JPS61502895A - 蛋白質吸収増進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質吸収増進剤 本発明は蛋白質吸収増進剤に関する。更に詳細には、本発明によれば筋肉注射に よシ投与した医薬的性質をもつ蛋白質の吸収を増進し、血管注射または注入を必 要とせずに治療効果を迅速に挙げることができるように、注射した蛋白質が循環 する血漿中で迅速に高濃度に到達するような色剤及び方法を開発した。実施例に あっては蛋白質を吸収増進化合物、好ましくはヒドロキシルアミンまたはその塩 、最も好ましくは塩酸塩、を包含する試剤に入れて投与すれば、試験した蛋白質 の血管壁への浸透を大きく増大して、以下に示す試験において注射後２分以内に 高血中濃度を得るに至るものである。

本発明は心筋砂室の疑いの苦痛のある冠状動脈患者について心臓の筋肉に対する 損傷を最少限にする方法で治療し、更に詳細には、患者に資格のある者が手当を 加える前にさえも、出来る＠シ早期にこの手当を行ない得るような手当の方法の 改良に関する。

血管内に面域が生じると、その血管によって血液を供給されている身体の器管は 傷害を来たすかまたは血液供給を全く奪われる。これが生じる血管によっては、 患者の生命に対する脅威は、下記の資料によって説明する状況の場合には、即ち ある生命の危険のある状況の場合には、小さいこともあり極めて大きいこともあ る。血管内の面域生成は血栓症という。血栓を溶解する物質は血栓溶解物質と呼 ばれる。冠状動脈の面域が溶解されると、その結果生じた心臓への血流は再充満 と呼ばれる。

動脈血管中の生命を脅かすかまたは極めて重大な面域生成の例は脳血栓、腎血栓 、眼動脈血栓であり、極めて重要なのは冠状動脈の血栓である。急性心筋砂室（ 冠状動脈心臓病）の症例の約８５乃至９０パーセントにあっては、冠状動脈に血 栓があって血液が心臓の筋肉（心筋）へ流れてこれに必須の酸素その他の栄養を 供給するのを妨げている。冠状動脈中の血栓または面域生成の結果は心筋（血液 の流動を行なう心臓筋肉組織）に対する危険である。血液の供給を奪われた心臓 の筋肉は直ぐには死なないが、すみやかに死ぬようになる過程を始める。それゆ え、心臓の筋肉に対する損傷の程度は硬塞した部位への血液の供給が閉塞した血 栓によって制限されている時間の作用となる。

これまで、硬塞した部位に対して実際に再充満を確立するために企てられた方法 は一般に病院の環境乃至これと同等の環境において行なわれて来た。いわゆる「 入院前」の手当は、一般に、心臓の筋肉の損傷を最少限にする手当が達成される ように、患者を生存させておいてできる限シ早く病院の環境内へ送りこむ方向へ 向けられていた。

病院の環境内で試みられる処置は患者の心臓の硬塞した部位に再充満を確立する 一定の方法を含む。直ちに手術をする必要が明らかに示されない場合には、再充 満の確立が閉塞を解除する効果を持った方法によって達成された。利用できる方 法には機械式カテーテル挿入及び血栓溶解剤の投与を含んでいた。ストレプトキ ナーゼあるいはウロキナーゼのような公知の血栓溶解剤を冠状動脈注入するかま ′ｆｃはカテーテルによって閉塞の部位の血管内に剤を徐々に投入する必要があ った。近年、ストレプトキナーゼの静脈内注入が効果があることが示された。

更に最近は、組織型プラスミノーゲン活性化剤あるいはｔ−ＰＡと呼ばれる物質 が試験的に利用されている。

（ザ・ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メデイシン、１９８４年３月 ８日、３１０巻、黒１０．６０９−６１３頁）。ストレプトキナーゼあるいはウ ロキナーゼのような他のプラスミノーゲンとは異なって、ｔ−ＰＡ（これは体内 にごく少量しかない）は、妥当かつ有効な量で維持された場合、面域には特定に 作用するが血中の他の関係のある蛋白質には作用しない。

「冠状動脈血栓症：！Ｊｌ織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）に関する 強調的薬理学的考察」と題する、バイオケミカル・７アーマコロジーＱ、３３　 巻、Ａ　Ｉ　２．１８３１−１８３８頁、に載っている１９８４年輪評は、下記 の結論的な記述を含んでいる。

「冠状動脈血栓溶解剤の導入のための薬剤の選定は大部分入手性によって決定さ れて来た。不運なことに、ストレプトキナーゼもウロキナーゼも共に循環してい るフィブリノーゲン、プラスミノーゲン、及びアルファー２−アンチプラスミン の減損を伴う組織の分解状態を惹起素のすべては協動して、出血の段階を作り、 ひどい出血の危険を伴なう。これらの薬剤を血管内投与することは、用量の上限 が烈しい組織分解状態を起す危険によって制限されていることも一因となって、 低い成功率によって限定されている。

組携ＤＮＡ技術の進歩が組織型プラスミノーゲン活性化剤を広範囲に入手可能に することになるという可能性は、ｔ−ＰＡの面域特異性のために特に興味深いも のである。冠状動脈血栓溶解用にはその潜在的な利点は次の療前及び中に各患者 について凝血及び繊維素溶解システムの広範囲な特性化の必要なしに迅速な実行 ができること、免疫錯体生成のため明白なアレルギー性反応または用量応答関係 の変化の回避、ｔ　−ＰＡの短い生物学的半減期及び組織分解状態の導入の欠除 のために必要時に一分毎の用量の調整が容易なこと及び繊維素分解を迅速に終止 するのが容易なこと。」 ｔ−ＰＡの投与に関する見込みはアメリカン・ハート・アソシエーション（米国 心臓協会）の報道会議で討議されて１９８３年１１月１６日にニューヨーク・タ イムズによって「癌細胞の蛋白質を用いて冠状動脈を休める」と題した記事に報 しられた。この記事は次のように述べてｔ−ＰＡの注射に触れている。「蛋白質 ｔ−ＰＡは心筋砂室または心臓発作にか＼つた患者の血管に注射しさえすればよ く、そうすればそれはドレインがつまった鉛Ｖ施設を通すのとはソ同様に血液中 を通って面域を溶解する。」 この記事は更に「将来の使用の希望」という副見出しで、多くの医者は彼らが心 臓を殺すかまたはこれに恒久的な損傷をさせないうちに心臓発作の早期の段階で これを止めるようにいつかは救急室及び救急車内でｔ−ＰＡが用いられると期待 しているので、ｔ−ＰＡｉ心臓発作の手当に用いる研究について期待を表明した と述べた。

「将来の使用の希望」の副見出しの記事にはまた次の項目が含まれている。「研 究者の一人であるワシントン大学のドクター・バートン・Ｅ・ソベル氏は、いつ かは患者は胸部に苦痛を感じたり他の心臓発作の早期徴候をごじたら直ぐに薬を 注射できるように薬びんを携帯するようになると口論んだ。」 医学用語では薬びんとはゴムの栓のついた多量の薬液または希釈液の容器でちっ て、注射器の操作者が薬びんから所定用量の液を取出せるように皮下注射針によ って突通せるようになったものをいう。現用のｔ　−ＰＡの場合には、用量分を 次に注入器の母液容器内へ注入すればよい。

薬を静脈内注入または静脈注射によって投与することが必要なことは、実際的な 見地からすれば自己投与に対して大きな障害をもたらす。特に心筋砂室の徴候に か＼っている人の混乱した状況を考慮した場合、そうである。

徴候が現われると直ぐに目標の冠状動脈不調の人によって、ｔ−ＰＡの利用がで きるようにするに充分な１−ＰＡの効果的な自己投与方法の開発ができれば、取 返しのつかない心筋損傷が生じるまでにできる限り早期にその使用を確実にする ことによって、ｔ−ＰＡの血栓溶解剤としてのその潜在的有効性を大いに増大さ せることになろう、また同時に、心筋砂室に伴って生じる心臓筋肉の損傷を最少 限にするのにはじめて直接効果のある入院前あるいは救急車収容前型の手当を与 えることになろう。

このような自己投与手当を提供することも本発明の目的である。

本発明はよシ広い適用範囲を有することがわかった。

救命、治療性を持った多数の蛋白質は現在では治療効果のある血中濃度を達成す るために専ら血管内に投与されなければならない。これらの例には進行中の心臓 発作を止めるために用いられるストレプトキナーゼ及びウロキナーゼを含む面域 溶解、繊維素溶解組織の活性化剤、及び抗血友病グロブリン（■因子）のような 血友病の出血を止める凝血系の成分がある。多くの場合には糖尿病の昏睡を手当 するために用いられるインシュリンのような他の蛋白質を静脈内に投与して医療 救急の時間的制約の中でこれを行なうに充分なだけ迅速に所望の治療効力を表わ すに充分な高濃度を得るようにしなければならない。最近、上に指摘したように 、患者に出血させ易くすることなしに面域の表面で繊維素溶解系を活性化するこ とができる蛋白質である、組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）の静脈内 投与によって、心臓発作に起因する冠状動誠内面域の溶解が実験動物及び患者に ついて達成された。ｔ−ＰＡの循環の半減期は非常に短いので、循環系から蛋白 質が急激になくなってその結果治療効果以下の濃度になるのを避けるために連続 的な静脈内注入が必要である。加えて、心臓筋肉の大部分が死なないうちに進行 中の心臓発作を阻止するため迅速な面域溶解の緊急な必要性のために、静脈内投 与が必要であるとみなされて来た。

上記の見地からして、蛋白質、例えばｔ−ＰＡ、及び筋肉注射された他の多くの 蛋白質の血中吸収を増進させることを第一の目的とする方法が開発された。この 方法は蛋白質を循環している血液プール内への迅速な浸透を引出す血液中の蛋白 質の吸収を増進させる薬剤で増強された試薬に蛋白質を溶解化させること全利用 するものである。開発された方法の他の目的は、筋肉注射によって増強された吸 収をして所望の治療効果が引出せるように蛋白質の薬理学的及び治療学的性質を 保持することである。更に他の目的は、緊急の状況下で治療学的血中濃度が持続 できるようにするため３０乃至６０分に亘る吸収を容易にすることである。

血管腔内への試験ｌ−た蛋白質の浸透は注射してから２分以内に高血中濃度にな った。開発された試薬は下記の試験において４種の蛋白質のすべての吸収を容易 にし、面域溶解性を持って試験した２種の蛋白質の機能性に有害な影響を与えな い。本発明は特定の例に用いられた蛋白質での使用に限るものではなく、上述の もの例えばインシュリンのような他の蛋白質にも適用できると信じられる。

本発明はｔ−ＰＡ包色剤医薬的性質全持った他の蛋白質も）及びｔ−ＰＡの血中 への吸収を増進させる薬剤を含む。この薬剤は好ましくは塩酸ヒドロキシルアミ ンである。例えば公知の救急型自動注射器を用いることができ、また方法として は２つの医薬剤を筋肉組織へ注射することから成る、例えば資格のある筋から電 話でそうするようにとの決定を受けた後、また直接連絡の資格のある個人的手当 の設定よシも前の時期にこれを行なうものである。

ｔ−ＰＡは面域選択的血栓溶解剤と見做されてはいるが、予め定められた量で血 流中に入れた場合、これまで行なった試験では、濃度は組織溶解状態を生起し得 る点まで増大できることを示している。筋肉注射には皮下注射針の挿通及び注射 の抜去りによって生じた傷に接し実質的にこれを取囲む部位にｔ−ＰＡの濃厚用 量を入れることを含む。その結果、少くとも局所的な溶解状態が引起されて針に よる傷から出血が生ずることが予想されよう。しかし予想外にも、試験の結果で はそのようなｕ４血は事実化じないことが示された。

第２に、ｔ−ＰＡは大型蛋白質である。それは判別できるほどの分量で血流中に 吸収されるとは予期されなかった。蛋白質の血管外濃度は血管内組白質の濃度の 約１０分の１である。蛋白質の移送が生じ得る通路の毛細管孔は蛋白質の分子の 大きさに比して小さく、それゆえ荷電のために蛋白質の移送を制限するためにそ うなると考えられる。ｔ−ＰＡのような大型蛋白質が、筋肉内に即ち血管外に投 与された場合、判別できる分量で血流中に急速に入り得るかどうかについてはこ のように大いに問題のあることであった。使用試験では実にｔ−ＰＡはそれ自身 では筋肉内注射後、治療に役立つだけの大量には血液中に急速には進入しないこ とが示された。

それゆえこのシステムの実際の手当には、蛋白質、例えばｔ−ＰＡと同時にまた は実質的に同時に吸収促進剤を筋肉内注射することを含まなければならない。

局所、皮下、または筋肉内に投与された低分子量物質の吸収の増大はジメチルス ルホキシド（ＤＭＳＯ）のような試薬で、及び骨格筋血流及びリンパ液流の増進 によって、達成された。

しかし、ＤＭＳＯはｔ−ＰＡその他の蛋白質の分子の吸収増進剤としては無効な ことが証明された。

本発明の原理に従って、血中へのｔ　−ＰＡ及び他の蛋白質の吸収速度はｔ−Ｐ Ａまたは他の蛋白質の投与と共にｔ−ＰＡまたは他の蛋白質の吸収増進剤、好ま しくは塩酸ヒドロキシルアミン、の投与を利用することによって増進される。好 ましくは塩酸ヒドロキシルアミンのような吸収増進剤をｔ−ＰＡまたは他の蛋白 質用剤に混入して単一の混合用剤を作り、これを例えば最先願の特許出願に記載 したようにして、筋肉内（ｉ、ｍ、　）に注射する。ｔ−ＰＡｔたは他の蛋白質 の別の用剤と同じ部位内に吸収増進剤を別の用剤として注射することも本発明の 考慮範囲内のものである（例えば米国特許第４，３９４，８６３号）。先に記述 したようにｔ−ＰＡまたは他の蛋白質用剤に加えて単一の混合用剤を作る、塩酸 ヒドロキシルアミンのような吸収増進剤の分量の一例は、体重１キログラム当り ０．１乃至８５ミリグラム、例えば０．１乃至４０またはｌ乃至８５ミリグラム の量である。

吸収増進剤としてはヒドロキシルアミンを無毒の水溶性塩の形で用いるのが好ま しい。それゆえ例えばヒドロキシルアミンの代わりに塩酸ヒドロキシルアミン、 臭化水素酸ヒドロキシルアミン、ヨウ化水素酸ヒドロキシルアミン、硫酸ヒドロ キシルアミン、硝酸ヒドロキシルアミン、酢酸ヒドロキシルアミン、プロピオン 酸ヒドロキシルアミンのような塩を用いることができる。最も好ましくは塩酸ヒ ドロキシルアミンを用いる。

また本発明に従うｔ−ＰＡｔたは他の蛋白質の吸収増進剤として考慮されるもの には、アンモニア（水酸化アンモニウム）、炭酸アンモニウム及び他のアンモニ ウム塩類例えば塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、臭化アンモニウム、及び 硫酸アンモニウム、尿素、モノ及びジアルキル尿素類例えばメチルウレア、エチ ルウレア、プロピルウレア、ブチルウレア、ＮｌＮ−ジメチルウレア、Ｎ、Ｎ− ジエチルウレア、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルウレア、モノ及びジアルキル尿素類例 えばフェニルウレア、ｐ〜トリルウレア、Ｎ、Ｎ−ジフェニルウレア、及びＮ、 Ｎ−ジーｐ−）リルウレア、チオウレア、ヒダントイン、５−置換ヒダントイン 類例えば５−アルキル、５−アルアルキル、及び５−アリールヒダントイン及び ５．５〜ジアルキル及び５，５−ジアリールヒダントイン類例えば５−メチルヒ ダントイン、５−エチルヒダントイン、５，５−ジメチルヒダントイン、１．５ −トリメチレンヒダントイン、１，５−テトラメチレンヒダントイン、５−フェ ニルヒダントイン、５−ｐ−１Ｊルヒダントイン、及び５，５−ジフェニルヒダ ントイン、グアニジン、メチルグアニジン、ヒドラジン、アルキルヒアリールヒ ドラジン類例えばメチルヒドラジン、エチルヒドラジン、ブチルヒドラ−ジン、 フェニルヒドラジン及びジフェニルヒドラジン、アルキル及びアリールヒドロキ シルアミン類例えばメチルヒドロキシルアミン、エチルヒドロキシルアミン ンのような化合物がある。置換ウレア類、ヒドラジン類、及びヒドロキシルアミ ン類も同様に塩の形で、例えば塩酸塩として、用いることができる。

ｉたｔ　−　Ｐ　Ａまたは他の蛋白質及び吸収増進剤を同時に投与することも主 としてヒト用に意図されてはいるが、それらを他の哺乳動物例えば犬、猫、牛、 及び馬に投与することも・本発明の範囲内である。（　年　月　日）出願の本発 明者の同時出願（番号　）の教示に従って、注射部位の筋肉の電気的刺戟を、筋 肉注射を用いる下記の多数の実施例における注射液に吸収増進剤特に塩酸ヒドロ キシルアミンを含めたものと併用することができる。電気的刺戟は本発明の吸収 増進剤の吸収を増大させ昂揚させる。

最も先願の特許出願中に指摘したように、ｔ−ＰＡまたは他の蛋白質を筋肉内へ 自己投与するのに適した自動注射ｉｔ−を用いることができるけれども、下記に 述べる実施例においてはｔ−ＰＡまたは他の蛋白質及び塩酸ヒドロキシルアミン を通常の針及び注射器で直接筋肉内へ投与することによって実施した。しかし、 自動注射器で薬剤を投与することは手動注射によって得られるよりも高血中濃度 を来たすと思われる。

うさぎについてｔ−ＰＡとヒドロキシルアミン（塩酸塩として）の筋肉内注射と 注射部位の骨髄筋の電気的刺戟とを用いた試験では犬及び患者についてｔ−ＰＡ を静脈内注入した後に冠状動脈血栓溶解を引起すとして知られているものと同等 かまたはそれを越えるｔ　−　Ｐ　、Ａのピーク血中濃度を得ることがわかった 後に、冠状動脈血栓症にした犬について同様の試験を評価した。これらの可能性 の実験では筋肉内注射後のｔ−ＰＡの吸収が容易になったことが冠状動脈血栓溶 解ならびに治療効果のあるｔ−ＰＡの血中濃度を引出したものとわかった。

在来の緩衝液にはｔ−ＰＡの溶解度が限られていたた量と同様のものに選定した （うさぎ及び犬に対して注射部位当りそれぞれ１及び１．５　ミＩＪ　ＩＪノト ル）、勿論これらはうさぎの筋肉質量に関しては大量を表わしてはいた。

かように注射液１ミリリツトル当シ同一濃度の吸収増進剤を両種の動物に用いた 、但しこれらは体重１キログラム当り極度に多量のヒドロキシルアミンの投！− 受けたことになり、２種の動物の体重１キログラム当り投与されたｔ−ＰＡとは ！同等の割合の投与にもが＼ゎらず、犬と比較してうさぎについては注射液中の ｔ−ＰＡ１１度は１０倍低かった。溶解化剤でｔ−ＰＡをがなり濃縮すると体積 を実質的に減少できると思われる。

うさぎについての研究のために、用いたｔ−ＰＡは前に記述したようにメラノマ 細胞上澄液分留（ｍｔ−Ｐａ）から採取した（ベルクマン、サイエンス２２０１ １８１−１１８３　（１９８３）　）かまたは組才灸ＤＮＡ技術によって作った （ヴアン・デル・ウェルフ、サーキュレーション６９６０５−６１０　（１９８ ４）　）　（ｒｔ−ＦＡ、ジェネンテク・コーポレーション、ロットＢＨＯＯ４ ＤＡＸ）。コノ二種の製剤での試験結果は見分けがつがなかったので、これらの 製剤を保管した。緩衝液（０，３Ｍ　ＮａＣ１、０，０１％トウイーン８０．０ ．０１　Ｍ燐酸カリ緩衝液、ｐＨ７，５）１ミリリットル当りｔ　−Ｐ　Ａ　０ ．５ミリリツトルの濃縮液を用いた。犬についての研究用には、ｒｔ−ＰＡ（ジ エネンテク、ロットＴＥＯ３１Ａ）をアミコン膜ろ過システムで２０倍に濃縮し た。

ＤＭＳＯを１％または３％（ｖ　／　ｖ　）溶液にして試験管及び注射液で用い た。塩酸ヒドロキシルアミンはｔ−ＰＡ浴溶液１ミリリットル当、Ｑ　４．３． ７５　ｍ９の濃度で用いた。この濃度は生理学的に充分耐えるものとされている 約１３ｍｙ　／　ｋｐの塩酸ヒドロキシルアミン合計量と比肩するものであった 。

評価した吸収増進剤がｔ−ＰＡと相互作用する程度を測定するために、ｒｔ−Ｐ Ａの溶液（０，０１５乃至５００ｇ／４ｎｌ）を、１％ＤＭＳ０，３％ＤＭＳＯ ’＋　１７５　ｒｎ９／ｍｌ　ヒドロキシルアミン（塩酸塩として）、またはＤ ＭＳＯとヒドロキシルアミン（塩酸塩として）との双方を加えた後、３７℃で１ 時間湿量した。免疫放射線測定または官能的に分析したｔ−ＰＡについてはなん らの影響も見分けられなかった。

５６匹の絶食させない白雄ニューシフンドうさぎ体重２ｋｙのものについて研究 を行なった。これらの動物の内生ｔ−ＰＡは人間のｔ−ＰＡに対して作られた抗 体と反応せず、それゆえ外部から投与されたｔ−ＰＡの血中濃度を特徴づけるた めに用いられた免疫放射線測定を妨げない。動物はベントパルビタールナトリウ ム（２４ｍｇ７ｋｇ　）で麻酔をかけ、気管切断により毎分２リツトルの割で９ ５％酸素を投与して換気させた。注射部位の骨髄筋（ｖａｓｔｕｓｍｅｄｉａｌ ｉｓ）を両面露出して連続した血液試料を内部へ入れた大腿骨静脈カテーテルを 通して取出した。注射部位の骨髄筋向及びリンパ液流を増大させるために、２本 の２７ゲージ、０．５インチのステンレス鋼針で筋肉を１秒当り５パルスで１４ ボルトで２．０ミリ秒間刺戟した。単一の負の末端電極も用いた。体重１　ｋｇ 当り合計１ｍｇのｔ−ＰＡを４部位の各々に１呪の割切れる数に分けて手動で注 射した。

体重的２３ｋＰの絶食させた麻酔させた犬に冠状動脈血栓症を起させた、ベルク マン・サイエンス２２０．１１８１−１１８３　（１９８３）参照。５乃至１０ 分以内に閉塞性血栓が生じ、血管腫測定で確認された。中に入れである下静脈腔 カテーテルを通して連続した静脈血試料をとった。

３本の２７−ゲーシステンレス鋼、１本は負の参考ノ役をするものて°゛、注射 部位の電気場刺戟を行なった。パラメータはうさぎに用いたものと同じであった 。ｔ−ＰＡを、合計用量が体重１　ｋｇ当り３　ｍｇ、注射液の合計量が各犬に ついて総計６Ｗになるように、各部位当り１．５ｍｌのアリコートで露出した＆ ｉ工筋に直接注射した。

５６匹のうさぎについての研究の実験の主要な目的は血中のｔ−ＦＡ活性であっ た。先に記したベルクマン、Ｉ　ｏ　ｃ、　ｃｉｔ、及びヴアン・デル・ウエル フ、ＡＥｎｇｌ。

−ＰＡ抗原濃度を連続して測定した。官能性ｔ−ＰＡ活性も測定した。ベルクマ ン、ＩＯＣ，ｃｉｔ、及びチェフェンブラン、サーキュレーション７１　、１１ ０−１１６　（１９８５）。

ｔ−ＰＡまたは試剤のみの筋肉内注射の前、注射の直後、及びその後ｌ乃至６０ 分の一定した間隔で、クエン酸ナトリウムヴアクテナ管に０乃至４℃で血液標本 を採った。

犬についての可能性実験については、もう一つの目的は血管腫測定法で記録した 冠状動脈血栓溶解であった。

血圧、心臓速度、心電図、大動脈血ガス及びｐＨ、ヘモグロビン、及びヘモグロ ビン酸素飽和を監視した。

両種の実験に対しては、注射部位の潜在的筋肉傷害の粗評定を全体の検査によっ て行なった。更に、一連の血液試料について血漿クレアチンキナーゼ（ｃ　ｒ＜ 　）活性を分光光度測定で評定した。クライン、カルディオヴアスク、Ｒｅｓ、 　７．４１２−４１８　（１９７３）、骨髄筋を慣らされた場合ＣＫが循環系へ 迅速かつ際立って解放されることが知られていることから、上記のことを行なっ た。

ｔ−ＰＡの血中濃度の連続的な変化を数群から成る５６匹のうさぎについて評価 した。血中濃度は吸収増進剤のみを含みまたは含まない緩衝液、または緩衝液に 入れたｔ　−Ｐ　Ａ、　ＤＭＳＯ人緩衝液、ヒドロキシルアミン（塩酸塩として ）入緩衝液、またはＤＭＳＯとヒドロキシルアミン（塩酸塩として）入緩衝液を 筋肉注射する前及びその後一定の間隔で評定した。

血液採取の間を通じて注射部位の筋肉に付随的に電気刺戟を与えまたは与えない で同一の組合わせを評価した。

一旦ヒドロキシルアミンがｔ−ＰＡの吸収を容易にすることが決定した後は、実 験をｔ−ＰＡの吸収についての用量応答関係を注射液中のＬ−ＰＡの濃度及びヒ ドロキシルアミンの濃度に対する関数として規定するために行なった。

うさぎについて２つの注射部位にはｔ−ＰＡなしのヒドロキシルアミンを、また 他の２つの部位にはヒドロキシルアミンなしのｔ−ＰＡ’ｋ、投与することによ って、ｔ−ＦＡの吸収に対するヒドロキシルアミンの系統的効果の可能性を評定 した。

以前に患者にｔ−ＰＡを静脈投与した（０，５乃至０．７５１！！９／ｋｊ？　 ）のと同じ程度の強さの体重１　ｋＰ当りのｔ　−Ｐ　Ａのｆｌ　（１ｍｔｉ／ ｋｙ　）でうさぎについて治療効果のある血中濃度が出せることが決定した後に 、犬について行なった実験を調べた。血栓状コイルを血管に入れた後７分乃至１ ０分以内に一般に生起する左前下降冠状動脈に閉塞性面域が生成することを血管 腫測定した後５乃至４５分以内にヒドロキシルアミン（塩酸塩として）と共にｔ −ＰＡを筋肉内投与した。一連の血管腫測定ｆ、はソ１５分間隔で実施した。冠 状動脈血栓に対するｔ−ＰＡの効果は血漿ｔ−ＰＡ濃度と相関々係があった。面 域溶解後（ｔ−ＰＡ注射後約１５分）、再閉塞を防ぐためにヘパリン（体重ｌ　 ｋＰ当り５００Ｕ）を与えた。繊維素溶解系の外部活性化がなかったので、ヘパ リン（ｎ−４０匹の犬）の投与にもか＼わらず内部に入れた血栓性冠状動脈コイ ルによって惹起された面域は相変らず存続する。対にしたデータに対してポンフ ェロ−二危険限度でまたはステユーデン）１試験での変数分析によって統計的比 較を実施した。

値は平均値±８Ｂとして表わした。

ヒドロキシルアミン（塩酸塩として）　（，１７５ｍＶ／ｒｒＬｌ）・１％ＤＭ ８０　、３％ＤＭＳＯ、も、共存するヒドロキシルアミン（塩酸塩として）及び ＤＭＳ　Ｏも、０．０１５乃至５０ｎ７ｒｔ−ＰＡｅ含む標本を３７℃で１時間 温置した試料の免疫放射線測定で発見できるｔ−ＰＡあるいは官能的に発見でき るｔ−ＰＡ活性をいずれも変えなかった。

ｔ−ＰＡの血中濃度 ｒｔ−ＰＡの筋肉的注射より前には、うさぎのいずれからも血漿中の免疫放射線 測定によってヒ）ｔ−ＰＡは発見できなかった。試験した４匹のうさぎのいずれ についても、実施した小外科手術手法及び筋肉の６０分間刺戟にもかくわらず、 繊維素板官能性試験で調べた血漿試料には発見できる内生ｔ−ＰＡ活性は認めら れなかった。

外部ｔ−ＰＡを注射液に含めない場合は試験した試剤のどの組合わせのものを注 射した後にもヒ）ｔ−ＰＡは発見できなかった。合計２６２　ｍｙ／ｍｌｌのヒ ドロキシルアミンを塩酸塩として筋肉的注射をしまたはしないで複数の部位に投 与して６０分間の採取間隔中の検疫操作した犬からとった血漿試料中には免疫放 射線測定で発見できる＋−ＰＡは存在しなかった。ｔ−ＰＡなしの緩衝液に入れ た塩酸ヒドロキシルアミンの筋肉的注射及び電気刺戟後の６０分の採取間隔中試 験した４匹の動物のいずれにおいても検疫操作した犬の繊維素板の測定できる官 能活性はｌＯ乃至５３　ＩＵ／Ｔｉ１ｌに亘り、増加しなかった。

塩酸ヒドロキシルアミンのみ（２６２ｍｐ）を犬に筋肉的注射した抑制実験では 、最高メテモグロビン濃度は１１乃至１３％に亘り、筋肉内注射後５乃至１５分 内に生じた（　ｎ　−３）。

動脈酸素張力は最低の９３　ｒｔｒｒｒ　Ｈｇまで低下した。酸素とのヘモグロ ビン飽和度は最少の８１％まで減少した。

心臓速度が一時的に早くなったこと以外は、ｔ−ＰＡを含むかまたは含まない塩 酸ヒドロキシルアミンを投与された犬はなんら認められるほどの作動力学的また は心電図による異常を示さなかった。

図面について説明する。

第１図はうさぎに４３．７５ｍり屓の塩酸ヒドロキシルアミンを用いた２　ｍ９ のｔ−ＰＡ緩衝液（合計注射液量−４ｍ１で４つの部位に分けた）を注射し、次 に試料採取時間を通じて注射部位に電気刺戟を加えた血漿試料の免疫放射線測定 で検出できかつ官能的に活性な血漿ｔ−ＰＡ活性のグラフである。免疫反応性の ｔ−ＰＡも官能活性の１−ＰＡも共に、吸収が容易になって筋肉内注射後急速に ピークに達した。

第２図は注射液中の免疫放射線測定で検出できるｔ−ＰＡのビーク濃度血漿が注 射液中のヒドロキシルアミンの濃度に依存することを示す図表であ゛る。注射液 合計４ｍｌ量中の塩酸ヒドロキシルアミンの量を図に示すように変えたほかは、 条件は第１図の註記に示したものと同様とした。

第３図は６匹のうさぎに筋肉内投与したｔ−ＰＡの量の関数としてのピーク血漿 ｔ−ＰＡ活性を示す図表である。投与したｔ−ＰＡの合計量を示したように変え たほかは、条件は第１図の註記に示したものと同様とした。

パネルＡは免疫放射線測定で検出できる活性を示す。パネルＢはアミド溶解、官 能活性を示す。全時間−活性エアロールの測定（ｎ−３０測定）の１時間の間を 通じての用量に関係した差異は変数（ｐ＜、ｏｏｔ）の測定された副分析として 大きかった。

第４図は３匹のうさぎの各々における筋肉内投与したｔ−ＰＡの吸収を容易にし た後の血漿ｔ−ＰＡ濃度の早期変化を示す図表である。条件は第１図の註記に示 したものと同様とした。

第５図は冠状動脈血栓症にした犬について免疫放射線測定で調べた血漿ｔ−ＰＡ の連続的変化の図表である。

冠状動脈カテーテルの先端の左前下降冠状動脈内へ血栓性コイルを挿入して血栓 症を起させた。筋肉内投与したｔ−ＰＡの吸収を容易にすることにより冠状動脈 血栓溶解を起させた。（血栓生成フィルは血管腫染料の末梢充填の欠除ならびに 明るい矩形として表われるコイルに類似した血管の不透明化の欠除によって明ら かな面域形成を表わした。）ｔ−ＰＡ（４ケ所に分けた合計６ｍｌの量に電気刺 戟を加えてから１５分して、開放性の血管腫測定で示される回復を表わしてコイ ルに近い末梢部の血栓の溶解が明らかとなった。認められるように、筋肉内に投 与したｔ　−Ｆ　Ａの吸収を容易にしてから間もなく血漿１−ＰＡの活性はピー クに達した。試料採取の間中、高くなった濃度が持続した。試験した３匹の犬の 各々について第２のピークが見られた。

第６図は塩酸ヒドロキシルアミンと牛血清アルブミンとを共に投与した場合の効 果を示す図表である。塩酸ヒドロキシルアミンなしで牛血清アルブミンを投与す る。

牛血清アルブミンに１２５沃素を照射した。最初の実験ではそれをうさぎに筋肉 注射した。血漿の試料を時々うさぎから取出して放射性沃素の１分当りのカウン ト（Ｃｐｍ）を測定した。図表上ではこれを曲線−ＨＡとした。

第２の実験では、うさぎに塩酸ヒドロキシルアミンを筋肉注射しながら同時に沃 素を照射した牛血清アルブミンを同量筋肉注射した。血漿の試料を時々取出して 放射性沃素の１分当りのカウントを測定した。図表上ではこれを曲線＋ＩＩＡと した。図表から、塩酸ヒドロキシルアミンの存在下では牛血清アルブミンは一層 早く吸収され、３０分後生血清アルブミン単独の場合の５倍以上の吸収ピークを 得たことがわかる。

うさぎに筋肉注射した後のｔ−ＰＡの血中濃度連続した静脈注入によってｔ−Ｐ Ａを実験動物及び患者に与えた結果から判断すれば、血中濃度が血漿１　ｍｌｌ 当り５０ｍ９を越えなければ治療効果は引出されない。

第１表に示したように、緩衝液単独で注射したｔ−ＰＡはごく僅かしか血中濃度 を増大させなかった。ＤＭＳＯを注射液に加えても血漿中のｔ−ＰＡ濃度を増加 させなかった。これと対照的に、塩酸ヒドロキシルアミンは注射後５分で＋−Ｐ Ａ吸収によって得られるピーク血中濃度をこれなしのものよりも約４０倍または ５０倍以上も高めた。吸収増進させて筋肉注射した後３０分以内に投与した蛋白 質の約１０％の吸収が認められた。１時間の観察範囲を通じて治療効果のある範 囲の濃度が持続した（第１表）。注射液に塩酸ヒドロキシルアミンを含め、カッ 注射部位の筋肉を電気刺戟することによって容易にしたｔ−ＰＡの筋肉内吸収後 の繊維素板で評定した免疫放射線測定及び官能性ｔ−ＰＡ活性の連続的変化の例 を第１図に示す。

第　１　表 ｔ−ＰＡの筋肉内投与後の血漿中の免疫（ｎ　ｇ／ｍ　ｌ　）放射線測定により 検出できるｔ−ＰＡ ｏ　０±０　０±０　０±０ ５　８±２　１１±４４３１±５２” １５　９±２　８±２１４６±１６” ３０　９±２　９±１　８５±１７’ ６０１０±３　１０±１　５３±１１’数値は平均上ＳＥである。すべての注射 液はｔ−ＰＡ２ｍ９、総計で４ｍ１（各部位につき１　ｍｌ　）を含んでいた。

塩酸ヒドロキシルアミンの濃度は４３，７５　ｍＶｆｎｌ）であった。

表に掲げた実験はすべて砂室部位の筋肉を電気刺戟して行なった。

東＝緩衝液単独に入れたｔ−ＰＡまたはＢ　＆　ｉＷ　＋　ＤＭＳＯに入れたｔ −ＰＡと比較してＰ　（０，１電気刺戟による筋肉血流の増大が筋肉内投与され たｔ−ＰＡの吸収を増進するかどうかを測定するために、緩衝液のみに入れたｔ −ＰＡ、、ＤＭＳＯを加えた緩衝液に入れたｔ−ＰＡ、及び塩酸ヒドロキシルア ミンを加えた緩衝液に入れたｔ−ＰＡを注射した後、電気刺戟を加えまたは加え ないで実験を行なった。塩酸ヒドロキシルアミンなしでｔ−ＰＡを投与した場合 に見られる極めて低い血中濃度は電気刺戟によって一貫して補正しなかった（ｎ −１１匹の動物）。しかし、塩酸ヒドロキシルアミンの入ったｔ−ＰＡを与えた 動物（ｎ−１５）においては、ｔ−ＰＡの吸収またはなくなるまでの時間を変更 することなく平均２５８±３２％ピーク濃度を増進させた。

第２図に示すように、免疫放射線測定方式で検出できるｔ−ＰＡの血中濃度は注 射液中の塩酸ヒドロキシルアミンの量に比例していた。ヒドロキシルアミン（塩 酸塩として）で富化した注射液に１ヌ薄３％のＤＭＳＯを加えたものは、ｔ−Ｐ Ａｏ量を一定に保った場合、塩酸ヒドロキシルアミン単独を用いた場合の結果と 比較して１−ＰＡのピーク血中濃度を増大させなかった。外部からｔ−ＰＡを投 与した後の免疫放射線測定で検出できるｔ−ＰＡも官能活性のｔ−ＰＡも共に、 注射液中の塩酸ヒドロキシルアミンの量及び濃度を一定に保った場合、４倍の範 囲上でｔ−ＰＡの濃度に比例していた（第３図）。

第４図に見られるように、注射後４分と５分の間に血中濃度は急速に上昇してピ ークに達した。各事例とも筋肉注射後早くも１分で血漿中のｔ−ＰＡの濃度増加 がはっきりした。

塩酸ヒドロキシルアミンで吸収を容易にした後のピーク血漿ｔ　−Ｐ　Ａの増進 は注射液のｐＨの減少によって単純に引起されるものではなかった。２匹の動物 の各々に”）ｌ／−１て、注射液のｐＨはヒドロキシルアミンナＬ　ｆ　５．９ と滴定された。注射後５分の血漿ｔ−ＰＡの濃度は僅かに６　ｎｑ／ｍｌであっ た。その後は大きな増加は起らながつた。塩酸ヒドロキシルアミンに見られた増 大は塩酸ヒドロキシルアミンの矛＋−，ｆ、　９．ｎ　９　ｆ　＋＝よるもので はなかった。ヒドロキシルアミンを右犬馳筋に、緩Ｍ５　Ｗ中のｔ−ＰＡを左大 腿筋に注射した２匹の動物については、緩衝液だけに入れて注射したｔ　−Ｐ　 Ａに対する第１表の血中濃度よりもピーク血中濃度は超過しなかった。

うさぎに用いた体重１に２当りの吸収増進剤の量は犬に用いたものまたは可能性 のある臨床研究のために最終的に予測されたものよりも非常に多かったけれども 、注射液中の高濃度が骨髄筋に悪影響があるかどうかを測定するために過大な分 量を用いた。うさぎについては、同一条件で緩衝液のみを注射した後の値と比軸 して、外科手術、塩酸ヒドロキシルアミン入りのｔ−ＰＡの注射、及ｔ−ＰＡを 入れまたは無しの塩酸ヒドロキシルアミン１７５ｍ９を投与した犬の場合は、研 究が終わった時点で血漿ＣＫは基本線の１８％未満の増加をしていた。総体検査 によってヘマトマは現われていなかった。注射後２時間して採った注射部位から の断面の光線顕微鏡検査では、ごく少量の隙間にある出血及び炎症しか認められ な注射液中の塩酸ヒドロキシルアミンでうさぎについてｔ−ＰＡの吸収容易化が 達成できることを証明した後、犬については開発された手法が冠状動脈血栓溶解 を引出し得るかどうか全測定するための予備研究を行なった。

ｔ−ＰＡ入り（ｎ＝３）あるいはｔ−ＰＡなしくｎ−３）で塩酸ヒドロキシルア ミンを筋肉内注射した後の動脈血心臓速度は次第に平均３２％増加してこれも注 射後２分でピークに達した。塩酸ヒドロキシルアミン単独では心室の不整脈は生 じなかった。ｔ　−Ｐ　Ａ　（３ｍｙ／ｋｙ　）を筋肉内投与し続いて電気刺戟 を与えると、先づ再充満不整脈が生じ、１５分以内に冠状動脈血栓溶解が始まっ た。

調べた３匹の動物の各々について同様の結果が得られた。

血漿ｔ−ＰＡ値は同様の時間経路をたどったが１−がしうさぎについて見られた ものよりも低かった。更に、第５図に示すように、免疫放射線測定法で検出でき るｔ−ＰＡの二次ピークが、各々の犬について最初のピーク後約４０分で始まっ て生じた。これは骨髄筋部位から出たものと匹敵するものであり、他の可能性に も増して特に血流の変化またはｔ　−Ｐ　Ａの循環系への遅いリンパ管輸送のた めであった。

このように、官能的に活性なｔ−ＰＡの治療効果のある血中濃度を達成できるこ と、また筋肉注射した物質の吸収を容易にすることにより冠状動脈血栓溶解をす ることができることがわかった。血漿の活性は注射後５分以内にピークに達し、 その後急速に下がった。これは循環系中のｔ−ＰＡの公知の半減期と一致する。

得られた血中濃度は、内在させた冠状の血栓生成コイルを引続き存在させたにも か＼わらず、１５分以内に犬の冠状動脈血栓溶ｌＷを起させるに充分なものであ った。

ヒドロキシルアミンを注射液に含め、かつ電気刺戟によって骨髄筋血流を増大さ せることによってｔ−ＰＡの吸収を増進させた。骨髄筋の全体的傷害は生じなか った。

試験管研究の結果から判断して血漿中のｔ−ＰＡの低濃度は初期の血栓の面域溶 解を引起すには適当であるため、１だ繊維素に結合しているｔ−ＰＡの生物学的 半減期は実質的に循環しているｔ−ＰＡの半減期よりも長い１０８（抜糸）　（ １９８４）　、参照〕上記に示した例に用いたものよりも低量のｔ　−Ｐ　Ａ　 、塩酸ヒドロキシルアミン、またはその双方でもって、生体での血栓症の発生後 早期に冠状動脈血栓溶解ができると信じられる。注射液の分量を減することは所 要のヒドロキシルアミンあるいは他の吸収増進剤の用量を減らすことになり、ま た注射部位の筋肉に対するｔＭ潜在的傷害を減少することになる。

これ１で、ｒ　−Ｐ　Ａ及び＃Ｒ維素溶解系の他の活性化剤は血流に直接注入す ることによってのみ投与されて来た。

本発明はこれに代わるｔ−ＰＡの投与方法を阜医療要員またはあらかじめ自己手 当方法の指示を受けた危険度の高い電話で管理されている人による迅速な実行て 変えることができる潜在的な代替法を提供する。

他の化合物はｔ−ＰＡについて所望の結果をもたらさなかったので、他の吸収増 進媒体で多くの試みをした後にヒドロキシルアミンが用いられた。その主な副作 用であるメテモグロビネミアの取入れは用いる用量では組織の酸化を禁止的には 制限しない。注射液中のヒドロキシルアミンの濃度が、現在の結果から判断して ありそうに思われるように、ｔ　−ｐ　Ａの吸収の重大な決定因子であるとすれ ば、人間について必要とするヒドロキシルアミンの合計用量は非常に低くなるよ うなので、特にｔ−ＰＡの濃度を上げることによって注射液の量を減らすことが できるとすれば、局所貧血性の心臓病を持った患者に対してさえも引起されたメ テモグロビネミアはごく取るに足りない程度のものとなる筈である。この吸収増 進剤の使用に伴うメテモグロビネミアが受容できないほどひどいと見なされる場 合には、メチレン・ブルーまたはグルタチオンを併せて投与するというような補 助剤使用の措置を利用して問題を１１、さくするか回避する。〔レイン、Ｊ、　 Ｐｈａｒｍａｅｏｌ、　Ｅｘｐ−Ｔｈｅｒａｐ、　１６５　＋　３６−４４　（ １９６９）参照〕 本調査で得られたものと比較できるｔ−ＰＡの血中濃度は実験動物及び患者につ いて出血し易くなる組織溶解性の状態を惹起することなく冠状動脈血栓溶解を来 たす。

筋肉内吸収を容易にした後に血漿ｔ−ＰＡを高めるという時間経過をとることは 、その鋭角的なピークのために特に好ま［−い。妥当な橘生法の適用を想定して 、人々は自動注射器による自己投薬または準医療ダ４眉績による手当の後間もな く直接医療手当を受けることができるようになろう。このように、筋肉内投与さ れたｔ−ＰＡを入れた後早急に血中濃度が低下するので、明確な診断上の情報を 得ている間に抗凝血剤と併用して静脈内注入を始めるかあるいは再閉塞を防止す る他の措置を行なうのが良い。

筋肉内に投与されたｔ−ＰＡの吸収容易化によって引起された心筋の再充満が再 充満による不整脈を引起すという可能性は、心臓カテーテル挿入試験所の設定ま たは冠状動脈手当ユニットの設定で容易に対処されるが、医学的に手当をされて いない患者については潜在的に危険なことがある。それゆえ、親出願に述べたよ うなリドカインまたはアルファ・アドレナリン阻止剤のような抗繊維素形成剤ま たは抗不整脈剤を併せて投与することが有利である。

また、再閉塞または血小板劣化を防ぐために下記のいずれかを用いることが望ま しいことがわかった。

１、トロンボキサン・シンセターゼ阻止剤例えば４−（２−（Ｉ　Ｈ−イミダゾ ール−１−イル〕エトキシ）安息香酸塩酸塩（ダシキシベン）のようなイミダゾ ールでトロンボキサンＡ（−トロンボキサンＡ２）の合成を阻止する。

２、トロンボキサンＡ（トロンボキサンＡ２）の受容体の４６抗物を入れる、例 、〔１α、２β（５Ｚ）、３β（ＩＥ）、４α）−７−Ｃ３−（３−シクロへキ シル−３−ヒドロキシ−１−ブ°ロベニル）−７−オキサビシクロ〔２゜２．１ 〕ヘプト−２−イル〕−５−へブテノン酸　（ＳＱ２７．４２７） ３、　血小板劣化の別の阻止剤、例えばアスピリン、インドメタシン、ナプロキ シン、及びスルフィンピラゾン、を入れる。

再閉塞または血小板劣化の防止のための剤はｔ−ＰＡ及び吸収増進剤例えば塩酸 ヒドロキシルアミンについて同時にでも逐次にでもいずれの順序にでも投与して よい。

再閉塞または血小板劣化防止剤は通常の方法、例えば筋肉内、静脈内、または経 口的にさえも、投与できる。

受容体対抗物または血小板再閉塞防止のための他の薬剤は例えば体重１　ｋｇ当 り０．１−１０　ｍ９の量で投与することができる。

先に述べたように本発明はまた筋肉内投与することによシ薬効性を持った他の蛋 白質の吸収を増進させるのにも有用である。このような蛋白質には例えば牛血清 アルブミン、ヒト血清アルブミン及びインシュリンがある。

このことは下記の実験によって示される。

二種の蛋白質、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）とヒト血１２テ 清アルフミン（ＩＳＡ）とを沃素１２５（１）で標識して循環系への吸収が血漿 のトリクロロ酢酸沈澱物の放射線活性の測定によって特徴づけできるようにした 。

ＢＳＡ及び［−Ｉ　Ｓ　Ａ蛋白質をホ゛ルトン・アンド・ハンタ１２！； 一法によって沃素１２５（Ｉ）で放射性標識してチロシン構成要素について放射 性配位子を作った。用いた放射性配位子の性格についての結果の独立性を証明す るために、第２の方法を用いた。その方法とは１１′；１グリフコンジユゲート を作って、放射線標識したチラミンが、等両市に蛋白質に結合している炭水化物 に結合している、放射線標識された蛋白質を作るものであった。この型の放射性 配位子はりソソマル酵素または酸性条件に曝されても安定である。更に、それは 標識された蛋白質の官能性を変えない。標識の方法においては、シラクチトール ・チラミン（２４μで中、０．５　Ｍ燐酸カリウム中、１００モル、ｐＨ７，７ ）を、標識をイオドゲン（ピアス・ケミカル・カンパニー社、米国イリノイ州ロ ックフォード所在）で被覆した管に入れることによって、最初にＮａ　１２５Ｉ 管の内容物をガラクトース・オキシダーゼ（２μｌ中４ユニツト、シグマ）を含 んだ別の管に移し、３７℃で４５分間温湿した。シアノ硼水素酸ナトリウム（燐 酸カリ緩衝液中１Ｍ溶液の３μｌ）及び牛またはヒト血清アルブ入れたものを管 に加え、次いで３７℃で４５分間更に湿量した。湿量後、１Ｍ炭酸水素アンモニ ウム５０μｌを管に加えた。＋５Ｉ−シラクチトール・チラミン−アルブミンｆ 　０．９　Ｘ　３０．　Ｏａｎカラムでのセファクリル５３００クロマトグラフ イー及び生理食塩水に対する透析によって１２５Ｉ−シラクチトール・チラミン から分離した。結合した蛋白質をアクアサイドで濃縮し、０．４５μｍ膜フィル ターでのろ過によって殺菌した。蛋白質含有量、特異放射能、及びトリクロロ酢 酸による沈澱を測定するためにアリコートを除去した。

放射性標識した血漿中のＢ　Ｓ　Ａ及びＨＳ　Ａ　ｔ−１注射後一定の時間間隔 で得た血漿のアリコート中の、及び血漿を１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）４部 で酸化することによって作った沈澱物中の、放射能測定によってＬヱした。筋肉 注射後のＢＳＡ及びＩ−Ｉ　Ｓ　Ａ蛋白質の吸収の増進がニューシーラントうさ ぎについて証明された。蛋白質溶液を、動物を軽く麻酔している間露出させた腿 の骨ａ筋肉に２５ゲージ針で手動で注射した。

吸収の増進°　放射性標識したアルブミンを１ゴアリコート中、蛋白質のマイク ログラム量と関連させて一分当り１６３４乃至２８９９百万カウントで（特異放 射能＝１．７４乃至３．０２　ｍＣｉＡ）うさぎに投与した。蛋白質は０．９％ ＮａＣ１溶液かまたはヒドロキシルアミンを塩酸塩として４３７５乃至１７５　 ｍ９／ｍｌの濃度で補足した０、９％ＮａＣｌの吸収増進剤にして投与した。

蛋白質の吸収の増進は放射性標識した牛血清アルブミンでも証明できた（２４回 測定）。蛋白質を食塩水だけ１・の平均となった。これと対照的に、塩酸ヒドロ キシルアミンによって吸収を増進させて筋肉注射した後５分間で達成したピーク 値８０％の血漿についてはＴＣＡ沈澱物の放射能は血漿１ｍ７！当り１分につき 平均１６，５８０カウントとなった。同様に、放射性標識したヒト血漿アルブミ ンの注射後は、吸収増進をしないで筋肉注射した後の最初の３０分間は、ＴＣＡ 沈澱物の放射能は血漿１−当り僅かに４１７ａカウントの平均となった。これと 対照的に、注射液１−当り塩酸−塩としてのヒドロキシルアミンを４３．８　ｍ ｆ／入れることによって吸収増進させて筋肉注射をした後最初の３０分間は、Ｔ ＣＡ沈澱物の放射能は血漿１　ｍｌ当り１分につき３２　、８６８カウントの平 均となった（１２回測定）。更に、注射後５分では７５％のピーク放射能が明ら かであった。最初の５分から後の血漿放射能の増大は、放射性標識されたアルブ ミンが循環系からなくなる速度よりも早い速度で連続的に吸収されることによる ものであった。

吸収増進剤の安定性：筋肉内に塩酸ヒドロキシルアミンを投与しても注射部位の 回復できない筋肉の損傷またはうさぎに注射液として食塩水のみを用いた場合に 見られる増進を越えた筋肉損傷の指標である血漿クレアチン・キナーゼの増犬全 大きくまたは顕倣鏡で見て証拠づけるものは表われなかった。蛋白質を入れたま たは入れない食塩水に入れた塩酸ヒドロキシルアミン１７５ｍ９を筋肉注射した 犬の場合、血漿クレアチン・キナーゼは基本線より上に１８％未満しか増加せず 、全体の検査によって注射部位には出血の徴候は明らかでなかった。注射後２時 間して注射部位からとった断面の軽顕微鏡検査ではごく僅かの組織間の炎症があ ることがわかった。吸収があり、最大の影響は注射後２分で見られ、続く数分間 のうちに基本線に戻ることが明らかとなった。心臓速度は漸次平均３２％増加し 、最大の影響は注射後２分で表われ、そして基本線へ急速に戻った。ヒドロキシ ルアミンはメテモグロビネミアを引起すことが知られている。

しかし、蛋白質の吸収を増進するために用いる量では、それは血中の酸素の搬送 に累を及ぼさなかった。メテモグロピンは犬に注射した後２分で８％でピークと なり、そして動脈の酸素圧力は７％以上低下しなかった。

本発明は短かい生物学的半減期を持った蛋白質を投与するのに特に適している。

このように、塩酸ヒドロキシルアミンを利用することによって吸収増進させて筋 肉注射により投与した短い生物学的半減期をもった蛋白質の治療掌上有効な濃度 を３０乃至６０分維持させることが、５乃至８分の循環での半減期を持った筋肉 内に投与されたｔ−ＰＡの吸収を増進して冠状動脈血栓溶解ができることが示さ れた。

峙　１．１　（ＪＩＪン ＦＩＧ、　１ 所間（／ｊ） ＦＩＧ、　４ →Ｆ７（幻 ＦＩＧ、５ 所間（夕） 所間　（９） ＦＩＧ、　６ 国際調査報告

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. （１）哺乳動物に対する治療性を持つた蛋白質を投与する方法てあつて、実質的 に同時に蛋白質を筋肉内に投与しかつ蛋白質の吸収を増大するのに効果的な吸収 増進剤を投与して蛋白質の吸収を増進させる改良方法。
2. （２）蛋白質が短期生物学的半減期を有する、請求の範囲第（１）項記載の方法 。
3. （３）治療上有効な蛋白質濃度が少くとも３０分間持続される、請求の範囲第（ ２）項記載の方法。
4. （４）哺乳動物が人間である、請求の範囲第（１）項記載の方法。
5. （５）哺乳動物が非人間である、請求の範囲第（１）項記載の方法。
6. （６）吸収増進剤がヒドロキシルアミンまたはその無毒性塩である、請求の範囲 第（１）項記載の方法。
7. （７）吸収増進剤が塩酸ヒドロキシルアミンである、請求の範囲第（６）項記載 の方法。
8. （８）治療上有効な蛋白質濃度が少くとも３０分間持続される、請求の範囲第（ ７）項記載の方法。
9. （９）蛋白質が短期生物学的半減期を有する、請求の範囲第（７）項記載の方法 。
10. （１０）蛋白質の治療上有効な濃度が少くとも３０分間持続される、請求の範囲 第（６）項記載の方法。
11. （１１）蛋白質が短期生物学的半減期を有する、請求の範囲第（６）項記載の方 法。
12. （１２）蛋白質が牛血清アルブミンである、請求の範囲第（７）項記載の方法。
13. （１３）蛋白質が牛血清アルブミンである、請求の範囲第（６）項記載の方法。
14. （１４）蛋白質がヒト血清アルブミンである請求の範囲第（７）項記載の方法。
15. （１５）蛋白質がヒト血清アルブミンである、請求の範囲第（６）項記載の方法 。
16. （１６）（ｉ）治療性を有する蛋白質及び（ｉｉ）筋肉内注射をした場合蛋白質 の吸収を増進させるに有効な量の蛋白質の血中吸収を増進させ得る薬剤、を含む 包剤。
17. （１７）蛋白質が短期生物学的半減期を有する、請求の範囲第（１６）項記載の 方法。
18. （１８）吸収増進剤がヒドロキシルアミンまたはその無毒性塩である、請求の範 囲第（６）項記載の包剤。
19. （１９）吸収増進剤がヒドロキシルアミンまたはその無毒性塩である、請求の範 囲第（１７）項記載の包剤。
20. （２０）吸収増進剤が塩酸ヒドロキシルアミンである、請求の範囲第（１６）項 記載の包剤。
21. （２１）吸収増進剤が塩酸ヒドロキシルアミンである、請求の範囲第（１７）項 記載の包剤。