micro-ambientes em cada placa.

Adicionalmente, se as placas de Petri foram agitadas durante amanipulação o líquido condensado foi reabsorvido no papel de filtrocriando uma condição desfavorável para a germinação do embrião. Demaneira a se superar o problema da condensação, tentou-se primeiroum papel de filtro seco ligeiramente maior na borda da placa de Petri.Isto auxiliou na redução da condensação na borda em alguma extensão,no entanto mais umidade condensou na lateral das placas de Petri.

Como segunda opção, foi testado o efeito de três diferentes fitasde embrulho sobre a condensação de umidade nas placas de Petri. Doisajustes de temperatura diferentes também foram investigados. Asplacas de Petri continham duas folhas de papel de filtro e um poliéstersaturado com 2 ml de líquido foram embrulhadas com fita filtro 3M,Nescofilm™ e embalagem Saran, e colocadas a 4°C e 7°C. O Nescofilme o Saran foram também testados com 2 e 4 orifícios feitos na lateraldas placas de Petri com uma espátula estéril. A perda de umidade paracada placa de Petri após 4 semanas foi utilizada como medida para aredução de condensação.

A fita filtro 3M foi mais eficiente na prevenção da condensaçãoem ambas as temperatura ambiente em comparação com o Nescofilm™e o Saran. Os orifícios no Nescofilm™ e no Saran auxiliaram no escapede umidade, mas não foram tão eficientes quanto a fita filtro 3M. Aperda de umidade a 4°C foi mais rápida que a 7°C. Isto poderia serdevido à diferença de umidade relativa em ambas as câmeras.

Estes resultados sugerem que a utilização de fita filtro 3Mauxilia no condicionamento pré-germinação de embriões pelo controleda perda umidade e evitando-se que a umidade condense nas placas dePetri tanto à temperatura ambiente quanto a frio. Uma vez que aembalagem Saran não permitiu qualquer perda apreciável de umidadeem ambas as temperaturas, pode-se ser capaz de armazenar embriõesprontos para geminação apropriadamente condicionados por embala-gem dupla com fita filtro 3M e embalagem Saran.

Os dados apresentados nestes experimentos sugerem que sepode substituir o meio 2M21 gelificado com 2 ml de meio líquido para aalimentação, armazenamento a frio e remoção de bloco de PEG deembriões coletados em massa. A utilização de fita filtro 3M permite ocondicionamento pré-germinação de embriões somáticos. Os embriõessomáticos condicionados à temperatura ambiente ou a frio foramcapazes de germinar tanto quanto os embriões de controle. Estesresultados preliminares indicam também que os embriões somáticoscondicionados podem ser efetivamente induzidos para iniciar o processode germinação pela adição de 2 ml de meio de germinação MODMSllíquido e possivelmente podem germinar na mesma placa.

Com base nestas observações, desta forma, é muito possível seobter a alimentação, tratamento a frio e remoção de bloco de PEG,umidade relativa alta, e possivelmente a germinação de embriões namesma placa. Adicionalmente, o condicionamento de embriões somáti-cos em meio líquido pode permitir o armazenamento a frio por umperíodo de tempo estendido por embalagem dupla com fita filtro 3M eembalagem Saran. Este procedimento de germinação de embriõessimplificado foi testado em um experimento de alta replicação.

Exemplo 9

Germinação e Conversão de Embrião: Efeito de Tratamento do Meioe Tempo de Armazenamento de Curto Prazo Sobre a Germinação eConversão in vitro de Embriões Armazenados a Frio

O propósito deste experimento foi testar o efeito de dois métodosdiferentes de fixação de embriões durante o armazenamento a frio (4°C)de curto prazo sobre a subseqüente germinação em conversão in vitro.Curto prazo se refere a 4, 6 e 8 semanas em armazenamento a frio. Osembriões utilizados neste experimento foram coletados em massa apartir de 8 diferentes linhagens celulares de duas famílias. Cadalinhagem tinha 6 placas de embriões armazenados a frio (CS). Ostratamentos de armazenamento a frio (tratamento n° 1 é exemplificadopelas etapas A e B do método padrão) foram:

1. 2M21 (gel): embriões em membrana de poliéster nasuperfície de meio 2M21 gelificado.

2. 2M21 (líquido: embriões em papel de filtro umedecidocom 2,5 ml de meio 2M21 líquido.

Após armazenamento a frio por 4, 6 ou 8 semanas, de acordocom o Tratamento 1 ou Tratamento 2, os embriões foram expostos atratamento com umidade relativa alta utilizando-se caixas Microtipembrulhadas com Nescofilm™ mantidas a 24°C ± 2°C por de 3 a 4semanas. Os embriões foram induzidos a iniciar a germinação em meiode germinação MODMS (Tabela 1) por 5 dias e então individualizados.Os embriões em germinação foram contados (aqueles com desenvolvi-mento radicular visível) e transferidos individualmente para caixasmagenta. Os germinantes plantáveis foram contados (aqueles tantocom raiz quanto crescimento de brotação de epicótilos) para se obterdados de conversão in vitro.

Os embriões armazenados pelo método padrão em meio gelifica-do (2M21) apresentaram níveis de germinação similares nas semanas 4,6 e 8 (352, 342 e 372 germinantes por grama de tecido, respectivamen-te). Os embriões armazenados em papel de filtro umedecido com meioliqüido (2M21) apresentaram germinação reduzida após 4 e 6 semanas(202 e 253 germinantes por grama de tecido, respectivamente), noentanto os níveis de germinação foram similares aos do método padrãoem 8 semanas (365 germinantes por grama de tecido). Desta forma,aparentemente houve uma interação entre a duração do tempo dearmazenamento e o método de armazenamento (meio gelificado versusmeio líquido) como efeito sobre a germinação.

Os embriões armazenados pelo método padrão em meio gelifica-do apresentaram conversão in vitro apenas ligeiramente reduzida (médiade plantáveis por grama de tecido) em 6 e 8 semanas de CS em compa-ração com o tratamento de 4 semanas de controle. Em contraste, osembriões armazenados em papel de filtro umedecido com meio líquidoapresentaram uma conversão in vitro maior em 8 semanas de CS (170plantáveis por grama de tecido) em comparação com os tempos de CSmais curtos de 4 e 6 semanas (102 e 101 plantáveis por grama detecido, respectivamente). Desta forma, aparentemente também háinteração entre a duração do tempo de armazenamento e o método dearmazenamento como efeito sobre a conversão in vitro.

Estes resultados apontam para uma vantagem potencial nautilização de meio líquido para armazenamento por tempo mais longodos embriões. Isto é, após 8 semanas uma germinação semelhante comaumento de conversão é obtida utilizando-se o método com meio líquidopara armazenamento a frio de embriões em comparação com o mesmotempo de armazenamento a frio utilizando-se o método com meiogelificado padrão.

O armazenamento de prazo mais curto de embriões utilizando-semeio líquido resultou nas taxas de conversão mais altas (média de 170plantáveis por grama de tecido) após 8 semanas de armazenamento afrio. Por comparação, este foi um melhoramento ligeiro na conversão nométodo de armazenamento a frio padrão durante 4 semanas em meiogelificado (média de 158 plantáveis por grama de tecido) (Tabela 12).

Os resultados obtidos neste experimento de armazenamento decurto prazo mostrados aqui em geral concordam com os resultadosobtidos nos experimentos de armazenamento de longo prazo de embri-ões. Isto é, a utilização de papéis de filtro umedecidos com líquidoaparentemente apresenta um efeito positivo sobre a germinação econversão in vitro que se manifesta sob condições de tempo de armaze-namento de longo prazo.

Exemplo 10

Germinação e Conversão de Embriões: Estudo das Capacidades deArmazenamento de Embriões em Meios 2M21Geliflcados no Escuro a 4°C

Os embriões foram coletados em massa, colocados em meio2M21 gelificado e mantidos em armazenamento a frio (CS) a 4°C por 4,16 e 24 semanas. Após seus respectivos tratamentos, continuaramcom os procedimentos operacionais padrão para germinação. O ajusterequereu 5 linhagens celulares e cada tratamento consistiu em 4replicatas por linhagem celular, cada uma das quais foi exposta àsetapas A e B do método padrão, embora a duração do tempo de arma-zenamento a frio na etapa A tenha variado conforme descrito abaixo:

Controle: embriões coletados em massa em S2M21, 4semanas de armazenamento a frio.

CS de 16 semanas: embriões coletados em massa emS2M21, 16 semanas de armazenamento a frio.

CS de 24 semanas: embriões coletados em massa emS2M21, 24 semanas de armazenamento a frio.

Os dados na Tabela 13 mostram que a germinação de embriõessomáticos armazenados por 16 semanas em meio 2M21 gelificado (CSde 16 semanas) foi comparável ao controle (CS de 4 semanas). Apercentagem de germinação neste experimento foi menor que a usual,porque todos os embriões coletados em massa foram contados paracada placa replicada em vez de embriões coletáveis contados no teste degerminação padrão. Isto confirma a observação prévia de que embriõessomáticos podem ser armazenados por 16 semanas em meio 2M21gelificado sem muito efeito adverso sobre a germinação. No entanto,observou-se que os embriões de 16 semanas pareciam anormalmenteintumescidos e eram amarelo claro com extremidades suspensorasmarrom. Depois da umidade relativa alta, estes embriões germinaram eforam transferidos para caixas magenta para a conversão. O tratamen-to CS de 24 semanas resultou na deterioração posterior da qualidadedos embriões e germinação pobre em comparação com o tratamento CSde 16 semanas.

Exemplo 11Germinação e Conversão de Embriões: Estudo das Capacidades deArmazenamento de Embriões em Meios 2M21 Líquidos

no Escuro a 4°C

Os embriões foram coletados em massa para cestas de poliésterque foram colocadas sobre dois papéis de filtro saturados com meio2M21 líquido (2,5 ml) e armazenadas por 4, 16 e 24 semanas. Excetopara o controle, um papel de filtro de 90 mm foi adicionado ã borda em4 semanas; as placas foram re-embrulhadas e, então, retornaram parao CS para seus respectivos tratamentos. O papel de filtro de 90 mmserviu para dois propósitos. Absorveu vapor de umidade na placa e emassim fazendo criou um ambiente de umidade relativa alta sem permitirque os embriões entrassem em contato direto com a água (a condensa-ção permite que a umidade se movimente da superfície de alimentaçãopara a seção superior da placa, isto é, umidade relativa alta modifica-da). Todas as placas foram embrulhadas com Nescofilm™ para preve-nir qualquer perda de umidade. A configuração requereu 5 linhagenscelulares representando 3 famílias e cada tratamento consistiu em 4replicatas por linhagem celular, cada uma das quais foi exposta àsetapas A e B do método padrão, embora a duração do tempo de arma-zenamento a frio na etapa A tenha variado conforme descrito abaixo e oestado do meio seja líquido e não gel:

Controle: embriões coletados em massa em 2M21 líquido.CS de 16 semanas: embriões coletados em massa em2M21 líquido, 16 semanas de armazenamento a frio.

CS de 24 semanas: embriões coletados em massa em2M21 líquido, 24 semanas de armazenamento a frio.

A Tabela 14 mostra que os embriões armazenados a frio por 16semanas em meio 2M21 líquido eram comparáveis aos embriões decontrole e não requereram tratamento de umidade relativa alta para agerminação. Em oposição aos embriões armazenados por 16 semanasem meio 2M21 gel, os embriões em 2M21 líquido apresentavam aparên-cia normal e produziram germinantes de boa qualidade. Os embriõesdo tratamento CS de 24 semanas em meio 2M21 líquido apresentavamboa aparência tal como no tratamento CS de 16 semanas. Estasobservações sugerem que para o armazenamento de embriões além de16 semanas o procedimento modificado (meio L2M21 + papel de filtro)pode ser desejado.

Exemplo 12Condicionamento de Embrião: Teste de Diferentes Métodos eTempos de Condicionamento

O propósito deste experimento foi o de testar o condicionamentoa frio além de 12 semanas utilizando-se um método de condicionamentoa frio que permite perda lenta de umidade do substrato de papel defiltro úmido. Um segundo parâmetro testado foi o volume de líquido nopapel de filtro em uma tentativa de se manter a duração do condicio-namento mais em linha com o esquema de tempo de 8 semanas tipica-mente utilizado no método padrão.

A Tabela 15 apresenta uma descrição detalhada dos componen-tes de cada um dos 10 tratamentos de condicionamento neste experi-mento.

Em resumo, os embriões somáticos de cinco linhagens celularesJ foram coletados em massa, reunidos e distribuídos nos dez tratamen-tos de condicionamento conforme descrito na Tabela 15. Os tratamen-tos 1-4 representam as etapas (A) e (B) do método padrão, mas comdurações de tempo variáveis de armazenamento a frio na etapa (A). Ostratamentos 5 a 10 representam modificações da etapa (A) do métodopadrão. Especificamente, nos tratamentos 5-10, o procedimento dearmazenamento a frio em (A) foi modificado para controlar a perda deumidade e utiliza papel de filtro saturado como substrato de condicio-namento em vez do meio gel do método padrão. A este propósito, o quese segue é uma descrição genérica do protocolo do tratamento alternati-vo ("condicionamento por Coleta em Massa") conforme deduzido pelosexperimentos com os tratamentos 5-10:

Condicionamento por Coleta em Massa: (etapa A) embriõessomáticos coletados em massa são colocados sobre papel de filtro quefoi saturado com o volume desejado (1 ou 2 ml neste experimento) demeio 2M21 líquido e colocado em armazenamento a frio pelo tempodesejado (8 a 16 semanas neste experimento), com um mecanismo nolocal para controlar a perda de umidade do papel de filtro durante otempo, e (etapa B) transferência dos embriões para meio de germinaçãode embrião gelificado e individualização do embrião somático em placasde germinação novas. Os embriões germinados são então transferidospara um vaso para conversão.

As condições específicas para os Tratamentos 1-10 são como sesegue:

O Tratamento 1 foi o método padrão utilizado para aprodução de plantas, apresentando tanto o tratamento de condi-cionamento a frio quanto o tratamento com umidade relativa altatotalizando 7 semanas.

Os Tratamentos 2, 3 e 4 foram similares ao Trata-mento 1, mas com tempo variável de armazenamento a frio de 11,e 19 semanas, respectivamente.

Os Tratamentos de 5 a 10 foram métodos de condi-cionamento a frio que variaram na duração total de 8 a 16 semanasno frio para induzir a perda gradual de umidade do substrato depapel de filtro úmido saturado com 2 ml (Tratamentos 5. 6 e 7) ou1 ml (Tratamentos 8, 9 e 10) de meio líquido.

A Tabela 16 resume os resultados de germinação e conversãoin vitro para os embriões condicionados nos 10 tratamentosdiferentes.

A Tabela 17 resume os teores de umidade das placas decondicionamento contendo embriões e o teor de umidade dosembriões após cada tratamento de condicionamento. O conjuntocompleto de dados para germinação e conversão é mostrado naTabela 18.

A perda de umidade alvo desejada de cada placa durante ocondicionamento a frio é de cerca de 1,5 graus, ou cerca de 75%dos 2 ml adicionados aos papéis de fíltro nos tratamentos 5, 6 e 7.A percentagem de perda de água nos tratamentos 5, 6 e 7 variou de40% (Trt 5), 68% (Trt 6) to 81% (Trt 7) (Tabela 17). Desta forma, ostratamentos 6 e 7 que armazenam a frio os embriões por 12 e 16semanas , respectivamente, se aproximaram da perda de água de75% desejada por placa.

As placas nos tratamentos 8, 9 e 10 continham apenas 1 mlde líquido adicionado ao substrato de papel de filtro antes docondicionamento a frio. A perda de água durante o condiciona-mento a frio variou de 81% (8 semanas, Trt 8), 107% (12 semanas,Trt 9) e 117% (16 semanas, Trt 10) (Tabela 17). Desta forma, otratamento 8 que continha 1 ml de líquido por papel de filtroapresentou aproximadamente a perda de umidade desejada (75%),enquanto os tratamentos de condicionamento mais longos, por 12e 16 semanas, perderam mais líquido que foi adicionado ao papelde filtro.

Os embriões nos tratamentos 1 a 8 apresentaram teores deumidade pós-condicionamento semelhantes, variando de 63% a87% (Tabela 17). Enquanto que o teor de umidade dos embriõesapós o condicionamento nos tratamentos 9 e 10 foram muito maisbaixos (44% e 21%). Isto reflete que para os tratamentos 9 e 10, osquais continham os períodos de tempo estendidos (12 e 16 sema-nas), a umidade é perdida tanto do líquido adicionado do papel defiltro quanto dos embriões na cesta.

Os Tratamentos 1 e 2, os quais tinham duração relativamen-te curta de armazenamento a frio, 4 e 8 semanas, respectivamente,produziram altas taxas de germinação, 38% e 33%, respectivamen-te. Os Tratamentos 3 e 4 com 12 e 16 semanas de armazenamentoa frio, respectivamente, produziram taxas de germinação baixas de14% e 18%, respectivamente. Desta forma, o condicionamento afrio estendido para além de 8 semanas não é desejável quando osembriões são mantidos no meio 2M21 geliflcado.

Vários dos tratamentos de condicionamento líquido que utiliza-ram papéis de filtro úmidos apresentaram tanto germinação quantoconversão relativamente altas (Tabela 16). Por exemplo, os Tratamentos7, 8, 9 e 10 todos apresentaram taxas de germinação e conversãosimilares ou mais altas que as do controle. A percentagem de embriõesque eram plantáveis (% de germinação χ % de germinantes plantáveis)desta forma foi a mais alta para estes tratamentos.

Estes resultados podem ser resumidos como se segue:

O teor de umidade médio dos embriões após o condicio-namento utilizando o substrato com meio gelificado foi de 77% (Tabela 17).

Os embriões do método gelificado apresentaram taxas degerminação de 33% e destes 34% dos germinantes eram plantáveis.Desta forma, 12% dos embriões (38% χ 34%) eram plantáveis (Tabela 16).

A extensão do método de condicionamento gelificado para19 semanas apresentou pouco efeito sobre o teor de umidade dosembriões (Tabela 17), no entanto reduziu o número de embriões queeram plantáveis (Tabela 16).

O teor de umidade dos embriões após o condicionamentoutilizando-se o método de condicionamento a frio em papel de filtroumedecido com 2 ml de meio líquido variou de 82% para 87% (Tabela17), apenas ligeiramente acima do padrão, embriões armazenadosgelificados. Este resultado verifica que a umidade não é perdida pelosembriões durante esta versão do tratamento de condicionamento a frioa base de líquido, mas em vez disto os embriões podem aumentarligeiramente seus teores de umidade.

A perda de água durante o método de condicionamento afrio líquido com 2 ml de meio líquido foi próxima dos 75% de perdaobjetivados quando a duração do armazenamento foi de 12 e 16 sema-nas, mas mais baixa quando a duração do armazenamento foi de 8semanas (Tabela 17).

A perda de água durante o método de condicionamento afrio com 1 ml de maio líquido foi próxima dos 75% de perda objetivadosquando a duração do armazenamento foi de 8 semanas. Quando aduração do armazenamento foi maior, 12 ou 16 semanas a perda deágua excedeu a quantidade de líquido adicionada aos papéis de filtro(Tabela 17).

Isto sugere que a utilização de 1 ml em vez de 2 ml de meiolíquido pode ser melhor quando a duração do tratamento de condicio-namento a frio é de 8 semanas. Inversamente, utilizando-se 2 ml podeser melhor quando a duração do condicionamento a frio deve ser de 12a 16 semanas.

As % de germinação e % de plantáveis mais altas foram obtidasem vários tratamentos de condicionamento a frio (tratamentos 7, 8 e 9).A percentagem de embriões plantáveis variou de 16 a 22% (Tabela 16),ligeiramente acima de aproximadamente o dobro de 12% plantáveis nométodo padrão (tratamento 1).

Os teores de umidade dos embriões nos tratamentos a frio demaior duração (tratamentos 9 e 10) alcançaram 44% e 21% (Tabela 17)e ainda apresentaram níveis altos de germinação e conversão (Tabela16). Desta forma, utilizando-se o método de condicionamento a frio abase de líquido com 1 ml de líquido por duração longa (12 ou 16semanas) resulta em perda de umidade dos embriões além da quanti-dade objetivada.

Estes resultados suportam as utilizações do método de condi-cionamento a frio a base de líquido para uma duração de 8 a 16 sema-nas pela colocação dos embriões coletados em massa em cestas no topode papéis de filtro umedecidos com meio 2M21. O volume de meiolíquido adicionado ao papel de filtro varia (1 ou 2 ml) dependendo daduração desejada. Os resultados aqui sugerem que 2 ml é melhor paraduração mais longa (isto é, 16 semanas) de condicionamento, enquanto1 ml é melhor para durações mais curtas (isto é, 8 semanas).

Este método resulta em germinação e conversão similares ouligeiramente melhores que o padrão, método de armazenamento a friode condicionamento a frio seguido por umidade relativa alta. Adicio-nalmente, este método de condicionamento a frio a base de líquido nãorequer a transferência dos embriões para caixas inconvenientes deumidade relativa alta. Isto é, o novo método é um tratamento decondicionamento de fase única que ocorre em um recipiente.

Estes resultados são importantes para produção em larga escalapor diversas razões. Primeiro, seria vantajoso se evitar o método emcaixa de umidade relativa alta, o qual é trabalhoso para se manipular,e, desta forma, dispendioso. Em segundo, o método de condicionamen-to a frio a base de líquido provê uma alternativa que pode ser maisefetiva em termos do custo que não requer a utilização de caixas deumidade relativa alta. O condicionamento ocorre em um recipiente semtransferência até que os embriões sejam finalmente removidos para agerminação.

Exemplo 13

Otimização dos Meios de Manutenção Líquidos

Para Intumescimento Rápidode Tecidos Embriogênicos de Pinheiro Loblolly

Este experimento foi desenhado para testar o efeito de diferentesmeios líquidos para o intumescimento rápido de tecido com o objetivode identificar um meio de manutenção líquido para a produção de umgrande volume de tecido embriogênico efetivo quanto ao custo para aprodução de embriões.

Este é um experimento de longo prazo em que cinco linhagenscelulares foram mantidas como culturas líquidas por até 24 semanas.No início deste experimento, estes tecidos posteriores ou tratamentocriogênico já tinham seis semanas de idade. A capacidade de produçãode embriões destas culturas foi testada a intervalos de quatro semanas.

Os dados de conversão dos embriões do primeiro plaqueamento de duaslinhagens celulares (J1 e J2) onde havia embriões suficientes de todosos quatro meios de tratamento listados abaixo.

A composição do meio DCR pode ser encontrado nas Tabelas 1 e2.

1. DCR com um total de 0,5 g/l de caseína.

2. DCR com um total de 1,0 g/l de caseína.

3. Mi3 com um total de 0,5 g/l de carvão ativado e um total de 1,0 g/l de caseína.

4. Mi3 com um total de 0,5 g/l de carvão ativado e um to-tal de 2,0 g/l de caseína.

Os tecidos dispersos em líquido foram colocados em frascoscontendo 20 ml dos respectivos meio de tratamento. Os frascos foramvedados e colocados na casa de vegetação no escuro. Após umasemana, as culturas em suspensão foram classificadas para seus SCV emais 10 ml dos respectivos meios de tratamento foram adicionados aosfrascos. Após mais uma semana de incubação da cultura, as culturasforam novamente classificadas para seus SCV, os dados de SCV foramregistrados a intervalos semanais a tempo da sub-cultura. Neste ponto,(isto é, duas semanas após o início da cultura líquida), dois frascosforam mantidos de cada tratamento combinado (um total de 40 frascos).Todas as culturas com SCVs de 60 ou acima foram plaqueadas para odesenvolvimento a 4 semanas de cultura líquida. Todos os SCVs foramajustados para 60 no momento do plaqueamento. Um ml da suspensãoSCV foi colocado em placa para meio de desenvolvimento de embrião(meio MSG de produção de embrião, ver Tabela 1) e quatro placas forampreparadas de cada frasco (4 réplicas). As placas foram vedadas comSaran e incubadas na casa de vegetação no escuro. Foram utilizadosmétodos padrão para o processo de desenvolvimento e os embriõessomáticos coletáveis foram contados. No momento do início da culturalíquida, foi colocado em placa também tecido mantido de cada linhagemcelular em meio Mi3 geliflcado utilizando-se meio padrão de desenvol-vimento de embrião para se obter dados de linha básicos da produçãode embrião somático.

Os dados SCV semanais, a quantidade de meio novo adicionadoa cada sub-cultura e os dados da contagem de embriões coletáveisforam registrados. A taxa de intumescimento de tecido (em número devezes) para cada frasco de cada sub-cultura foi calculada pela divisãode 30 (volume total de suspensão em ml em cada frasco) pelo valor(volume em ml) retido em cada frasco antes da adição de meio fresco. Ovolume potencial total de SCV (em ml) disponível para o plaqueamento a4 semanas de idade da cultura líquida para cada frasco - 30 ml χ taxade intumescimento de tecido (em vezes) na 3a sub-cultura χ taxa deintumescimento de tecido (em vezes) na 4a sub-cultura χ proporção dediluição para SCV 60. O número total de embriões somáticos coletáveispotenciais para cada frasco = volume potencial total (em ml) de tecido aSCV 60 χ número de embriões somáticos por ml de SCV. Os dadosforam analisados utilizando-se o procedimento PROCGLM de um pacotede programas disponível comercialmente SAS. O SAS é um programaestatístico utilizado para a análise dedados (SAS Institute Inc., Caiy,NC, EUA).

Os volumes de célula sedimentada (SCV) foram determinadospara cada linhagem celular a cada semana para cada meio de tratamen-to. O SCV é uma estimativa bem conhecida do crescimento celular.Foram observadas variações altamente significativas entre as linhagenscelulares (p<0,0001) e entre os tratamentos (p<0,0001) para SCV.Similarmente, a interação linhagem celular χ tratamento foi tambémaltamente significativa (p<0,0001).

De maneira a tornar a grande quantidade de dados facilmentecompreensível, as razões dos tratamentos #2, #3 e #4 em relação aotratamento #1 foram calculadas tanto para produção de tecido quantopara a produção de embrião. Primeiro, foi calculada a média reunida decinco linhagens celulares χ 6 pontos dos dados para cada tratamentopara a produção de tecido. Os valores são 19,3, 33,67 e 90 para ostratamentos 1, 2 e 3, respectivamente. As razões do tratamento #2(33/19,3) = 1,7, tratamento #3 (67/19,3) = 3,5 e tratamento #4(90/19,3) = 4,7 foram calculadas. As razões de tratamento #3, trata-mento #4 para produção de embrião (Tabela 26) foram também calcula-das utilizando-se o mesmo método. O valor da produção potencial detecido para cada tratamento foi calculado multiplicando-se o valor daprodução de tecido pelo valor da produção de embrião. Por exemplo,para o tratamento #4 (4,7 χ 5,4) = 25.A média para as cinco linhagens celulares reunidas pelo trata-mento é mostrada na Tabela 25. A Tabela 25 mostra crescimento maisrápido (intumescimento mais rápido) nos meios Mi3 líquidos (ambostratamentos com caseína) durante todo o período quando em compara-ção com o controle DCR. A caseína aumentada em DCR (1 g/l decaseína) mostra também um ligeiro aumento no crescimento em atéquatro meses em cultura em relação ao controle, mas significativamentemais baixo que nos tratamentos Mi3. Entretanto, nos 5o e 6o meses detratamento #2 (DCR com 1 g/l de caseína) foi produzido um volumemaior de tecido e muito aproximado ao tratamento com Mi3.

Uma vez que a linhagem celular por interação de tratamentocom meio foi altamente significativa, os dados de cada linhagem foramanalisados separadamente para cada tratamento. A comparação daprodução de tecido (aumento em vezes) em diferentes pontos no tempoem cultura líquida é mostrada na Tabela 19. Os valores de cada caixarepresentam a multiplicação tas taxas de intumescimento de tecido dequatro semanas. Por exemplo, o valor para o tecido da linhagem celularJ5 mantida no meio com tratamento #4 na semana 12 é de 78. Estevalor foi calculado pela multiplicação das taxas de intumescimento detecido nas semanas 9, 10, 11 e 12 = 2,8 χ 2,9 χ 3,0 χ 3,2, respectiva-mente. De acordo com o método atual após a sub-cultura, o SCV dasuspensão diluída deve ser de aproximadamente 40.

Tipicamente, uma suspensão não é sub-cultivada se não alcançaSCV de 60 após 7 dias, o que significa um mínimo de 1,5 vezes doaumento por semana. Por esta razão, em quatro semanas um aumentomínimo esperado em vezes deveria ser 1,5 χ 1,5 χ 1,5 χ 1,5 = 5 parauma linhagem celular ser considerada com crescimento em culturalíquida. Com base neste critério, apenas duas linhagens celulares (J1 eJ2) puderam ser mantidas em todos os quatro meios de tratamento portodas as 24 semanas. O material de partida na semana 0 foi um gramade tecido, o que eqüivale a 5 ml de suspensão SCV a 60%. O valor nacoluna da semana 4 foi calculado com base em quanto a suspensãoSCV 60% estava disponível em ml dividida por 5.

O efeito dos tratamentos com meio sobre o intumescimentopotencial de tecido de cinco linhagens celulares a diferentes pontos notempo em cultura após a iniciação da cultura líquida é mostrado naTabela 19. A variação linhagem a linhagem para o volume de tecido foiobservada.

O tratamento #1 falhou em sustentar crescimento de tecido emtrês das cinco linhagens celulares. Por outro lado, o tratamento #4(meio melhorado) sustentou crescimento de tecido em todas as cincolinhagens celulares. Quando as performances de tratamento #2 (DCR-1caseína) e tratamento #3 (MÍ3-1 caseína) foram comparadas, o meioMi3-1 caseína foi similar para a linhagem celular J3 e significativamen-te superior para as outras quatro linhagens celulares. Por outro lado, otratamento #4 (MÍ3-2 caseína) foi significativamente superior ao meioDCR para todas as linhagens celulares. O tratamento #4 foi apenasmelhor na capacidade de intumescimento de tecido, sua performancefoi também consistente com uma média de aumento de 98 vezes em umintervalo de quatro semanas.

Os dados de produção de embrião das cinco linhagens celularesforam comparados em tecidos intumescidos em quatro meios líquidos aintervalos de quatro semanas. Foram observadas variações altamentesignificativas entre as linhagens celulares (p<0,0001) e entre os trata-mentos (p<0,0001) para a produção de embrião. Similarmente, ainteração linhagem celular χ meio de tratamento foi também altamentesignificativa (p<0,0001). Os resultados são mostrados na Tabela 20.

Ambos os frascos foram mantidos de cada linhagem celular poscombinações de tratamento até o quarto plaqueamento e foram coloca-do em placas tecidos de todas as 40 fontes (5 linhagens χ 4 tratamentosχ 2 frascos) para o desenvolvimento de embrião. Após o quarto plaque-amento, a linhagem por tratamento combinado que falhou em crescerfoi descartada. Os dados de produção de embrião mostrados na Tabela20 mostram claramente a superioridade do tratamento #4 (meio Mi3com 2 de caseína) em relação ao tratamento #1 de controle. Emborauma variação frasco a frasco significativa não tenha sido observada noprimeiro plaqueamento, isto ficou evidente no plaqueamento subse-qüente (* = diferença significativa e ** = diferença altamente significati-va). A capacidade de produção de embrião declinou com a idade dacultura para a maioria das linhagens celulares. Pode-se observar aquique estas linhagens celulares já tinham seis meses de idade quando acultura líquida foi iniciada.

A Tabela 26 mostra o efeito de quatro tratamentos sobre aprodução de tecido, produção de embrião e produção potencial deembrião de cinco linhagens celulares (reunidas). Os dados representamo aumento em vezes em comparação com o controle (DCR líquido com0,5 g/l de caseína) que é 1.

Os embriões do primeiro plaqueamento de duas linhagenscelulares (J1 e J2) onde havia embriões suficientes de todos os quatromeios de tratamento, foram coletados manualmente, condicionados,germinados e convertidos utilizando-se o método padrão. Os resultadossão mostrados na Tabela 21. Embora tenha sido evidente uma intera-ção linhagem-tratamento, os dados de conversão reunidos sugerem quea qualidade dos embriões produzidos pelos quatro meios de tratamentofoi comparável.

Exemplo 14

Comparação dos Meios DCR e MI3/0,5 de caseína

Explantes semente imaturos de 17 famílias de pinheiro loblollyforam colocados em placa em meio de iniciação WV5 padrão. Ver asTabelas 1 e 2. Tecidos embriogênicos recentemente iniciados retiradosde explantes semente imaturos (linhagens celulares) foram transferidospara o Meio 1 (DCR), ou Meio 2 (Mi3 com 0,5 g/l de caseína), doistratamentos alternativos de meio de manutenção. A concentração de30 sacarose foi de 30 g/l em ambos os meios. O tecido foi transferido parameios frescos a cada 2 semanas.

Foram coletados dados quando ao número de linhagens célulares recentemente iniciadas que cresceram com sucesso para umamassa de 1 grama. Ver Tabela 22,

Aproximadamente 1320 linhagens celulares recentementeiniciadas de 17 famílias de pinheiro loblolly foram transferidas para osdois meios alternativos. 51% destas linhagens celulares cresceram comsucesso para uma massa de 1 grama no meio Mi3, enquanto 40% daslinhagens celulares cresceram com sucesso para uma massa de 1grama no meio DCR.

Exemplo 15

Comparação dos Meios de Manutenção MI3com Dois Níveis de Caseína

Explantes semente imaturos de 4 famílias de pinheiro loblollyforam colocados em placa em um de dois meios de iniciação WV5. Veras Tabelas 1 e 2. Um dos meios WV5 contém a quantidade "padrão" decaseína, por exemplo, 0,5 g/l, enquanto a outra placa continha 2,0 g/lde caseína.

O experimento foi desenhado de tal forma que os embriões nosmeios 0,5 g/l de caseína/WV5 foram subseqüentemente transferidospara um meio 0,5 g/l de caseína/Mi3 conforme descrito abaixo.

Similarmente, os embriões nos meios 2,0 g/l de caseína/WV5 foramsubseqüentemente transferidos para um meio 2,0 g/l de caseína/Mi3também como descrito abaixo.

Foram transferidos Tecidos embriogênicos recentemente inicia-dos retirados de explantes semente imaturos (linhagens celulares) parao Meio 2 (Mi3 com um total de 0,5 g/l de caseína), ou Meio 3 (Mi3 comum total de 2,0 g/l de caseína) como dois meios alternativos de trata-mento de manutenção. A concentração de sacarose foi de 15 g/l emambos os meios. O tecido foi transferido para meios frescos a cada 2semanas.

Foram coletados dados quanto ao número de linhagens celularesrecentemente iniciadas que cresceram com sucesso para uma massa de3 gramas. Ver Tabela 23.A utilização do meio de manutenção com teor de hidrolisado decaseína mais alto aumentou a percentagem de linhagens celularesrecentemente iniciadas que cresceram com sucesso para uma massa de3 gramas. O sucesso foi de 40% quando as linhagens celulares foramcrescidas em meio com 0,5 g/l de caseína, e 48% quando foram cresci-das em meio com 2 g/l de caseína.

Exemplo 16

Efeito do Meio de Desenvolvimento

Sobre a Produção de Embrião

Vinte e seis linhagens celulares embriogênicas foram crescidasem meio de manutenção 3 (Mi3 com 2 g/l de caseína) e plaqueadas emdois meios de desenvolvimento de embrião, isto é, em meio de baseMSG. Este meio é baseado em MSG com 2 g/l de maltose e 21 mg/l deABA. Um meio continha 70 g/l de PEG e um continha 130 g/l de PEG(PEG = polietilenoglicol). O tecido com desenvolvimento de embrião foitransferido para meio fresco após 6 semanas e os embriões foramcoletados após mais 3 semanas.

As linhagens celulares foram classificadas para a produção deembrião. A Tabela 24 classifica as linhagens para a produção deembrião. Sim = pelo menos 10 embriões por grama de tecido; Não =menos de 10 embriões por grama de tecido.

Sete das 26 linhagens plaqueadas mostraram produção deembrião diferenciadas entre os dois meios de desenvolvimento testados.Notes-se que várias linhagens (por exemplo, as linhagens celulares 6,10 e 17) responderam muito melhor em meio com 13% de polietilenogli-col, enquanto as outras linhagens (por exemplo, linhagens celulares 2,24 e 25) responderam muito melhor em meio com 7% de polietilenoglicol.

Testes adicionais com outras linhagens celulares revelaram quea germinação de certos genótipos é também influenciada pela concen-tração de PEG. Por esta razão, pode-se otimizar tanto a produção deembrião quanto a germinação de forma específica para o genótipo.Exemplo 17

Efeito do Nível de Caseína Sobre a Recuperaçãoe Crescimento de Culturas Embriogênicasde Conífera Recuperadas de Crioarmazenagem

É conhecido dos especialistas na técnica de embriogênesesomática de conífera que as culturas em geral perdem a capacidade deregeneração com o aumento do tempo de cultura. Desta forma, éimportante para o sucesso da aplicação de SE para a propagação clonalde coníferas ser-se capaz de recuperar e multiplicar rapidamente ouintumescer culturas de armazenamento criogênico e ser-se capaz de ofazer com muitos genótipos diferentes para aumentar a probabilidadede captura dos genótipos selecionados,

Este exemplo testou o efeito de um meio de intumescimento detecido aperfeiçoado (Mi3 com alto teor de caseína) tanto sobre a taxa decrescimento quanto sobre a freqüência de recuperação de culturasembriogênicas de pinheiro loblolly da crioarmazenagem.

Logo após a iniciação da cultura cada 10 famílias H e 12 famíliasI de linhagens celulares embriogênicas de pinheiro loblolly foramdivididas igualmente para o tratamento com 0,5 e 2,0 g/l de caseína emmeio de pré crio-manutenção Mi3. As linhagens foram crio-preservadasde acordo com os métodos padrão, recuperadas das crioarmazenagens ecolocadas em meio Mi3 (Tabelas 1 e 2) contendo nível ou 0,5 (nívelpadrão) ou 2,0 g/l (alto) de hidrolisado de caseína - o mesmo nível quecasa amostra continha antes e durante a crioarmazenagem. Destaforma, cada linhagem celular foi testada tanto em baixo quanto em altoteor de caseína. Este procedimento auxilia em assegurar que asdiferenças observadas no crescimento ou recuperação são mais prova-velmente devidas aos efeitos do tratamento que dos efeitos do genótipo.

Em 4 semanas depois de crio-recuperação todos os tecidosforam pesados. O peso da cultura a 6 semanas é um peso potencialcom base em quanto uma sub-amostra aumentou em peso multiplicadopelo peso a 4 semanas.Ocorreram interações significativas entre as linhagens e o nívelde caseína tanto no crescimento de tecido a 4 semanas (p<0,0001 paraas famílias Hei) quanto no crescimento potencial de tecido a 6 sema-nas (p<0,0001 para a família Hep = 0,01 para a família I). Esteresultado mostra que algumas linhagens se beneficiam mais do altoteor de caseína que outras linhagens em termos do crescimento detecido aumentado.

No total, o alto teor de caseína mais do que dobrou a quantidadede tecido disponível em 4 semanas (Tabela 27). Em várias linhagenshouve pouco ou nenhum crescimento em baixo teor de caseína, mascrescimento significativo no tratamento com alto teor de caseína.

Em adição ao efeito positivo que o teor de caseína aumentadoapresentou sobre o crescimento, aumentou a freqüência de recuperaçãoda linhagem celular em ambas as famílias (Tabela 28). Enquanto queapenas 6 de 10 linhagens celulares foram recuperadas da família H nonível de caseína de 0,5 g/l, 9 de 10 linhagens foram recuperadas nonível mais alto de caseína. Todas as 12 famílias I de linhagens celularesforam recuperadas em caseína alta, enquanto apenas 7 das 12 foramrecuperadas em baixa caseína.

lsto é um resultado importante para o sucesso da implementa-

ção de estratégias de teste clonal. Mostra que mais linhagens podemser recuperadas com sucesso a partir de crioarmazenagem utilizando omeio Mi3 com alto teor de caseína. Embora tenha havido uma linha-gem por interação de tratamento, no total as linhagens podem serintumescidas mais rapidamente em alta caseína. Este resultadoaumenta significativamente a probabilidade de linhas de elite poderemser recuperadas com sucesso da crioarmazenagem e intumescidas paraa produção em massa. Além disto, a taxa de intumescimento rápidoauxilia em assegurar que as culturas resultantes terão retido suascapacidades embriogênicas para produção em larga escala.

Em conclusão, utilizando-se alto teor de caseína no meio decultura aumenta o número de linhagens que podem ser recuperadas dacrioarmazenagem com crescimento de tecido melhorado.

Exemplo 18

Efeito do Brassinolide em Meio de Pós Crio-RecuperaçãoSobre o Crescimento de Tecido e Subseqüente Produçãode Embriões de Linhagens Celulares Embriogênicasde Pinheiro Loblolly

Este experimento verifica se o brassinolide no meio de intumes-cimento pós armazenamento criogênico apresenta um efeito positivosobre a recuperação e crescimento de tecido possibilitando uma multi-plicação e intumescimento mais rápidos; e se há uma interação linha-gem com tratamento (sem ou com brassinolide) que possa ser exploradapara permitir a varredura de genótipos de maneira a otimizar s melhorcombinação para cada linhagem celular em termos tanto do crescimen-to de tecido quanto da subseqüente produção de embrião somático.

Foram testados dois tratamentos com meio de recuperação pós-crioarmazenagem:

Tratamento # 1: meio Mi3 (Tabelas 1 e 2) com alto teor de caseína(2,0 g/l) (meio aperfeiçoado).

Tratamento #2: O mesmo meio com alto teor de caseína Mi3 comadição de 0,1 μΜ de brassinolide.

Cinco linhagens celulares J e cinco linhagens celulares K foramtestadas. Para cada linhagem celular, 4 frascos (2 meios de pós crio-recuperação χ 2 replicatas) foram retirados da criarmazenagem. Otecido recuperado de cada frasco foi transferido para seu respectivomeio fresco com duas semanas de intervalo utilizando-se um método detransferência com cesta. Dados de peso foram registrados para o tecidoderivado de cada frasco na 6a semana após a crio-recuperação. Na 6asemana, os tecidos de ambas as replicatas de cada tratamento foramreunidos e mantidos em seus respectivos meios de manutenção utili-zando-se um método de dispersão: 200 mg por amostra em 1 ml demeio Mi3 líquido dispersados por agitação e derramados em cada placade cultura. Um total de 800 mg de tecido de cada linhagem celular χcombinação de meios de pós-crio foram colocados em placa em meio dedesenvolvimento de embrião (4 replicatas de 200 mg/ placa) para testara capacidade de produção de embriões. O peso total de tecido de cadasub-cultura foi registrado para se calcular o potencial de cada trata-mento para intumescimento de tecido e produção de embrião. Osembriões somáticos coletáveis de cada placa foram registrados a 9semanas de incubação em meio de desenvolvimento de embrião MSG(Tabelas 1 e 2). Os dados de produção de embrião foram analisadosseparadamente para as linhagens celulares JeK utilizando-se oprocedimento PROCGLM da SAS. O potencial de produção de embriãopara cada tratamento foi calculado pela multiplicação dos dados deprodução de embrião pelo tecido potencial total produzido em cadalinhagem celular e tratamento.

Ocorreram diferenças consideráveis na produção de tecido entreas linhagens celulares de cada fonte (JeK). Para todas as 10 linhagenscelulares, o meio Mi3 aperfeiçoado com adição de brassinolide (trata-mento 2) produziu a quantidade mais alta de tecido. Para linhagenscelulares de recuperação lenta (K10 e Kl 1, e J4), a adição de brassino-lide foi bastante efetiva (um aumento de duas a três vezes no cresci-mento).

O efeito do brassinolide no meio de intumescimento Mi3 aperfei-çoado sobre a subseqüente produção de embrião foi testado. A análiseda variância mostrou interações linhagem celular χ meio de tratamentoaltamente significativas (p<0,0001). Uma vez que a interação linhagemcelular χ meio de tratamento foi altamente significativa, os dados decada linhagem celular foram analisados separadamente para cadatratamento. Os resultados são mostrados nas Tabelas 29 e 30.

Os potenciais de produção de embrião totais de tecidos recupe-rados e multiplicados em meio Mi3 aperfeiçoado com brassinolide foramsignificativamente mais altos (> 35% tanto para a linhagem J quantopara a linhagem K em comparação com o controle).

Os resultados mostram claramente que a adição de brassinolideé benéfica para o crescimento de tecido pós-crio. O impacto do brassi-nolide na produção de embriões é altamente dependente da linhagem.Por esta razão, uma bateria de abordagens para a varredura de linha-gens no que diz respeito às suas respostas em Mi3 com ou sem brassi-nolide é uma forma efetiva de se otimizar a produção em larga escala deembriões.

Em resumo, o meio Mi3 aperfeiçoado contendo brassinolideproduziu a quantidade mais alta de tecido: 127% para as linhagens J e191% para as linhagens K em comparação com o meio aperfeiçoadosem brassinolide.

Interações altamente significativas linhagem celular χ meio detratamento (com ou sem brassinolide) (p = < 0,0001) foram observadaspara a capacidade de produção de embriões de tecidos com 6 semanasde idade.

Este tipo de interação meio χ linhagem possibilita a varredura eotimização da produção de embriões para linhagens celulares particula-res para produção em larga escala.

O potencial de produção de embriões de tecidos recuperados emultiplicados em meio Mi3 aperfeiçoado com brassinolide foi significati-vãmente mais alto - 149% para as linhagens celulares J e 136% para aslinhagens celulares K - em comparação com o meio Mi3 aperfeiçoadosem brassinolide.

Exemplo 19

Melhorando a Captura de Genótipo Entre Várias FamíliasGenéticas Diferentes de Pinheiro LoblollyPela Exploração da Famíliapor Interação de Tratamento com Meio

Explantes semente imaturos foram cultivados de cada uma desete famílias geneticamente diferentes (A, B, C, D, E, F e G) de pinheiroloblolly. Os explantes foram cultivados em quatro diferentes meios decultura - tratamentos 1, 2, 3 e 4, conforme mostrado na Tabela 31. Ostecidos embriogênicos somáticos de explantes responsivos foramtransferidos para meios de manutenção conforme mostrado na Tabela31 em 8 semanas. Após 4 semanas em meio de manutenção (o tecidofoi transferido para meio de manutenção novo na semana 2), o númerode culturas que atingiu pelo menos 1 grama foi determinado. Emresumo, os quatro tratamentos foram: o tratamento de controle (n° 1)continha meio de iniciação WV5 com 30 g/l de maltose e 0,5 g/l decaseína, e o meio de manutenção Mi3 com 30 g/l de sacarose e 0,5 g/lde caseína. Desta forma, o tratamento de controle continha níveis decaseína típicos (isto é, baixos) em ambos os meios de iniciação e manu-tenção. O tratamento 2 diferiu do controle pelo fato de conter um altonível de caseína (2 g/l) em ambos os meios de iniciação e manutenção.

O tratamento 3 diferiu do controle no fato de conter um nível reduzidode maltose (15 g/l) no meio de iniciação. O tratamento 4 diferiu docontrole no fato de conter tanto alto teor de caseína (2,0 g/l) quanto teorbaixo de maltose (15 g/l) no meio de iniciação, bem como teor decaseína alto (2,0 g/l) no meio de manutenção.

A análise estatística dos dados mostrou que ocorreu uma famíliaaltamente significativa por interação de tratamento (p = 0,02) para apercentagem de explantes semente que estabeleceram culturas comcrescimento vigoroso em 12 semanas. Desta forma, a freqüência deestabelecimento de cultura SE para a maioria das famílias (5 de 7)variou por tratamento. Duas das cinco famílias (D e E) apresentaramas freqüência de estabelecimento mais altas no tratamento 2, quecontinha alto teor de caseína em ambos os meios de iniciação e demanutenção. Três das cinco famílias (C, FeG) apresentaram a fre-qüência mais alta de estabelecimento no tratamento 4 que tinha altoteor de caseína e baixo teor de maltose no meio de iniciação e alto teorde caseína no meio de manutenção.

Estes resultados mostram que uma varredura de um número defamílias em uma bateria de meios iniciação/manutenção de culturaresulta no fato de se ser capaz de capturar com sucesso mais culturasSE. Esta abordagem possibilita que se identifique um tipo particular demeio que é mais adequado para uma família genética particular. Apósuma varredura inicial para se determinar o tipo de meio mais responsi-vo, pode-se cultivar explantes adicionais no tipo de meio "preferido"para se atingir as freqüências de iniciação mais altas para cada famíliaindividual.

O poder desta abordagem se torna óbvia observando-se asdiferenças a seguir na freqüência de captura de genótipo com base naescolha do meio ideal para uma família em particular. Por exemplo,com base nos resultados na Tabela 31, é necessário se cultivar 10000explantes da família C em meio WV5 (meio de controle, trt #1) para secapturar 100 linhagens celulares. Enquanto que é necessário secultivar apenas 1000 explantes da mesma família C para se obter 100linhagens celulares utilizando-se o meio de iniciação WV5 aperfeiçoado(alto teor de caseína e baixo teor de maltose) em combinação com omeio de manutenção Mi3 aperfeiçoado (alto teor de caseína).

Similarmente, enquanto 5000 explantes da família E são neces-sários para se cultivar em meio WV5 de controle e meio de manutençãode controle Mi3 para se obter 100 linhagens celulares, apenas 1400explantes da família E são necessários se cultivar em WV5 com alto teorde caseína seguido de Mi3 com alto teor de caseína para se obter 100linhagens celulares.

A bateria de abordagens, desta forma, possibilita uma capturade genótipos muito mais eficiente para teste clonal e aumenta a possibi-lidade de ser capaz de capturar os genótipos suficientes necessáriospara se identificar aqueles genótipos com o ganho genético potencialsignificativo desejado para emprego em larga escala.

Exemplo 20

Aperfeiçoando a Eficiência da Produção de Embriõespela Exploração do Genótipo por Interação deDesenvolvimento de Embrião

Sete linhagens celulares de pinheiro loblolly foram testadas emdois níveis de PEG (7 e 13%) e dois tipos de PEG (Fluka: peso molecularde 4000 e Acros: peso molecular 8000), para um total de 4 tratamentosde desenvolvimento de embrião somático. Placas de desenvolvimento deembrião múltiplas foram testadas em cada tratamento e os dadosrastreados por placa para possibilitar a determinação de um númeromédio de plantas por placa de desenvolvimento. Os dados coletadosincluem: (1) número médio de embriões coletáveis produzidos por placade desenvolvimento de embrião, (2) freqüência em que os embriõescoletados germinaram e (3) o número médio de plantas estabelecidasproduzidas por placa de desenvolvimento de embrião. Ver Tabela 32.

Ocorreram significativas interações linhagem por tratamentopara a germinação de embriões e estabelecimento de plantas. Algumaslinhagens celulares se beneficiaram do PEG aumentado, enquantooutras apresentaram uma redução significativa no número de plantasproduzidas em alta quantidade de PEG. Desta forma, uma abordagemde varredura de genótipo para a otimização do meio de desenvolvimentode embrião é uma forma efetiva de se assegurar que durante a produ-ção em larga escala com genótipos específicos que seja utilizado o meiode desenvolvimento de embrião ideal.

Por exemplo, com base nos resultados, embora a linhagemcelular Al tenha produzido mais embriões em PEG alto, a germinação econversão foram suprimidas em PEG alto. Uma vez que a germinação econversão são etapas dispendiosas, seria vantajoso com esta linhagemcelular particular se utilizar PEG a 7%, preferivelmente a do tipo Flukacom peso molecular de 4000. A linhagem celular Cl respondeu diferen-temente, apresentando a melhor produção de embriões, germinação econversão (estabelecimento de planta) em PEG do tipo Fluka 4000 a13%. Por esta razão, a abordagem de varredura de genótipo possibilitase otimizar a produção de embriões para cada genótipo.

Exemplo 21

Uma Abordagem Combinatória Para Otimizar o Processode Embriogênese Somática Para Uso em Produção Comercialem Larga EscalaPrimeiro, nas etapas de iniciação e manutenção, a combinaçãode meios utilizada nestas duas etapas é otimizada a nível da família.

Esta abordagem foi delineada no Exemplo 19. Isto possibilita a capturamais eficiente de genótipos de uma família em particular a ser colocadaem armazenamento criogênico para subseqüente utilização no processode etapas múltiplas.

Em segundo, na recuperação de linhagens celulares da crioar-mazenagem os componentes do meio são otimizados de acordo tantocom o crescimento de tecido quanto com a produção subseqüente deembriões. Esta abordagem foi delineada nos Exemplos 17 e 18.

Em terceiro, na etapa de desenvolvimento de embrião, sãotestados meios de desenvolvimento de embrião múltiplos para sedeterminar o meio ideal para uma linhagem celular em particular. Estaabordagem é delineada nos Exemplos 20 e 16.

Desta forma, a aplicação de uma bateria de meios em váriasetapas seqüenciais resulta em uma abordagem combinatória paraaumentar a probabilidade de maximização do número de candidataspara aumento de escala, e também para aumentar a eficiência e reduziro custo para a implementação do processo de embriogênese somática.Esta interação tipo do meio por linhagem ou família possibilita que serealize uma varredura e otimize vários parâmetros, incluindo os seguin-tes: captura de genótipo, recuperação de tecido de armazenamentocriogênico, intumescimento de tecido em aumento de escala, produçãode embriões, eficiência de germinação e estabelecimento de plantas(conversão) para linhagens celulares particulares para produção emlarga escala.

Exemplo 22

Metodologia de Condicionamentode Embrião Alternativa

Embriões somáticos de várias linhagens celulares diferentes depinheiro loblolly foram testados para germinação após exposição ou aométodo descrito abaixo ou na patente US 5.413.930, a qual é incorpo-rada aqui como referência. O método novo e aperfeiçoado descrito aquié muito mais simples, menos dispendioso, menos demorado e resultaem germinação e conversão a planta similares ou melhores. Maisimportante, este novo aperfeiçoado método de condicionamento é maisconveniente para aumento de escala para condicionamento de grandesnúmeros de embriões para produção comercial de larga escala. Aopasso que o método padrão conforme ensinado na patente US5.413.930, embora efetivo para produção em pequena escala, não éconveniente para produção comercial em larga escala.

O condicionamento em pequena escala padrão (controle nasTabelas 33 e 34) utilizou vasos contendo 50 ml de água esterilizadasobre os quais foi colocada uma grade de suporte para manter osembriões afastados do contato direto com a água. Cestas contendoembriões coletados foram marcadas com papel de filtro estéril e coloca-das sobre a grade de suporte no vaso. Este método de condicionamentopadrão é uma das etapas mais trabalhosas do processo SE, e não éfacilmente susceptível ao aumento de escala para processos de produ-ção maiores. O experimento mostra que uma boa germinação e umaboa conversão de embriões podem ser obtidas pela simplificação doprocesso de condicionamento, e evitando-se a etapa trabalhosa deumidade relativa alta (URA) onde os embriões são mantidos em vasovedado sobre água. O método padrão requer muita manipulação,incluindo: preparação dos vasos, preenchimento destes com água,marcação dos embriões, e armazenamento dos vasos volumosos deURA. O método de condicionamento "sem URA" alternativo requerapenas uma cesta estéril e vaso por cesta de embriões. É possível, sedesejado, se colocar mais de uma cesta estéril com embriões por vaso.Os embriões na cesta ou cestas são levados a armazenamento a frio(7°C neste exemplo) e colocados em um papel de filtro seco em um vasoestéril. Os vasos são vedados com Nescofilm™ e, então, incubados noescuro aproximadamente à temperatura ambiente (24°C, neste exem-plo). Após três semanas, os embriões foram removidos e colocados emmeio de germinação MODMS. Os embriões foram então individualiza-dos na superfície do meio e a germinação foi iniciada.

A germinação foi essencialmente a mesma entre os dois métodosde condicionamento (Tabelas 33 e 34). Em ambos os testes a germina-ção foi similar entre o método 1 - o método controle ou padrão, e ométodo 2 - o método ce condicionamento novo aperfeiçoado. Noentanto, o novo método de condicionamento é muito mais simples, maisefetivo quanto ao custo e, desta forma, mais útil para produção comer-cial em larga escala. Ambos os experimentos conduzidos com diferenteslinhagens celulares mostraram o mesmo resultado. A saber, o novométodo de condicionamento é um aperfeiçoamento significativo emrelação aos métodos do estado da técnica tendo em vista sua simplici-dade e facilidade de utilização e ainda resulta na germinação equivalen-te ou melhor dos embriões.

Exemplo 23

Máquina Semi-Automática de Coletaem Massa de Embriões

Este Exemplo descreve uma realização de modo em batelada deuma máquina de coleta em massa semi-automática. A funcionalidadeda máquina pode ser convertida a uma máquina contínua totalmenteautomatizada, a qual pode ser integrada em uma produção automatiza-da em linha de larga escala. A máquina coletora em massa de embriõesde modo em batelada semi-automatizada tem três módulos funcionaisbásicos: 1) unidades de lavagem, 2) unidades de suporte e 3) unidadesde enxágüe. Tanto as unidades de lavagem quanto as unidades deenxágüe possuem vácuo para a remoção de água de rejeito e tecido. Amáquina foi automaticamente controlada por um pequeno controladorprogramável lógico (PLC) (por exemplo, Direct Logic, modelo número DL-05) com uma interface de operados para as entradas do operador,parâmetros operacionais, mensagens de erro e relatórios de produção.Um PLC com mais entradas e saídas digitais ou um computador PCpode ser necessário para um sistema completamente automatizado. Amáquina completa foi localizada em um ambiente estéril, por exemplo,uma capela de fluxo laminar ou câmara filtrada HEPA. A máquinacontinha também a funcionalidade adicional de limpeza no local (CIP)para um bom controle de qualidade (QC) pela simples adição de enca-namento, uma bomba e uma válvula controlada automaticamente paraesterilizar a máquina durante as horas não produtivas sem o desmonteda máquina. Isto assegura uma maximização do tempo enquantomantendo as condições estéreis. Os embriões foram coletados comodelineado na Figura 11 (fluxograma do processo). A seguintes etapasdescrevem a operação da máquina.

Etapa 1

O operador carregou os embriões e tecido em 3 unidades desuporte (aproximadamente 500 embriões por unidade de suporte)inclinando a unidade de suporte, tal como por 45 graus, na direção dooperador para facilitar a carga.

Etapa 2

O operador alinhou as unidades de suporte verticalmente sobreas unidades de lavagem e iniciou o processo de lavagem com uminterruptor de pé. Os controladores verificaram que as montagensestavam na posição e orientação corretas por sensores de posição. Ocontrolador então ativou dois cilindros pneumáticos para abaixar asunidades de suporte e os mecanismos de aspersão para a posição delavagem. Na posição abaixada, sensores adicionais verificaram que asmontagens foram registradas nas posições corretas antes do ciclo delavagem ser iniciado. O ciclo de lavagem pré-programado foi entãoexecutado. Os meios, água de rejeito e tecido vegetal estranho foramretirados utilizando-se vácuo pela abertura automática de uma válvulacontrolada eletronicamente.

Etapa 3

O controlador levanta automaticamente os mecanismos deaspersão e unidades de suporte utilizando os cilindros pneumáticos. Ooperador foi alertado para atravessar ambas as montagens horizontal-mente na direção da frente da máquina para a unidade de enxágüe. Seo tecido não havia sido retirado completamente dos embriões pelalavagem, o operador pode intervir e iniciar um outro ciclo de lavagemutilizando o interruptor de pé.

Etapa 4

Ao prosseguir para o ciclo de enxágüe, o operador girou asunidades de suporte 180 graus resultando no fato do tecido se localizarna parte inferior. Uma vez que as partes superiores foram alinhadascom a estação de enxágüe, o operador iniciou o ciclo de enxágüe com ointerruptor de pé.

Etapa 5

O controlador e sensores de proximidade asseguram um ali-nhamento apropriado antes de prosseguir. O controlador então ativoudois cilindros pneumáticos para abaixar as unidades de suporte emecanismos de aspersão para a posição de enxágüe. O ciclo de enxá-güe pré-programado foi então executado. Os embriões enxaguadosforam coletados em cestas localizadas nas unidades de enxágüe e aágua de enxágüe foi retirada por meio de vácuo pela abertura automáti-ca de uma segunda válvula eletronicamente controlada.

Etapa 6

Ao final do enxágüe o controlador levantou as unidades de suportede tal forma que o operador pudesse inclinar as unidades de suporteafastando-as das unidades de enxágüe. As cestas com os embriõescoletados foram então removidas para o próximo estágio do processo deprodução.

Uma descrição mais detalhada de uma realização presentementepreferida da invenção é provida abaixo e ilustrada nos desenhos. Umesforço foi realizado para se utilizar os mesmos números de referênciaou semelhantes em todos os desenhos para se fazer referência àsmesmas partes ou semelhantes.

Com referência à Figura 2, é mostrado um desenho esquemáticode uma realização de um aparelho de limpeza de embrião vegetal (10) deacordo com a presente invenção. O aparelho de limpeza de embriãovegetal (10) pode ser utilizado para a preparação de embriões vegetaismúltiplos para a produção de plantas. Conforme mostrado na Figura 2,o aparelho de limpeza de embrião vegetal (10) inclui preferivelmenteuma fonte de fluido de limpeza (11), um sistema de condicionamento defluido (12), um mecanismo de aspersão (14), uma estação de limpeza(16), e uma mecanismo de saída (18), uma fonte de pressão negativa(20) e um controlador (22).

A fonte de fluido (11) pode ser selecionada de uma variedade defontes conhecidas na técnica, porque o aparelho de limpeza de embriãovegetal (10) pode ser utilizar qualquer tipo de fluido de limpeza adequa-do para a lavagem e enxágüe de embriões vegetais. Desta forma, afonte de fluido (11) poderia ser, por exemplo, uma torneira provendoágua fria ou um ou mais tanques provendo água.

O sistema de condicionamento de fluido (12) conforme mostradona Figura 3, pode ser posicionado entre a fonte de fluido (11) e omecanismo de aspersão (14). O fluido de limpeza preferivelmente fluida fonte de fluido (11) através de uma linha de fluido (104) para osistema de condicionamento de fluido (12), e então através de uma20 linha de fluido (118) para o mecanismo de aspersão (14).

A linha de fluido (104) pode ser qualquer tubulação adequada,tal como um tubo de cloreto de polivinila (PVC) com diâmetro de umapolegada. A linha de fluido (118) pode ser qualquer tubulação adequa-da, tal como tubulação Tygon com 0,95 cm de diâmetro.

O sistema de condicionamento de fluido (12) pode removercontaminantes do fluido de limpeza e/ou esterilizar o fluido de limpezaantes que alcance o mecanismo de aspersão (14). O sistema de condi-cionamento de fluido (12) pode incluir uma unidade de filtração (110),uma válvula controlada eletronicamente (108), e/ou um esterilizadorultravioleta (112).

A unidade de filtração (110) do sistema de condicionamento defluido (12) pode ser qualquer unidade de filtração adequada que removacontaminantes, tal como um filtro de membrana. Nesta realização, ofiltro pode incluir um compartimento de filtro (132) (tal como um ColeParmer modelo número 01508-35). O cartucho do filtro pode apresen-tar qualquer tamanho de poros adequado, por exemplo, 1 mícron. Ofluido de limpeza flui para o compartimento do filtro (132) a partir dalinha de fluido (104) e flui através do cartucho do filtro (136) e flui parafora para a linha de fluido (106). A linha de fluido (106) pode serformada, por exemplo, do mesmo material utilizado para a linha defluido (104). A linha de fluido (106) pode incluir um regulador depressão (150) que é utilizado para controlar a pressão na entrada defluido para o mecanismo de aspersão (14) (o que será descrito posteri-ormente).

A válvula controlada eletronicamente (108) pode ser configuradapara controlar o fluxo entre a unidade de filtração (110) e o esterilizadorUV (112). Pode ser qualquer válvula de controle conhecida na técnica,tal como uma simples válvula solenóide. A válvula controlada eletroni-camente (108) é controlada por um sinal de controle (130) provenientedo controlador (22) para abrir se se deseja que o fluido flua da linha defluido (106) para a linha de fluido (140) e para o esterilizador UV (112).A válvula eletronicamente controlada (108) pode ser fechada pelocontrolador (22) para evitar tal fluxo. A linha de fluido (140) pode serqualquer tubulação adequada, tal como uma tubulação de PVC de umapolegada de diâmetro. O estado da válvula eletronicamente controlada(108) será determinado pelo estágio do ciclo de limpeza que sistema estárealizando em um momento particular ou pela seleção do operador se ooperador escolhe interromper a operação de limpeza.

O esterilizador UV (112) é um dispositivo que utiliza radiação UVpara eliminar microrganismos no fluido de limpeza. O esterilizador(112) inclui um compartimento (138), um ou mais bulbos de luz UV(114), tal como uma lâmpada fluorescente, e um canal de fluxo (116). Aluz proveniente do bulbo de luz UV (114) ilumina o fluido conforme esteflui através do canal de fluxo (116). Um exemplo de um esterilizador UVadequado é um esterilizador Hydrotech modelo Número Pura UV20-1, oqual emite luz em um comprimento de onda de 254 nm. Conforme ofluido deixa o esterilizador UV (112), entra na linha de fluido (118), aqual leva para o mecanismo de aspersão (14).

O mecanismo de aspersão (14) ou a estrutura de liberação defluido pode ser configurado para dispensar adequadamente fluido delimpeza sobre os embriões. O mecanismo de aspersão (14) podecompreender um bocal (120) um compartimento de aspersão (122), epelo menos um mecanismo de alinhamento (124).

O bocal (120) pode ser selecionado dependendo da taxa de fluxodesejada e do padrão de aspersão do fluido de limpeza. Por exemplo, avelocidade ou pressão do fluido de devem ser selecionadas de tal formaque não danifiquem os embriões durante os processos de lavagem ouenxágüe. A velocidade do fluido é dependente da linha de pressão, dapressão negativa aplicada às estações de limpeza (conforme serádiscutido posteriormente), e do desenho do bocal. A velocidade oupressão do fluido pode ser alterada para diferentes tipos de embriõessimplesmente alterando-se o bocal. Um exemplo de um bocal adequadoé um produzido pela AllSpray LLC com um modelo número de FCS de65 graus. Este bocal tem uma capacidade de 1,40 gpm a 2,8 kgfcnr2 euma faixa de 0,76 gpm a 0,7 kgfcnr2 a 2 gpm a 6,3 kgfcnr2.

A seleção do bocal (120) também pode ser baseada no padrão deaspersão desejado do mecanismo de aspersão (14). Por exemplo, umapadrão de aspersão cônico pode ser desejado no qual a aspersão sobreos embriões apresenta uma distribuição homogênea. Alternativamente,o padrão de aspersão pode ser mais um padrão anular no qual maisfluido é direcionado para o centro da aspersão enquanto há menosfluido em torno da periferia da aspersão. Preferivelmente, o bocal (120)é configurado para prover um padrão de aspersão no qual uma porçãoexterna da corrente de fluido entra em contato com as paredes internado compartimento de aspersão (122) e/ou com a unidade de suporte(202). Este tipo de padrão de aspersão apresenta o efeito de manter asparedes internas do compartimento de aspersão (122) e/ou a unidadede suporte (202) livres de fragmentos celulares e embriões enquantoainda limpa os embriões com o fluido que foi retirado das paredes e devolta sobre os embriões. Uma pessoa com especialização normal natécnica, uma vez ciente desta descrição, pode determinar um bocaladequado com base no padrão de aspersão desejado, da linha depressão, e da pressão de vácua (a qual será descrita posteriormente).

O compartimento de aspersão (122) pode ser utilizado paraconter fluido de limpeza que sai do bocal (120) de tal forma que o fluidoé direcionado para a estação de limpeza (16). O compartimento deaspersão (122) pode ser substancialmente transparente, tal como umpolicarbonato claro, vidro transparente ou outro tipo de materialtransparente, de tal forma que um operador pode ver através do com-partimento de aspersão e monitorar ou observar os resultados daoperação de lavagem. Se o operador ficar insatisfeito com os resulta-dos, o operador pode ordenar uma outra lavagem utilizando um meca-nismo de entrada no controlador (22). Alternativamente, uma câmera(não mostrada) pode ser utilizada para monitorar a operação de lavagematravés do material substancialmente transparente e enviar um sinalpara o controlador (22) (que será discutido posteriormente), o qual éprocessado pelo controlador para determinar se uma outra operação delavagem é necessária. Embora o compartimento de aspersão (122) naFigura 3 seja cilíndrico com uma superfície circunferencial (126), podeser de qualquer formato, tal como piramidal, cônico ou cúbico. Comouma alternativa adicional, um compartimento da unidade de suporte(202), unidade de lavagem (208), e/ou unidade de enxágüe (212),podem ser substancialmente transparentes para permitir o monitora-mento da lavagem e/ou enxágüe.

O mecanismo de alinhamento (124) pode prover um alinhamentodesejado entre o compartimento de aspersão (122) e a estação delimpeza (16) para se obter um efeito ideal ou desejado do padrão deaspersão do bocal (120). O mecanismo de alinhamento (124) pode serdisposto na extremidade do compartimento de aspersão (122), isto é, nolado oposto ao bocal (120). O mecanismo de aspersão (124) pode ser,por exemplo, uma série de pinos na superfície circunferencial (126) docompartimento de aspersão (122). Os pinos podem ser configuradospara se combinarem com a unidade de suporte (202) da estação delimpeza (16), o que é mostrado na Figura 4. A circunferência dasuperfície externa (204) da unidade de suporte (202) pode simplesmentedeslizar para o perímetro interno formado pela série de pinos em tornoda superfície circunferencial (126) do compartimento de aspersão (122)do mecanismo de aspersão (14). Alternativamente, a unidade desuporte (202) pode apresentar fendas ou ranhuras correspondentes queacomodam os pinos. Em vez de pinos (124), o mecanismo de alinha-mento (124) pode ser, por exemplo, uma luva tubular (não mostrada)fixada à superfície circunferencial (126) do compartimento de aspersão(122) e pode ser configurada para se combinar com a superfície externa(204) da unidade de suporte (202). Como outra alternativa, a superfícieexterna (204) da unidade de suporte (202) pode ser ajustada no interiorda superfície interna do compartimento de aspersão (122) ou vice-versa.

Sensores de posição (não mostrados) podem ser providos paraassegurar o alinhamento apropriado entre o compartimento de aspersão(122) e a unidade de suporte (202). Os sensores de posição podem serde qualquer tipo de sensor de proximidade conhecido na técnica epodem ser colocados na unidade de suporte (202) (ou a unidade delavagem e/ou unidade de enxágüe descritas abaixo). Por exemplo, ossensores de proximidade podem ser sensores capacitivos, ultrassônicos,óticos, de contato elétrico. No exemplo de um sensor de proximidadeindutivo, o sensor gera um campo eletromagnético para detectar umobjeto metálico que passa próximo à sua face. Quando o sensor deproximidade está dentro de uma distância predeterminada de um metalalvo, envia um sinal para o controlador (22) indicando um alinhamentoapropriado. Se o sensor não fica na distância predeterminada, nenhumsinal será enviado para o controlador. No exemplo de um sensorcapacitivo, este utiliza a face ou superfície do sensor como uma placa deum capacitor e a superfície de um objeto alvo condutor ou dielétricocomo a outra. A capacitância varia inversamente com a distância entreas placas do capacitor nesta disposição e um certo valor pode serajustado para acionar a detecção, a qual é enviada para o controladorpara indicar um alinhamento apropriado. Se ocorrer um alinhamentoimpróprio, uma ou mais das seguintes ações podem ser tomadas: (1) aoperação de limpeza pode ser interrompida, (2) mecanismos de movi-mentação convencionais (não mostrados) podem tentar mover a unida-de de suporte e/ou compartimento de aspersão até que ocorra oalinhamento apropriado, ou (3) pode ser gerado um aviso por meio deum alarme ou mostrador no controlador (22) para avisar ao operadorquanto ao não alinhamento.

A estação de limpeza (16) preferivelmente lava e enxágua osembriões. Conforme mostrado na Figura 5, a estação de limpeza (16)pode compreender a unidade de suporte (202), uma unidade de lavagem(208), e/ou uma unidade de enxágüe (212).

A unidade de suporte (202) fixa os embriões e os transportaentre a unidade de lavagem (208) e a unidade de enxágüe (212). Aunidade de suporte (2020) pode compreender um membro cilíndrico(205) que suporta uma estrutura de fixação (206) par fixar os embriões.O membro cilíndrico (205) pode ser feito de um material transparente,tal como vidro, policarbonato ou outros para se obter informaçãoquanto as operações de lavagem e/ou enxágüe. Por exemplo, o opera-dor pode ser capaz de visualizar através do material transparente eobservar os resultados das operações de lavagem e/ou enxágüe edeterminar se operações de lavagem ou enxágüe adicionais são neces-sárias. Alternativamente, uma câmera (não mostrada) pode ser utiliza-da para monitorar as operações de lavagem e/ou enxágüe através domaterial transparente e enviar um sinal para o controlador (22) (o queserá discutido posteriormente), o qual é processado pelo controladorpara determinar se uma outra operação de lavagem ou de enxágüe énecessária.

A estrutura de suporte (206) pode ser em um material poroso,tal como um material em malha, uma peneiro, ou semelhantes, configu-rado para fixar os embriões. Se forem utilizados materiais em malha, otamanho e configuração dos poros no material poroso dependerão dotipo de embrião sendo limpo e dos tipos de fragmentos celulares sendoremovidos pelo processo de limpeza, isto é, a espécie e condições dosembriões podem ser consideradas quando da escolha de qual tamanhoda malha se utilizar de maneira a capturar os embriões em estágioapropriado. Por exemplo, as dimensões de embrião somático depinheiro são em geral de comprimento de cerca de 1,0 mm a cerca de5,0 mm e o diâmetro varia de cerca de 0,5 mm a cerca de 2,0 mm. Damesma forma, um especialista na técnica, uma vez ciente desta descri-ção, seria capaz de escolher um tamanho de malha adequado parautilizar de maneira a manipular os embriões, mas evitar a perda de umnúmero inadequado de embriões em virtude de sua passagem atravésde aberturas muito grandes na malha. Vários tamanhos de malhapodem apresentar uma grade com tamanhos de poros de 100, 150, 200,250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 670, 700, 710, 750, 800,e 900 micra ou qualquer integrador entre estes.

Por exemplo, os poros podem preferivelmente variar de 400micra a 900 micra e, com maior preferência, variar de 500 micra a 750micra. Adicionalmente, os poros podem apresentar tamanhos emoutras faixas adequadas, tais como de 560 micra a 710 micra ou de 600micra a 670 micra. Em certos casos, 800 micra pode ser um tamanhomuito grande para certas linhagens celulares de conífera. Uma vez quealtas concentrações de polietilenoglicol produzem embriões menores,pode, desta forma, ser desejável se utilizar tamanhos de peneira queapresentam poros menores que 670 micra. Em geral, a aberturapercentual do material poroso pode ficar em qualquer faixa adequada,tal como 48% ou acima, 53% ou acima, 56% ou acima; entretanto, épreferivelmente se ter uma abertura percentual tão grande quantopossível.

A unidade de lavagem (208) e a unidade de enxágüe (212) podemser configuradas para lavar e enxaguar, respectivamente, os embriões.A unidade de lavagem (208) e a unidade de enxágüe (212) são estrutu-ralmente semelhantes entre si em certos aspectos. Podem incluirmembros cilíndricos (209) e (213), respectivamente, que podem serfeitos em qualquer material, tal como um polipropileno branco, e sãoconfigurados para combinarem com a unidade de suporte (202). Aunidade de lavagem (208) e a unidade de enxágüe (212) podem serconfiguradas para se combinarem com a unidade de suporte (202) damesma forma que a unidade de suporte (202) se combina com o com-partimento de aspersão (122), por meio da utilização de um mecanismode alinhamento (124). Um alinhamento apropriado entre a unidade desuporte (2020) e a unidade da lavagem (208) ou a unidade de suporte(202) e a unidade de enxágüe (212) podem ser desejado para se obterum efeito de limpeza ideal. Sensores de posição (não mostrados),conforme descrito acima, podem ser utilizados para assegurar o ali-nhamento apropriado.

A unidade de lavagem (208) pode ou não apresentar umaestrutura de suporte (210). O propósito da estrutura de suporte (210) éprover um equilíbrio entre o fluxo de fluido de entrada proveniente domecanismo de aspersão e o fluxo do fluido de saída para o mecanismode saída devido ao sistema de vácuo. A estrutura de suporte (210) podeser, por exemplo, um material poroso, tal como um material em malha.Quaisquer tamanhos e configurações adequados de orifícios podem serutilizados de maneira a direcionar o fluxo de fluido para o mecanismode saída (18). Se for utilizado um material em malha, o diâmetro totaldo material preferivelmente é de 7 cm com 90 orifícios com um diâmetrode 1,6 mm e 5 orifícios com um diâmetro de 0,95 cm.

A unidade de enxágüe (212) pode também apresentar umaestrutura de suporte (214), a qual é utilizada para suportar a cestaremovível (230) e pode ser direcionar o fluxo de fluido para o mecanismode saída. A cesta removível (230) pode ser removida da unidade deenxágüe (212) de tal forma que os embriões possam ser removidos daunidade de enxágüe (212) pelo operador tomando a cesta removível(230) e a puxando para fora do membro cilíndrico (213).

A estrutura de suporte (214) pode ser de um material poroso, talcomo um material em malha. Se a unidade de lavagem (208) apresentauma estrutura de suporte (210) feita em material poroso, preferivelmen-te o material poroso da estrutura de suporte (214) da unidade deenxágüe (212) apresenta um tamanho de poro menor. Também, omaterial poroso da estrutura de suporte (214) preferivelmente apresentaum tamanho de poro menor que o material poroso da estrutura desuporte (206) da unidade de suporte (202). A razão para a utilização deum tamanho de poro menor na unidade de enxágüe é que existemmenos fragmentos celulares no ciclo de enxágüe que no ciclo de Iava-gem. Adicionalmente, o tamanho de poro menor permite um vácuomais uniforme da fonte de pressão negativa (20), o que auxilia noprocesso de secagem dos embriões após o processo de enxágüe, con-forme será descrito posteriormente. A estrutura de suporte (214), porexemplo, pode ser uma placa com diâmetro de 7 cm com 132 orifícios.Noventa orifícios têm diâmetro de 1,6 mm enquanto 42 orifícios têmdiâmetro de 0,8 mm. Neste exemplo, a estrutura de suporte (214) podeapresentar um anel externo de orifícios com 1,6 mm de diâmetro quecircundam uma coleção de orifícios com 16 mm de diâmetro e 0,8 mmde diâmetro. Os orifícios de 1,6 mm de diâmetro dentro do anel externode orifícios com 1,6 mm podem ser no formato de uma cruz que apre-senta sua interseção no centro do anel externo de orifícios de 1,6 mm.A estrutura de suporte (214), entretanto, pode apresentar qualquerconfiguração adequada desde que seja evitado uma inundação daunidade de enxágüe com o fluido.

A cesta removível (230) pode também ser em material poroso, talcomo um material em malha. Se um material em malha for utilizado, otamanho do poro pode ser menor que o tamanho do poro do materialem malha (214) da estrutura de suporte (214). Por exemplo, a cestaremovível pode apresentar um diâmetro de 6,85 cm e apresentar umtamanho de poro na faixa de 15 micra a 65 micra, com maior preferên-cia,, o tamanho do poro será de 33 micra.

Em operação, os embriões não lavados são colocados no interiorda unidade de suporte (202) por um operador ou por um mecanismo decarga automático (não mostrado) de tal forma que os embriões fiquemna estrutura de suporte (206) e estejam contidos no interior do membrocilíndrico (205) da unidade de suporte (202). Após os embriões nãolavados estarem carregados na unidade de suporte (202), o comparti-mento de aspersão (122) cobre a unidade de suporte (202), e a unidadede suporte (202) é ajustada à unidade de lavagem (208). Um ou maisciclos de lavagem são realizados dependendo do nível de fragmentoscelulares e do estado dos embriões. O operador pode observar atravésdo material transparente do membro cilíndrico (205) da unidade desuporte (202) e visualizar os resultados da lavagem. Se o operador nãoficar satisfeito com os resultados, o operador pode ordenar uma outraoperação de lavagem utilizando um mecanismo de entrada no controla-dor (22).

Após o ciclo de lavagem estar completo, o compartimento deaspersão (122) é desengatado da unidade de suporte (202) e é deslocadohorizontalmente ou manualmente ou automaticamente utilizando-seuma estrutura de deslocamento horizontal (por exemplo, a estrutura dedeslocamento horizontal (514) na Figura 6, conforme descrita abaixo)para a umidade de enxágüe (212). A unidade de suporte (202) podeentão ser virada ou manualmente ou automaticamente utilizando-seum dispositivo rotativo (por exemplo, o dispositivo rotativo (510) daFigura 6, conforme descrito abaixo) de tal forma que os embriõeslavados fiquem por debaixo da estrutura de suporte (206). Os embriõeslavados são mantidos no local na estrutura de suporte (206) pelo tensãosuperficial do fluido de lavagem que é retido na unidade de suporte(202) após o ciclo de lavagem. A unidade de suporte (202) é combinadacom o compartimento de aspersão (122) e com a unidade de enxágüe(212) (conforme descrito abaixo) de tal forma que um ciclo de enxágüeseja realizado. Durante o ciclo de enxágüe, os embriões serão forçadospela aspersão de enxágüe para fora da estrutura de suporte (206) epousam da cesta removível (230) da unidade de enxágüe (212). Umavez terminado o ciclo de enxágüe, os embriões podem ser removidos daunidade de enxágüe (212) removendo-se a cesta removível (230).

O mecanismo de saída (18) pode ser configurado para receber ofluido de limpeza utilizado e os fragmentos celulares dos embriões quepassam através das estruturas de suporte (210) e (214) durante osciclos de lavagem e enxágüe. O mecanismo de saída (18), conformevisto nas Figuras 2 e 4, pode compreender uma primeira saída (216)que está em comunicação fluida com a unidade de lavagem (208) e umasegunda saída (218) que está em comunicação fluida com a unidade deenxágüe (212). O fluido de limpeza flui para fora das primeira e segun-da saídas durante os ciclos de lavagem e de enxágüe, respectivamente.Conforme mostrado na Figura 5, a primeira saída (216) está conectadacom uma primeira linha de fluido (404), enquanto a segunda saída(218) está conectada com uma segunda linha de fluido (406).

A Figura 5 mostra um desenho esquemático da fonte de pressãonegativa (20), que durante os ciclos de lavagem e enxágüe pode serconfigurada para retirar o fluido de lavagem e os fragmentos celularesdos embriões durante as operações de lavagem e enxágüe. Destaforma, o vácuo pode auxiliar na redução dos fragmentos celularesresiduais deixados nos embriões. Adicionalmente, o movimento de arprovocado pelo vácuo também seca os embriões após o processo deenxágüe. Numa modalidade da presente invenção, a pressão negativapode variar de -0,35 kgfcnr2 a -0,11 kgfcm 2 e, com maior preferência, éde -0,1 kgfcm-2. Entretanto, a pressão negativa pode ser qualquerpressão adequada. A fonte de pressão negativa (20) preferivelmenteinclui uma válvula de controle elétrico (408), uma seção de fluxo (416),uma bomba a vácuo (402), uma válvula verificadora (410), e uma saídade drenagem (412).

A válvula controlada eletronicamente (408) é conectada com asprimeira e segunda linhas de fluido (404, 406). A válvula controladaeletronicamente pode ser de qualquer tipo de válvula controladaeletronicamente, tal como uma válvula solenóide. A válvula controladaeletronicamente (408) é controlada pelo controlador (22) na Figura 2,que durante o ciclo de lavagem comanda a válvula controlada eletroni-camente (408) para conectar a linha de fluido (404) com uma linha defluido (414) enquanto fechando a passagem para a linha de fluido (406)e unidade de enxágüe (212). A linha de fluido (414) pode ser qualquertubulação adequada, tal como uma tubulação de PVC com uma polega-da de diâmetro. Inversamente, durante o ciclo de enxágüe, o controla-dor (22) comanda a válvula controlada eletronicamente (408) paraconectar a linha de fluido (406) com a linha de fluido (414) enquanto15 fechando a passagem da linha de fluido (404) e unidade de lavagem(208). Desta forma, a válvula controlada eletronicamente (408) pecontrolada pelo controlador (22) na Figura 2 para conectar a bomba avácuo (402) ou para a unidade de lavagem (208) ou para a unidade deenxágüe (212), dependendo do estado do ciclo de limpeza.

A seção de fluxo (416) recebe fluido da linha de fluido (414). Aseção de fluxo pode ser qualquer tubulação adequada, tal como umatubulação de PVC de uma polegada de diâmetro. A seção de fluxo (416)pode apresentar uma seção superior (418) e uma seção inferior (420). Aseção superior (418) pode conduzir para cima para a bomba a vácuo(402). A seção inferior (410) conduz para baixo na direção da saída dedrenagem (412) por meio das linhas de fluido (224) e (226), as quaispodem ser quaisquer tubulações adequadas, tais como tubulações dePVC de uma polegada de diâmetro. A seção de fluxo (416) atua comouma separador ar-fluido na qual o ar é aspirado para cima na direçãoda bomba a vácuo (402) por meio da seção superior (418) enquanto ofluido de limpeza e resíduos fluem para baixo por meio da seção inferior(420) devido à força de gravidade. Adicionalmente ou alternativamente,o resíduo ou fragmentos celulares provenientes da estação de limpeza(16) podem ser coletados utilizando-se uma armadilha de poliésterconvencional colocada no mecanismo de saída (18).

A seção de fluxo (416) é conectada a uma bomba a vácuo (402)por uma linha de fluido (444). A linha de fluido (444) pode incluir umregulador de pressão (430), o qual é utilizado para monitorar e controlaro nível de pressão no sistema a vácuo. Esta informação pode serutilizada pelo controlador para monitorar e equilibrar o fluxo do fluidode entrada com o fluxo do fluido de saída (conforme descrito abaixo).

A bomba a vácuo (402) pode ser qualquer dispositivo a vácuoconvencional. Por exemplo, a bomba pode ser um MEDAES MedPlusVacuum Plant (Modelo n° 6911-XYS-NAME).

A válvula de verificação (410) opera em função do peso do líquidoe da força da bomba a vácuo (402). Quando a bomba a vácuo (402) éinicialmente acionada, a válvula de verificação (410) é fechada. O fluidode limpeza começa a se acumular por trás da válvula de verificação(410). O fluido continua a se acumular na seção inferior (420) até quealcança uma altura predeterminada Η. H é a altura crítica em que opeso do fluido iguala a força da bomba a vácuo (402). Quando estaaltura crítica é alcançada, a válvula de verificação (410) se abre epermite que o fluido seja drenado, por exemplo, para o esgoto. A colunade fluido na seção de fluxo (416) evita que ar entre no sistema, preser-vando, desta forma, o vácuo enquanto o fluido é drenado. Desta forma,uma corrente estável de fluido usado e fragmentos celulares é descarre-gada do sistema.

Um escape pode ser adicionado à linha de fluido (226) localizadoentre a válvula de verificação (410) e a saída de drenagem (412). Esteescape pode ser utilizado, por exemplo, para minimizar que o ar noesgoto entre no sistema a vácuo pela partida do sistema a vácuo antesque a válvula de verificação (410) seja fechada.

Como uma precaução de segurança, o aparelho pode incluir umsensor de nível de fluido e um alarme (220) localizados no interior daseção de fluxo (416) que podem ser utilizados para indicar que o nívelde fluido na seção de fluxo (416) está muito alto devido a algumaretenção ou entupimento no sistema de drenagem. Tal entupimentopode danificar a bomba a vácuo (402). O sensor de nível de fluido (220)irá gerar um sinal (222) que é transmitido de volta para o controlador(22) ou por linha de transmissão ou comunicação sem fio. Quando ocontrolador (22) recebe o sinal de alarme, o controlador pode emitir umalarme sonoro ou visual para o operador o alertando da possibilidade deum entupimento no sistema de drenagem. Alternativamente, o contro-lador pode fechar automaticamente o sistema em resposta ao avisoproveniente do sensor de nível de fluido (220).

Um aparelho de acordo com a presente invenção pode serconfigurado para sincronizar o fluido que entra na estação de limpeza(16) com o fluido de saída através do mecanismo de saída (18). Consi-derando-se a proporção de fluido de entrada para fluido de saída sepode evitar dano aos embriões devido à velocidade ou pressão do fluidoconforme este atua sobre os embriões durante os processos de lavageme enxágüe. Desta forma, pode ser desejável se selecionar a magnitudeda linha de pressão, a magnitude da pressão negativa, e o desenho dobocal, de tal forma que um fluxo de fluido adequado e padrão de fluxode fluido adequado sejam obtidos para se obter condições de limpezaideais enquanto evitando qualquer dano aos embriões. Desta forma, osistema deve ser equilibrado quando a seleção dos componentes dosistema, particularmente o bocal, a fonte de pressão negativa, ostamanhos dos poros das estruturas de suporte e as válvulas de supri-mento.

O controlador (22) é configurado para controlar pelo menos uma,e preferivelmente todas, fonte de fluido de limpeza (11), sistema decondicionamento de fluido (12), mecanismo de aspersão (14), estação delimpeza (16), mecanismo de saída (18), e fonte de pressão negativa (20),ou automaticamente ou por controle pelo operador. O controlador (22)pode ser conectado e controlar estes componentes por meios convencio-nais. Por exemplo, o controlador (22) pode ser conectado por um oumais linhas de transmissão com fio (812) aos vários dispositivos queopera e aos sensores que enviam informação.

O controlador (22) pode compreender um mostrador, um oumais microprocessadores, memórias, linhas de entrada/saída, umainterface de usuário gráfica, e/ou um ou mais botões de operação. Ocontrolador (22) pode incluir, por exemplo, um controlador lógicoprogramável (PLC) (por exemplo, Direct Logic, modelo número DL-05)com uma interface de operador para as entradas do operador, parâme-tros operacionais, mensagens de erro, e relatórios de produção. UmPLC com mais entradas e saídas digitais ou um computador PC podemser utilizados para um sistema totalmente automatizado. Por exemplo,o controlador pode conter programas de processamento de dados emum ou mais microprocessadores para o processamento de dadosrelativos aos sensores de posição e nível de fluido conforme mostradoacima e programas para a realização de comandos operacionais para ocontrole da válvula controlada eletronicamente (108), a bomba a vácuo(402), a válvula controlada eletronicamente (408), o cilindro pneumático(506), um cilindro pneumático (512), e uma estrutura de deslocamentohorizontal automática (514) (que será descrita posteriormente). Alémdisto, o controlador pode ser configurado para controlar o fluxo deentrada de líquido através do mecanismo de aspersão (14) e/ou apressão do líquido de entrada aspergido pelo mecanismo de aspersão(14) utilizando o regulador de pressão (150). Se tal controle de pressãoé utilizado, o controlador pode ser configurado para manter a pressãodo fluido de entrada em uma faixa adequada de maneira a prover umapressão adequada sobre o embrião para remover os fragmentos celula-res, por exemplo, uma faixa de cerca de 1,54 kgfcnr2 a cerca de 3,15kgfcm2. Numa modalidade de acordo com a presente invenção, apressão do fluido de entrada é de cerca de 2,45 kgfcm 2.

Conforme mencionado acima, a escolha do desenho do bocal,pressão do fluido de entrada e pressão de vácuo para o sistema deve sercuidadosa de maneira a efetivamente limpar os embriões sem osdanificar. Estes elementos devem ser escolhidos de tal forma que oimpacto ou pressão da aspersão sobre os embriões estejam dentro deuma faixa especificada para efetivamente, mas com segurança, limparos embriões. A pressão sobre os embriões é função do desenho dobocal, pressão de fluido de entrada, e pressão de vácuo. Por exemplo, obocal, pressão de entrada, e pressão de vácuo preferivelmente sãoprojetados para liberar uma pressão de líquido de entrada na faixa de0,00035 506 a 0,0019 qullogramaforça por centímetro quadrado a umadistância padrão normalizada de trinta centímetros e, com maiorpreferência, cerca de 0,0126 qullogramaforça por centímetro quadradoa uma distância padrão normalizada de trinta centímetros.

Pressão(impacto/polegada2) = IthX(%impacto/polegada2),

onde Ith = 0,526 χ Cp χ sqrt(P)

e onde Ith é o impacto teórico (libras força), Cp é a capacidade dobocal (galões por minuto) à pressão P (kgfcnr2), e %impacto é baseadonos dados coletados a uma distância de 30 centímetros do orifício desaída do bocal.

O controlador pode ser projetado para utilizar o regulador depressão (150) e/ou o regulador de pressão (430) para alterar os impac-tos por polegada quadrada sem a necessidade de alterar o bocal.

O controlador pode ser programado para realizar toda a opera-ção de limpeza automática a partir do momento em que os embriõesnão lavados são colocados na unidade de suporte até o momento emque estes são removidos da unidade de enxágüe. Alternativamente, ocontrolador pode ser programado para realizar apenas partes daoperação automática de limpeza. Por exemplo, as operações de lavageme enxágüe podem ser automatizadas enquanto os deslocamentos dasunidades de suporte nas direções vertical e/ou horizontal são controla-dos pelo operador ou manualmente ou por meio do controlador. Umoutro exemplo pode ser o de ter-se toda a operação de limpeza automa-tizada enquanto o operador tem a opção de interromper a operação delimpeza e repetir uma operação em particular, se pretendido. Porexemplo, se o operador deseja uma operação de lavagem adicional, ooperador pode utilizar o controlador para interromper toda a operaçãode limpeza e repetir a operação de lavagem por quantos ciclos delavagem desejar.

O controlador (22) preferivelmente também é programável de talforma que possa regular a freqüência e duração das operações delavagem e enxágüe com base na entrada fornecida pelo operador parauma corrida operacional particular. A entrada fornecida pelo operadorpode ser baseada no tipo de embriões e fragmentos celulares que estãosendo trabalhados em uma corrida operacional particular. Destaforma, o controlador pode ser programado pelo operador para ajustar apressão sobre os embriões, a freqüência das operações de lavagem e/ouenxágüe, ou a duração das operações de lavagem e/ou enxágüe combase no tipo de embrião e de fragmento celular. Um exemplo de umciclo de trabalho adequado para o ciclo de lavagem e enxágüe pode serde 30 segundos para a operação de lavagem e de 2 segundos para aoperação de enxágüe.

Um exemplo de um controlador de acordo com a presenteinvenção é apresentado na Figura 2. Nesta realização, o controladorinclui um interruptor LIGA/DESLIGA (702), uma interface gráfica (704),e um mostrador (706). O mostrador (706) pode ser parte da interfacegráfica (704) ou pode ser um componente separado. O mostrador (706)pode mostrar variáveis operacionais e parâmetros ao operador. Porexemplo, o número de operações de limpeza realizadas, informação dosensor de posição, ou quaisquer falhas relativas aos sensores deposição, sistema a vácuo, ciclos de lavagem e enxágüe, etc., podem sermostrados no mostrador (706). O mostrador permite ao operador darentrada com parâmetros para o ciclo de lavagem, entrada de parâme-tros para o ciclo de enxágüe, e capacidade em repetir o ciclo de lavagemse desejado. O ajuste do ciclo de lavagem pode ser utilizado paraajustar o tempo do ciclo ou a freqüência das operações de lavagem parauma corrida operacional particular. Alternativamente, em vez de umainterface gráfica, outros dispositivos de entrada podem ser utilizados,tais como um teclado ou um pedal.

As Figuras 2-5 mostram uma ilustração esquemática de umarealização da presente invenção. A ilustração esquemática mostra ummecanismo de aspersão e uma estação de limpeza (isto é, uma unidadede suporte, uma unidade de lavagem, e uma unidade de enxágüe);entretanto, é empregada uma pluralidade de mecanismos de aspersão eestações de limpeza preferivelmente. As Figuras 6, 8A-8B, 9A-9B e10A-10D mostram uma implementação particular desta realização dapresente invenção. Contém três mecanismos de aspersão (14) e trêsestações de limpeza (isto ê, três unidades de suporte (202), três unida-des de lavagem (208) e três unidades de enxágüe (212)). O aparelhototal inteiro pode ser colocado em uma base (808), a qual pode incluirpernas de suporte (810) (como visto nas Figuras 10A-10D).

As Figuras 8A e 8B mostram uma vista em seção transversal euma vista lateral dos mecanismos de aspersão (14), um braço demontagem (502), e um cilindro pneumático (506). A Figura 8A mostraportas de entrada de água (142) e bocais (120). O fluido proveniente dafonte de fluido (11) é alimentado através das portas de entrada (142)para os bocais (120). Por exemplo, os três bocais (120) podem ser dotipo AllSpray LLC (Modelo Número de FCS 65°) e apresentarem umacapacidade de 1,0 gpm a 2,8 kgfcnr2. Os mecanismos de aspersão (14)incluem compartimentos de aspersão (122) (feitos de policarbonatoclaro, vidro ou outro material transparente) com mecanismos dealinhamento (124) na forma de luvas tubulares que serão ajustadas emtorno das unidades de suporte (202). Os mecanismos de alinhamento(124) são fixados aos respectivos compartimentos por parafusos deajuste que são colocados no interior de aberturas rosqueadas (802). Ostrês mecanismos de aspersão (14) são fixados ao braço de montagem(502) por meio de hastes (504) de tal forma que todos se movimentamverticalmente e horizontalmente como uma unidade. O braço demontagem (502) é fixado ao cilindro pneumático (506), o qual provocaum movimento vertical dos mecanismos de aspersão (14). O cilindropneumático (506) pode ser controlado pelo controlador (22).

As estações de limpeza incluem três unidades de suporte (202),três unidades de lavagem (208) e três unidades de enxágüe (212). AsFiguras 9A e 9B mostram uma vista plana e uma vista em seçãotransversal das unidades de suporte (202), da placa de montagem (508),de um dispositivo rotativo (510) e de um cilindro pneumático (512). Asunidades de suporte (202) apresentam superfícies externas uniformes(204) que se ajustam no interior dos mecanismos de alinhamento (124)dos mecanismos de aspersão (14) enquanto também são capazes de seajustar no interior das unidades de lavagem (208) e das unidades deenxágüe (212).

As unidades de suporte (202) são fixadas à placa de montagem(508) de tal forma que todas as unidades de suporte se movem verti-calmente, horizontalmente, e em rotação como uma unidade. A placade montagem (508) é conectada ao dispositivo rotativo (510) o qual émontado em um outro cilindro pneumático (512) via um braço demontagem do cilindro (522). O dispositivo rotativo (510) faz com que asunidades de suporte (202) girem após o ciclo de lavagem, mas antes dociclo de enxágüe de tal forma que os embriões serão coletados sobre acesta removível (230) das unidades de enxágüe (212) após o ciclo deenxágüe. Conforme mencionado previamente, os embriões permanece-rão no local devido à tensão superficial do fluido remanescente naunidade de suporte (202) após o ciclo de lavagem. O cilindro pneumáti-co (512) desloca as unidades de suporte na direção vertical de tal formaque as unidades de suporte (202) podem ser abaixadas para se uniremcom as unidades de lavagem (208), levantadas para as remover dasunidades de lavagem, abaixadas para se unirem com as unidades deenxágüe (212), e levantadas para as remover das unidades de enxágüe.O dispositivo rotativo (510) e o cilindro pneumático (512) podem sercontrolados pelo controlador (22).

A Figura IOA mostra uma vista plana das unidades de lavagem(208), das unidades de enxágüe (212), e de duas válvulas a vácuoeletrônicas (408A) e (408B). A Figura 10B mostra uma vista lateral dasunidades de enxágüe, do manifold. a vácuo (518), e de funis de saída(520). A Figura 10C mostra uma vista em seção transversal dasunidades de lavagem (208), dos funis de saída (520), do manifold avácuo (516), e do trilho horizontal (804). A Figura 10D mostra umavista em seção transversal da unidade de enxágüe (212), dos funis desaída (520), do manifold a vácuo (518), e do trilho horizontal (804).

Ambos os cilindros pneumáticos (506) e (512) são montados emuma estrutura móvel horizontal (514). A estrutura móvel horizontal(514) compreende um trilho horizontal (804) montado na base (808). Oscilindros pneumáticos (506) e (512) são montados em uma placavertical (820), a qual é montada em um suporte (806). O suporte podeser deslizado manualmente ao longo do trilho horizontal (804) quando omecanismo de aspersão e as unidades de suporte são deslocados dasunidades de lavagem para as unidades de enxágüe e vice-versa.

Alternativamente, o cilindro pneumático (506) com os mecanismos deaspersão (16) e o cilindro pneumático (512) com as unidades de suporte(202) podem ser deslocados automaticamente pelo controlador (22) pelautilização de uma estágio de movimentação que é acionado por umoutro cilindro pneumático, um estágio de acionamento linear, ou umoutro aparelho gerador de movimento conhecido na técnica.

As unidades de lavagem podem incluir uma saliência (814) nointerior das unidades de lavagem (208) para prover um local para asunidades de suporte se apoiarem durante o processo de lavagem. Aestrutura de suporte (210) pode ser colocada na saliência (814) ou nasuperfície inferior (822) das unidades de lavagem (208). As unidades deenxágüe (212) apresentam uma superfície inferior (818) na qual écolocada uma estrutura de suporte (214) fixa. Uma cesta removível(230) é então colocada sobre a estrutura de suporte (214) fixa de formaa coletar os embriões enxaguados após o processo de limpeza. Asunidades de lavagem e de enxágüe ambas se conectam a um mecanis-mo de saída que pode compreender dois conjuntos de funis (520) queestão em comunicação fluida com dois manifolds (516) e (518). Os funispodem ser, por exemplo, do modelo n° 07-33/10 produzido pela Nalge-ne Labware, os quais contêm um orifício de drenagem com diâmetro de0,8 mm.

O manifold (516) está em comunicação fluida com a linha defluido (404), a qual está conectada com uma primeira válvula controla-da eletronicamente (408A). O manifold (518) está em comunicaçãofluida com a linha de fluido (406), a qual está conectada a uma segundaválvula controlada eletronicamente (408B). Ambas as válvulas estãoconectadas a um sistema a vácuo e de drenagem (não mostrado) viauma linha de fluido (414), e ambas estão em comunicação com ocontrolador de tal forma que uma das válvulas controladas eletronica-mente está aberta e uma outra está fechada dependendo do estágio doprocesso de limpeza. Por exemplo, durante o ciclo de lavagem, ocontrolador (22) comanda a válvula controlada eletronicamente (408A)para abrir, o que conecta o sistema a vácuo e de drenagem ao manifold(516) e às unidades de lavagem (208), mas, comanda a válvula contro-lada eletronicamente (408B) para fechar, o que corta o manifold (518) eas umidades de enxágüe (212) para o sistema a vácuo e de drenagem.Inversamente, durante o ciclo de enxágüe, o controlador (22) comanda aválvula controlada eletronicamente (408B) para abrir, o que conecta osistema a vácuo e de drenagem ao manifold (518) e às unidades deenxágüe (212), mas comanda a válvula controlada eletronicamente(408A) para fechar, o que corta o manifold (516) e as unidades delavagem (208) para o sistema a vácuo e de drenagem.

A seguir, o método de preparação de embriões vegetais múltiplospara a produção de plantas será discutido com referência às Figuras7A-7F. O método pode compreender a etapa de fornecimento deembriões vegetais múltiplos em uma estação de limpeza. Na etapa 1 naFigura 7A, o operador pode carregar os embriões às unidades desuporte (202) (por exemplo, aproximadamente 500 embriões podem sercolocados em cada unidade de suporte (202)) inclinando as unidades desuporte, tal como em 45 graus, na direção do operador para facilitar ocarregamento. Alternativamente, as unidades de suporte podem sercarregadas automaticamente por meio de uma correia transportadora,um braço robótico, ou semelhantes (não mostrados). Da mesma forma,a cesta removível (230) é colocada nas unidades de enxágüe (212) nestemomento.

Na etapa 2, na Figura 7B, o operador ou o controlador podealinhar verticalmente os mecanismos de aspersão (14), as unidades desuporte (202), e as unidades de lavagem (208) verticalmente iniciar oprocesso de lavagem. O operador pode iniciar a operação de lavagemcom o controlador utilizando, por exemplo, um interruptor de pé, umteclado, ou uma interface gráfica. O controlador (22) pode verificar seos mecanismos de aspersão (14), as unidades de suporte (202) e asunidades de lavagem (208) estão na posição e orientação corretas pelaleitura da informação fornecida pelos sensores de posição (não mostra-dos). O controlador (22) ativa, então, os dois cilindros pneumáticos(506) e (512) para abaixar a montagem de aspersão (14) e as unidadesde suporte (208) para a posição de lavagem. Na posição abaixada,sensores adicionais podem verificar se as montagens foram registradasnas posições corretas antes do ciclo de lavagem ser iniciado. Estessensores adicionais podem ser sensores de proximidade conhecidos natécnica. Conforme previamente discutido, os sensores de proximidadepodem ser indutivos, capacitivos, ultrassônicos, óticos, ou sensores decontato elétrico.

O ciclo de lavagem pré-programado é então executado. O fluidode limpeza é deixado fluir através da válvula controlada eletronicamente(108), do filtro (110), do esterilizador UV (112), e do bocal (120), porcomandos emitidos pelo controlador (22) para a válvula controladaeletronicamente (108) na Figura 3. Os meios, fluido de limpeza usado, etecido vegetal estranho, são retirados pela utilização de pressão negati-va pela abertura automática da válvula de controle elétrico (408). Umapressão negativa é fornecida para as unidades de lavagem (208) para ocontrole do fluxo de fluido de saída. A pressão negativa fornecida paraas unidades de lavagem é controlada pelo controlador (22), o qual emiteo comando operacional para a válvula controlada eletronicamente(408A) abrir (enquanto mantendo a válvula controlada eletronicamente(408B) fechada).

Na etapa 3 da Figura 7C, após terminado o ciclo de lavagem, aválvula controlada eletronicamente (108) fecha o fluxo de fluido e aválvula controlada eletronicamente (408A) é fechada. O controladorpode levantar automaticamente os mecanismos de aspersão (14) e asunidades de suporte (202) utilizando os cilindros pneumáticos (506) e(512). Entretanto, se os fragmentos celulares não tiverem sido comple-tamente retirados dos embriões pela lavagem, o operador pode intervir einiciar um outro ciclo de lavagem dando entrada em um comando nocontrolador pela utilização, por exemplo, de um interruptor de pé, umainterface gráfica, ou um teclado.

Na etapa 4 na Figura 7D, após terminarem todas as operaçõesde lavagem, o operador ou o controlador movimenta os cilindrospneumáticos (506) e (512) (com os mecanismos de aspersão (14) eunidades de suporte (212)) horizontalmente na direção das unidades deenxágüe (212). Quando a unidades de suporte (202) se deslocam nadireção das unidades de enxágüe (212), o operador ou o controlador (22)podem girar as unidades de suporte em 180 graus de tal forma que osembriões ficam localizados no fundo da estrutura de suporte (206). Osembriões são retidos no interior das unidades de suporte (202) pelatensão superficial do fluido remanescente no interior da unidade desuporte (202) após a operação de lavagem.

Na etapa 5 na Figura 7E, o controlador (22) e os sensores deproximidade asseguram um alinhamento apropriado antes do prosse-guimento. O controlador (22) ativa então os dois cilindros pneumáticos(506) e (512) para abaixar o mecanismo de aspersão (14) e as unidadesde suporte (202) para a posição de enxágüe. Uma vez estando osmecanismos de aspersão (14), as unidades de suporte (202), e asunidades de enxágüe (212) ajustados entre si, o operador ou o controla-dor (22) pode iniciar o ciclo de enxágüe. O fluido de limpeza é deixadofluir através da válvula controlada eletronicamente (108), do filtro (110),do esterilizador UV (112), e do bocal (120) por comandos emitidos pelocontrolador (22), o qual controla a válvula controlada eletronicamente(108). Uma pressão negativa é fornecida para as unidades de enxágüe(212) para controlar o fluxo do fluido de saída. A pressão negativafornecida para as unidades de enxágüe é controlada pelo controlador(22), o qual emite o comando operacional para a válvula controladaeletronicamente (408B) para abrir (enquanto a válvula controladaeletronicamente (408B) é mantida fechada).

O tempo entre o início do vácuo e a liberação do fluido é impor-tante para assegurar uma distribuição uniforme da aspersão sobre osembriões na estrutura de suporte (214). Tendo em vista que a liberaçãode fluido é equilibrada com a fonte de pressão negativa para um padrãode aspersão particular, o estabelecimento de uma pressão de vácuoadequada antes da liberação do fluido é uma consideração importante.Adicionalmente, a operação da válvula de verificação (410) depende dovácuo ser iniciado antes da liberação de fluido.

Um exemplo de uma sincronização preferida do fluxo de fluido edo sistema a vácuo durante os processos de lavagem e enxágüe é comose segue. Para o processo de lavagem, o sistema a vácuo é acionadoinicialmente. Após cinco segundos de vácuo (podendo variar de 0-10segundos), é iniciado o fluxo do fluido de limpeza. O fluxo de fluido e ovácuo correm juntos por 30 segundos durante o processo de lavagem(podendo variar de 0-80 segundos). O fluxo de fluido é interrompido e ovácuo continua a operar por mais 7 segundos (podendo variar de 0-10segundos).Para o processo de enxágüe, o fluxo de fluido é iniciado primeiroe corre por 3 segundos (podendo variar de 0-10 segundos). A bomba avácuo é iniciada após o fluxo de fluido ter corrido por 1 segundo(podendo variar de 0-10 segundos). O fluxo de fluido é interrompidoprimeiro e o vácuo continua a operar por mais 10 segundos (podendovariar de 0-80 segundos).

O fluido que entra no mecanismo de aspersão durante a opera-ção de lavagem pode ser de um tipo diferente de líquido do que entra nomecanismo de aspersão durante a operação de enxágüe. Por exemplo, olíquido que entra no mecanismo de aspersão durante a operação delavagem pode simplesmente ser água esterilizada e filtrada, enquanto olíquido que entra no mecanismo de aspersão durante a operação deenxágüe pode ser água esterilizada e filtrada com um aditivo, tal comoum hormônio de crescimento. Nessa situação, uma válvula controladaeletronicamente pode ser utilizada para escolher entre os dois tipos defonte de fluido para a entrada no mecanismo de aspersão. Alternativa-mente, o líquido utilizado na operação de lavagem pode ser o mesmotipo de líquido utilizado na operação de enxágüe, tal como água filtradae esterilizada.

Na etapa 6 da Figura 7F, ao final da operação de enxágüe, ocontrolador (22) levanta as unidades de suporte (202) e o mecanismo deaspersão (14) utilizando os cilindros pneumáticos (506) e (512) de talforma que o operador ou o controlador podem inclinar e deslizar asunidades de suporte as afastando das unidades de enxágüe (212). Osembriões enxaguados podem ser coletados removendo-se a cestaremovível (230) para a próxima etapa do processo de produção. Oaparelho pode iniciar o processo novamente pela carga de novosembriões não lavados nas unidades de suporte (202) e movimentandoas unidades de suporte (202) de volta para as unidades de lavagem(208).

O aparelho de limpeza inteiro pode ficar localizado num ambien-te estéril, por exemplo, uma capela de fluxo laminar ou câmara filtradaHEPA. No caso da utilização de uma capela de fluxo laminar, é impor-tante se otimizar o desenho e orientação dos componentes do aparelhode maneira a minimizar o redirecionamento do ar na capela.

Alguns componentes, tais como as unidades de suporte, asunidades de lavagem e as unidades de enxágüe, podem ser configura-dos para serem colocados em uma autoclave para procedimentos delimpeza e esterilização das partes individuais. Da mesma forma, assuperfícies de contato dos componentes podem ser colocadas em umaautoclave. Alternativamente ou adicionalmente, o aparelho de limpezapode apresentar a funcionalidade adicional de limpeza no local (CIP)para um bom controle de qualidade pela simples adição de encanamen-to, uma bomba, e uma válvula controlada automaticamente paraesterilizar a máquina durante as horas não produtivas sem o desmontedo aparelho de limpeza. O fluido que pode ser bombeado para osistema durante a CIP pode ser, por exemplo, alvejante ou uma concen-tração diluída deste ou peróxido de hidrogênio ou uma concentraçãodiluída deste. Isto assegura um tempo de produção maximizadoenquanto mantendo as condições estéreis.

Um aparelho de acordo com a presente invenção pode sertambém configurado para alimentar automaticamente nutrientes emateriais antifúngicos como pré-tratamento e para condicionamento.

Desta forma, o método de lavagem e o aparelho de acordo comvárias das realizações da presente invenção podem ser rápidos, baratos,altamente eficientes, e aumentar a consistência em qualidade uma vezque o método e o aparelho podem executar lavagem e enxágüe degrandes números de embriões vegetais en masse, em vez de individual-mente.

Adicionalmente, tendo em vista que o aparelho pode ser parci-almente ou totalmente automatizado, o envolvimento humano naoperação de lavagem é minimizado. Como resultado, (1) poucos huma-nos são necessários para limpar um grande número de embriõesvegetais uma vez que o aparelho e o método são capazes de limparmilhares de embriões; (2) há menos chance de contaminação provocadapelo contato humano com os embriões; (3) maior consistência pode seralcançada na operação de limpeza o que conduz a um melhor controlede qualidade; e (4) ocorre um maior controle do processo de limpezauma vez que todas as variáveis alimentadas pelo operador são manipu-ladas pelo controlador.

Além disto, o aparelho e o método são expansíveis de tal formaque podem haver várias estações de limpeza em um aparelho. Destaforma, o aparelho pode conter uma, duas, três, quatro, cinco ou maisestações de limpeza ao mesmo tempo, de tal forma que a saída pode sergrandemente aumentada.

Pode haver muitos benefícios potenciais derivados da utilizaçãodo método e aparelho descritos acima para a lavagem de embriões. Porexemplo, foi observado que a lavagem e enxágüe substancialmenteremove moléculas de polietilenoglicol (PEG) que se aderem às superfí-cies dos embriões durante sua exposição aos meios de desenvolvimentoembriogênico. Esta é uma descoberta significativa porque a remoção dePEG por meio de lavagem e enxágüe elimina várias etapas demoradas etrabalhosas no protocolo de coleta tradicional. Por exemplo, não énecessário se armazenar os embriões coletados em massa em meiogelificado no frio por de 3-4 semanas para permitir a difusão do PEGdos embriões. Desta forma, de acordo com uma realização da presenteinvenção, pretende-se configurar o mecanismo de aspersão e a estaçãode limpeza de modo a remover PEG dos embriões vegetais.

Uma utilização adicional ou vantagem para o aparelho delimpeza acima pode ser como um classificador de embriões pela simplesmudança das estruturas de suporte na unidade de suporte (202) eunidade de lavagem (208). Por exemplo, selecionando-se uma estruturaem malha adequada para a estrutura de suporte (206) na unidade desuporte (202), é possível se remover um tamanho indesejado e/ounúmero de embriões no processo de coleta fazendo-se com que o fluidode limpeza empurre os embriões indesejados para o mecanismo desaída (18) e para o sistema de drenagem.

Embora o mencionado acima descreva realizações da invenção,esta não é restrita a elas. Tendo em vista a descrição da presenteinvenção, um especialista na técnica observará que pode haver outrasrealizações e modificações dentro do escopo e espírito da invenção. Damesma forma, todas as modificações obteníveis por um especialista natécnica a partir do presente relatório e dentro do escopo e espírito dapresente invenção estão incluídas como realizações adicionais dapresente invenção. O escopo da presente invenção deve ser definido talcomo apresentado nas reivindicações a seguir.Tabelas

Tabela 1

Tabela 1 - Formulação de meio completo. Ver Tabela 2 para os compo-nentes de sal inorgânico e vitamina. O pH de todos os meios é de 5,8antes da esterilização por autoclavagem.

<table>table see original document page 118</column></row><table>a Hidrolisado de caseína Sigma C4523

b Fitagel adicionado apenas em Mi3 gelificado

c Gelrite (Gellan Gum, Schweizerhall, n° 86200, Merk, Kelco Div.)

d Carvão ativado (Nuclar SN, MeadWestvaco)Tabela 2

Tabela 2 - Sais inorgânicos e vitaminas nas formulações do meio

<table>table see original document page 120</column></row><table>Tabela 3

Tabela 3 - Dados de germinação de embriões - Comparação entre osmétodos de Coleta Manual χ Coleta em Massa

Número de Germinantes por Grama de Tecido Bmbriogênico

Linhagem Celular TRTl TRT2 TRT3 TRT4K12 32 27 328 56K13 356 80 576 100L31 368 96 968 304M34 120 148 640 344K14 776 340 856 844Q38 144 132 800 368K15 404 396 984 692K16 640 572 924 764K17 500 299 584 544K18 432 340 608 364K19 432 331 332 120K20 504 292 572 464N37 216 68 200 132L32 352 340 848 344K21 700 740 1412 920K22 636 260 1068 661K23 108 144 168 300K24 404 188 296 260K25 180 229 16 101K26 316 256 472 272Média 381 264 633 398

Tratamento 1 = Controle (Coleta Manual - padrão)

Tratamento 2 = Coleta Manual -MFP- padrão

Tratamento 3 = Coleta em Massa - padrão

Tratamento 4 = Coleta em Massa - MFP - padrãoTabela 4

Tabela 4 - Número de germinantes para coleta em massa e coletamanual de embriões somáticos de 20 linhagens diferentes de pinheiroloblolly

<table>table see original document page 122</column></row><table>Tabela 5

Tabela 5 - Número de mudas somáticas plantáveis para coleta emmassa e coleta manual de embriões somáticos de 20 linhagens celularesdiferentes de pinheiro loblolly

<table>table see original document page 123</column></row><table>Tabela 6

Tabela 6 - Efeito da Coleta em Massa sobre a remoção de bloco de PEGde embriões somáticos de pinheiro loblolly

<table>table see original document page 124</column></row><table>

Tabela 7

Tabela 7. Efeito da Coleta em Massa sobre a remoção de PEG de embriões somáticos maduros de pinheiro loblolly

<table>table see original document page 124</column></row><table>Tabela 8

Tabela 8 - Efeito do nível de caseína durante a iniciação (INIC) emanutenção (MANU) sobre o crescimento de culturas embriogênicassomáticas de pinheiro loblolly. Pesos médios dentro da família seguidosda mesma letra não são significativamente diferentes de acordo com oteste de faixa múltipla. A probabilidade Logit é uma medida da possibi-lidade para cada família de que a diferença em percentagem de linha-gens > 1 grama em comparação com o controle seja devida apenas aoacaso.

<table>table see original document page 125</column></row><table><table>table see original document page 126</column></row><table>

Tabela 9

Tabela 9 - Efeito de vários tratamentos pré-germinação sobre a germi-nação de embriões somáticos de pinheiro loblolly.

Número de germinantes por grama de tecido embriogênico

<table>table see original document page 126</column></row><table>

Tabela 10

Tabela 10 - Efeito do condicionamento a temperatura ambiente sobre agerminação de embriões.

<table>table see original document page 126</column></row><table>Tabela 11

Tabela 11 - Efeito de tratamentos pré-germinação alternativos sobre agerminação de embriões somáticos de pinheiro loblolly de 6 linhagenscelulares diferentes.

<table>table see original document page 127</column></row><table>Tabela 12

Tabela 12 - Resumo de germinação e conversão in vitro (plantáveis) deembriões somáticos de pinheiro loblolly de oito linhagens celulares emdois tratamentos de armazenamento a frio por 4, 6 e 8 semanas dearmazenamento a frio (4°C).

<table>table see original document page 128</column></row><table><table>table see original document page 129</column></row><table>Tabela 13

Tabela 13 - Efeito do armazenamento a frio estendido (16 semanas emmeio S2M21) sobre a germinação dos embriões.

<table>table see original document page 130</column></row><table>Tabela 14

Tabela 14 - Efeito do armazenamento a frio estendido (16 semanas emmeio L2M21) sobre a germinação dos embriões.

<table>table see original document page 131</column></row><table>Tabela 15

Tabela 15 - Descrição dos tratamentos de condicionamento testados.Tratamento n° 1 é controle padrão

<table>table see original document page 132</column></row><table>

a Substrato são cestas com embriões colocadas durante o condiciona-mento a frio. As placas de condicionamento nos tratamentos 5 a 10foram embrulhadas com fita filtro para permitir a perda de umidade daplaca durante o condicionamento a frio. As placas de condicionamentonos tratamentos 1 a 4 foram embrulhadas com Nescofilm™ durante ocondicionamento a frio.

b Volume de meio líquido aplicado ao papel de filtro durante o condicio-namento a frio.c Os embriões foram primeiro condicionados a frio.

d O condicionamento por URA (em caixas pipeta) a 23°C seguido decondicionamento a frio.

e Tempo total, frio + URA (se aplicada), em condicionamento.

Tabela 16

Tabela 16 - Resumo dos dados de germinação e conversão (plantáveislistados pelo tratamento de condicionamento. Ver Tabela 15 para adescrição de cada tratamento de condicionamento.

<table>table see original document page 18</column></row><table>

a As placas e dados se perderamTabela 17

Tabela 17 - Efeito de 10 tratamentos de condicionamento de embrião diferen-tes sobre a perda de umidade de placas de condicionamento (colunas A a D) eteor de umidade de embriões após o condicionamento (colunas EaH). Ver

Tabela 15 para a descrição dos tratamentos. Os embriões somáticos foram de5 linhagens celulares reunidas.

<table>table see original document page 134</column></row><table><table>table see original document page 135</column></row><table>

nd = não determinadoTabela 18

Tabela 18 - Conjunto completo de dados da germinação e conversão (plantá-veis) in vitro com embriões somáticos de pinheiro que receberam tratamentosde condicionamento diferentes. Ver Tabela 15 para a descrição de cadatratamento.

<table>table see original document page 136</column></row><table><table>table see original document page 137</column></row><table>Tabela 19

Tabela 19 - Comparação da produção de tecido em diferentes pontos notempo em cultura líquida. A unidade utilizada é o aumento de produ-ção em vezes em quatro semanas. Se um valor em cada caixa é menorque 5, isto indica que ou o tecido ou o meio não é adequado para ocrescimento da cultura em líquido

<table>table see original document page 138</column></row><table><table>table see original document page 139</column></row><table>Tabela 20

Tabela 20 - Comparação do número médio de embriões somáticos obtidos porplaca de desenvolvimento de embrião de cinco linhagens celulares que forammantidas por de 4 a 24 semanas em meios líquidos Mi3 e DCR contendodiferentes níveis de caseína. AeB são designações de frascos. * = diferençasignificativa e ** = diferença altamente significativa. Células vazias indicamque o plaqueamento não foi realizado devido a crescimento de tecido baixo.Tratamentos 1, 2, 3 e 4 como na Tabela 9.

<table>table see original document page 140</column></row><table><table>table see original document page 141</column></row><table>Tabela 21

Tabela 21 - Efeito do tratamento com meio de intumescimento de tecido sobrea conversão de embriões somáticos a plantas

<table>table see original document page 142</column></row><table>Tabela 22

<table>table see original document page 143</column></row><table>

Tabela 23

Tabela 23 - Comparação do sucesso do crescimento de linhagens embriogêni-cas de cinco famílias diferentes de pinheiro loblolly a pelo menos 3 gramas emmaio com 0,5 g/l de casína versus 2,0 g/l de caseína

<table>table see original document page 143</column></row><table>Tabela 24

Tabela 24 - Efeitos dos meios sobre a produção de embrião.

Sim = Linhagem celular produziu pelo menos 10 embriões por grama detecido

Não = Linhagem celular produziu menos de 10 embriões por grama de tecido

<table>table see original document page 144</column></row><table><table>table see original document page 145</column></row><table>

Tabela 25

Tabela 25 - Efeito de tratamentos em meio de manutenção líquidosobre o crescimento (média SVC em quatro semanas) de cinco linhagenscelulares J (reunidas).

<table>table see original document page 145</column></row><table>Tabela 26

Tabela 26 - Efeito de quatro tratamentos de intumescimento de tecidosobre a produção de tecido, produção de embriões e produção potencialde embriões de cinco linhagens celulares (reunidas). Os representam oaumento em número de vezes em comparação com o tratamento decontrole #1

<table>table see original document page 146</column></row><table>

Tabela 27

Tabela 27 - Resumo do efeito do nível de caseína sobre o crescimentodepois da crio-recuparação (peso fresco de tecido em gramas) delinhagens celulares H e I de pinheiro loblolly

<table>table see original document page 146</column></row><table>Tabela 28

Tabela 28 - Efeito do nível de caseína sobre a freqüência de recupera-ção de linhagens celulares embriogênicas de pinheiro loblolly de arma-zenamento criogênico.

<table>table see original document page 147</column></row><table>Tabela 29

Tabela 29 - Comparação da produção de tecido, número de embriõessomáticos por grama de tecido e produção potencial de embriões apartir de cinco linhagens celulares da família J mantidas em pós crio-manutenção com e sem brassinolide. A mesma letra entre os tratamen-tos de cada linhagem celular indica uma diferença não significativa. Osnúmeros em negrito indicam o melhor tratamento.

<table>table see original document page 148</column></row><table>

xNR = Sem recuperação, estes genótipos falharam em crescer no meiosem brassinolide.

yNY = Não testado devido ao fato de não ter havido recuperação.Tabela 30

Tabela 30 - Comparação da produção de tecido, número de embriõessomáticos por grama de tecido e produção potencial de embriões apartir de cinco linhagens celulares da família k mantidas em pós crio-manutenção com e sem brassinolide. A mesma letra entre os tratamen-tos de cada linhagem celular indica uma diferença não significativa. Osnúmeros em negrito indicam o melhor tratamento.

<table>table see original document page 149</column></row><table>Tabela 31

Tabela 31 - Família por interação de tratamentos com meios obtida poruma bateria de abordagens de varredura utilizando-se quatro diferentesmeios de iniciação e manutenção em 7 famílias genéticas diferentes. Apercentagem de sementes de partida que estabeleceu culturas embrio-gênicas é mostrada para cada tratamento com meio.

<table>table see original document page 150</column></row><table>

aControle meio de iniciação WV5 contendo 30 g/l de maltose e 0,5 g/lde caseína.

b COntrole meio de manutenção Mi3 contendo 30 g/l de sacarose e 0,5g/l de caseína

* Estatisticamente diferente do controle (teste de probabilidade logit)Tabela 32

Tabela 32 - Efeito do nível e tipo de polietilenoglicol (PEG) sobre a produção,germinação e estabelecimento em planta de embriões somáticos entre 7linhagens celulares embriogênicas somáticas de pinheiro loblolly.

<table>table see original document page 151</column></row><table><table>table see original document page 152</column></row><table>

Tabela 33

Tabela 33 - Germinação de embriões somáticos de pinheiro loblolly deuma linhagem celular da família J após exposição a dois meios decondicionamento.

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a 1. Controle: Substrato é meio gelificado, 28 dias a 7°C, seguido de 21dias em vaso vedado, sobre água a 24°C (URA)

2. Novo método: O mesmo que o controle durante 28 dias a 7°C,seguido de 21 dias em vaso vedado sobre papel de filtro a 24°C.b5 réplicas/método, 60 a 178 embriões/réplica.

c Percentagem de germinação média ± desvio padrão entre 5 répli-cas/método.Tabela 34

Tabela 34. Germinação de embriões somáticos de pinheiro loblolly apósexposição a dois meios de condicionamento.

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a Mesmo método utilizado na Tabela 33

b Embriões de 68 genótipos testados no método 1, e de 65 genótiposdiferentes no método 2.

c Percentagem de germinação média ± desvio padrão entre os diferentesgenótipos em cada método.

Claims (73)

"Métodos Combinatório de Otimização da Embriogênese Somática,de Preparação de Embriões, de Múltiplos Embriões Vegetais e deEmbriões Somáticos de Conifera Para a Produção de Plantas e deObtenção de Embriões Germinantes, Meio Liquido Para o Cultivo deTecido Embrionário e Equipamentos Semi-Automatizado Para aColeta de Embriões e de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, Embriões e Planta"

1. Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,caracterizado por que compreende (i) lavar múltiplos embriões vegetaissimultaneamente e (ii) transferir os embriões lavados para um substratoe para um ambiente apropriado para o condicionamento dos embriõespelo período de tempo pretendido, para que se tornem competentespara germinação, de modo a serem usados na produção de plantas.

2. Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que compreendeainda recuperar um ou mais dos embriões a qualquer hora durante operíodo de tempo pretendido.

3.Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que os embriõesvegetais são embriões somáticos.

4. Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o substrato decondicionamento é um gel que compreende maltose, glutamina e ácidoabscísico.

5. Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o substrato decondicionamento é um papel de filtro saturado com um volume de meiolíquido, que compreende maltose, glutamina e ácido abscísico.

6. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que o volume domeio líquido é 0,5 ml ou 2,5 ml.

7. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o condiciona-mento ocorre num ambiente de alta umidade relativa sem armazena-mento a frio.

8. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o condiciona-mento compreende armazenar os embriões num meio gelificado, a frio,por um período de tempo.

9. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o métodocompreende ainda colocar os embriões numa membrana de poliéster oupapel, transferir a membrana para um recipiente, que é, então, selado,e manter o recipiente a uma temperatura alta por um período de tempo.

10. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que a temperaturaé de cerca de 1°C até 12°C.

11. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 10, caracterizado por que a temperatu-ra é de cerca de 3°C até 6°C.

12. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o período detempo é de cerca de 1 dia até aproximadamente 24 semanas.

13. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 8, caracterizado por que o período detempo é de cerca de 4 dias até aproximadamente 12 semanas.

14. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por que o recipienteselado é mantido à temperatura ambiente.

15. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por que a temperatu-ra é de cerca de 15°C até aproximadamente 30°C.

16. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por que a temperatu-ra é de cerca de 20°C até 28°C.

17. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por que o período detempo é de cerca de 1 semana até aproximadamente 12 semanas.

18. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 17, caracterizado por que o período detempo é de cerca de 2 semanas até aproximadamente 5 semanas.

19. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que os embriõessão condicionados por um período de 8 até 24 semanas.

20. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado, por que pelo menosuma das etapas de lavagem e transferência é automatizada.

21. - Meio Líquido Para Cultivo de Tecido Embrionário, caracteriza-do por que compreende uma concentração de caseína que varia entrecerca de 1.100 e aproximadamente 3.000 mg/l.

22. - Método de Obtenção de Embriões Germinantes, caracterizadopor que compreende (i) colocar culturas embriogênicas oriundas dearmazenamento a frio em meio de criorrecuperação por um período detempo e, então, cultivar o tecido embriogênico num meio líquido, (ii)transferir o tecido embriogênico para meio de desenvolvimento deembriões de modo a produzir embriões, (iii) lavar uma massa dosembriões gerados com água, (iv) colocar a massa lavada de embriões emum substrato que está saturado com meio de condicionamento e (v)germinar os embriões, em que (a) o meio de criorrecuperação compre-ende pelo menos uma entre uma concentração de caseína que variaentre cerca de 1.100 e aproximadamente 3.000 mg/l ou uma quantida-de de Brassinolídeo, (b) o meio líquido tem uma alta concentração decaseína, (c) o meio de desenvolvimento de embriões tem uma quantida-de pretendida de polietileno glicol e (d) o meio de condicionamento élíquido.

23. Método de Obtenção de Embriões Germinantes, de acordo com aReivindicação 22, caracterizado por que a quantidade de polietilenoglicol no meio de desenvolvimento de embriões varia entre cerca de 7% eaproximadamente 13%.

24. Método de Obtenção de Embriões Germinantes, de acordo com aReivindicação 22, caracterizado por que a quantidade de Brassinolídeovaria entre 0,05 to 0,5 μΜ.

25. Método Combinatório de Otimização da Embriogênese Somáti-ca, caracterizado por que compreende (i) iniciar a embriogênese de umtecido embriogênico vegetal num meio de iniciação, que compreendeuma alta concentração de caseína, (ii) manter o tecido embriogênicoiniciado num meio de manutenção que compreende uma concentraçãode caseína em armazenamento a frio, (iii) recuperar o tecido embriogê-nico do armazenamento a frio num meio que compreende pelo menosuma entre (a) uma concentração de caseína ou (b) uma quantidadeótima de Brassinolídeo e (iv) desenvolver os embriões do tecido embrio-gênico recuperado num meio de desenvolvimento de embriões quecompreende uma quantidade ótima de polietileno glicol, sendo que aconcentração de caseína no meio de iniciação e no meio de manutençãofica dentro da faixa de cerca de 1.100 mg/l até aproximadamente 3.000mg/l.

26. Método Combinatório de Otimização da Embriogênese Somáti-ca, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por que a percen-tagem de polietileno glicol no meio de desenvolvimento de embriõesvaria entre cerca de 7% até aproximadamente 13%.

27. Método Combinatório de Otimização da Embriogênese Somáti-ca, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por que a quanti-dade ótima de polietileno glicol é determinada antes de se realizar ométodo combinatório pelo (i) cultivo das culturas embriogênicas nummeio de desenvolvimento de embriões que compreende uma quantidadede polietileno glicol e (ii) comparando o crescimento das culturasembriogênicas em embriões com o crescimento dos embriões do mesmogenótipo em meio de desenvolvimento de embriões que compreende pelomenos uma quantidade diferente de polietileno glicol.

28. - Método Combinatório de Otimização da Embriogênese Somáti-ca, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por que o meio emque o tecido embriogênico é recuperado após o armazenamento a friocompreende caseína e Brassinolídeo.

29. - Método Combinatório de Otimização da Embriogênese Somáti-ca, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por que a quanti-dade de Brassinolídeo é de cerca de 0,1 μΜ.

30. - Método Combinatório de Otimização da Embriogênese Somáti-ca, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por que a quanti-dade ótima de Brassinolídeo é determinada antes de realizar o métodocombinatório pelo (i) cultivo do tecido embriogênico que foi recuperado apartir do armazenamento a frio num meio que compreende uma quan-tidade de Brassinolídeo e (ii) comparando o crescimento do tecidoembriogênico com o crescimento do tecido embriogênico de mesmogenótipo em meio que compreende pelo menos uma quantidade diferen-te de Brassinolídeo.

31. - Método Combinatório de Otimização da Embriogênese Somáti-ca, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por que o meio deiniciação compreende ainda uma concentração de maltose de cerca de 10-25 g/l.

32. - Equipamento Semi-Automatizado Para Coleta de Embriões, quecompreende (1) o carregamento de embriões numa superfície, (2)lavagem dos embriões, (3) enxágüe dos embriões e (4) descarregamentoou transferência dos embriões da superfície para outra superfície ourecipiente ou contêiner, para manipulação adicional.

33. - Embriões, caracterizados por que são preparados pelo método daReivindicação 1.

34. - Planta, caracterizada por que é cultivada a partir do embrião daReivindicação 33.

35. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o embrião é deuma conífera.

36. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 35, caracterizado por que a conífera éda espécie Pinus.

37. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a espéciesPinus é Pinus taeda (Loblolly pine) ou Pinus Radiata.

38. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, caracterizado por que compreende:uma estrutura de liberação de fluido, que leva fluido deentrada para os múltiplos embriões vegetais;uma estação de limpeza, com comunicação de fluidoscom a estrutura de liberação de fluido e configurada para segurar osmúltiplos embriões vegetais, de modo a que eles recebam o líquido deentrada oriundo da estrutura de liberação de líquidos para limparresíduos celulares dos múltiplos embriões vegetais;um mecanismo de saída, com comunicação de fluido coma estação de limpeza e configurado para receber líquido de saída daestação de limpeza; eum controlador, configurado para controlar pelo menosuma estrutura de liberação de fluido e a estação de limpeza para limparresíduos celulares dos múltiplos embriões celulares.

39. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 38,caracterizado por que a estrutura de liberação de fluido inclui ummecanismo de aerossol para aspergir os múltiplos embriões vegetais.

40. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 38,caracterizado por que a estação de limpeza inclui:uma unidade de lavagem, para lavar os múltiplos embri-ões vegetais; euma unidade de enxágüe, para enxaguar os múltiplosembriões vegetais.

41. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 40,caracterizado por que a unidade de enxágüe inclui um material porosoconfigurado para segurar os múltiplos embriões vegetais e que possuium tamanho de poro dentro da faixa de 15 micra a 65 micra.

42. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 40,caracterizado por que a unidade de enxágüe inclui um material porosoconfigurado para segurar os múltiplos embriões vegetais e que é remo-vível para remover os múltiplos embriões vegetais da unidade de enxá-güe.

43. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 40,caracterizado por que a estação de limpeza inclui ainda uma unidadede espera que transporta os múltiplos embriões vegetais a partir daunidade de lavagem para a unidade de enxágüe.

44. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 43,caracterizado por que pelo menos uma estrutura de liberação defluido, unidade de lavagem, unidade de enxágüe e unidade de esperainclui um revestimento substancialmente transparente que permite omonitoramento de pelo menos um dentre a lavagem e o enxágüe atravésdo revestimento substancialmente transparente.

45. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 43,caracterizado por que compreende ainda uma estrutura controladapelo controlador para deslocar a unidade de espera da unidade delavagem para a unidade de enxágüe.

46. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 43,caracterizado por que a unidade de espera inclui um material porosoconfigurado para segurar os múltiplos embriões vegetais e que possuium tamanho de poro que varia dentro de uma faixa de 400 micra até-900 micra.

47. Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 43,caracterizado por que a unidade de espera inclui um primeiro materialporoso configurado para segurar os múltiplos embriões vegetais e quepossui um primeiro tamanho de poro e a unidade de enxágüe inclui umsegundo material poroso configurado para segurar os múltiplos embri-ões vegetais e que possui um segundo tamanho de poro, sendo que osegundo tamanho de poro é menor do que o primeiro tamanho de poro.

48. Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 40,caracterizado por que o mecanismo de saída inclui:uma primeira saída, com comunicação de fluido com aunidade de lavagem e configurada para receber líquido de saída daunidade de lavagem; euma segunda saída, com comunicação de fluido com aunidade de enxágüe e configurada para receber líquido de saída daunidade de enxágüe.

49. Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 38,caracterizado por que compreende ainda uma fonte de pressão negati-va com comunicação de fluido com o mecanismo de saída para proverpressão negativa.

50. Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 49,caracterizado por que a fonte de pressão negativa inclui um sistema devácuo que compreende uma válvula eletrônica conectada a uma bombade vácuo.

51. Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 49,caracterizado por que a fonte de pressão negativa inclui uma válvulade retenção com comunicação de fluido com a estação de limpeza econfigurada para operar em função do peso do líquido de saída e deuma força da pressão negativa.

52. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 38,caracterizado por que o controlador está configurado para controlar ofluxo do líquido de entrada através da estrutura de liberação de fluido.

53.- Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 38,caracterizado por que o controlador está configurado para controlar apressão do líquido de entrada liberado pela estrutura de liberação defluido.

54. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 53,caracterizado por que o controlador está configurado para manter oimpacto (impingement) do líquido de entrada dentro de uma faixa de-0,000355753 até 0,00189 quilogramas por centímetro quadrado a umadistância padrão normalizada de trinta centímetros.

55. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 38,caracterizado por que compreende ainda uma fonte de pressão negati-va com comunicação de fluido com o mecanismo de saída,em que o controlador está configurado para controlar apressão do líquido de entrada liberada pela estrutura de liberação defluido e para controlar uma pressão provida pela fonte de pressãonegativa ao mecanismo de saída.

56. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 38,caracterizado por quea estação de limpeza inclui:uma unidade de lavagem; euma unidade de enxágüe, configurada parasegurar os múltiplos embriões vegetais;o mecanismo de saída inclui:uma primeira saída, com comunicação de fluidocom a unidade de lavagem e configurada para receber o primeiro líquidode saída da unidade de lavagem; euma segunda saída, com comunicação de fluidocom a unidade de enxágüe e configurada para receber o segundo líquidode saída da unidade de enxágüe;compreendendo ainda uma fonte de pressão negativacom comunicação de fluido com a primeira e segunda saídas, paraprover pressão negativa para a primeira e a segunda saídas,em que o controlador está configurado para controlar aestrutura de liberação de fluido e a fonte de pressão negativa.

57. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 38,caracterizado por que compreende ainda um sistema de condiciona-mento de fluido com comunicação de fluido com a estrutura de libera-ção de fluido e configurado para uma opção entre filtrar o líquido deentrada e esterilizar o líquido de entrada.

58. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 57,caracterizado por que o sistema de condicionamento de fluido incluium filtro de membrana e um esterilizador UV.

59. - Equipamento de Preparação de Múltiplos Embriões VegetaisPara a Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 38,caracterizado por que a estação de limpeza está configurada pararemover polietileno glicol dos múltiplos embriões vegetais.

60. - Método de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para aProdução de Plantas, caracterizado por que compreende:colocar múltiplos embriões vegetais numa estação delimpeza;lavar os múltiplos embriões vegetais por meio da libera-ção de um líquido de entrada para os embriões vegetais; econtrolar com um controlador um fluxo de líquido deentrada liberado para os embriões vegetais.

61. - Método de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para aProdução de Plantas, de acordo com a Reivindicação 60, caracterizadopor que o impacto do líquido de entrada é mantido dentro de uma faixade 0,000355753 até 0,00189 quilogramas por centímetro quadrado auma distância padrão normalizada de trinta centímetros.

62. - Método de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para aProdução de Plantas, de acordo com a Reivindicação 60, caracterizadopor que compreende aindaprover uma pressão negativa para a estação de limpezapara controlar o fluxo do líquido de saída; econtrolar com o controlador a pressão negativa suprida àestação de limpeza.

63. - Método de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para aProdução de Plantas, de acordo com a Reivindicação 60, caracterizadopor que compreende ainda pelo menos uma opção entre filtrar o líquidode entrada e esterilizar o líquido de entrada.

64. - Método de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para aProdução de Plantas, de acordo com a Reivindicação 60, caracterizadopor que o polietileno glicol é removido a partir dos múltiplos embriõesvegetais na etapa de lavagem.

65. - Método de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para aProdução de Plantas, caracterizado por que compreende:colocar múltiplos embriões vegetais numa unidade delavagem;lavar os múltiplos embriões vegetais por meio da libera-ção de um primeiro líquido de entrada na unidade de lavagem;transportar os múltiplos embriões vegetais até umaunidade de enxágüe;enxaguar os múltiplos embriões vegetais por meio daliberação de um segundo líquido de entrada na unidade de enxágüe; econtrolar com um controlador pelo menos uma dasetapas de lavagem, transporte e enxágüe.

66. Método de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para aProdução de Plantas, de acordo com a Reivindicação 65, caracterizadopor que compreende ainda as etapas de:aplicar uma primeira pressão negativa à unidade delavagem, para controlar o fluxo do primeiro líquido de saída oriundo daunidade de lavagem; eaplicar uma segunda pressão negativa à unidade deenxágüe, para controlar o fluxo do segundo líquido de saída oriundo daunidade de enxágüe.

67. Método de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para aProdução de Plantas, de acordo com a Reivindicação 65, caracterizadopor que compreende ainda a etapa de pelo menos uma das opções entrefiltrar o primeiro e o segundo líquidos de entrada e esterilizar o primeiroe o segundo líquidos de entrada.

68. Método de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para aProdução de Plantas, de acordo com a Reivindicação 65, caracterizadopor que o primeiro líquido de entrada e o segundo líquido de entradatêm a mesma composição.

69. Método de Preparação de Múltiplos Embriões Vegetais Para aProdução de Plantas, de acordo com a Reivindicação 65, caracterizadopor que o primeiro líquido de entrada e o segundo líquido de entradatêm composições diferentes.

70. Método de Preparação de Embriões Somáticos de Conifera Paraa Produção de Plantas, caracterizado por que compreende:posicionar os múltiplos embriões somáticos de coníferanum material poroso com um tamanho de poro dentro da faixa de 400micra até 900 micra; elevar o fluido até os múltiplos embriões somáticos deconífera no material poroso para limpar os embriões somáticos daconífera.

71. - Método de Preparação de Embriões Somáticos de Conífera Paraa Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 70, caracteri-zado por que o tamanho do poro do material poroso está dentro dafaixa de 560 micra até 710 micra.

72. - Método de Preparação de Embriões Somáticos de Conífera Paraa Produção de Plantas, de acordo com a Reivindicação 70, caracteri-zado por que o tamanho do poro do material poroso está dentro dafaixa de 600 micra até 670 micra.

73. - Método de Preparação de Embriões Para a Produção de Plantas,de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por que o volume domeio líquido é menor ou igual ao volume necessário para saturar opapel de filtro.