BR112012017385A2 - método de regeneração de plantas e aparelho para o mesmo. - Google Patents

Abstract

MÉTODOS DE REGENERAÇÃO DE PLANTAS E APARELHOS PARA O MESMO Um método de preparação de um fragmento de tecido de planta é fornecido, em que a dominância apical do tecido de planta meristeático é inibida seguida pela fragmentação do tecido. São também fornecidos métodos de micropropagação de planta e métodos de produção de semente artificial utilizando supressão de dominância aplical em, preferivelmente, um processo semiautomático. Também é fornecido uma máquina de processamento de tecido de planta que gera fragmentos de planta com alta eficiência de regeneração e um aparelho de produção de semente artificial.

Description

-. MÉTODOS DE REGENERAÇÃO DE PLANTAS E APARELHOS PARA O MESMO > CAMPO DA INVENÇÃO Esta invenção refere-se à regeneração de plantas. Mais particularmente, esta invenção refere-se ao aparelho e métodos de regeneração de plantas de uma maneira de alto rendimento, sob condições assépticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Tem havido muitos esforços na automatização de várias etapas de micropropagação e tecnologia de produção de sementes de plantas artificial. Estes incluem os conceitos e demonstração prática dos sistemas de imersão temporários, várias formas de tecnologias de biorreator adaptadas à micropropagação, tentativas de gerar tecnologias de corte ' de tecido como sistemas de cultivo de robôs e fotoautotróficos. Todos estes foram destinados a reduzir custos de trabalho para tornar a micropropagação comercial em grande escala mais eficiente e economicamente competitiva. A regeneração de plantas usando tecnologia de sementes de plantas artificiais é uma alternativa à micropropagação tradicional para produção e distribuição de plantinhas clonadas. Vários aspectos desta tecnologia permanecem subdesenvolvidos para uso em comercialização em larga escala. Muito do trabalho usando tecnologia de semente artificial foi focado em embriões somáticos como o tecido de escolha. Para muitas espécies de plantas, a embriogênese somática, o processo de produção de embriões somáticos, é muitas vezes longo, trabalhoso, específico de genótipo e pode levar a alterações genéticas ou fenotípicas. Assim, sementes artificiais foram derivadas a partir de tecido não |

-. embriogênico, mas continua a haver uma economia indesejável > 5 de produção comercial particularmente em termos de custos de trabalho. Apesar do progresso que está sendo feito com relação à tecnologia de sementes artificiais, a produção eficiente de plantas monocotiledôneas maduras apresentando variação somoclonal mínima permaneceu elusiva, Weyerhaeuser desenvolveu uma tecnologia de embriogênese somática, seleção de embriões e encapsulamento de embriões automatizada para pinheiros que é comercialmente utilizada. Variantes somaclonais muitas vezes resultam em reduzido desempenho agronômico em comparação com a(s) planta(s) da(s) qual/quais eles são derivados. A variação somaclonal é particularmente evidente com as técnicas de regeneração baseadas em calos, incluindo embriogênese somática, que são usadas nos sistemas de regeneração de plantas.

RESUMO DA INVENÇÃO Apesar de progresso ter sido feito na micropropagação e, em particular, no desenvolvimento de semente de planta artificial, o uso comercial difundido é relativamente limitado devido, em parte, aos altos custos trabalhistas e aos limites físicos no aumento de escala. Por conseguinte, a invenção é amplamente direcionada ao aparelho e métodos adequados para utilização em micropropagação de plantas e, mais particularmente, na regeneração de propágulos assepticamente de uma forma de alta produtividade. Em outros aspectos amplos, a invenção é direcionada a um aparelho de processamento de tecido de planta que gera fragmentos de tecido de planta que não requerem um estágio |

"o de desenvolvimento em meios de cultura antes da produção de . semente de planta artificial.

Em outros aspectos amplos, a invenção fornece métodos e sistemas que são pelo menos parcialmente automatizados, semiautomáticos ou completamente automatizados.

Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um método de preparação de um fragmento de tecido meristemático vegetal para utilização em micropropagação de planta, O dito método incluíndo as etapas de: (i) inibição da dominância apical de um tecido meristemático de planta; e (ii) fragmentação do tecido meristemático da planta resultante da etapa (i) para preparar o fragmento de tecido meristemático de planta para uso em micropropagação de planta.

Em um segundo aspecto, à invenção fornece um fragmento de tecido meristemático de planta produzido de acordo com o método do primeiro aspecto.

Em um terceiro aspecto, a invenção fornece um método de micropropagação de planta, o dito método incluindo as etapas de: (i) inibir a dominância apical de um tecido meristemático de planta; (ii) fragmentar o tecido meristemático de planta resultante da etapa (i), para assim produzir um fragmento de tecido meristemático de planta; e (iii) regenerar uma planta ou tecido de planta do fragmento de tecido meristemático de planta.

Em um quarto aspecto, a invenção fornece um método de produção de uma semente de planta artificial, o dito método |

O ÇS2SSSSÓSSSSSSSCSNCSNeethee A) 4/65 e incluindo as etapas de: . (1) inibir a dominância apical de um tecido meristemático de planta; (ii) fragmentar o tecido meristemático de planta resultante da etapa (i) para desse modo produzir um fragmento de tecido meristemático de planta; e (iii) revestir o fragmento de tecido meristemático de planta com um meio de revestimento de tecido de planta para, desse modo, produzir a semente de planta artificial.

Em um quinto aspecto, a invenção fornece uma semente artificial produzida de acordo com o método do quarto aspecto.

Em modalidades preferidas de qualquer um dos aspectos acima mencionados, a etapa (i) inclui ainda o cultivo do tecido meristemático de planta mantendo simultaneamente a inibição da dominância apical.

Em outras modalidades preferidas de qualquer um dos | aspectos acima mencionados, o tecido meristemático de planta é cultivado antes da inibição da dominância apical.

De preferência, o tecido meristemático de planta é cultivado durante cerca de 4 semanas, mantendo simultaneamente a inibição da dominância apical.

Em modalidades preferidas, a inibição da dominância i apical é por meio do tratamento selecionado a partir do grupo consistindo de tratamento físico, tratamento químico e tratamento bioquímico do tecido meristemático de planta.

De preferência, a inibição da dominância apical é por meio de tratamento físico e, mais preferencialmente, por corte do tecido meristemático de planta, e ainda mais preferivelmente, o tecido meristemático de planta é cortado |

> Mamona nIa iate SLI aaa a La tai ACALMA ADA LAO rr da 5/65 "e. ao longo de um eixo longitudinal.

: Em modalidades preferenciais de qualquer um dos aspectos acima mencionados, o tecido meristemático de planta é derivado do ápice do broto.

Em modalidades preferenciais de qualquer um dos aspectos acima mencionados, o tecido meristemático de planta é derivado do meristema apical do broto ou meristema axilar.

Em certas modalidades preferidas, a etapa (ii) e/ou a etapa (iii) no método de qualquer um dos aspectos acima mencionados é, de preferência, pelo menos parcialmente automatizada, mais preferencialmente semiautomática e ainda mais preferencialmente totalmente automatizada.

Em um sexto aspecto, à invenção fornece um aparelho de processamento de tecido de planta adequado para a geração de fragmentos de tecido de planta para utilização na micropropagação de planta, em que o dito aparelho de processamento de tecido de planta compreende uma pluralidade de lâminas, em que pelo menos duas (2) lâminas cortam um tecido de planta em uma sequência ordenada ao longo de pelo menos dois (2) planos diferentes.

De preferência, o aparelho de processamento de tecido de planta compreende pelo menos três (3) lâminas que cortam um tecido de planta em uma sequência ordenada ao longo de pelo menos três (3) planos diferentes.

Em modalidades preferidas, a técnica de micropropagação de planta é selecionada da micropropagação de planta convencional e da produção de semente de planta artificial.

Mais preferivelmente, a micropropagação de planta é a |

“. produção de semente de planta artificial.

: Em modalidades preferidas, o tecido de planta é selecionado do grupo consistindo de um botão de flor axilar, uma folha, inflorescência e um ápice de broto.

De preferência, o tecido de ápice de broto é um tecido de botão de flor apical e/ou um tecido de meristema apical.

Em um sétimo aspecto, a invenção fornece um método de preparação de um fragmento de tecido de planta para utilização na micropropagação de planta, o dito método incluindo a etapa de (i) cortar um tecido de planta usando um aparelho de processamento de tecido de planta do sexto aspecto, para assim gerar o fragmento de tecido de planta adequado para utilização na micropropagação de planta.

Em um oitavo aspecto, à invenção fornece um método de produção de uma semente de planta artificial, o dito método incluindo a etapa de (i) cortar um tecido de planta utilizando um aparelho de processamento de tecido de planta do sexto aspecto para assim gerar um fragmento de tecido de planta adequado para utilização em uma semente de planta artificial.

Em modalidades preferenciais de qualquer um do sexto ao oitavo aspectos, o tecido de planta é derivado de um cluster de microbroto.

De preferência, o tecido de planta e/ou cluster de microbroto é derivado de tecido de planta selecionado do grupo consistindo de um botão de flor axilar, uma folha, inflorescência e um ápice de broto.

Mais preferivelmente, o ápice de broto é um tecido de botão de flor apical e/ou um tecido de meristema apical.

Em modalidades preferidas do sétimo e oitavo aspectos, |

RA IAERAAANAAAAAIA ALA AAA AAA A sa a ia pc 2 DAL LENDA AAA LA raia ASA 0 al tt até amia ind 7/65 “ o tecido vegetal é cultivado in vitro antes da etapa (i).

: Em modalidades preferidas do oitavo aspecto, o método inclui ainda a etapa de (ii) revestir o fragmento de tecido de planta derivado da etapa (i) com um meio de revestimento de tecido de planta.

Em um nono aspecto, a invenção fornece um fragmento de tecido de planta produzido de acordo com um método do sétimo aspecto.

Em um décimo aspecto, a invenção fornece uma semente de planta artificial produzida de acordo com um método do oitavo aspecto.

Em um décimo primeiro aspecto, a invenção fornece um aparelho de produção de semente de planta artificial que compreende pelo menos duas (2) câmaras, em que uma primeira câmara adaptada para conter um meio de revestimento de tecido de planta que compreende um ou mais fragmentos de tecido de planta; e uma segunda câmara adaptada para conter uma solução de ambiente de revestimento de semente, em que a primeira câmara e a segunda câmara são operativamente associadas, de modo que a descarga do meio de revestimento de tecido de planta da primeira câmara para dentro da segunda câmara forma, por meio disso, uma semente de planta artificial.

Em um décimo-segundo aspecto, a invenção fornece um método de micropropagação de planta, o dito método incluindo a etapa de (i) cortar um tecido de planta usando um aparelho de processamento do tecido de planta do sexto aspecto, para desse modo gerar 0 fragmento de tecido de planta adequado para utilização na micropropagação da planta.

| o Em um décimo-terceiro aspecto, a invenção fornece um | sistema para a micropropagação de planta, o dito sistema incluindo um dispositivo para fragmentar um tecido meristemático de planta com dominância apical inibida para produzir um fragmento de tecido meristemático de planta e regenerar uma planta ou tecido de planta a partir do fragmento de tecido meristemático de planta ou revestir o fragmento de tecido meristemático de planta com um meio de revestimento de tecido de planta. Em modalidades preferidas, o sistema inclui um ou mais elementos selecionados a partir das características 3 a 6 da figura 37.

Na modalidade preferida de qualquer um dos aspectos, o micropropágulo e/ou a semente de planta artificial gera uma planta monocotiledônea ou planta dicotiledônea.

Mais preferencialmente, a planta monocotiledônea é um ou mais membros da família Poacea, e é mais preferencialmente selecionada do grupo consistindo de cana de açúcar, sorgo e trigo e, ainda mais preferencialmente, é cana de açúcar. Em outras modalidades preferidas, a planta monocotiledônea é um ou mais membros da família Musa e, de preferência, banana. Em ainda outras modalidades preferidas, a planta monocotiledônea é um ou mais membros da família Zingiberaceae e, mais preferencialmente, gengibre.

De preferência, o meio de revestimento de tecido de planta compreende alginato e/ou xantana.

De acordo com modalidades preferidas de qualquer um dos aspectos anteriormente mencionados, o fragmento de tecido de planta se regenera em uma planta com uma alta |

| aaaNaRA AS baita MEC RCDS Lala a ia a anta ad idas a ta dna 09 ra dentais eenéeaa lista ori asda anna a mel caro em ANNA a Aa 9/65 o eficiência. : De preferência, o fragmento de tecido da planta tem um tamanho médio de entre cerca de 0,5 mm e cerca de 20 mm. Mais preferivelmente, o fragmento de tecido de planta ! tem um tamanho médio de entre cerca de 2 mm e cerca de 4 | mm, Ainda mais preferivelmente, o fragmento de tecido de planta tem um tamanho médio de cerca de 3 mm.

Em modalidades preferidas particulares, o fragmento de tecido de planta tem um tamanho de diâmetro médio, e mais preferencialmente um tamanho de diâmetro médio em cada direção.

Em modalidades preferenciais de qualquer um dos aspectos acima mencionados, por cultivo se entende cultura “in vitro”.

Em qualquer um dos aspectos acima mencionados, os fragmentos de planta e, de preferência, os fragmentos de tecido meristemático de planta se regeneram em plantas ou tecido de planta sem calos interpostos ou produção de embrião somático.

Em modalidades preferenciais de qualquer um dos aspectos acima mencionados, o tecido de planta ou tecido meristemático de planta é de uma planta monocotiledônea ou planta dicotiledônea. De preferência, o tecido de planta ou tecido de planta meristemático é de uma planta monocotiledônea.

Em modalidades particularmente preferidas, o tecido de planta ou tecido meristemático de planta é de uma planta monocotiledônea. Em modalidades preferidas, a planta monocotiledônea é selecionada de uma planta da família |

DD MI nm A A aa TA an De Ste) 10/65 o Poaceae, uma planta da família Poaceae da família Musa e Wi uma planta da família Zingiberaceae.

De preferência, a planta monocotiledônea é da família Poaceae que inclui cana de açúcar e cereais tais como trigo, arroz, centeio, aveia, cevada, sorgo e milho. Mais preferencialmente, a planta monocotiledônea é selecionada do grupo consistindo de cana de açúcar, sorgo e trigo.

Outras plantas monocotiledôneas que são contempladas incluem bananas, HHes, tulipas, cebolas, aspargos, gengibre, bambu, dendezeiro, coqueiro, tamareira e palmeiras ornamentais como palmeira kentia e rápis.

Em outras modalidades preferidas, a planta monocotiledônea é da família Musa e, mais preferencialmente, banana.

Em ainda outras modalidades preferidas, a planta monocotiledônea é da família Zinglberaceae &e, mais preferivelmente, gengibre.

Também são contempladas as células, tecidos, folhas, frutos, flores, sementes e outro material reprodutivo, material útil para a propagação vegetativa, híbridos F1 e todas as outras plantas e produtos de planta deriváveis da dita planta monocotiledônea.

Ao longo de todo este relatório descritivo, à menos que o contexto exija de outra forma, as palavras “compreende” (“comprise"), “compreende” (“comprises”) e “compreendendo” serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros indicado, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS | oo A fim de que a invenção possa ser prontamente 7 compreendida e colocada em efeito prático, modalidades preferidas serão agora descritas a título de exemplo com referência ao anexo: Figura 1 Peças de meristema e botão de flor apícal após o cultivo e prontas para as etapas de processamento de tecido.

Figura 2 Clusters de microbrotos em proliferação limpos de excesso de ágar, crescimento de folha e tecido marrom.

Figura 3 Tecido fragmentado produzido pelo aparelho de processamento de tecido de planta.

Figura 4 Vista em perspectiva do aparelho de produção de semente de planta artificial de escala de laboratório de acordo com uma modalidade da presente invenção.

Figura 5 Estágios diferentes e germinação do crescimento de uma semente de planta artificial em uma plantinha durante 3 semanas em cultura líquida.

Figura 6 Resposta da regeneração de planta de i sementes artificiais do cultivar de cana de açúcar KQ228 cultivadas em meio Murashigc e Skoog (MS) com ou sem auxinas diferentes. IBA - ácido indol-3-butírico; NAA - ácido a-naftalenacético. As barras de erro indicam t+ s.e.

Figura 7 Resposta de regeneração de planta de sementes de planta artificial do cultivar de cana de açúcar 0208 crescido em meio MS com ou sem auxinas diferentes. IBA - ácido indol-3-butírico; NAA - ácido a-naftalenoacético. As barras de erro indicam t+ s.e.

Figura 8 Uma semente de planta artificial com desenvolvimento de broto e raiz. A matriz de gel é ainda |

- MANUSEAR tas dana calm ini trir na AA A tr A AA AAA 12/65 "o ligada à base da plantinha no lado direito (como mostrado : pela seta).

Figura 9 Uma comparação da regeneração de planta a partir de sementes de plantas artifíciais de 4 variedades comerciais. As barras de erro indicam t s.e.

Figura 10 Aparelho de produção de semente de planta artificial em escala laboratorial para a produção de semente de planta artificial de cana de açúcar (esquerda). Vista ampliada (direita) de sementes de planta artificial diretamente após à remoção da câmara inferior.

Figura 11 Efeito da matriz de revestimento de tecido na produção de semente de planta artificial do cultivar de cana de açúcar KQ228. Legenda por agrupamento: primeira barra = total; segunda barra = utilizável; terceira barra = vazio. As barras de erro indicam t s.e.

Figura 12 Regeneração da semente de planta artificial a partir de 3 tipos de tecidos obtidos a partir de clusters de microbrotos. As barras de erro indicam t+ s.e.

Figura 13 Tamanho médio (mm) de sementes de planta artificial contendo fragmento de tecido.

Figura 14 Refinamento do tamanho do fragmento foi necessário para melhorar a produção de sementes de planta artificial úteis.

Figura 15 Vista em perspectiva de um aparelho de processamento de tecido de planta de acordo com uma modalidade preferida da presente invenção.

Figura 16 Vista plano de um aparelho de processamento de tecido de planta mostrando lâminas e empurradores de acordo com uma modalidade da presente invenção.

Figura 17 (A) Vista em perspectiva de uma câmara de |

Do DOS SNS 13/65 oo corte de um aparelho de processamento de tecido de planta 7 de acordo com uma modalidade da presente invenção; (B) Vista plana da câmara de corte de (A); (C) Vista em seção da câmara de corte através das linhas indicadas na Figura 17 (B).

Figura 18 Vista em seção da câmara de corte através das linhas J até O.

Figura 19 Vista em seção da câmara de corte através das linhas B até B.

Figura 20 (A) Vista plana da câmara de corte; (B) Vista em seção da câmara de corte através das linhas, conforme indicado.

Figura 21 Botões de flor apicais e axilares de broto cultivados in vitro (A) se desenvolvem em clusters em proliferação de tecido meristemático (B). Os fragmentos de (B) são capazes de se desenvolver em brotos ou plantas in ! vitro.

Figura 22 Tecidos meristemáticos em proliferação (A) foram cortados em fragmentos de 2 à 3 mmº (B) capazes de regenerar plantas in vitro.

Figura 23 Potencial de regeneração de planta para diferentes partes de massa de tecido meristemático em proliferação. Efeito do tamanho do fragmento de tecido e o método de produção de fragmento [corte com a mão (HC) versus moinho de café (CM)] na regeneração da planta de cana de açúcar. Quatro replicatas por tratamento. Cada replicata (frasco) continha 40 sementes artificiais em meio MS líquido suplementado com BA 4 HUM. As culturas foram mantidas no agitador (120 rpm), em fotoperíodo de 16 he a 27 ºC. 1 9g de tecido meristemático produziu, em média, 49 |

E a DD e 14/65 o sementes artificiais.

7 Figura 24 Capacidade regenerativa de diferentes partes de tecido meristemático em proliferação usadas para a produção de fragmento de tecido. Quatro replicatas por tratamento. Cada replicata (frasco) continha 30 sementes artificiais em meio MS líquido suplementado com BA 4 pM. As culturas foram mantidas em agitador (120 rpm), fotoperíodo de 16 h e a 27 ºC. 1 gq de tecido produziu, em média, 49 sementes artificiais.

Figura 25 Otimização da matriz de encapsulação para a produção de semente artificial utilizando fragmentos de tecido a partir da ponta do broto ou tecido meristemático em proliferação derivado de botão de flor axilar. Dez replicatas por tratamento. Cada replicata (frasco) continha 35 sementes artificiais ou 1,4 gq de fragmentos de tecido de 3 mm? em meio MS líquido suplementado com BA 4 yuM. As culturas foram mantidas em agitador (120 rpm), fotoperíodo de 16 h e a 27 ºC.

Figura 26 Germinação de sementes artificiais e desenvolvimento de plantinhas durante 4 semanas (A). Plantinhas produzidas a partir de sementes artificiais que crescem em substrato de solo (B).

Figura 27 Germinação e estabelecimento de sementes artificiais de cama de açúcar em solo. Elas foram cultivadas em estufa. Sementes artificiais foram semeadas em 1 ou 2 cm de profundidade ou mantidas descobertas com o solo. Cada tratamento teve 10 replicatas. Toda a germinação de plantinhas semanal foi registrada. As sementes artificiais foram pré-cultivadas em meio MS líquido suplementado com NAA 0,5 um durante 2 semanas, em agitador |

É A RLEOCUAIAURIRA DA SAL Ao) aa ntiditinalna lia datdat ralada iniallsalitiatdaica santa tati aneis atenta aaa ADA a ata sat 15/65 "= a 120 rpm, em fotoperíodo de 16 h e a 27 “CC. Legenda: 7 primeira barra = coberto com 1 cm de solo; segunda barra = descoberto com solo; terceira barra = coberto com 2 cm de solo. As barras de erro indicam t s.e.

Figura 28 Fragmentos de tecido suspensos em suspensão e alginato-kelzan (A). Aparelho de imobilização em escala de bancada para a produção de semente artificial de cana de açúcar (B); Observe que as sementes artificiais são formadas na câmara inferior. Sementes artificiais prontas para germinação (C).

Figura 29 Determinação do tecido ótimo: razão de matriz de encapsulamento para a produção de sementes artificiais. Legenda: primeira barra = pérolas com fragmentos; segunda barra = pérolas vazias; terceira barra = pérolas distorcidas.

Figura 30 Uma gotícula com um fragmento de tecido formando-se a partir da câmara superior da máquina de imobilização em escala de bancada (A) sementes artificiais contendo fragmentos de tecido.

Figura 31 Máquina de processamento de tecido e as especificações (A e B); fragmentos de corte em máquina 5 dias (C) e 4 semanas (D) após o cultivo em meio nutriente basal, A regeneração de fragmentos ocorreu em meio nutriente basal.

Figura 32 Comparação da produção de fragmento de tecido meristemático usando a máquina de processamento de tecido e o método de corte manual. O processo manual minimizou o dano tecidual e, portanto, produziu mais fragmentos de tecido úteis em comparação com à fragmentação mecânica.

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NINA NAAAAARNAARARMASALMAMRAAAA AA MMRMAtI NAMES SANA RAIA AAnLiiiliaalintulntdia deitada lana 16/65 "oc Figura 33 Regeneração de planta a partir de sementes : artificiais de 4 variedades comerciais. Cada frasco continha fragmentos produzidos a partir de 7 g de tecido meristemático. As barras de erro indicam t s.e.

Figura 34 Melhoria induzida por auxina na conversão de sementes artificiais em plantinhas das duas variedades de cana de açúcar australiana mais comercialmente importantes (9208 e K0228).

Figura 35 Comparação da eficiência de regeneração de planta de fragmentos meristemáticos de gengibre e sementes artificiais após o crescimento durante 6 semanas em cultura líquida.

Figura 36 Comparação da eficiência de regeneração de planta dos fragmentos meristemáticos de gengibre e sementes artifíciais após crescer durante 3 semanas em cultura líquida.

Figura 37 Fluxograma das etapas chave envolvidas na tecnologia de produção de semente artificial de cana de açúcar. Legenda 1. Topo do broto, à fonte de meristemas apical e axilar de broto; 2. Tecido meristemático em proliferação obtido da ponta do broto e/ou botão de flor axilar; 3. Máquina de Processamento de Tecido para fragmentar o tecido meristemático. 4. Tecido meristemático fragmentado 5.

Tecido meristemático fragmentado em suspensão de alginato-kelzano; 6. Produção de sementes artificiais no aparelho de imobilização; 7. Sementes artificiais, 8. Germinação de sementes artificiais. S, Plantinhas produzidas a partir de sementes artificiais plantadas no campo.

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RES NS 17/65 ' : DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 7 A presente invenção é atribuída, pelo menos em parte, no desenvolvimento de métodos e sistemas para a preparação de fragmentos de tecido de planta que são capazes de regenerar em uma planta ou tecido de planta que supera os custos de produção elevados de outras técnicas de micropropagação e que ainda sejam altamente eficientes.

Em outros aspectos gerais, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, no desenvolvimento de um sistema de semente de planta artificial que utiliza pequenos fragmentos de plantas e, em certas modalidades, clusters de microbroto, derivados de botões de flor axilares de cana de açúcar em i proliferação e/ou ápice de broto in vitro, para produzir plantinhas, embora seja observado que à invenção pode abranger além da cana de açúcar até as monocotiledôneas ou dicotiledôneas.

Em aspectos amplos particulares, a invenção fornece métodos e sistemas para a preparação de fragmentos de tecido meristemático de planta.

Em modalidades particulares, os métodos ou sistemas da presente invenção produzem um fragmento de tecido meristemático de planta ou fragmento de tecido de planta que é capaz de se regenerar em uma planta ou tecido de planta.

Em modalidades particularmente preferidas, as plantas ou tecido de planta pode ser regenerado diretamente a partir dos fragmentos produzidos pela invenção sem calos interpostos ou produção de embriões somáticos.

Uma vantagem particular fornecida pelos fragmentos da invenção é a produção bem sucedida de plantas em frequência elevada (80-90%) diretamente a partir de fragmentos pequenos.

A cultura de tecido de planta foi amplamente utilizada |

DraaMiaMrMAM MMA Arda rAAtrrrrAMAMMAAAAAAAALAAMUAD MANDA AAA AAA atada AAA tatiana haha hAAA Ain AA 18/65 " na propagação, transformação, mutagênese, criação e : eliminação de vírus da planta. Tais sistemas de cultura de tecidos são geralmente referidos como sistemas de “micropropagação”, em que explantes de tecido de planta são cultivados in vitro em um meio sólido ou líquido adequado, a partir do que plantas maduras são regeneradas. Em modalidades particulares, “micropropagação” refere-se à tecnologia de micropropagação convencional ou, alternativamente, tecnologia de semente de planta artificial. Como será observado por uma pessoa versada na técnica, a tecnologia de micropropagação convencional | inclui técnicas de micropropagação que não incluem a produção de uma semente de planta artificial, mas que se referem à propagação e regeneração de plantas e tecidos de planta a partir de uma planta cultivada in vitro; tecido de planta e ou partes destas.

Por “semente de planta artificial” se entende uma semente de planta que não ocorre na natureza, mas sim é um propágulo funcionalmente semelhante a uma semente de planta que foi produzida por algum nível de intervenção humana utilizando técnicas de micropropagação. A “semente de planta artificial” é capaz de regenerar em uma planta e pode sofrer germinação. Os termos “semente de planta artificial” e “semente artificial” podem ser usados aqui de modo intercambiável.

Em aspectos amplos particulares, a invenção reside em métodos de preparação de fragmentos de tecido meristemático de planta para utilização na micropropagação de planta pela (i) inibição da dominância apical de um tecido mnmeristemático de planta; e (ii) processamento do tecido |

DAMN AAAAArNMNAAAARRENAAAAANNSAAA RANA Ata AAA A indo Ata ihAAnaiAaAAAANAAAMRAAAA AAA tatiana AAA. 19/65

Ta meristemático de planta resultante da etapa (i) para 1 preparar um fragmento de tecido meristemático de planta que é adequado para utilização na micropropagação de planta, como exemplificado na seção Exemplos e, em particular, nos Exemplos 1, 3 e 7 a 10. Os fragmentos de tecido meristemático de planta preparados por estes métodos são adequados para utilização na tecnologia de micropropagação de planta convencional ou tecnologia de semente artificial.

Em termos gerais, a etapa (i) que inclui a inibição da dominância apical resulta na produção de propágulos geneticamente uniformes (ou, de outro modo, conhecidos como “propágulos autênticos deste tipo”) de um tecido meristemático de planta e, de preferência, grandes quantidades de tecido meristemático de planta organogenicamente competente para utilização na etapa (ii). Em modalidades preferidas, a etapa (i) inclui a cultura in vitro e a proliferação do tecido meristemático de planta sem diferenciação em brotos ou plantinhas.

A capacidade para produzir e manter o tecido meristemático capaz de se regenerar em brotos ou plantinhas por períodos prolongados sob condições de cultura definidas é conseguida através da inibição da dominância apical, deste modo, permitindo que os axilares proliferem.

Em modalidades preferidas, o tecido meristemático de planta é derivado do tecido de meristema apical de broto ou, alternativamente, o tecido meristema axilar.

Será percebido por uma pessoa versada na técnica que o tecido de meristema de botão de flor apical é derivado do ápice do broto, enquanto que meristemas axilares são derivados de botões de flor axilares do meristema apical de broto

| rAAAAAAAAEAAAAAA AAA AAA AANANA AA baita AaAMAMAAAAAAANAAAAMNAAAAAAA tica 20/65 e primário ou axilar.

7 “Dominância apical” é um termo usado na técnica por meio do qual o crescimento vertical supera o crescimento lateral em uma planta. A dominância apical é controlada por hormônios de planta chamados de auxinas.

A presente invenção contempla à inibição da dominância apical. No contexto da presente invenção, por “inibir”, “inibição”, “inibido”, “inibitório” ou “inibidor” entende- se qualquer tratamento que pelo menos parcialmente interfere com, previne, anula, suprime, reduz, diminui, interrompe, bloqueia ou dificulta o crescimento vertical dominante de uma planta ou tecido de planta resultante do ápice da planta ou ápice do tecido de planta e inclui a inibição completa da dominância apical. A título de exemplo, “inibição” pode referir-se a uma diminuição de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% em dominância apical.

A dominância apical pode ser inibida por qualquer um ou uma pluralidade de meios, como são conhecidos na técnica. O tratamento físico inclui a anulação do crescimento mecanicamente do tecido de botão de flor apical, rompendo ou cortando o botão de flor apical, embora sem limitação a isto. Assim, a remoção do domínio do broto primário pode ocorrer através do corte do botão de flor apical. Em modalidades preferidas, a dominância apical é inibida pelo corte em fatias longitudinais do tecido meristemático de planta.

A invenção também contempla à inibição química da dominância apical pelo tratamento hormonal ou a utilização de outras pequenas moléculas orgânicas com uma atividade |

AAA Arad 21/65 ] To. biológica e meia-vida desejada.

: A invenção adicionalmente contempla técnicas bioquímicas para inibição da dominância apical, inclusive de técnicas moleculares e genéticas. Exemplos —.não dlimitativos de inibição molecular de dominância apical incluem o uso de peptídeos, proteínas tais como anticorpos. Técnicas genéticas incluem o uso de técnicas baseadas em ácido nucleico ou genes que incluem o uso de ribozimas, moléculas silenciadoras de genes como mikRNA, siRNA e semelhantes.

Em certas modalidades preferidas, o tecido meristemático da planta é cultivado ou propagado antes da inibição da dominância apical. O período de cultura é, conforme necessário, e pode ser de até cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas e cerca de 3 semanas, embora sem limitação a isto. Em modalidades particularmente preferidas, o tecido meristemático de planta é cultivado in vitro. Em formas particularmente preferidas destas modalidades, o tecido meristemático de planta é derivado a do tecido de meristema apical de broto, embora o uso de meristema axilar também seja contemplado.

Em outras certas modalidades, a dominância apical do tecido meristemático de planta é inibida antes da cultura. De acordo com estas modalidades, o tecido meristemático de planta é cultivado, mantendo ao mesmo tempo a inibição da dominância apical.

Em modalidades preferidas, o tecido meristemático de planta é cultivado sob condições de inibição da dominância apical até a reemergência da dominância apical, isto é, até a primeira formação de broto. O período para à cultura é, |

ARMADA DMA at tati Ana hei inteira it ita AAA AAA 22/65 Ta como requerido, para gerar quantidades desejadas de tecido : meristemático de planta e, de preferência, de até cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 3 meses, cerca de 4 meses, cerca de 5 meses, cerca de 6 meses, cerca de 7 meses, cerca de 8 meses, cerca de 9 meses, cerca de 10 meses, cerca de 11 meses e cerca de 12 meses ou mais, contanto que o tecido permaneça meristemático.

Em modalidades particulares, a etapa de fragmentação de um tecido meristemático de planta da etapa (ii) é para talhar, fatiar ou, de outro modo, cortar. A etapa de fragmentação pode ser realizada manualmente com uma faca convencional ou pode ser automatizada ou semiautomática (tal como pelo uso de uma máquina de moagem tal como um moinho de café) ou realizadas por um dispositivo automatizado. Em modalidades preferidas, a etapa (ii) é realizada pelo aparelho de processamento de tecido de planta, conforme demonstrado nas figuras 15 e 16.

Em modalidades particulares, o tecido meristemático de planta não é derivado de feto.

Em modalidades preferidas, o tecido morto é removido antes da etapa de fragmentação. Máquina de Processamento de Tecido Automatizada Em outros aspectos gerais, as máquinas foram desenvolvidas para automatizar as etapas de trabalho intensivo deste processo. Isto inclui um aparelho para fragmentar massas em proliferação de microbrotos e um sistema automatizado para encapsular aqueles fragmentos. As sementes de planta artificiais desenvolvidas utilizando |

RR AA O OA 23/65 “e microbrotos são capazes de crescer em plantinhas normais : bem desenvolvidas plântulas duas (2) semanas após a colocação em um sistema de cultura líquido. A presente invenção é particularmente acessível em sistemas em que a embriogênese não pode ser utilizada para micropropagação e precisa se basear em outras formas de morfogênese.

Portanto, uma motivação subjacente não exclusiva da presente invenção é produzir material clonal usando uma tecnologia que leva à proliferação de meristemas (as chamadas células tronco de planta) e adaptando estes à tecnologia de produção de semente de planta artificial. Por conseguinte, os inventores conceberam e desenvolveram um aparelho e um sistema para produzir tecidos alvo estéreis e morfogenicamente competentes para a rápida produção rápida de material para a produção de semente de planta artificial, e a regeneração de plantas. Isso tem valor comercial considerável.

Uma vantagem particular, embora sem limitação à isto, da invenção é um sistema de automação parcial, semiautomático ou totalmente automatizado de micropropagação à base de meristema de broto que tem a capacidade de produzir propágulos clonais (autênticos deste tipo) mais do que quaisquer outras tecnologias de propagação in vitro (cultura de calo, cultura de células, cultura de protoplastos, organogênese direta, embriogênese somática, etc).

Portanto, de acordo com aspectos amplos da presente invenção, a invenção é amplamente direcionada a um aparelho de processamento de tecido de planta para a geração de fragmentos de tecido de planta adequados para utilização na | micropropagação de planta. Em modalidades particularmente 1 preferidas, fragmentos de tecido de planta produzidos por ísto são adequados para uso em semente de planta artificial, em que as sementes de planta artificial regeneram plantas com alta eficiência. Em uma forma particular, o aparelho de processamento de tecido de planta é uma aparelho de corte de tecido de planta.

A invenção é também amplamente dirigida a métodos de micropropagação de planta e/ou produção de sementes artificial que utiliza o aparelho de processamento de tecido de planta.

As figuras 15 e 16 mostram um aparelho de i processamento de tecido de planta 100 de acordo com uma modalidade da presente invenção. o aparelho de processamento de tecido de planta 100 compreende uma câmara de corte 200 e uma pluralidade de motores de condução 300. Como será percebido pelo destinatário versado, a fonte de energia para a operação é tomada direta da fonte elétrica monofásica. A potência é reduzida por um transformador antes de ser fornecida para os motores de condução 300. Os motores de condução 300 são conectados às hastes rosqueadas quadradas 310 que, por sua vez, possuem uma porca de metal 320 fixada. A porca de metal 320 é fixada a um suporte de ferramenta 330 e move-se ao longo do comprimento da haste 310, que por sua vez impele o suporte da ferramenta 330 para dentro e para fora da câmara de corte 200. O suporte de ferramenta 330 se move em conjuntos de Suportes lineares. Como será descrito em mais detalhe a seguir, uma lâmina é impulsionada por uma arranjo de manivela de sino e move-se sobre conjuntos de rolamentos lineares, enquanto |

| 25/65 ! ' e que outro está ligado a uma porca de rosca guia e move-se : para trás e para a frente sobre rolamentos lineares. O , corte de tecido de planta ocorre dentro da câmara de corte : 200 e a coleta dos fragmentos de tecido de planta cortados ' ocorre na bandeja coletora 101. ; Será percebido que, em uma modalidade preferida, um controlador lógico programável controla a sequência de operação do aparelho de processamento de tecido de planta

100. Como pode ser observado na Figura 15, os mecanismos do aparelho são de preferência montados sobre uma base de alumínio usinada 102 e cobertos por uma tampa Perspex translúcida 103, A finalidade da tampa é dupla: (1) para proporcionar uma barreira de segurança entre a máquina enquanto em funcionamento e o operador. A transparência da tampa permite o monitoramento da operação sem exposição de pessoal ao mecanismo do aparelho; (2) a tampa permite o controle da esterilidade do ambiente de operação durante a operação. A amostra de tecido de planta a ser cortada é introduzida através da tampa em um tubo alimentador especialmente concebido 104. Pressão é aplicada à matéria- prima através da introdução de um peso leve no topo do material no tubo de alimentação. Durante e no final da operação de corte, as amostras podem ser coletadas a partir de uma abertura 101 situada sob o aparelho sem a remoção da tampa. As Figuras 17A e 17B mostram uma vista mais detalhada da câmara de corte 200. A câmara de corte 200 compreende uma abertura 201 formada através das paredes laterais verticais 203 e um piso 202 no qual o tecido da planta é carregado para o corte subsequente. A câmara de corte 200 |

Arara NANMMaAAArAAAAAAAA AA AAA AAA AAA AAA AAA AAA MEAN AAA 26/65

= compreende ainda uma primeira lâmina 210, uma segunda : lâmina 220 e uma terceira lâmina 230. Associados com a primeira e a segunda lâminas estão um primeiro empurrador

211 e um segundo empurrador 221, respectivamente. '

A primeira lâmina 210 corta um tecido de planta | diretamente do carregamento.

O primeiro empurrador 211 empurra o material em baixo torque por todo o comprimento para dentro da abertura 201 da câmara de corte 200. A segunda lâmina 220 corta o tecido da planta cortado pela primeira lâmina 210 até o tamanho em uma dimensão.

O segundo empurrador 221 empurra o tecido de planta mais adiante para dentro da abertura 201 da câmara de corte 200. A terceira lâmina 230 corta o tecido de planta até o seu tamanho de fragmento desejado final.

Deste modo, um material de planta ou tecido meristemático de planta da presente invenção é cortado em uma sequência ordenada por pelo menos duas lâminas ao longo de pelo menos dois planos diferentes.

Por “cortado em uma sequência ordenada” se entende cortar, fragmentar, fatiar ou, de outro modo, cortar de forma ordenada e, portanto, não de maneira aleatória.

Em modalidades particulares preferidas, “cortado em uma sequência ordenada” é cortar um tecido de planta ou tecido meristemático de planta em sequência.

Embora seja percebido que em outras certas modalidades o tecido da planta ou tecido meristemático da planta é cortado não sequencialmente por pelo menos duas lâminas ainda em uma sequência ordenada.

Os fragmentos de tecido de planta são subsequentemente coletados em uma bandeja sob o aparelho de processamento de tecido de planta 100. A Figura 18 mostra uma vista em seção através das |

> sntncntnta dum eenta sita laico dans sea tias arames asia nitauaatindaiaic ca das leia sa RD bias aaa AU —— 27/65 Do linhas J até J da câmara de corte 200. Em operação, a ' primeira lâmina 210 entra na abertura 201 através de um plano que é aproximadamente paralelo até o chão 202 da câmara de corte 200 e faz um corte completo do tecido da planta. Isto é, o primeiro corte do tecido da planta com a primeira lâmina 210 pode gerar uma placa do tecido da planta. A placa do tecido da planta é empurrada pelo primeiro empurrador 211 ainda mais para dentro da câmara de corte, em preparação para o segundo corte, A figura 19 mostra uma vista em seção através das linhas B até B da câmara de corte 200. A segunda lâmina 220 entra na câmara de corte 200 em um plano que é aproximadamente perpendicular às paredes laterais verticais 203 e, portanto, essencialmente corta a placa do tecido da planta gerada pelo primeiro corte em uma tira. O segundo empurrador 221 subsequentemente empurra à tira de tecido de planta na frente da terceira lâmina 230. A figura 20 mostra a terceira lâmina 230 em relação à câmara de corte 200. A terceira lâmina 230 está posicionada em relação à câmara de corte 200 aproximadamente | perpendicularmente em relação às paredes laterais verticais |

203. A terceira lâmina 230 rapidamente corta a tira que 1 está sendo empurrada pelo segundo empurrador 221 em | fragmentos de tamanho e forma desejados. Por exemplo, os fragmentos podem ser um cubo, embora sem limitação a isto. Um destinatário versado irá perceber que os fragmentos produzidos terão o tamanho e/ou integridade de tal modo que os fragmentos de tecido vegetal não requerem um estágio de desenvolvimento em meios de cultura antes do revestimento do fragmento do tecido de planta. Além disso, fragmentos de |

Ts tamanhos aproximadamente iguais são produzidos sob 7 condições assépticas com mínimo manuseio do usuário, Outras vantagens é que o aparelho é conducente com a produção de planta em massa e há pouco ou nenhum dano ao tecido o que, então, não reduz as taxas de regeneração da planta.

OS fragmentos gerados pela terceira lâmina 230 são subsequentemente coletados para processamento posterior.

A presente invenção que se aplica ao aparelho de processamento de tecido de planta 100 é aplicável a uma variedade de tecidos de planta diferentes, inclusive do fuso da folha ou verticilo, lâmina da folha, botões de flor axilares, caules, ápice de broto, bainha da folha, entrenó, pecíolos, talos de flores, embrião, raiz ou inflorescência.

Adequadamente, uma propriedade biológica relevante dos tecidos da planta utilizados na presente invenção é que eles contêm células que se dividem ativamente e potencial de diferenciação.

De preferência, o tecido vegetal é o botão de flor axilar e/ou ápice do broto.

Em modalidades preferidas, o ápice do broto é tecido de botão de flor apical e/ou tecido de meristema apical.

Será percebido que os fragmentos de tecido de planta gerados pelo aparelho de processamento de tecido de planta 100 ou gerados de outro modo pela etapa (ii) como aqui anteriormente descrito devem ter um tamanho médio, e de preferência um tamanho de diâmetro médio, que é condutivo para a produção de uma semente de planta artificial ou, no caso de micropropagação de planta convencional, condutivo para regenerar em uma planta ou tecido de planta de acordo com os métodos da presente invenção.

Em modalidades preferidas, o tamanho médio é de cerca de 0,5 mm, cerca de | atuais nadanta ensaes égide alia LARA a ALAN LA dela ra in onáLiA Ladanatatt dA LA AL OCA AAA Aa ARA AAA AAA A AL 29/65 “. 1 mm, cerca de 1,5 mm, cerca de 2,0 mm, cerca de 2,5 mm, : cerca de 3,0 mm, cerca de 3,5 mm, cerca de 4,0 mm, cerca de 4,5 mm, cerca de 5,0 mm, cerca de 5,5 mm, cerca de 6,0 mm, cerca de 6,5 mm, cerca de 7,0 mm, cerca de 7,5 mm, cerca de 8,0 mm, cerca de 8,5 mm, cerca de 9,0 mm, cerca de 9,5 mm, cerca de 10,5 mm, 11 mm, 11,5 mm, 12,0 mm, 12,5 mm, 13,0 mm, 13,5 mm, 14,0 mm, 14,5 mm, 15,0 mm, 15,5 mm, 16,0 mm, 16,5 mm, 17,0 mm, 17,5 mm, 18,0 mm, 18,5 mm, 19,0 mm, 19,5 mm e 20,0 mm. Em modalidades particulares, o tamanho médio preferido é de cerca de 3 mm.

Em outros aspectos amplos, a invenção fornece métodos de produção de uma semente de planta artificial que não requerem um estágio de desenvolvimento em meios de cultura de tecido após fragmentação e antes da encapsulação do fragmento de tecido em um meio de revestimento de tecido de planta.

Em certas modalidades preferidas, os métodos de produção de sementes de plantas artificial da presente invenção que incluem a utilização do aparelho de processamento de tecido de planta 100 incluem ainda as etapas de cultivar um tecido de planta antes da fragmentação usando o aparelho de processamento do tecido de planta 100. Adequadamente, o tecido de planta derivado de uma planta é cultivado in vitro com meios de crescimento, de preferência com o seu lado de corte para baixo, durante um período de tempo suficiente para permitir ! que o tecido da planta atinja um tamanho de explante que é capaz de ser subsequentemente processado. Um período de cultura preferido é de 4 semanas, no entanto, será observado que o tempo de cultura pode variar dependendo de |

AA AAA A 30/65 o. uma série de fatores, tais como o tipo de tecido de planta í e pode ser prolongado ou encurtado, conforme necessário. Antes do processamento no aparelho de processamento do tecido de planta, o explante cultivado é limpo por remoção de tecido foliar e qualquer tecido morto, e se necessário, ágar em excesso. Será ainda adicionalmente percebido que a cultura in vitro pode ser realizada em meio sólido ou líquido.

A figura 4 representa um aparelho de produção de semente de planta artificial 1 de acordo com uma modalidade da presente invenção. O aparelho de produção de semente de planta artifícial 1 compreende uma primeira câmara 2, uma segunda câmara 3 e uma unidade de agitação 4. A primeira câmara 2 compreende um ponto de entrada 5 e um orifício 6 localizado em lados opostos da primeira câmara 2. Um filtro 7 e uma junção de filtro 8 estão localizados em um lado da primeira câmara 2. A segunda câmara 3 compreende uma vedação de vidro 9 de projetando a partir de um ponto superior e uma válvula de paragem 10 localizada oposta. A primeira câmara 2 e à segunda câmara 3 estão associadas entre si de tal modo que Oo orifício 6 descarrega material na segunda câmara 3. 1 Em operação, fragmentos de tecido de planta são misturados com um meio de revestimento de tecido de planta fora da primeira câmara 2. A mistura 13 é vertida através do ponto de entrada 5 e a tampa da primeira câmara é colocada sobre para, assim, criar uma vedação e um vácuo interno. O agitador 4 é ligado para criar um vórtice de cerca de 2 cm de altura da solução de colocação de revestimento de semente. A válvula de parada 10 é a seguir |

| NNNNUANNA ANNA Mr animnan tata ataalaa ditada iii abeiAA Anata asddaid dada. 31/65 To aberta lentamente para permitir o fluxo suficiente da ' mistura de fragmento de tecido de planta 13 através do orifício 6. Gotículas individuais 14 da mistura caem para baixo da primeira câmara 2 para dentro da segunda câmara 3.

Quando as gotículas 14 da primeira câmara 2 se misturam com a solução de colocação de revestimento de semente 3, as gotículas se fixam em uma semente de planta artificial contendo o fragmento de tecido de planta 15. As sementes de planta artificiais 15 permanecem sob agitação na segunda câmara 3 durante tempo suficiente para permitir que o meio de revestimento endureça totalmente. As sementes de planta artificiais são subsequentemente removidas por decantação e rinsadas, de preferência em água deionizada estéril, para desse modo produzir uma semente de planta artificial. A semente de planta artificial pode ser vendida sem propagação de plantinhas ou, alternativamente, a semente de planta artificial podem ser germinada e cultivada para produzir uma plantinha que pode ser subsequentemente vendida para um usuário final.

Será percebido que uma Vantagem do aparelho de produção de semente de planta artificial. 1 é que uma variedade de sementes de planta artificiais podem ser geradas em um curto período. Além disso, a necessidade de alimentação do operador é minimizada.

É observado que o meio e revestimento de tecido de planta pode compreender qualquer polímero, soluto, carboidrato, goma guar, carragena (e suas combinações), que são adequadas para o revestimento ou encapsulamento de um tecido de planta para produzir uma semente de planta artificial. De preferência, o meio de revestimento de |

“. tecido de planta compreende alginato de sódio e xantana.

Em 7 modalidades particularmente preferidas, a concentração de alginato de sódio é de 3 a 4% p/v, enquanto que a concentração de xantana é de 1 a 1,5% p/v, esta concentração sendo a concentração da solução adicionada apo meio de revestimento de tecido de planta.

Em modalidades particularmente preferidas, a concentração de alginato de sódio é de cerca de 3% p/v, enquanto que a concentração de xantana é de cerca de 1% p/v.

Será percebido que a concentração de agentes utilizados no meio de revestimento de tecido de planta irá variar dependendo do agente que é utilizado e da razão de tecido de planta meio de revestimento de tecido de planta.

Em modalidades particularmente preferidas, o meio de revestimento de tecido de planta estará em uma concentração que vai . produzir pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 30%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% de eficiência de regeneração Ou germinação em plantinhas.

Será observado que o alginato de sódio é disponível comercialmente como Manugel GMBGO, enquanto xantana está disponível como Kelzanôd, como são outras formulações de revestimento de tecido de planta úteis.

Em modalidades preferidas, a solução de colocação de revestimento de semente é CaCl; a uma concentração particularmente preferida de 0,06 M.

No entanto, o destinatário versado irá perceber que qualquer solução de colocação de revestimento de semente pode ser utilizada e, em certa medida, à escolha da solução de colocação de revestimento de semente depende do que é utilizado para o meio de revestimento de tecido de planta.

É observado que o |

Sa meio de revestimento de tecido de planta pode compreender : substâncias químicas tais como cloreto férrico, cloreto de cobalto, nitrato de cálcio e hidróxido de cálcio.

Naquelas modalidades que contemplam O cultivo de tecido de planta ou parte de planta, o meio de cultura pode incluir a formulação nutriente de Murashige e Skoog (Murashige e Skoog, 1962, Physiologia Plantarom 15:473) ou meio de Gamborg (Gamborg et al., 1968, Exp. Cell. Res. 50:151). De preferência, o meio compreende a formulação nutriente de Murashige e Skoog. Será observado que os meios acima mencionados são comercialmente disponíveis, como são outros meios potencialmente úteis.

Será observado que o meio de cultura pode conter outros suplementos necessários para o crescimento do explante tais como, mas sem se limitar, a açúcares, hormônios (por exemplo, auxinas e citocininas), ácido cítrico e ácido ascórbico. É feita referência à Publicação Internacional No. WO 01/82684 (incorporada por referência), que fornece exemplos não limitativos de meios de crescimento adequados e suplementos que podem ser aplicados à presente invenção.

Também é preferível ter uma proporção ideal de tecido para solução de colocação de modo que Oo aparelho de imobilização funcione de forma ideal. Em modalidades particularmente preferidas que se referem ao alginato, a proporção de tecido para solução pode estar entre 50 ge 100 g de tecido/L e, mais preferivelmente, 70 g de tecido/L.

Embora a presente invenção seja preferencialmente exemplificada usando cana de açúcar, gengibre e banana, |

U RMSANSNUNUA int Att ennnAntmmasaisehalat dia daatemióbiáheiaeslidos atlanta AAAtoadAta anda Arade Ma. 34/65 . será percebido que a invenção pode ser aplicada a qualquer ' planta, inclusive de plantas monocotiledôneas e plantas dicotiledôneas. Em certas modalidades preferidas, a invenção é particularmente direcionada aos membros da família Poaceae, inclusive de cana de açúcar, cereais, trigo, sorgo e milho, e outras plantas, tais como plantas de abacaxi, orquídeas, dendezeiros, tamareiras e Miscanthus sp.

Em outros aspectos gerais, a invenção refere-se à um sistema para a micropropagação de plantas em que um aparelho fragmenta um tecido de planta, e de preferência um tecido meristemático de planta que tenha sido submetido à inibição da dominância apical, seguido por revestimento do fragmento de planta. Em modalidades preferidas, o sistema inclui um aparelho de processamento de tecido de planta para produzir os fragmentos. O sistema pode também incluir um aparelho de produção de semente artificial para revestir o fragmento de planta em meio de revestimento de tecido de planta.

De preferência, o sistema é um sistema integrado.

De preferência, O sistema incluí o aparelho de processamento de tecido de planta 100 e/ou o aparelho de produção de semente de planta artificial 1.

De preferência, o sistema inclui um ou mais elementos selecionados a partir das características 3 até 6 da figura

37. O sistema pode ser semiautomático ou totalmente automatizado.

Para que a invenção possa ser prontamente compreendida e colocada em efeito prático, os seguintes exemplos não limitativos são fornecidos.

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| MMNAINNISAS ASAS idolo imnaatnánidiantntaárLALAANAANARNAAANALNRSARAAAAAAA at Ata Madi. | 35/65 ” EXEMPLOS Í Introdução A cana de açúcar é uma cultura principal da Austrália, gerando receitas de exportação de cerca de US$ 941 milhões por ano (Australian Bureau of Agricultural and Resource Economics 2009). Cana de comercial é propagada vegetativamente por cortes de talo chamados de biletes.

Na Austrália, cerca de 20% da cultura (cerca de 80.000 ha) é replantada a cada ano (Austalian Sugar Year Book 2008). Estima-se que cerca de 880 milhões plantinhas são necessárias anualmente para o replantio.

A produção de plantinhas livres de doença nessa escala é muito trabalhosa e utiliza 6 a 10 t/ha de talos trituráveis (no valor de aproximadamente $ 17 milhões/ano para toda a indústria) que, de outra forma, poderiam ser usados para à produção de açúcar.

Em um esforço para cumprir maior produtividade, um método de micropropagação automatizado mais eficiente para a produção em larga escala de material de plantio foi procurado.

No Brasil, a Syngenta desenvolveu um método de produção de segmentos de talos nodais de cana de açúcar de menos de quatro centímetros de comprimento - Plenc.

Estes são tratados com produtos de proteção às sementes €& de proteção às culturas proprietários para maximizar O desenvolvimento precoce da planta e o estabelecimento da cultura.

Alega-se que Plene permitirá que os produtores de cana de açúcar replantem seus campos com maior frequência, eliminando a degradação do rendimento típica da colheita e, deste modo, levando a um ganho de rendimento de até 15%. Isto também permitiria que OS produtores utilizassem equipamentos de plantio mais leve, o que economiza em |

RINS DNANRMNAOL tam st ntIRtAdAsAsdANARAA A Alt Matta. 36/65 “e custos de combustível. No entanto, as máquinas de plantio í ainda estão em desenvolvimento para este processo. sistemas baseados em cultura de tecidos rápido e eficiente para cana de açúcar comercial não são novos.

Lakshmaman et al. (2001) desenvolveu um rápido e eficiente método de regeneração in vitro utilizando um sistema de cultura em camada de células fina transversal, chamado SmartSetto, para a produção de grandes quantidades de cultivares para o plantio comercial na Austrália. As indústrias de cana de açúcar no Brasil, Cuba, Índia e EUA já utilizam a micropropagação para à produção de material de plantio para uso comercial. No entanto, o custo de mudas produzidas é muito maior do que o material derivado de bilete de, limitando a sua adoção pela indústria.

Em um esforço para reduzir o trabalho, muito esforço na automação da micropropagação de produtos de plantas derivados de embriões somáticos tem sido feito (Guiderdoni et al., 1995). Embora desenvolvida originalmente como um sistema de regeneração alternativo à cultura de meristema, a embriogênese somática alcançou proeminência como uma parte integrante do sistema de transformação genética (Bower e Birch, 1992). A embriogênese somática foi relatada a partir de um número grande de clones de cana de açúcar comercial (Guiderdoni et al., 1995;, Manickavasagam &e Ganapathi, 1998), e pode ser obtida diretamente (Manickavasagan e Ganapathi, 1998), ou indiretamente (Guiderdoni e Demarly, 1988), a partir do tecido foliar. Calos embriogênicos podem ser mantidos durante vários meses sem perder o seu potencial embriogênico até qualquer nível significativo (Fitch e Moore, 1993).

|

"=. A variabilidade genética foi frequentemente relatada í em cana de açúcar cultivada de tecido (Heinz e Mee, 1971; Lourens e Martin, 1987; Burner e Grisham, 1995; Taylor et al., 1995; Hoy et al., 2003). Estudos foram realizados para avaliar a extensão da variabilidade decorrente da regeneração in vitro e sua transmissão para gerações sucessivas através de propagação vegetativa (Lourens € Martin, 1987; Burner e Grisham, 1 95). Estas investigações demonstraram que variabilidade somaclonal substancial ocorreu em propágulos derivados in vitro, independentemente do método de regeneração.

No entanto, experimentos de campo extensivos demonstraram que as variações fenotípicas em cana de açúcar cultivada de tecido eram frequentemente temporárias como à maioria das variantes revertidas para O fenótipo de origem inicial nas culturas de rebento de cana de açúcar (Lourens e Martin (1987), Burner e Grisham

(1995), e Irvine et al. (1991)). A regeneração acidental para à micropropagação da cana de açúcar comercial foi investigada da mesma forma.

MNovaCaned é um processo de micropropagação pelo qual as plantas de cana de açúcar são multiplicadas in vitro, adaptadas às condições de plantio externas, plantadas no campo E, a seguir, vegetativamente propagadas.

Esta abordagem pode contribuir para a produção de material livre de doença certificado em taxas de multiplicação melhoradas.

Este protocolo de propagação in vitro, NovaCane6, produz com sucesso uma abundante fonte de plantas livres de patógenos que podem ser eficientemente adaptadas às condições de plantio externas.

A terceira e última fase do processo de propagação é avaliar a fidelidade clonal e o

| o desempenho da planta no campo.

í Outra abordagem, semelhante à NovaCane6, é para produzir material de plantio pela integração de sistemas de imersão —“temporária RITAG (TIS), uma micropropagação semiautomática com tecnologia SmartSettO (Mordocco et al., 2005). TIS foi usado com sucesso para propagar muitas culturas, incluindo cana de açúcar (Aitken-Christie e Jones, 1987; Lorenzo et al. 1998; Escalano et al. 1999; Etienne e Berthouly 2002; McAlister et al. 2005). A maioria dos estudos TIS reportado utilizaram a ponta do broto, botão de flor axilar, calos ou órgãos como nódulos, raízes e microtúberos como material de explante (Etienne e Berthouly 2002). Os sistemas TIS de cana de açúcar reportaram até o momento o uso de culturas derivadas de ponta de broto (Lorenzo et al. 2001; Rodriguez et al. 2003). Esta abordagem, embora seja bem sucedida e forneça clones autênticos deste tipo, não permite o aumento e escala suficiente e a utilização comercial.

Atualmente, os inventores descrevem o uso de clusters de microbrotos fragmentados e uma matriz de encapsulamento de alginato para desenvolver um sistema de produção de semente de planta artificial de cana de açúcar com alta eficiência de regeneração de planta. Os botões de flor axilares e/ou o tecido do ápice do broto é cultivado durante 4 semanas em meio MS semissólido contendo uma citocinina para produzir massas que se proliferam de microbrotos. Esses clusters são limpos de material foliar estranho e cortados em fragmentos de tecido de 3 mm e imobilizados. Cerca de 80% dos microbrotos imobilizados produziram plantinhas quando mantidos em um meio líquido MS |

| amil ANNN MNA UA RSA AMAUMAtaitnalAdNN AAA dsUmt AA RARA RSADA SAO NANA ARSAM AAA AAA 39/65 “e otimizado (Murasbige e Skoog). Além disso, as máquinas õ necessárias para produzir o tecido fragmentado e para encapsular o mesmo em sementes de planta artificiais foram desenvolvidas. Quando utilizado juntamente com os protocolos para tecido meristemático formado adventiciamente e os protocolos de semente de planta artificial desenvolvidos, uma abordagem de sistema completa para produzir plantinhas de cana de açúcar para propagação e liberação em escala comercial foi alcançada. EXEMPLO 1 Materiais e Métodos Gerais

1.1 Materiais de Planta Tecido de “talo” de cana de açúcar preso novos foram coletados debaixo do meristema apical. As variedades KQ228, Q190, 0208 e (0232 foram utilizadas em todos os experimentos.

1.2 Preparação dos topos dos brotos O topo de broto de plantas de cana de açúcar crescidas | no solo saudáveis, com de 3 a 8 meses de idade, é uma excelente fonte de explante para regeneração de plantas. A qualidade do material de planta (topos do broto) desempenha um papel significativo na determinação da frequência de regeneração. Os topos de brotos coletados de plantas estressadas (estresse hídrico, infecção por patógeno, canas velhas, etc.) não respondem bem na cultura. Além disso, evita-se coletar topos de broto durante a estação chuvosa para minimizar a contaminação da cultura.

1.3 Preparação de botões de flor axilares e meristema apical para a propagação de tecido Sob condições assépticas, botões de flor axilares e |

" pedaços de meristema apical foram cortados dos topos da S cana.

1.4 Meios e Condições de Cultura Formulação nutriente de Murashige e Skoog (MS) (Murashige e Skoog 1962) suplementada com 30 gL'* de sacarose. Para formar um meio sólido os meios foram Í suplementados com ágar grau Davis J3 (8 gL*). O meio basal foi enriquecido com uma citocinina esterilizada por filtração de 6-benzilaminopurina (BA) 4 uM para a preparação dos botões de flor axilares e meristema para a propagação de tecido. O pH de todos os meios foi ajustado até 5,7 t+ 0,1 antes da autoclavagem a 121 ºC e 101 KPa durante 20 min. Culturas líquidas foram agitadas continuamente em um agitador giratório a 120 rpm. Todas as culturas foram vedadas em uma WÚnica camada de fita Micropore”" da 3M e incubadas a 26 ºC t+ 2 ºC com um fotoperíodo de 16 h proporcionado pelo tubos fluorescentes brancos, com uma densidade de fluxo de fótons de 30 umol m” ? 8º ao nível da cultura. As culturas foram transferidas para meio fresco uma vez por semana, ou mais frequentemente se o meio ou o tecido ficou marrom devido à exsudação fenólica.

1.5 Processamento de tecido Clusters de microbroto foram removidos das placas de meio e colocados em placas de Petri estéreis (Figura 1). O tecido foi limpo do ágar em excesso e o crescimento da folha e o tecido marrom foram removidos usando um escalpelo e pinça esterilizados por chama (Figura 2). O tecido foi então colocado no aparelho de processamento de tecido de planta. Pedaços de tecido são cortados em formatos < 3 mm |

“ (Figura 3). Os fragmentos de tecido são coletados í assepticamente.

1.6 Preparação para Encapsulação de Fragmentos de Microbrotos Um dia antes do uso, 200 ml de alginato de sódio 3% p/v (manugel GMB) + xantana 1,0% p/v foi esterilizado, resfriado e colocado a 4 ºC de um dia para o outro.

1.7 Montagem do aparelho de produção de semente de planta artificial de escala laboratorial O aparelho de produção de semente de planta artificial de escala laboratorial foi montado na capela de fluxo laminar. Um agitador magnético estéril foi colocado na câmara 3 com 500 mL de solução de CaCl; 0,06 M estéril gelada. Este foi colocado sobre uma unidade agitadora. O topo da câmara inferior foi lubrificada levemente com graxa de silicone, e a câmara 2 foi colocada no topo. O grampo foi então firmemente apertado em ambas as peças. A vedação de vidro e a válvula de parada também foram levemente lubrificados e colocados sobre as aberturas menores na câmara do meio. A válvula de parada foi fechada. A câmara 1 foi levemente lubrificada na junção de conexão inferior e, em seguida, colocada dentro da câmara 2. Um filtro de 0,2 um estéril foi colocado no tubo ligado à junção do filtro.

1.8 Encapsulamento de fragmentos de microbroto Quatorze gramas de microbrotos de 4 semanas de idade fragmentados foram suspensos em 50 mL de alginato de sódio 3% p/v + xantana l1% p/v estéril, gelada. A mistura foi agitada para separar os fragmentos e, em seguida, combinada com 6 restante da mistura de 150 ml de alginato/xantana. A mistura foi vertida na câmara 1 do aparelho de encapsulação | o e a tampa foi colocada de volta e vedada. Há algum õ derramamento na câmara 2 até um vácuo interno ser criado. O agitador foi ligado (velocidade média) para criar um vórtice de aproximadamente 2 cm de altura. A válvula de parada foi a seguir aberta lentamente para permitir fluxo suficiente da mistura de fragmento de tecido através do orifício. Gotículas individuais da mistura pingam da câmara 1 dentro da câmara 2. A válvula de parada pode precisar ser adicionalmente liberada conforme a solução continua através disso. Quando a câmara 1 estava vazia, as sementes artificiais dentro da solução de CaCl, foram continuamente agitadas durante 30 minutos para endurecer. O aparelho é separado e o cloreto de cálcio é removido por decantação a partir das sementes artificiais. As sementes de plantas artificiais foram então lavadas duas vezes com água DI estéril (500 mL) e deixadas na água DI até que as vazias e mal formadas fossem removidas e selecionadas.

1.9 Crescimento de sementes de planta artificial em cultura líquida Trinta e seis sementes de planta artificial (aproximadamente 15 mL) foram colocadas em um frasco erlenmeyer de 250 mL estéril com 85 ml de líquido MS estéril com 30 gL”* de sacarose. Os frascos foram colocados nas bandejas agitadoras giratórias a 120 rpm, a 27 ºC +11 ºC, e um fotoperíodo de 16 h foi fornecido por tubos fluorescentes brancos frios durante 2 a 3 semanas. O meio foi removido por decantação e substituído a cada 3 a 4 dias. EXEMPLO 2 Influência da adição de hormônio na regeneração de |

"a planta KQ228

: Um meio líquido simples contendo sais de MS provou ser suficiente para a germinação é o crescimento de plantinhas de sementes de planta artificial de KQ0228. Neste meio, as sementes de planta artificial germinaram e produziram plantinhas normais em 3 semanas (Figura 5). As sementes mudaram de uma conta de gel transparente para uma cor castanho-preta nos primeiros poucos dias de serem colocadas em cultura líquida.

Dentro de 7 a 10 dias há a produção de broto a partir das sementes e dentro de duas semanas, os ' brotos estão se alongando e a produção de raízes fora da semente de planta artificial começa.

Dentro de 3 semanas a plantinha tinha se desenvolvido totalmente, com extensa produção de broto e raiz fora do gel.

Espera-se variações na taxa de emergência das plantinhas com diferentes genótipos (Figura 6 e Figura 7). Condições de crescimento típicas para a cultura líquida são de 120 rpm e 27 ºC com um fotoperíodo de 16 horas, Em geral, as plantinhas produzidas com reguladores de crescimento tiveram o crescimento impedido se os níveis hormonais foram de 1 pM em comparação com aqueles obtidos a partir do meio MS isento de regulador de crescimento.

Como tal, MS é tipicamente utilizado para o meio de cultura líquido.

A regeneração de sementes de plantas artificial em plantinhas a uma taxa de 70 a 90% é alcançável.

A adição de um hormônio mostra regeneração aumentada de sementes de planta artificiais tanto para Q208 quanto para K0228. O sistema de semente de planta artificial requer um período de 2 semanas em cultura líquida para germinar a semente, estabelecer raízes e se desenvolver em uma plantinha

|

Ta (Figura 8). Este período de crescimento ocorre em cultura de frasco ou em biorreatores. EXEMPLO 3 Adaptação do protocolo de semente de planta artificial às diferentes variedades KQ228, Q0232, Q190 e Q208; e o efeito sobre a regeneração.

o sistema de sementes de planta artificial desenvolvido —“para KQ228 foi adaptado — para outros cultivares. Este é um dos pontos fortes desta técnica, pelo fato de que ela pode funcionar com diferentes variedades de cana de açúcar. A diferença entre as variedades é observada apenas no tempo de subcultivo. Algumas variedades requerem um tempo de pré-cultura mais longo em ágar antes da Í encapsulação. Houve uma diferença significativa entre a taxa de regeneração da plantas de variedades quando todas as variedades tinham períodos de pré-cultura idênticos, embora isto seja esperado pois a regeneração é dependente de genótipo (Figura 9). Para minimizar à diminuição na regeneração de outras variedades, 1 ou 2 semanas de cultura adicionais em ágar foram incluídos para aumentar a idade do botão de flor e tecido meristemático utilizado para à produção de semente de planta artificial.

EXEMPLO 4 Aparelho de escala laboratorial para a produção de semente de planta artificial Um sistema para encapsulação de tecido foi concebido e construído (Figuras 4 e 10). A máquina tem 2 câmaras e requer um mecanismo agitador no fundo. A câmara inferior contém a solução de cloreto de cálcio (e uma barra de agitação). A câmara superior contém a mistura de alginato e |

= xantana com o tecido de microbroto fragmentado de 4 semanas ' de idade.

Por liberação lenta da válvula de liberação de vácuo no topo da câmara inferior, gotículas de alginato e tecido descem através de um orifício de 9 mm na parte inferior da câmara superior para dentro da câmara inferior.

Quando os dois líquidos se misturam, as gotículas se assentam em uma pérola de gel (em formato de bola) contendo o fragmento de tecido.

Isto também é conhecido como uma semente de planta artificial.

As sementes de planta artificial permanecem na câmara inferior agitando durante 30 minutos.

Elas são removidas por decantação e são rinsadas duas vezes em água deionizada estéril e transferidas para meio líquido para germinação.

A inovação deste conceito é primariamente na área da eficiência.

Muitas sementes de plantas artificiais podem ser feitas em um curto período de tempo.

A maioria das invenções de semente de planta artificial baseiam-se em um operador que recolhe embriões individuais de pedaços de tecido e os coloca na solução de gelificação.

Este fragmento coberto por solução é a seguir gotejado com a mão ou pipeta na solução de colocação.

Este é um processo longo e árduo.

Embora esta máquina seja apenas para quantidades de escala laboratorial, o conceito foi provado e facilmente demonstra que a produção de semente de planta artificial pode ser realizada de forma eficiente.

O método de encapsulamento incorpora uma solução de alginato de sódio de 3 a 4% p/v + xantana de 1 à 1,5% p/v.

Quando a mistura de alginato entra em contato com a solução de CaCl,; 0,06 M estéril gelada, a solução de alginato começa à endurecer

(Figuras 4 e 10). |

- RNMNIRANNNAANnMSA RANA Aa AAA MA. 46/65 o. A determinação da concentração de alginato de sódio e % xantana foi crítica para desenvolver o sistema de encapsulamento usando microbrotos fragmentados derivados de : botões de flor axilares e tecido de ápice de broto. A densidade do tecido da planta foi maior e, assim, o tecido afundou durante o encapsulamento e bloqueios ocorreram. A quantidade de alginato de sódio e xantana foi ajustada para 3% p/v de alginato de sódio + 1% p/v de xantana (por 7 g de tecido). Isso produziu cerca de 375 sementes de planta artificial/100 mL de solução. Disto cerca de 80% era utilizável e aumentos adicionais para este número são esperados com a utilização dos aparelhos de processamento de tecido de planta é os aparelhos de produção de semente de planta artificial de escala piloto.

A proporção de tecido para solução de alginato também foi testada com 70 g de tecido/L. Esta proporção é importante uma vez ela não causa bloqueios no aparelho de encapsulação atualmente desenvolvido é há um maior número de sementes de planta artificial produzidas com o menor número de sementes de planta artificial vazias (Figura 11).

EXEMPLO 5 Influência do tipo de tecido na germinação de sementes de planta artificiais As sementes de planta artificial são de aproximadamente 9 a 10 mm em tamanho e são de um formato oval-esférico (Figura 13). O tamanho de semente ótimo é determinado por duas variáveis: o tamanho do fragmento de tecido mínimo necessário para o crescimento na condição de cultura atual e as mecânicas do aparelho de produção de semente de planta artificial em escala laboratorial.

|

"e Experimentos com fatias de fragmentos de 2, 3 e 4 mm % demonstraram que os fragmentos de 3 mm são os melhores para a regeneração de planta e os mais fáceis de cortar com as mãos (antes do desenvolvimento do aparelho de processamento de tecido). Os fragmentos de dois milímetros também foram eficazes para a regeneração, mas foi difícil cortar o tecido com precisão em intervalos de 2 mm sem danificar o tecido (Figura 14). Outras melhorias no corte de tecido podem permitir a utilização mais eficiente da dimensão do tecido sem qualquer perda de eficiência de regeneração. « O aparelho de produção de semente de planta de escala i laboratorial é outro determinante do tamanho da semente. 4 Uma vez que o aparelho baseia-se em um vácuo para liberar a mistura de alginato/tecido no cloreto de cálcio e que não existe mecanismo de agitação na câmara superior para manter a mistura de tecido e alginato homogênea, o tamanho do orifício da câmara superior de onde a solução de revestimento de tecido de planta e fragmentos caem teve de ser otimizado para alcançar uma produção regular e | eficiente de sementes de planta artificial úteis. | EXEMPLO 6 | Aparelho de processamento de tecido vegetal para a i fragmentação de tecidos para a produção de sementes de planta artificial.

Um cortador em cubos de tecido de cana de açúcar de escala laboratorial capaz de produzir fragmentos de tecido de cana de açúcar para encapsulamento em uma matriz de alginato foi produzido.

Os testes preliminares desta máquina se mostraram bem sucedidos com fragmentos de tamanho aproximadamente iguais produzidos. | e A máquina é capaz de cortar tecido de planta sem : causar muitos danos e o tecido se regenera nas plantas.

Os testes para o processamento asséptico de tecido na máquina utilizando procedimentos laboratoriais padrão foram realizados com sucesso.

Isto incluiu a autoclavagem das partes antes da utilização, uma vez que a produção de tecido estéril é crítica, uma vez que isto irá determinar as naturezas práticas operacionais desta máquina para à produção de planta em massa.

Os testes com materiais autoclavados e sprays com etanol à 70% foram bem sucedidos x e a contaminação dos tecidos não ocorreu.

Esta máquina mostrou que é possível desenvolver um sistema de escala ú comercial capaz de fragmentar material de planta para a produção de semente de planta artificial.

EXEMPLO 7 Testes de Campo O desempenho de campo de várias culturas (SS: culturas estabelecidas com plantas produzidas a partir de tecido de folha (Patente AU 2001252043)), culturas micropropagadas convencionais (MP; culturas estabelecidas com plantas produzidas a partir de botões de flor axilares por micropropagação tradicional) e culturas de semente de planta artificiais (AS; culturas estabelecidas com plantas produzidas a partir de sementes de planta artifícial a partir de clusters de microbroto) foi comparado com culturas propagadas de tolete de uma gema (OE; culturas estabelecidas com plantas produzidas a partir de cortes do talo de tolete de uma gema a partir de plantas cultivadas no campo propagadas de forma convencional), sob condições de produção comercial em dois locais (Burdekln e Mackay). |

: C Os ensaios de campo para plantinhas provenientes de : sementes de planta artificial se mostraram bem sucedidos. ' Sementes de planta artificial foram produzidas e transferidas para uma sementeira antes do plantio no campo.

Isto permitiu que as plantinhas que emergiram se aclimatassem e estabelecessem um sistema mais forte de raiz ' antes do plantio no campo.

As culturas estabelecidas com plantinhas produzidas a partir de sementes artificiais (cultura AS) foram comparadas com as culturas SS, MP e OF.

A cultura de semente artificial (AS) apresentou desempenho à semelhante às outras em relação a todos os parâmetros de rendimento avaliados.

Por exemplo, não houve diferença $ significativa na cana de açúcar e no rendimeénto de açúcar entre os tratamentos (Tabela 1). Uma tendência semelhante no desempenho da cultura foi evidente em Mackay da mesma forma, mas os testes apresentaram grande variação espacial.

EXEMPLO 8 Sistema —“Integrado para a Produção de Sementes Artificiais de Cana de Açúcar Antecedentes O objetivo principal deste trabalho é desenvolver e implementar tecnologias de propagação rápidas in vitro para a adoção acelerada de novas variedades de cana de açúcar desenvolvidas de modo convencional, bem como geneticamente | 25 modificadas.

A tecnologia de propagação in vitro, comumente referida como micropropagação, é à biotecnologia de planta mais amplamente empregada e é utilizada para a produção em larga escala de plantas de horticultura, floricultura e silvicultura de alto valor em todo o mundo.

Isto é principalmente feito pela propagação do meristema de broto o | “e (um tecido preexistente organogenicamente competente : ' localizado no ápice do broto e nas axilas do caule e capaz | de se diferenciar/desenvolver em uma planta completa em um ambiente permissivo) e desenvolvimento disto em plantinhas. Este é um processo intensivo muito trabalhoso, mas uma mudança de patamar na produtividade do processo de propagação nessas culturas onde é empregado. A maior vantagem da micropropagação convencional baseada em meristema de broto é à sua capacidade de produzir propágulos clonais (autênticos deste tipo) mais do que : qualquer outras tecnologias de propagação in vitro (culturas de calos, cultura de células, cultura de 7 protoplastos, organogênese direta, embriogênese somática, etc.). A micropropagação é amplamente praticada em países de baixo custo. Esta tecnologia de micropropagação convencional é também aplicada para a propagação de cana de açúcar em muitos países (por exemplo, Tailândia, China, Índia, Brasil e Indonésia). Atualmente, o alto custo e a mão-de-obra são limitantes de sua aplicação em países desenvolvidos como a Austrália. Propagação de cana de açúcar comercial tradicional Existem dois métodos principais para a propagação de cana de açúcar comercial:

1. Plantio de talo: como o nome sugere, uma nova cultura é suscitada pelo plantio de cortes de caule de comprimento longo produzidos a partir do talo inteiro logo antes do plantio.

2. Plantio de bilete: biletes são segmentos menores produzidos por corte do talo inteiro em pedaços com dois nós intactos. |

” Ambos os métodos são populares na Austrália e em % muitos outros países. Cerca de 770 milhões de mudas são necessárias para atender à demanda de material de plantio anual por ano. Para atender até mesmo uma fração dessa demanda é necessário um sístema de propagação rápido altamente eficiente e de baixo custo. A fim de alcançar estes resultados um sistema de semente artificial foi desenvolvido. Desenvolvimento do sistema de semente artificial de cana de açúcar . Quais são as especificações para o sistema de semente artificial de cana de açúcar? 7 1) Propágulos tipo semente plantáveis de forma direta 2) aAutênticos com tolerância muito baixa a tipos diferentes do cultivar original 3) Tecnologia com alta eficiência/produtividade 4) Independência de Genótipo 5) Oportunidade para automatizar todas ou a maior parte das etapas envolvidas 6) Tecnologia Escalável 7) Efetividade de Custo 8) Capacidade de produção fora da estação, armazenamento e transporte de propágulos 9) Tecnologia transferível para outras culturas Conceitos e abordagens tecnológicas envolvidas

1. Jardinagem de tecido e produção de propágulos autênticos deste tipo. Para produzir propágulos geneticamente uniformes brotos e meristemas axilares (da ponta do broto e botões de flor axilares, respectivamente) |

| MERENDA SL ta aantnt esta sttdA A nad Aa ADAaaLdianttdalmháltaiaia atdnttialdamdalahhdidaiiaai Ltda ALLA casca ata AA Ala lalala. 52/65 : .” foram utilizados como material de partida. O primeiro : desfio técnico foi a produção de grandes quantidades de tecido meristemático organogenicamente competente (jardinagem de tecido) para produção de semente artificial (Tabela 1). Através de experimentação um processo para a cultura e proliferação in vitro de meristema sem diferenciação em brotos ou plantinhas foi desenvolvido (Figura 21). Isto é alcançado pela quebra da dominância apical do meristema da ponta do broto, permitindo que os axilares se a proliferem. Teoricamente, a proliferação de tecido pode ser continuada indefinidamente contanto que o tecido permaneça ] meristemático. Nós rotineiramente mantemos o tecido meristemático durante 6 meses para a produção de sementes artificiais. A inovação chave neste ponto é a capacidade para produzir e manter o tecido meristemático da cana de açúcar capaz de se regenerar em brotos ou plantinhas por períodos prolongados em condições de cultura definidas.

2. Maximização da produtividade de jardinagem de tecido. Um fator determinante da produtividade da tecnologia de semente artificial é a sua capacidade para produzir o número máximo de plantas a partir de uma quantidade mínima de tecido. Isto pode ser conseguido por cultivo do tecido meristemático em proliferação em uma condição de cultura que permite à regeneração de planta (Figura 22). No entanto, outro requisito chave é fazer com que o produto final, “semente artificial de cana de açúcar” seja o menor possível para todos os efeitos práticos. Esses dois requisitos sugerem que as plantas precisam ser regeneradas a partir da menor quantidade possível de tecido |

: , . meristemático o mais rápido possível. Para concretizar ' estes objetivos foi desenvolvido um sistema de cultura que pode produzir plantas a partir de fragmentos de tecido meristemático tão pequenos como 2 mm (Figura 23). O tamanho mínimo do fragmento de tecido com produtividade máxima foi verificado como sendo 3 mm (Figura 23).

Para maximizar ainda mais a produtividade do sistema, experímentos foram realizados para identificar a parte mais regenerativa da massa de tecido —“meristemático em proliferante (Figura 24). Fragmentos tanto de 3 mm quanto . de 2 mm foram preparados a partir da camada exterior do tecido e o restante do tecido do núcleo interior. Estes 7 dois tipos de tecidos foram comparados com fragmentos do verticilo de folha de 3 mm para a produção de semente artificialáà e subsequente regeneração da planta. Os resultados sugerem que a camada exterior é mais produtiva do que o núcleo interno com fragmentos do verticilo da folha sendo os menos regenerativos.

A inovação nesta etapa é que esta forma de produção de plantas de cana de açúcar não foi demonstrada anteriormente. Além disso, a produção bem sucedida de plantas em frequência elevada (80 a 90%) diretamente a partir de pequenos fragmentos, sem calos intervenientes ou produção de embriões somáticos forma um avanço tecnológico chave para o desenvolvimento de um sistema de produção de semente artificial comercialmente viável. A produção de fragmento de tecido neste estágio foi feita manualmente, tornando todo o processo intensivamente trabalhoso.

3. Conversão de fragmentos de tecido em uma estrutura tipo semente capaz de germinar em plantinha: |

É LARES RE ALAAL nb sad LA 54/65 7 .. .. O desafio seguinte foi determinar se fragmentos de . tecido podem ser feitos em uma estrutura tipo semente de modo funcional (sementes artificiais). Isto necessitou do encapsulamento de fragmentos em uma matriz biologicamente compatível que conduz umidade, nutrientes, hormônios de crescimento, pesticidas, etc. permitir que a semente germine e estabeleça a plantinha no solo. Um substrato apropriado para o encapsulamento de fragmentos e um método para a encapsulação foram estabelecidos. O conceito de sementes artificiais não é novo e foi demonstrado , experimentalmente em muitas espécies. No entanto, a utilização de meristemas de cana de açúcar fragmentados 7 para aumentar a produtividade do sistema de semente artificial e o desenvolvimento de um substrato adequado (combinação de alginato de sódio e goma xantana) são novos. A adição de goma xantana foi necessária para atingir a viscosidade do gel necessária para ajustar a produção de sementes com fragmentos individuais (Figura 25). Com a matriz de encapsulação alginato-xantana otimizada, a regeneração da planta da matriz a partir de sementes artificiais aumentou até 85%. As sementes artificiais germinaram bem (Figura 26A) e produziram plantas normais em ensaios de estufa (Figura 26B). Cerca de 80% das sementes artificiais semeadas em solo germinaram e se desenvolveram em plantinhas (Figura 27).

4. Desenvolvimento de um aparelho de imobilização de escala de bancada para a produção rápida de sementes artificiais de cana de açúcar: Um sistema para a imobilização de tecido foi concebido e construído (Figura 28B). Esta máquina é para trabalho em |

- MURRNRNRRIRRRNESURIA RNA Adao ntats) AAA datada Anta rat ntaA AAA MAMMA AtALnAANA Rai Aa alt tha niaba ata aatda di tmb sd dal dobras ata drama inata alinea 55/65 7 | . laboratório de escala de bancada e foi utilizado com * . sucesso para a produção de sementes artificiais.

A máquina tem 2 câmaras e requer um mecanismo agitador na parte inferior.

A câmara inferior contém a solução de cloreto de cálcio (e uma barra de agitação). A câmara superior contém o alginato e a mistura de xantana com fragmentos de tecido 7 (Figura 28A). Por liberação lenta da válvula de liberação de vácuo no topo da câmara inferior, gotículas de alginato e tecido descem através de um orifício de 9 mm na parte inferior da câmara superior para dentro da câmara inferior. : Quando os dois líquidos se misturam, as gotículas se assentam em uma pérola (em formato de bola) contendo 7 fragmento de tecido.

As pérolas (sementes artificiais; Figura 28C) permanecem na câmara inferior agitando durante 30 minutos.

Elas são removidas por decantação e rinsadas duas vezes em água deionizada estéril e transferidas para meio líquido para germinação.

O método de imobilização incorpora uma solução de alginato de sódio 3% p/v + xantana 1% p/v.

Quando à mistura de alginato-tecido entra em contato com a solução de CaCl, 0,06 M estéril gelada, a solução de alginato começa a endurecer e a semente artificial é formada.

Esta tecnologia é bem estabelecida.

A determinação da concentração de alginato e xantana foi crítica para o desenvolvimento do sistema de imobilização utilizando fragmentos de tecido derivados de botões de flor axilares e tecido do ápice do broto.

A densidade do tecido de planta foi maior do que a solução de alginato e o tecido afundou durante a imobilização sem a formação de pérolas adequada.

Alginato de sódio 3% p/v e |

. xantana 1% p/v foram considerados ótimos para à formação de DE pérolas. Isto produziu aproximadamente 375 pérolas/100 mL de solução e quase 80% destas germinaram em plantinhas (Figura 27). A proporção de tecido para solução de alginato foi também testada com 70 g de tecido/L sendo o melhor para o aparelho de imobilização atualmente em uso (sem bloqueios) e o número mais alto de pérolas produzidas com o menor número de pérolas vazias (Figura 29).

5. Determinação do tamanho ótimo da semente artificial: . O tamanho de semente ideal é determinado por duas variáveis críticas: o tamanho do fragmento de tecido mínimo 7 necessário para o crescimento na condição de cultura atual e as mecânicas da máquina de imobilização em escala de bancada. Experiências com diferentes tamanhos de fragmentos mostraram que o fragmento de 3 mm é o melhor para a regeneração de planta e o mais fácil para cortar com às Í mãos (antes do desenvolvimento da máquina de processamento | de tecido) (Figura 24). Fragmentos de dois milímetros foram também eficazes para a regeneração, porém foi difícil cortar com precisão o tecido em intervalos de 2 mm sem danificar o tecido, O aparelho de imobilização (Figura 28B) é o outro determinante do tamanho da semente. Uma vez que o sistema que estamos utilizando baseia-se em um vácuo para liberar a mistura de alginato/tecido na solução de cloreto de cálcio e que não existe mecanismo agitador na câmara superior para manter a mistura de tecido e alginato homogênea, o tamanho do orifício da câmara superior de onde a solução de pérola cai teve de ser otimizado para atingir uma produção regular |

| IRINA RSALSR LAURA GA ea ALIADAS nim Aa Als ma) ata adiada ias io tn cota dido actas duda Lad dit sssiotas lisina listrada Lsiniaa aaa 57/65 . e eficiente das sementes artificiais úteis (Figura 30A). As o pérolas são de aproximadamente 9 a 10 mm de tamanho e apresentam um formato oval-esférico (Figura 30B).

6. Automação da fragmentação de tecido: máquina de processamento de tecido (TPM): Como mencionado anteriormente, a fragmentação de tecido é um processo intensamente trabalhoso e sem automação desta etapa esta tecnologia nunca se tornará comercial. Assim, uma parte crucial em alcançar um resultado comercial para este trabalho foi o , desenvolvimento de uma máquina capaz de cortar o tecido com as especificações necessárias. Uma máquina de processamento 7 de tecido de cana de açúcar de topo de bancada capaz de produzir fragmentos de tamanho aproximadamente igual do tecidos de cana de açúcar para imobilização em pérolas de alginato foi desenvolvido e testado/utilizado com sucesso (Figuras 31, 32).

7. Aplicação do sistema de produção de semente artificial em múltiplas variedades de cana de açúcar: O sistema de semente artificial desenvolvido para K9228 foi adaptado a outros cultivares atuais, Houve diferenças significativas na taxa de germinação entre as variedades diferentes (Figura 33). A maior parte das sementes artificiais de cana de açúcar produziu um sistema tanto de broto quanto de raiz simultaneamente quando cultivadas in vitro em meio MS líquido sem quaisquer hormônios de crescimento (Figura 33). Uma vez que as sementes artificiais foram capazes de produzir o sistema tanto de broto quanto de raiz simultaneamente quando semeadas em solo, eles germinaram e se desenvolveram em |

DAE RSS SSD 58/65 . plantinhas.

No entanto, um número significativo de sementes o artificiais se desenvolveram em broto com enraizamento retardado.

As sementes artificiais com formação de raiz atrasada tendem à morrer no solo e, para melhorar esta situação, a conversão de sementes artificiais diretamente em plantas foi tentada em cultura.

O cultivo de sementes artificiais de cana de açúcar em meio MS suplementado com pequenas quantidades de ácido auxina-indol-3-butírico (IBA) ou ácido a-naftalenacético (NAA), melhorou à conversão de sementes em plantinhas (Figura 34). Isto é em grande parte . devido à melhoria induzida por auxina no enraizamento.

EXEMPLO 9 7 Avaliação de campo das sementes artificiais Os ensaios de campo das safras em escala comercial estabelecidas a partir de sementes artificiais das duas variedades comerciais australianas mais populares, 0208 e K90228, foram realizados.

Neste ensaio, culturas derivadas de semente artificial de teste foram comparadas com culturas convencionalmente propagadas, micropropagadas (por tecnologia in vitro convencional) e derivadas de SmartSettG.

Os resultados indicam que a propagação da cana de açúcar por tecnologia de semente artificial não teve impacto na cana de açúcar e no rendimento de açúcar (Tabela 3), e no teor de fibra e ccs (Tabela 4), EXEMPLO 10 Adaptação da tecnologia de semente artificial de cana | de açúcar para outras culturas: Banana e gengibre Aqui, Os inventores testaram a aplicação de tecnologia de semente artificial de cana de açúcar no gengibre e banana, duas culturas de monocotiledôneas.

Os resultados |

. mostram que o método de semente artificial de cana de o açúcar, como utilizado no Exemplo 8, pode ser utilizado para propagar bananas e gengibre (Figura 35 e 36). A frequência de conversão de sementes artificiais em plantinhas em banana foi baixa em comparação com o gengibre. Isto não é surpreendente, considerando que as condições de cultura otimizadas para a cana de açúcar foram utilizadas para essas duas culturas. Com a otimização adicional a eficiência deste sistema poderia ser melhorada nestas culturas da mesma forma.

. Como observado na cana de açúcar, nenhuma diferença significativa na regeneração de planta entre os fragmentos , meristemáticos e as sementes artificiais foi registada em ambas as culturas.

Ao longo de todo o relatório descritivo, o objetivo foi descrever as modalidades preferidas da invenção sem limitar a invenção à qualquer modalidade ou conjunto específico de características. Será portanto, percebido pelas pessoas versadas na técnica que, à luz da presente divulgação, várias modificações e alterações podem ser feitas nas modalidades particulares exemplificadas sem se afastar do escopo da presente invenção. | Todos os programas de computador, algoritmos, patentes e literatura específica aqui referidos são aqui incorporados por referência,

TABELAS Tabela 1: Produção de tecido regenerativo viável a partir do verticilos de folha de cana de açúcar ou ponta do broto para preparação de sementes artificiais. A variedade comercial KQ0228 foi usada para este experimento. |

AMANRNAMAAAAMAMAAAAMARAARIADA ERRAR AAA IARA AAA AAA AAA tita AMMMÁhARMMMAAAAA ANS, 60/65 . Método de |Explante | condições |Tratamen- | Duração — | Número Número de o propaga- de to em | da médio de | sementes ção cultura — | RITA cultura — | plantas |artifi- pré-RITA em —RITA|produzi- |ciais (semana) | das produzi- das Sistema — |vertici- los 1 minuto 11 brotos | nº de los — da|vertici- | de por imersão — | folha los — da] imersão verticilo temporá- folha de tecido de folha . rio RITA foram em meio desenvol- | MS a cada ' vidas em|48h B4NIO 1 minuto 21 brotos | Na sólido no | de por escuro imersão verticilo durante 2|de tecido de folha semanas, lem meio a seguir|Ms transfe- | contendo ridos 6 para benzila- meio' MS| denina durante 1 |0,88 uM a semana cada 48 h sob fotope- ríodo de 16 h |

— MNÓMMINANRASAA AAA AAAAaCk La RMANALRA RARA AA dt tha fit ai bata Anti AAA LARA AAA Ani AAA 61/65 ' de los da | 10s da | de por o imersão folha folha imersão a vertici-

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dos em meio durante 2 |MS semanas em B4NIO no escuro, a seguir transfe- ridos para Ns durante 1 semana, 16 h de luz, 8 Rh de escuro

Ponta do|Ponta do|FPontas de| Fragmen- 63 78/ponta broto? broto ou|broto ou|tos de brotos/ de broto

|

AAA AAAAAANLMOURAMRAUIAARA dat AAA SAIA ASAS rrtatAAAAANAANNAARAAAMARAEMAAAAE ns nissan ta 62/65 . botão de|botões de|tecido de ponta de o flor flor 3 mm broto axilar axilares | revesti- (usando foram dos em sementes iniciados | alginato artifi- em —meio|3% + ciais) B4 sólido | Kelzan e 1,5% cultivado | cultiva- durante 4 | dos em - semanas. meio MS O tecido| líquido ' desenvol- | em um vido agitador, durante fotope- aquele ríodo de período é | 16 h coletado e cortado em fragmen- tos de 3 mm para a produção de semente artifi- cial * Verticilos de folha cultivados foram cortados em fragmentos de 3mm.

Os fragmentos de 3 verticilos foram |

. utilizados para cada unidade RITA. o ? 1,63 q de tecido produzido por ponta de broto ? Meio de Murashige e Skoog º B4N10 - Meio MS suplementado com 6-benzilaminopurina 4uMe ácido naftalenacético 10 uM ? Meio B4 - MS suplementado com 6-benzilaminopurina 4 uM NA = não aplicável Tabela 2. Identificação da matriz de encapsulamento mais apropriada para o desenvolvimento de semente : artificial *Testes iniciais usando alginato 4% p/v com um polímero de xantana foram realizados usando o sistema de ] fragmento de tecido de folha SmartSettO.

Com a alteração para broto e tecido meristemático axilar posterior, a concentração de alginato foi reduzida até 3% p/v para desempenho ótimo (referência à Figura 25, da mesma forma). Alginato de | Xantana (% | Vazão Bloqueios Suspensão — de sódio* (tp/v) | p/v) tecido ótima Pp/v p/y Alginato — 4% |Keltrol 0,5% | Muito rápida Não p/v p/v Alginato — 4% |Kelzan — 0,5% | Constante Não Não p/v p/v Alginato — 4% |Kelzan 1,0% | Constante Raramente sim p/y p/v Alginato — 4% |Kelzan — 1,5% | Muito espessa | Sim Sim p/v p/v Tabela 3 Cana de açúcar e Rendimento de açúcar da |

. cultura derivada de semente artificial. os dados o apresentados são da cultura de planta (cultura do primeiro ano). TCH = tonelada de cana de açúcar/ha; TSH = toneladas de açúcar/ha; AS, SS, MP e OES são culturas estabelecidas com material de plantio produzido por sementes artificiais, SmartSett6, micropropagação convencional e tolete de uma gema, respectivamente, de uma cultura convencionalmente propagada.

Caracte- Clone Tratamentos Fator Lsd (5%) rística E be E e | m | | | TCH K0228 115 120 123 121 Trata- xs ' | mento Podes Db de he | | | ee do e e | Lo ass dus fo fa o | | | TSH Ko228 17,8 18,8 19,1 19,0 Trata- |Ns mento en [O Ea bo bo | 1 | dee E dass das bos | | | [o les [asa fz bei fe | | | Tabela 4. Cana de açúcar comercial (ccs) e teor de fibra da cultura derivada de semente artificial.

Os dados apresentados são de Cultura de Planta (cultura do primeiro ano). AS, SS, MP e OES são as culturas estabelecidas com material de plantio produzido por sementes artificiais, SmartSett6, micropropagação convencional e tolete de uma gema, respectivamente, a partir de uma safra convencionalmente propagada. |

É DOMMNMMRMNArrSrDArAAAAA AA AAA AAMAAAAA NANA AAA AAA AM AA Att AAA Arara AA AmAAAA AAA MAMMA Add aaa datado 65/65 Es PD | DE e e e | | | ces KQ0228 15,4 15,8 15,6 15,8 Trata- NS mento es | fo bas bo | | | des [O Te [me mo | | | fee Bus [ae fe e PE Fibra K9228 14,6 15,0 14,7 14,2 Trata- NS (8) mento ode [| fee fee ee | | | |

Claims (33)

REIVINDICAÇÕES

1. Método de preparação de um fragmento de tecido meristemático da planta para utilização como uma semente na micropropagação de planta, o dito método sendo CARACTERIZADO pelo fato de incluir as etapas de: (1) inibir a dominância apical de um tecido meristemático da planta; (ii) proliferar o tecido meristemático da planta; e (iii) fragmentar o tecido meristemático da planta resultante da etapa (ii) para preparar o fragmento de tecido meristemático da planta para utilização como uma semente na micropropagação de planta.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende a regeneração de uma planta ou de um tecido da planta a partir do fragmento de tecido meristemático da planta.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as etapas (i) e/ou (ii) incluem ainda o cultivo do tecido meristemático da planta mantendo simultaneamente a inibição da dominância apical.

4, Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que oO tecido meristemático da planta é cultivado antes da inibição da dominância apical.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido meristemático da planta é cultivado entre até 1 semana e até 12 meses.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a inibição da dominância apical é por meio de tratamento selecionada do grupo que consiste em tratamento físico, tratamento — químico, tratamento “bioquímico e impacto ambiental do tecido meristemático da planta.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a inibição da dominância apical é por meio de tratamento físico.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento físico é o corte do tecido meristemático da planta.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido meristemático da planta é cortado ao longo de um eixo longitudinal.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que oO tecido meristemático da planta é derivado do ápice do broto ou do meristema axilar.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido meristemático da planta é de uma planta monocotiledônea.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a planta monocotiledônea é cana de açúcar.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a planta monocotiledônea é banana.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de tecido meristemático da planta tem um tamanho

: médio dentre cerca de 0,5 mm e cerca de 20 mm.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (iii) é pelo menos parcialmente automatizada.

16. Método de produção de uma semente de planta artificial, o dito método sendo CARACTERIZADO pelo fato de incluir as etapas de: (1) inibição da dominância apical de um tecido meristemático da planta; (ii) proliferação do tecido meristemático; (iii) fragmentação do tecido meristemático da planta resultante da etapa (ii), para desse modo produzir um fragmento de tecido meristemático da planta; e (iv) revestimento do fragmento de tecido meristemático da planta com um meio de revestimento de tecido da planta para assim produzir a semente de planta artifícial.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que as etapas (i) e/ou (ii) incluem ainda o cultivo do tecido meristemático da planta mantendo simultaneamente a inibição da dominância apical.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido meristemático da planta é cultivado antes da inibição da dominância apical.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a inibição da dominância apical é por meio do tratamento selecionado a partir do grupo que consiste em tratamento físico, tratamento químico, tratamento bioquímico e impacto ambiental do tecido meristemático da planta.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19,

CARACTERIZADO pelo fato de que a inibição da dominância apical é por meio de tratamento físico.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento físico é o corte do tecido meristemático da planta.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido meristemático da planta é cortado ao longo de um eixo longitudinal.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido meristemático da planta é derivado do ápice de broto ou do meristema axilar.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o tecido meristemático da planta é de uma planta monocotiledônea.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a planta monocotiledônea é cana de açúcar.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a planta monocotiledônea é banana.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de tecido meristemático da planta tem um tamanho médio dentre cerca de 0,5 mm e cerca de 20 mm.

28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de revestimento de tecido da planta compreende alginato e xantana.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que as etapas (iii) e/ou (iv) são pelo menos parcialmente automatizadas.

30. Sistema para micropropagação de planta, o dito sistema sendo CARACTERIZADO pelo fato de incluir um dispositivo para fragmentação de um tecido meristemático da planta com dominância apical inibida para produzir um fragmento de tecido meristemático da planta e regenerar uma planta ou um tecido da planta a partir do fragmento de tecido meristemático da planta ou revestir o fragmento de tecido meristemático da planta com um meio de revestimento de tecido da planta.

31. Aparelho para processamento de tecido da planta adequado para gerar fragmentos de tecido da planta para utilização na micropropagação de planta, o dito aparelho de processamento de tecido da planta sendo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma pluralidade de lâminas em que pelo menos duas lâminas cortam um tecido da planta em uma sequência ordenada ao longo de pelo menos dois planos diferentes.

32. Aparelho para processamento de tecido da planta, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos três lâminas que cortam um tecido da planta em uma sequência ordenada ao longo de pelo menos três planos diferentes.

33. Aparelho para produção de semente de plana artificial CARACTERIZADO pelo fato de compreender pelo menos duas câmaras, em que uma primeira câmara é adaptada para conter um meio de revestimento de tecido da planta que compreende um ou mais fragmentos de tecido da planta; e uma segunda câmara adaptada para conter uma solução de colocação de revestimento de semente,

em que a primeira câmara e a segunda câmara são operativamente associadas, de modo que a descarga do meio de revestimento de tecido da planta da primeira câmara na segunda câmara, forma, desse modo, uma semente de planta artificial.