JPS61501547A - ヒトのマラリア寄生虫プラスモディウム・ファルシパルムの後期シゾント−メロゾイト期特有の抗原を産生するｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子及び生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトのマラリア寄生虫プラスモディウム・ファルシパルムの後期シゾントーメロ ゾイト期特をの抗原を産生ずるＤＮＡ配列、組撓えＤＮＡ分子及び生産方法 発明の技術的分野 本発明は、ヒトのマラリア寄生虫（プラスモディウム・ファルシパルム）の後期 シゾントーメロゾイト期特有の抗原を産生ずるＤＮＡ配列１組換えＤＮＡ分子及 びその生産方法に関する。より詳細には、本発明はヒトのマラリア寄生虫（プラ スモディウム・ファルシパルム（ＰｌａｓｍｏｄｉｕＩＩＩｆａｌｃｉｏａｒｕ ｍ）の後期シゾントーメロゾイト期特有の抗原の生産、形質転換した宿主内でそ れらの抗原を生産する方法、及び人間をその寄生虫感染から守るためにそれらの 抗原及びそれらを含む組成物の使用方法に関するものである。

技術的背景 マラリアは世界中の多くの場所で病気及び死亡をひきおこす一つの主原因である 〔第３版　アニュアル・レポート・オン・ザ・スペシャル・プログラム・フォー ・リサーチ・アンド・トレーニング・イン・トロピカル・ディジー：ｌ：、ＷＨ Ｏ。

ジェノバ（１９７９）　）　、世界人工のおよそ１／３の人々が感染の危険にさ らされている。１年に１［５０００万人がマラリアにかかると推定され、アフリ カだけでも年間死亡数は主に子供であるが、約１００万人である（Ｊ、Ａ、ディ ーンズ及びＳ、コーエン「マラリアの免疫学」、了ニュアル・し第９−１７頁（ １’９７８））、従って、マラリアは熱帯及び亜熱帯地域の経済計画を圧迫する 主要素といえる７マラリアは寄生虫プラスモディウムによってひきおこされる。

１００ｆｆ１以上のプラスモディウム属の変種が、広範囲のを椎動物でマラリア をひきおこすことが知られている。しかしながら、これらの種は狭い範囲に限定 された宿主特異性を示す。たとえば、４種のみが人間に感染する。すなわち、Ｐ 。

ファルシパルム（ヱＪｄ二之圧凹）　、Ｐ、　ビバソクス（−ムーヱムー）Ｐ、 マラリアエ（Ｌユｎム社）及びＰ、オバーレ（人工に）である。Ｐ、ファルシパ ルム（ム匡１厘法ωは、これらの種の中で群をぬいて最も致死率が高い。特殊な プラスモディウム種内にも高程度の抗原異質性がある〔たとえばＲ，Ｌ。

コツベル等、［１１アミノ酸より成る繰返し配列をもつプラスモディウム・ファ ルシパルムの特異的抗原の分離」、ネイチャー、第３０６巻、第７５１−５６頁 （１９８３）、ＲｌＦ、アンダース等［数種のプラスモディウム・ファルシパル ムの分離株により合成されたＳ−抗原の特性化−１、プロシーディンゲス・オン ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス、Ｕ　Ｓ　Ａ　、第８０巻、第６ ６５２−５６頁（１９８３））。

マラリアの全世界にわたる撲滅には、多くの実行上の困難がつきまとっている。

これらの問題は、殺虫剤に対する蚊の抵抗性の増加、及びクロロキンのような４ −アミノキノＩＪンを含むより一般的に使われる化学療法剤に対して耐性をもつ マラリア寄生虫が出現したことによって複雑化してきた。従って、マラリアに対 するワクチンの調製が到達点をめざして長い間なされてきており、これからも続 くであろう。

そのようなワクチンの調製は、いろいろな行間によってはばまれている。たとえ ば、培養中に成長した寄生虫からの抗原化合物の製造は、特に有益なワクチンを つくるのに必要な大量規模において極めてむずかしい。加えて、マラリア寄生虫 の生活環は、特異的免疫過程の作用に関し各種の有力な目標を与える。たとえば 、予防免疫は、寄生虫の２つの異なる成長段階（植生期及び無性血中期）につい て操作できる（Ｇ。

■。ブラウン等、「イン・ビトロでプラスぞディラム・ファルシパルムの生育を 阻害するような精製ヒト免疫グロブリンの標的抗原」、ネイチャー、第２９７巻 、第５９１−９３頁（１９８２））。

植生は、蚊にさされるとき体内に注入される。無性の面中期は、マラリアの病状 に大きく関与している。それらは輪状体、栄養体及びシゾントとよばれる一群の 成長段階を経る成熱過程を含む。最後に、無性サイクルの終りに成長シゾントは 赤血球を破裂させ、メロゾイトが循環系中に放出される。

放出されたメロゾイトは次いで他の赤血球膜の特異的リセブターに付着して侵入 をはじめる。それらは、また蚊によって摂取されうる精母細胞と卵母細胞とに分 化し、有性的に再生されて引き続いて感染をおこすための植生をつくる。

植生は免疫系に作用する寄生虫の第一形態であるので、マラリアワクチンの効果 的な標的である。しかしながら、蚊にさされることによって注入された植生が肝 臓でマラリア血になるまでの遷移時間は穫めて短い。さらに、１つの植生が肝臓 に届くだけで、病気をひきおこすには充分である。従って、循環している抗体を １００％の死滅効果を確保するのに必要な循環抗体のレベルは維持することが極 めて困難である。

対メロゾイト期ワクチンは、地域的に成人で発見された免疫型のものが使用され るべきである。植生期には影響をうけないが、肝臓からのメロゾイトの第一世代 はワクチンによって誘導された免疫系の抗体によって攻撃されうる。実際、この メロゾイトの分裂物は、その免疫応答の天然ブースターとして作用するであろう 。他方、対生殖母細胞ワクチンは、伝達連鎖の破壊という理論上の利点をもって いるが、このワクチンはワクチン接種される個々の人を直接には保護しないとい う欠点を有しうる。従って、最適なワクチンは血中期ワクチンとすべきであると 思われる。

無性の血中期の抗原、特にシゾントとメロゾイトの抗原はマラリアに対する予防 免疫について主な役割を果すことが示されている。たとえば、免疫ドナーからの 免疫グロブリンはシゾントーメロゾイト特異的な抗原を認識する（Ｌ、Ｈ，ベリ ン及びＲ，デイヤル、イムノロジカル・レビュー、第６１巻、第２４５−６９頁 （１９８２）；Ｇ、ｖ、ブラウン等、ネイチャー、第２９７巻、第５９１−９３ 頁（１９８２）；Ｊ、Ｈ，Ｌ、ブＬ／　イア　、ｒ、　７−、プレーＪ−７ＷＨ Ｏ，第５７巻、第２４５−４６頁（１９７９））。シゾントーメロゾイトに対す る免疫血清とモノクローナル抗体も、インビトロでの寄生虫生長に対し阻害活性 を示す〔ブラウン等、前出；プレイフェアー前出；Ｌ、Ｈ，ベリン等、ネイチャ ー、第２８９巻、第３０１−３０２頁（１９８１）、Ｌ、シラオフイールド等、 インフェクション・イムノロジー、第３８巻、第８９．３−９７頁（１９８２） ）。

さらに、ベリン等のモノクローナル抗体は、世界中いろいろな地域からのプラス モディウム分離株と反応し、それらの生長を阻害する。サルは慣用のマラリア試 験動物であって、Ｐ、７アル’７　ハフ１／　ム（Ｌ」マ代山υＬ目）のメロゾ イト特異的であることが明らかなポリペプチドの注入の後、寄生虫による静脈の 致死的危機から保護されるということも示されている（Ｌ、　Ｈ，ベリン等、ク リニカル・エクスベリメント・オン・イムノロジー（１９８４）、Ｂ、ベルクリ 等、アブストラクト・オプ・インターナショナル・コンブレス・オン・パラサイ トロジー；カルシエリ−（１９８４））。注目すべきことに、それらの保護ポリ ペプチドは分子量２００，１４０゜８２及び４１にダルトンであり、インビトロ でのＰ、ファルシパルム（ムハ旦江肛２）の生長に対し阻害活性を有する、ペリ ンらのモノクローナル抗体によって免疫沈降されたものと同しポリペプチドであ る（Ｌ、Ｈ，ペリン及びり、デイヤル前出、Ｌ、Ｈ，ペリン等、前出〕。従って 、これらのポリペプチド及び同じ保護活性をもつ他のものをより多く供給するこ とが、マラリアに対する効果的なワクチンを開発するために必要である。しかし ながら、現在、そのような大規模生産を可能にするこれらのポリペプチドの有効 な供給源は存在しない。

いろいろなタンパクと抗原が、適当な宿主中で組換えＤＮＡの技術を用いて生産 されてきた〔たとえばＳ、ナガタ等、「大腸菌におけるヒト白血球インターフェ ロン活性をもつポリペプチドの合成」、ネイチャー、第２８４巻、第３１６−２ ０頁（１９８０）　（ｒ　ＦＮ−α）；Ｃ，Ｊ、バレル等、「プラスミドｐＢＲ ３２２にクローン化されたＢ型肝炎ウィルスＤＮＡ配列の大腸菌での発現」、ネ イチャー、第２７９巻、第４３−４８頁（１９７９）；Ｍ、パセック等、「Ｂ型 肝炎ウィルス遺伝子と大腸菌内でのその発現」、ネイチャー、第２８２巻、第５ ７５−７９頁（１９７９）、（Ｂ型肝炎ウィルス抗原）；Ｈ，クツパー等、「口 蹄疫つ１ルスの主要抗原のｃＤＮＡのクローニングと大腸菌での発現」、ネイチ ャー、第２８９巻、第５５５−５５９頁（１９８１）、（ＦＭＤウィルス抗原） 〕。

マラリア抗原のあるものは、大腸菌内でクローニングされたままとどまっている （Ｋ、Ｇ、オーディンク等、［マラリアの高分子量抗原をコードする遺伝子のク ローニング二分子ｉｆ］、４５，０００のタンパクをコードするプラスモディウ ム・ファルシパルム遺伝子断片の単離」、モレキュラー・パイケミカル・バラサ イト、第１０巻、第５５−６６頁（１９８４）、（分子！　１４５．０００抗原 ）〕。他にも大腸菌内での発現について報告がある。これらには、Ｐ、ノウレジ （−巳上ｎｏｗｌ＋■」からのマラリア植土表面抗原がある（Ｊ、エリス等、［ プラスモディウム・ノウレジのマラリア植生表面抗原遺伝子の大腸菌におけるク ローニングと発現」、ネイチャー、第３０２巻、第５３６−３８頁（１９８３） ｉＧ、Ｎ、ゴドソン等、「プラスモディウム・ノウレジの植生周囲タンパクの順 次反復した免疫原領域の同定と化学合成」、ネイチャー、第３０５巻、第２９− ３３頁（１，９８３））。この抗原は、１２回にわたる３６塩基対の繰返し単位 をもつＤＮＡ配列を特徴とすると報告されている。さらに、この繰返し単位のア ミノ酸配列をもつ化学的に合成されたペプチドは、プラスモディウム・ノウレジ のＨ株のＣＳタンパクに対して作成されたモノクローナル抗体と免疫反応した。

上記に報告された植生抗原は、その繰返し単位をもつコピーの一部でも退化物で もない繰返し単位の両側にアミノ酸を含むといわれる。これらの配列の免疫活性 は研究されていない。

さらに、未同定の「血中期」抗原の一部は、大腸菌にクローン化されかつ発現さ れると云われるＣＤ、Ｊ、ケンプ等「プラスモディウム・ファルンバルム血中期 抗原の大腸菌内での発現：免疫をもつヒトから得られた抗体での検出」、ブロシ ーデインダス・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス、ＵＳＡ、第 ８０巻、第３７８７−９１頁（１９８３））　。

ケンブ等の報告には、血中期抗厘がどんな生長段階の無性血中期抗原に対しても 特異的であるという記述はない。寧ろそれらは赤血球サイクルの全段階の混合物 のＲＮＡに由来するといわれている。ケンプ等の報告には、これらの抗原のあら ゆるものがＰ、ファルシパルム感染からサルを保護することが示されたポリペプ チドのひとつに特異的であるモノクローナル抗体によって特異的に認識されると いうことも１．５示されていない。

ケンブ等の抗原のひとつは、分離株特異的なものであり、１１アミノ酸の繰返し 配列を含んでいると報告されている［Ｒ，Ｌ、コンペル等、「分離株特異的なプ ラスモディウム・ファルシパルムのＳ抗原は、１１アミノ酸の繰返し配列をもっ ている」、ネイチャー、第３０６巻、第７５１−５６頁（１９８３））。この抗 原により生ずる抗体は、成熟栄養体との反応性を有すると共に無性血中サイクル のシゾント期に対しより強い反応性を存するといわれる。それらは、そのサイク ルの未熟な輪状体とは反応しなかった。また、選択された抗原がサルに寄生虫免 疫性を与えるポリペプチドのひとつに特異的なモノクローナル抗体によって、特 異的に認識されるという記述もない（Ｌ、Ｈ，ペリン等、前出〕。

さらに、選択抗原は、分離株特異性であるといわれる。従。

って、それに対する抗原体は、世界中のいろいろな地域のＰ。

ファルシパルムから得た抗原とは交差反応しない。

発明の開示 本発明は、後期シゾントーメロヅイト期の特異的抗原をコードするＤＮＡ配列の いろいろな種類を単離することにより、上記問題を解決する。これらの配列は、 その後、適当な宿主の形質転換及びそれらによってコードされる抗原の生産に用 いられる。

本発明によって生産されたこれらの抗原は、マラリア感染したヒト血清及び既知 のマラリア予防抗原に特異的なモノクローナル血清（α２００　Ｋ、　α１４０ に、α８２Ｋ及びα４１Ｋ）のプールで認識される。本発明の抗原は、少なくと もサルをマラリアから守ることが示された抗原（２００ｋｄ）のひとつを免疫沈 降する抗体を動物で産生ずる。さらに、これらの抗体は、免疫螢光試験で、いろ いろな地域からのＰ、ファルシパルムの分離株と反応する。

従って、本発明の抗原は、“７ラリアに対する世界的に有効な予防組成物及び方 法にを用である。それらもしくはそれらの抗体も、いろいろな血液サンプル中の マラリア感染を検出する診断手段及び方法として有用である。

上記のことから、本発明の基本的特徴はＰ、ファルシパルムの後期シゾントーメ ロゾイト期特有抗原の発現をコードする各種のＤＮＡ配列の選択及び特性化であ ることが判るであろう。これら種類のＤＮＡ配列は、Ｖ１４．Ｇ２．Ｒ］、４゜ Ｄ４．ＸＩ　１．Ｍ２．Ｔ５．Ｍ７．Ｖ４．Ｄ８．Ｉ　４及びＥ８よりなる群か ら選択される。各種類は、本発明によって生産される同名の特定ｃＤＮＡクロー ンへのクロス・ハイブリダイゼーションを特徴とする６従って、これらの特定種 類の付加的なものは、天然１合成、半合成源及び特に人間に感染する各種プラス モディア種のＤＮＡ配列の遺伝子バンクから選択されうる。

本発明のＤＮＡ配列はさらに、マラリア感染について世界的に有効な保護及び診 断への用途に有用となる高レベルで、後期シゾントーメロゾイト期特有の抗原を 発現させるという特徴を存する。

本発明の実施における最良方法 ここに開示する発明を十分に理解するため、以下詳細に説明する。

この説明において以下の用語を用いる：ヌクレオチド：糖部（ペントース）、リ ン酸及び窒素複素環式塩基よりなるＤＮＡあるいはＲＮＡの単量体単位。塩基は グリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介し糖と結合し、糖と塩基との結合 体はヌクレオシドとよばれる。塩基はヌクレオチドを特性化する。４つのＤＮＡ 塩基はアデニン（ｒＡＪ　”）、グアニン（ｒＧＪ）、　シトシン（ｒＣＪ　） 及びチミ７　（ｒＴＪ　）である、、４つのＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃ及びウラシ ル（ｒＵＪ）である。

一旦至しム酉菱吐：となりあったペントースの３′と５′の炭素がホスホジエス テル結合で互いに連結した直鎖状デオキシヌコドン：　ｍＲＮＡを介してアミノ 酸、翻訳開始シグナルもしくは翻訳停止シグナルをコードする３つのヌクレオチ ド（トリブレット）のＤＮＡ配列。たとえば、ヌクレオチド・トリゾＬ／　７ト ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡ及びＣＴＧはアミノ酸ロイシン（ｒＬ ｅｕＪ）をコードし、ＴＡＧＴＡＡ及びＴＧＡは翻訳停止シグナルであり、かつ ＡＴＧは翻訳開始ソゲナルである。

藁葺１上ユム：　ｍＲＮＡからアミノ酸への翻訳の際のコドンのグループ化。翻 訳の間、正しい解読フレームが維持される。たとえば、ＤＮＡ配列ＧＣＴＧＧＴ ＴＧＴＡＡＧは、３つの解読フレームまたは相を示しており、それらの各々はち がったアミノ酸を与える： 立旦ユ　立旦ユ　ニ立工　人人玉：ＡＩａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓａｌ シ基の間がペプチド結合で互いに連結されたアミノ酸の線状列。

ゲノム：細胞あるいはウィルスの全ＤＮＡ、特に物質のポリペプチド並びにオペ レーター、プロモーター及びシャインーダルガーノ配列のような配列を含むリポ ソーム結合・相互作用配列をコードする遺伝子を包含する。

遺伝子：鋳型あるいはメツセンジャーＲＮＡ　（ｒｍＲＮＡＪ）を介してｍＲＮ Ａからの特異的ポリペプチドに特性的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。

発現：遺伝子がポリペプチドを産生ずる過程。転写と翻訳との組合せ。

プラスミド：プラスミドが宿主細胞内で複製するような完全「レプリコン」を含 んだ非染色体２本鎖ＤＮＡ配列。プラスミドを単細胞生物内に存在させると、そ の生物の特性はプラスミドＤＮＡによって変化するか、または形質転換される。

たとえば、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔ’）の遺伝子をもつプラスミドは従前 にテトラサイクリン感受性であった細胞を形質転換させて耐性にする。プラスミ ドで形質転換された細胞は形質転換株と呼ばれる。

ファージもしくはバタテリオフ　−ジ：バクテリアのウイルスであり、その大部 分はタンパク膜あるいは外殻（カプシド）でカプシド化されたＤＮＡ配列より成 る。

クローニング・ビークル：宿主細胞内で複製可能であるプラスミド、ファージＤ ＮＡもしくは他のＤＮＡであり、１つあるいは少数のエンドヌクレアーゼ認識部 位によって特徴化され、その部位でＤＮＡ配列は不可欠な生物的機能、たとえば 複製、コートタンパクの生産、プロモーターや結合部位などの損失を伴なわずに 決定しうる方式で切断できる。また、それらは形質転換細胞の同定に適当なマー カー、たとえばテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性を含んでいる。クロー ニングビークルはしばしばベクターとよばれる。

クローニング：無性的再生によって生物もしくはＤＮＡ配列に由来するような生 物もしくはＤＮＡ配列を大量に得るための過程。

組換えＤＮＡもしくはバイブリドＤＮＡ　：異なったゲノムからのＤＮＡの部分 を含み、生細胞体外で末端と末端を結合しかつ生細胞中で維持できるようにした 分子。

ＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター・プロモーター領域、ｆｄコートタン パクの制御領域、ＳＶ４０の初期及び後期グロモーター、ポリオーマウィルス、 アデノウィルス、シミアンウィルスに由来するプロモーター、３−ホスホグリセ ゛リン酸キナーゼあるいは他の解糖系酵素のプロモーター、Ｓ母酸性ホスファタ ーゼ、たとえばＰｂｏ２などのプロモーター、酵母α接合型因子のプロモーター 及び前核・翼核細胞とそれらのウィルスあるいはその組合せの遺伝子を制御する ことが知られている他の配列などが含まれる。

Ｐ、ファルシパルムの後期シゾントーメロゾイト期特異的トーメロゾイト発育期 に特異的である。（２）サルで予防効果のあるマラリアのポリペプチド特異的な モノクローナル抗体によって特異的に認識される。（３）少なくともナルで予防 効果のあるマラリアのポリペプチドの少なくとも１つの免疫沈降させる抗体を産 生ずることができる、ようなポリペプチド。

以下、ヒトマラリア寄生虫Ｐ、ファルシパルムの後期シゾントーメロゾイト期特 有の抗原をコードするＤＮＡ配列の選択と、それらの配列で形質転換した宿主内 でのこれら配列の発現の方法を１実施例につき説明する。

あるポリヌクレオチドがＰ、ファルシパルムの後期シゾントーメロゾイト期特有 であるかどうかの決定本出願はインビトロでヒト赤血球にＰ、ファルシパルムの ５ＧＥＩ分離株を感染させた（Ｌ、　ロドリゲス・デ・ジルバ等、プレチンＷＨ Ｏ１第６１巻、第１０５−１１２頁（１９８３）　）。

そののち、インビトロで、Ｗ、トラガーとＪ、Ｂ、ジエンセン、サイエンス第１ ９３巻、第６７３−７５頁（１９７６）の方法に従って、これらの細胞を培養し た。ロドリゲス・デ・ジルバ等によって述べられたように上記培養の同調化を計 り、それに続いて培養液をインビトロで１０％の正常ヒト血清を加えたメチオニ ンを含まないＭＥＭ中で３５３−メチオニン（５９μＣｉ／ｍｌ）で標識した。

１０％ＮＰ４０でのリシス（Ｉｙｓｉｓ　）と遠心分離ののち、ＴＣＡ沈殿され る３０，０ＯＯｃ　ｐ　ｍの抽出物を還ｒ状態でアクリルアミド−３ＤＳゲルに かけて分析した［Ｕ、に、レムリー、ネイチャー、第２２７巻、第６８０−８３ 頁（１９７０））。

それにより、合成されたタンパクの大多数はＰ、ファルシパルムの異なった発育 期に共通であるということを見出した（第１図）、シかしながら、少数のタンパ クは成熟型かあるいはメロゾイトを含む分裂シゾントでのみ合成されるというこ とも見出された（第１図、矢印）。これらのバンドの相対的な集積量は、この少 数のタンパクが後期シゾントとメロゾイトの主要構成物であることを示している 。

これらのポリペプチドは後期シゾントーメロゾイトに特異的であるためかつその ような世代特異的ポリペプチドはサルで予防効果をもつことが示されているので 〔ベリン等前記〕、感染赤血球細胞からｃＤＮＡを調製し最後にこれらのシゾン トーメロゾイト期特有のポリペプチドをクローニングと発現化させることによっ て、ポリ　（Ａ）ＲＮＡを単離した。

Ｐ、ファルシパルムのポリ（Ａ）ＲＮＡの調製ヒ）赤血球細胞にＰ、ファルシパ ルム（ザイールで採取された分離株５ＧＥ２）を感染させ、非同調培養で１５％ 寄生虫血症に生育させた。その後、６Ｍグアニジン・イソチオシアネート　０． １Ｍ２−メルカプトエタノール、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）及 び０．５％Ｎ−ラウロイルザルコシンから成る溶液中で感染細胞をホモジネート し、５．７Ｍ塩化セシウムでＲＮＡの遠心分離することにより、培養物から全Ｒ ＮＡを調製した（Ｊ、Ｍ、チルブライン等、バイオケミストリー、第１８巻、第 ５２９４−９９頁〕。それから、オリゴｄＴセルロースでアフィニティー・クロ マトグラフィーによってポリ　（Ａ）ＲＮＡを精製した。

マラリアｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーの作成及びその関連クローンにつ いて後期シゾントーメロゾイト期特をのものを選択するためのスクリーニングＣ ，Ｔ、　ウエイク等ｒＨＬＡ−ＤＲ鎖をコードするｃ　ＤＮＡクローンの単離」 、プロシーディンゲス・オン・ナショナルアカデミ−・オン・サイエンス、ＵＳ Ａ、第７９巻、第６９７９＝８３頁（１９８２）に実質的に記された方法に従っ てｃＤＮＡを合成し、オリゴｄＣを末端付加し、Ｐｓｔｌで開裂させ、オリゴｄ Ｇを末端付加したｐＢＲ３２２にクローニングすることによって、上記ポリ（Ａ ）ＲＮＡからｃＤＮＡクローンのライブラリーを作成した。

次いで、大腸菌Ｔ（８１０１株をこれらのｃＤＮＡで形質転換し、そのライブラ リーの約９０００のクローンを生−′！させ、それらをニトロセルロースフィル ターにレプリカしたＣＤ。

ハナハン及びＭ、メセルソン、ジーン、第１０巻、第６３−６７頁（１９８０） ）。

後期シゾントーメロゾイト期特有のそれぞれのｃＤＮＡに関連したクローンを選 択してこのライブラリーをスクリーニングするために、Ｌ、ロドリゲス・デ・シ ルバら（前出）によって述べられた方法の変法に従って、輪状体期に濃縮したＲ ＮＡ＆ｉ製物から全ＲＮＡ及び成熟シゾントーメロゾイト期に濃縮した全ＲＮＡ を各々調製した。

Ｐ、ファルシパルム分離株５ＧＥ２　（ザイール採取）からの寄生化赤血球を直 径１０Ｃ１１のファルコンペトリ皿に１１ｍ１の６％へマトクリソト培地で培養 したＣＬ、ロドリゲス・デ・シルバ等、前出、Ａ、Ａ、ホルダー及びＲ，Ｒ，フ リーマン、ネイチャー、第２９４巻、第３６１−６４頁（１９８１）　）。

次いで、７時間間隔で２回の５％マンニトール処理によって、２２％寄生虫血症 に２５枚のペトリ皿の細胞を同調化させた。

２２時間後、これらの培地は９％の寄生虫血症をもち、８０％以上のシゾントを 含んでいた。フィジオゲルでのフローテーションによってンゾントを精製し、培 養液でこれらを洗浄したのち、未感染赤血球と５：ｌの割合で混合した。ここで は再侵入間を６時間に限定し、マンニトール処理によって残っている成熟型をリ ンスさせた。それからこの細胞を１０枚のベトリ皿にまいた。６時間の付加培養 ののち、５枚のベトリ皿から細胞を集め（輪状体の調製）、残りの５枚は３３時 間の付加培養ののち細胞を集めた（成熟分裂シゾント）。これらの培養物は各々 １２％の寄生虫血症（細胞）とそれぞれ９７％以上の輪状体（及び少数の若い栄 養体）及び９５％以上の分裂したシゾント（少数の若いシゾント）をもっていた 。

これらのリッチなＲＮＡ１製物から、１本鎖型　Ｐ−ｃ　ＤＮＡプローブを定法 で調製した。その後、これらのＣＤＮＡライブラリーをニトロセルロースフィル ター上でのコロニー・ハイブリダイゼーション法で一木鎖型ｃＤＮＡをプローブ としてスクリーニングしたＣＭ、グルンスティン及びり、ホグネス、ブローシデ インダス・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス、ＵＳＡ、第７２ 巻、第３９６−６５頁（１９７５））。

本出願人は上記の標識プローブでスクリーニングするために、本実験のライブラ リーのクローンを含むニトロセルロースフィルターを調製した。５０Ｐｇ／ｎ＋ １の変性サケ精子ＤＮＡとｌμｇ／ｍｌボＩＪ　Ａを含む２　ｘＳＳＣ（１ｘＳ ＳＣ＝０．１５ＭＮａ　ｃ　！、０．１５Ｍ　クエン酸ナトリウム）、１×デン ハートで６５℃２時間フィルターのプレハイブリダイゼーションを行なった。そ の後、標識プローブを最終濃度が２〜４×１゜ｃｐｍ、／ｎｌになるように加え 、１６時間バイブリド化した。

次いで、フィルターを５×３０分間、２ＸＳＳＣ中で洗浄し、約１６時間オート ラジオグラフした。

コロニーの大部分は両方のｃＤＮＡプローブとバイブリド形成したが、スクリー ニングした９０００のうち約１５０コロニーは後期シゾントーメロゾイトリノチ なｃ　ＤＮＡプローブとのみ選択的・排他的にバイブリド化した。本発明では、 これらのコロニーを大腸菌ＨＢＩ　Ｏ１（ｐＢＲ（Ｐｓ　ｔ）／Ｘ）　（ここで Ｘはフィルター上での当該クローンの位置を示すものである）のように示した。

たとえば、そのようなりローンのひとつは大腸菌ＨＢＩＯＩ　（］）ＢＲ３２２ （Ｐｓｔ）／Ｄ４）である。各々のクローンｐＢＲ（Ｐｓ　ｔ）／Ｘ’Ｔ：特徴 づけられた組換えＤＮＡ分子と挿入ＤＮＡ配列Ｘを示した。

ここでも、ｒＸＪは当該クローンの位置を示す。たとえば上記のＤ４゜ 格子フィルター上でシゾントーメロゾ−（トリソチなプローブで、より強力なシ グナルを示すクローンを拾い出し、前記のようにフィルターをレプリカした。そ の後、選択ｃＤＮＡクローンを前記と同条件下において２つのプローブで再バイ ブリド化した。この第２のスクリーニングの結果を第２図に示す。（Ａ）は後期 シゾントーメロゾイトリフチなプローブでのスクリーニングを示し、（Ｂ）は輪 状体リッチなプローブでのスクリーニングを示している。

Ｐ、ファルシパルム生育の過程の世代特異的様式で活性化されるＤＮＡ配列に対 応するこの第２のハイブリダイゼーションの後、コロニーを選択するためにＲＮ Ａ　（プロット）ヲ輪状体と後期シゾントーメロゾイト期の両方から上記の方法 。

で調製し、それらをここでの選択クローンのいくつがからとり出した３２ｐ−標 識プラスミドＤＮＡとバイブリド化させた。

バイブリド形成のために全ＲＮＡのサンプルをとり（１連あたり４μｇ）、それ らを変性させ、０．８％アガロースゲルで電気泳動したＣＧ、に、マクマスター 及びＧ、Ｇ、カーミノシェル、プロシーディンゲス・オン・ナショナル・アカデ ミ−・オン・サイエンス、第７４巻、第４８３５−３８頁（１９７７））。エチ ジウムブロマイド染色は、メロゾイト（Ｍ）及び輪状体（Ｒ）の両方に等量のＲ ＮＡが存在することを示している。その後、ＲＮＡをＤＢＭ紙゛に移し、バイブ リド化と洗浄を、Ｇ、Ｍ、バール等によるプロシーディンゲス・オン・ナショナ ル・アカデミ−・オプ・サイエンス、ＵＳＡ、第７６巻、第３６８３−８７頁（ １９７９）の方法に従って行なった。バイブリド化プローブのために、個々の後 期シゾントーメロゾイト期特有コロニーのいくつかから調製したプラスミドＤＮ Ａを、ニック・トランスレーシランしたＣＰ、　Ｗ、Ｊ、リグビー等、ジャーナ ル・オプ・モレキュラー・バイオロジー、第１１３巻、第２３７−５１頁（１９ ７７））。バイブリド化のために、５Ｘ１０’ｃｐｍ／ｍｌの濃度でこれらのプ ローブを用いた。

第３図は２つのこのようなノーザン・プロット　ハイブリダイゼーションの結果 を示す：　（Ａ）ｃＤＮＡＤＮＡプローンＤ４（Ｂ）ＣＤＮＡＤＮＡプローンＸ Ｉ；Ｍ−後期シゾントーメロゾイトＲＮＡプロット、Ｒ−輪状体ＲＮＡプロット 。これらのノーザン・プロットは、それらのｍＲＮＡが異なる大きさと量をもっ ことを示している。それらはまた新しい遺伝子の活性化が、転写レベルで特殊な 寄生虫生育期におこることも示唆している。また、２つのクローンは異なったマ ラリア遺伝子に関与することも示している。

後期シゾントーメロゾイト期特有のクローンの種々の種類の選択 本発明の後期シゾントーメロゾイト期特有クローンを関係のある種類に分類する ため、いくつがのクローンの挿入物をプローブとして用い、ハイブリダイゼーシ ョンによって他のクローンの関連配列として同定した。

これらの個々のクローンからの挿入物をＰｓｔｌで切断し、１％アガロースゲル 上で精製して、ＤＥＡＥ−セルロース紙を用いて抽出をおこないＣＧ、ドレソツ エン等、アナリティカル・バイオケミストリー、第１１２巻、第２９５−９８頁 （１９８１））。それらをニック・トランスレーションした。その後、上記で示 したものと同じ条件下で、それらの標識挿入物をプローブとして３２Ｐ−ｃＤＮ Ａメロゾイトリソチなプローブ及び輪状体リッチなプローブとのハイブリダイゼ ーションに用いた。

第４図は、上記（第２図）で選択された後期シゾントーメロゾイトｃＤＮＡクロ ーンのレプリカを用いたこの「関連化」バイブリド形成の結果を示すオートラジ オグラフであり、旦ユニ■切断挿入物がクローン（Ａ）Ｄ４及び（Ｂ）Ｖ１４か らのものを示す。

同様の「関連化」バイブリド形成により、ここでの１３３個の後期シゾントーメ ロゾイト期特異的クローンを１２種の重複しない種類のクローンに分類すること ができた。＊＊　残り１７種のクローンは、工２の種類のどれにも属さない。し かしながら、それらはおそらく他の後期シゾントーメロゾイト期特有の種類をあ られすであろう。

第１表 各々の種類のクローンの数から、これらの１２の種類はＰ。

ファルシパルムの後期シゾントーメロゾイト期特異的に発現するタンパクの豊富 に存在する及びかなり豊富に存在するタンパクをコードするＤＮＡ配列であろう と結論した（例えば第１図）。

上述したノーサンＲＮＡプロットに基づいて、これらの１２の系列は異なるマラ リア遺伝子に関与することを示した。

従って、Ｐ、ファルシパルムの成長期サイクル中で輪状体からメロゾ・イトに至 る寄生虫の成熟は、比較的小さなセットのＤＮＡ配列の選択的活性化によるとし た。さらに、これらのＤＮＡ配列には、いろいろな活性化の程度がある。そのよ うな選択的な遺伝子の活性化はショウジヨウバエ（Ｅ、　Ａ、フィルデング等、 セル、第３３巻、第１１５−１２３頁（１９８３））、カイコガＣＴ、Ｈ，エイ ツクブツシュ及びＦ、Ｃ，カファトス、セル、第２９巻、第６３３−４３頁（１ ９８２）〕及びタマホコリカビＣＭ、Ｃ，メヒデイ等、セル、第３２巻、第７６ ３−７１頁（１９８３））の成長過程でも報告されている。

上記と同様の条件下で、これらのクローンの種類から選択されたクローンを用い た同様のハイブリダイゼーションは、それらの種類の他のメンバーを天然１合成 、半合成、あるいはＰ、ファルシパルムの遺伝子バンクを含む他を出所とするＤ ＮＡ配列のコレクションから選び出すために用いうる。

上記と同様の技術はＰ、ビバックス（Ｐ、ν１ｖａｘ　）　＋　Ｐ、マラリアエ （Ｐ、ｍａｌａｒｉａｅ）及びＰ、オバーレ（Ｐ、ｏｖａｌｅ　）のような他の プラスモディウム種の後期シゾントーメロゾイト期特異的タンパクをコードする ＤＮＡ配列の種類を選択しうる。

後期シゾントーノロゾイト期特育抗原の生産本発明による種々な種類のＤＮＡ配 列でコードされる後期シゾントーメロヅイト期特有の抗原を生産するために、ｃ ＤＮＡクローンのもう一つのライブラリーを作成した。このライブラリーは、ク ローンのために発現ベクターｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓ　ｔ　（Ｈ，クツパーからの寄 贈）及び大腸菌（一旦ユｃｏｌｉ）ＭＣ１０６１（ｐｃｒ８５７）を用いた以外 は、はぼ前述したと同様にポリ　（Ａ）ＲＮＡから作成した。

発現ベクターｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓ　ｔはｐＰ　Ｌ　ｃ　２４　（Ｅ。

リマウント等、ジーン、第１５巻、第８１−９３頁（１９８１））の派生物であ る。このベクターはベクターの？、５３２部分をコードする配列の下流に、Ｐｓ ｔＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位をもつという特徴がある。また、修飾され たアンピシリン耐性遺伝子をもっている。この修飾遺伝子は、ｐＵＣ８〔たとえ ばＵ、ルーサー等、モレキュラー・ジェネラル・ジエネティクス、第１７８巻、 第４７５−７７頁（１９８０）参照〕に由来し、立上ユ■部位をもたない。従っ て、このベクターはプロモーターとＭＳ２のコード領域の下流に唯一のヱユ」■ 部位をもち、そこにベクターのＰＬプロモーターの制御下に発現させたいｃＤＮ Ａを挿入する。

この発現ベクターにおける、この場合のライブラリーでは約２１　、０００のク ローンを生じた。それらのクローンのうち後期シゾントーメロゾイト期特異的抗 原に関するものを選ぶため、最初に本発明の前述の１２種類のクローンから取っ た各々のプローブから成る混合ハイブリダイゼーション・プローブで、このライ ブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションの条件は、前記のクロ ーン種類の選択のためのものとほぼ同じであった。この方法で約５００のクロー ンを選択した。その後、これらのクローンを前記種類からの個々のプローブでス クリーニングし各々の種類に分類した。ここでもハイブリダイゼーションはほぼ 同条件で行なった。このライブラリーから１２Ｍ類全部の代表を分離した。

ランダムに４つの種類のクローン（Ｒ１４，Ｇ２．Ｖ１４゜及びＸ１１）の各々 から１５のクローンを選択し、アンピシリンとカナマイシンとを添加したし一ブ ロースでそれらを３０℃にて一晩液体培養した。それから培養物を１：４で同様 に添加した４２℃のし一ブロースで希釈し、４２℃にてそれらを３時間誘導させ た。

ここでは最終培養物を２つの方法で処理した。１つは一定量をとり、リゾチーム で細胞を溶菌し、凍結融解し、遠心分離して標準的なＥＬＩＳＡ検定法で上澄を 分析した。この検定法では、本細胞抽出物をサルで予防効果のある２　００　Ｋ 。

８２Ｋ及び４１にのマラリア抗原に特異的なモノクローナル抗体〔ペリン等、上 記〕の支持体結合プールに加えた。その後、アフィニティ精製しておいた酵素結 合ウサギ抗ネズミ免疫グロブリンを加えた。色素反応によって陽性抽出物が検出 された。この試験結果を第２表に示す。

第二として、培養物の一定量をとり、細胞を遠心分離し、沈殿物をレムリー緩衝 液に懸濁し、溶液を煮沸して還元条件下でポリアクリルアミド−３ＤＳゲルにの せて分析した〔レムリー、上記〕。対照としてここではマラリアｃＤト丁入挿入 　物をもたないクローンから調製した培養物を用いた。対照と比較して、付加的 なバンドを見ることによってゲルを分析した。ゲル試験の結果も併せて第２表に 示す。

第２表 Ｘｌｌ　Ｋ４　−　−　− Ｘ１２　−　−　− Ｒ１４Ｂ８　−　−　− Ｄ１２　−　Ｄ１２　Ｄ１２ −　Ｄ］５−− −Ｊ１８Ｊ１８− ＊　本発明の発現ベクター中の各々のｃＤＮＡには２つの可能な方向性と３つの 可能な解読フレームがあるので、ｃＤＮＡが正しいマラリアのポリペプチドを発 現する可能性は１／６である。ここでは、少なくとも１つでも発現する可能性を 高めるために、各々の種類から１５個のクローンを選んだ。

＊＊　これらはこの場合においてゲル上で観察される付加的なバンドをもつクロ ーンであった。他のクローンの付加的バンドは他のゲルバンドによって覆い隠さ れてしまったのであろう。

＊＊本　本発明のクローンによって産生される抗体のいくつかは、この試験で用 いられた３つのタイプのモノクローナル抗体に特異的ではないである・）。寧ろ それらはマラリアを予防する抗原に特異的である、他のモノクワ−ナル抗体灯特 異的であろう。

この場合の他の種類のクローンも同様に分析しうる。これらのクローンによる各 々の抗原のウェスタン・プロットも、マラリア抗原を予防するポリペプチドに特 異的な個々のモノクローナル抗体〔たとえばり、Ｈ、ペリン等〕を用いて行ない うる。最終的に、本発明のマラリア抗原をネズミもしくはウサギ１′：注入し、 生じた抗体をマラリアの予防ペプチドを免疫沈降するために用いた〔たとえばり 、Ｈ，ペリン等〕。

ここではさらに、研究をすすめるためにクローンＸ１ｌ−０１１とＲ１４−Ｒ８ を選んだ。上記のようにアンピシリンｃｏｌｉ）５３７　（ｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓ ｔ　（Ｘｌｌ−０１１）及び大腸菌＜Ｅ、ｃｏｔ　１）５３７　（ｐＰＬ３１八 −Ｐｓｔ（Ｒ１４−Ｒ８）を３０℃で一晩液体培養した。４３℃での培養物のし 一ブロースとの１：４希釈ののち、４３℃でそれらを３時間保温した。次いで、 遠心分離、ＰＢＳ洗浄及び音波処理によって抽出物を調製し、再懸濁した沈殿物 を、全寄生虫タンパク（ガンビア）に対して生したウサギ抗血清から４１にタン パクＣＬ、ペリン等、上記〕をアフィニティクロマトグラフィーで除去したもの によりウェスタン・プロットで分析した。

Ｘ１ｌ−０１１抽出物は、血清によって特異的に認識される成る種のタンパク産 物（高収量）が存在するという特徴をもつ。また、２００ｋｄマラリアタンパク に特異的な抗血清によっても認識される。Ｒ１４−Ｒ８抽出物は上記の全寄生虫 血清とは反応しなかった。しかしながら、感染者の血を用いたその後の免疫診断 試験は、、Ｒ１４−８８抗原が感染患者に存在することを示し、た。

また、このＸ１ｌ−０１１培養物の抽出物を、ＰＢＳ洗浄沈殿物を６Ｍ尿素に再 懸濁しかつその混合物を再遠心することによって調製した。次いで、上澄をウサ ギに接種させ、抗ｒｆｎ隋を生じさせるために用いた。この抗血清は、インビボ で標識されたメロゾイト寄生虫の２００ｋｄのタンパクと免疫沈降した−弱く） 。

クローンＸ１ｉ−０１１の部分的なりＮＡ配列が解明され、その中には５アミノ 酸の反復があった。しかしながら、その配列はクローン３１〜１あるいはＦＣＣ −１で決定された配列（後述）のどの部分とも重なり合わなかった。

また、クローン系列Ｄ４からの部分的ＤＮＡ配列をも得た。

この配列は４アミノ酸の反復という特徴をもっている。しかしながら、これらも Ｘ１ｌ−０１１，３１〜１及びＦ　ＣＣ−１の配列と重なり合わなかった。

他のンゾントーメロゾイト期特異的抗原の生産Ｐ、ファルシパルムの後期シゾン トーメロゾイト期特異的抗原を生産するためのもう一つの試みとして、はぼ上記 と同法で調製されたポリ　（Ａ）ＲＮＡから８１を用いてｃＤＮＡを調製した。

次いで、このｃＤＮＡを用いて、上記のように制限切断エンドヌクレアーゼＰｓ ｔ＋で切断し、ｄＣ，／ｄＣ末端付加した発現ベクターｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓｔで ｃ　ＤＮＡライブラリーを作成した。ｄＣ付加ＤＮＡをｄＧ付加した立工工Ｉ開 裂ベクターに挿入し、コンピーテント大腸菌（Ｌｃｏｌ　１）Ｃ６００（ｐｃｉ ８５７）を形質転換した（以下、「大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）５３７Ｊと云う）。

その後、４０／ｊｇ／ｍｌアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加 したし一ブロースに入れ、３０℃にて一晩生育させ、その後４２℃にて５時間生 育させた。高い方の温度では培養中の細胞はＭＳ２融合タンパクの一部として挿 入ＤＮＡ配列の発現が誘導される〔たとえば１、クツパー等の文献（上記）〕。

ココロニを、５％ＳＤＳを含む緩衝塩溶液中で溶菌した。

その後、フィルターを６５℃で３０分間加温し、電動プロット機を用いてフィル ターにタンパクを固定した。次いで、これらのコロニーから得られた固定化タン パクを、全寄生虫タンパク（ガンビア）に対して生したウサギ抗血清から４１に タンパク（Ｌ、ベリン等前出〕をアフィニティ、クロマトグラフィーで除去した ものでスクリーニングした。１２５１−スタた。、゛、れらのコロニーをニトロ セルロースフィルターに移し、上記のようにスクリーニングした。ここでは、ｔ （ｉの陽性コロニーを分離した二大腸菌（Ｅ、ｃｏ　ｌ　１）Ｃ６ＱＯ（ｐＣＩ ８５７）（ｐＰＬ３ＬＡ−Ｐｓｔ　（Ｐｓｔ）／１）（以下、「大腸菌（Ｅ、ｃ ｏｌ　１）Ｃ６００（ｐ３１　１９）Ｊあるいは「大腸菌（Ｅ、ｃｏｔ　１）５ ３７　（ｐ３１−１）ｊと云う）。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｔ）５３７　（ｐ３１　１＞を上記のようにアンピシリンと カナマイシンを添加したし一ブロース中で３０℃にて一晩生育させた。４３℃の し一ブロースで培養液を１：４に希釈した後、４３℃で３時間保温した。その後 、遠心分離、ＰＢＳ洗浄及び音波処理によって抽出物を調製し、再懸濁した沈殿 物を上記のようなウサギ抗血清を用いたウェスタン・プロットで分析した。この 分析により、血清によって特異的に認識される抽出物中の３０にタンパク（１４ にのＭＳ２タンパクと１６にマラリア抗原）が見出された。このタンパクは全細 胞質タンパク量の約２〜３％を占めている。

また同様に、誘導した大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）５３７（ｐ３１−１）の培養物か ら、ＰＢＳ洗浄沈殿を６Ｍ尿素に懸濁し、その混合物を再遠心することによって 抽出物をｍ製した。次いで、その上澄をウサギに接種して、その中で抗血清を生 じさせるために用いた。この血清はインビボで標識したメロゾイト寄生虫タンパ クと免疫沈降した。続いて行なったＳＤＳゲルは、シゾント開製物から沈殿した タンパクが２００にのマラリア予防タンパクであり、生産物に関係することを示 した〔ベリン等、上記〕、精製メロゾイト調製物中で抗血清はメロゾイト表面に ある８３ｋｄポリペプチドを認識した。従って、この抗原はメロゾイトの成塾過 程の間に変化したものである。従って、ｐ３１〜１によって産生される抗原は既 知のマラリア予防用抗原に関連している。さらに、この３１−１タンパクに対し て生したウサギの抗血清は、常用の免疫螢光試験法〔Ｐ、オニール及びＧ、Ｄ、 ジョンソン、ジャーナル・オン・クリニカル・バソロジー・、第２３巻、第１８ ５−９３頁（１９７０））で、インビトロで生育し、た種ｌの地域からのＰ、フ ァルシパルム分離株、たとえば５ＧＥ２　（ザイール）、ＦＵＰ　（パロ・アル ド）、ＦＣＲ３クローンＡ２．ＦＣＣ２（中国）及びＭ２Ｓ　（ホンジュラス） の無性血中期と反応した。抗血清は固定化シゾントの内部成分と反応し、固定化 及び未固定のメロゾイトの表面と反応した。

３１−１タンパクの免疫学的特徴は、２００ｋｄタンパク〔ベリン等、上記〕の 一部分と同一である。３１−１タンパクによってコードされる抗原部位は、８３ ｋｄのメロゾイト表面タンパクに保持され、２００ｋｄのシゾントタンパクがイ ンビボでプロセシングをうけて生じたものであることも示された。

ｐ３１−　Ｉ　ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を決定し、そこから読みとれる アミノ酸配列を示した。配列決定のためにｐ３１−１ｔ一旦！ユＨＴと乱ヱ」■ で制限切断し、マクサム・ギルバート配列決定法を用いた。

ｐ３１−Ｉ　ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列及びそこから読みとれるアミノ酸 配列を第５図に示す。第５図に示されたように、ｐ３１−ＩＤＮＡ挿入物から読 みとれるアミノ酸配列は３つの領域に分けられる＝４３アミノ酸よりなる独特の 配列、３０アミノ酸の３アミノ酸の反復（ｓｅｒ−ｇｌｙ−ｇｌｙもしくは５ｅ ｒ−ｖａｌ−ａｌａｓ、及びそれに続く２０アミノ酸の独特の配列。これらの配 列は、他の公開され特衣昭６１−５０１５４’７　（１Ｑ）たマラリア配列に関 連がない。

また、ｐ３１−１の１ｍｍＨＩ一旦ヱユｎ断片をゲルで精製したのち、ニック・ トランスレーションして上記１５０個のＰ、ファルシパルムの後期シゾントーメ ロゾイト期特異的抗原をコードするＤＮＡ配列の１２ｆｔ類に含まれる陽性コロ ニーを、スクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとした。ハ イブリダイゼーションは２ＸＳＳＣ中で６５℃で行ない、フィルターの洗浄も同 条件で行なった。しかしながら、陽性のものは検出されなかった。従って、クロ ーン３１−１のＤＮＡ配列はクローン自身Ｐ、ファルシパルムの後期うメゾント ーメロゾイト期特異的抗原の１類には含まれるが、１５０クローンのいずれより も３１−１ｍとして特徴化される特殊な遺伝子の異なる部分であろう。従って、 これらのクローンのいずれともバイブリド化しない。

また、ｐ３１−１のＢａｍＨＩ　（Ｈｉｎｄｌ［［）断片を、ゲルで精製した後 、二、・り・トランスレーションして関連ＤＮＡ配列を選択するためにクローニ ングベクターｐＵＣ９及び大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３を用いて作成した マラリア遺伝子ライブラリーを、スクリーニングするためのハイブリダイゼーシ ョンプローブとした。いくつかの配列を選択し、最大のものをＦＣＣ−１と名付 けた。

ＦＣＣ−１のヌクレオチド配列及びそこから読みとれるアミノ酸配列を第６図に 示した。第６図かられかるように、ＦＣＣ−１は、３１−１マラリアＤＮＡ配列 （第６図でヌクレオチド２９５−５９７）が３′及び５′方向に延長したもので ある。さらに第６図かられかるように、ＦＣＣ−ＩＤＮＡ配列は３１−１の開始 点の上流に停止コドン（＊）（たとえばヌクレオチド１５６−１５８）及び翻訳 開始シグナル（ＡＴＧヌクレオチド２２５−２７）を３１−１と同フレームで有 する。これらのデータは、ｐ３１−１として特徴化されるタンパクをコードする 部分の上流全部がクローン化されたことを示している。ＦＣＣ−１の３　末端で 解読フレームは、まだ開いている。従って、本発明では、この配列の完全なコー ド及び非コード領域はクローン化されていないと考えられる。しかしながら、３ １−１もしくは、好ましくはＦＣＣ−１の下流部分を用いた同様のハイブリダイ ゼーションは、そのようなりローニックを可能にする。

もちろん、３１−１ば２００ｋｄのマラリア予防タンパクに対する抗体を生産す るのに有用なタンパク生産物を発現するので、このタンパクの全コード配列を得 ることは不必要であることに注目すべきである。

後期シグナルーメロゾイト期特異的抗原を生産本発明のＤＮＡ配列は、発現のレ ベル及び産生されるマラリア抗原の特性を向上させるために他の発現ベクターの 作成に用いうる。たとえば、本ＤＮＡ配列は、ＭＳ２タンパク或いは他のタンパ クの部分に融合していない抗原を生産するちととなる。また、それらによってコ ードされる抗原のフラグメント或いは、マラリアに関係しないアミノ酸を含むタ ンパクの生産に用いられる。また、それらは、種々の宿主にその宿主内で抗原を 生産させるための形質転換に用いられる。そのような宿主としては、大腸菌（Ｅ 、ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　＋　シュードモナス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　）　、酵母、他の菌類、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐ’ｔ ｏｍｙｃｅｓ）　＋マウスまたは他の動物細胞、昆虫ｍ胞、植物細胞及びヒト組 換細胞が含まれる。最後に、これらのＤＮＡ配列に由来するアミノ酸配列は、マ ラリアの抗原として有用な合成ペプチドの作製に役立つ。生じた抗原が後期シゾ ントーメロゾイト期特異的抗原であるということだけが必要である。合成及び作 成の方法は技術的によく知られている。

たとえば、本発明では３１−１及びＦＣＣ−１クローンに由来するアミノ酸配列 に基づいて幾つかの合成ペプチドを作成した。第１ペプチド（ペプチドＡ）は、 これらのクローンでコードされるアミノ末端の４３アミノ酸残基より成っている ：ＳＹＱＥＬＶＫＫＬＥＡＬＥＤＡＶＬＴＧＹＳＬＦＱＫＥＫＭＶＬＮＥＧＴＳ ＧＴＡＶＴＴＳＴ　（第６図、ヌクレオチド２９３−４２２及び第５図参照〕。

それはクローンの「独特」な領域から選択された。第２ペプチド（ペプチドＢ） は、ペプチドＡのカルボキシ末端の２３アミノ酸より成っている。第３ポリペプ チド（ペプチドＣ）は、クローン３１−１及びＦＣＣ−１の反復領域からの３４ アミノ酸より成っている：　５ＧＧＳＶＴＳＧＧＳＧＧＳＶＡＳＶＡＳＧＧＳＧ ＧＳＶＡＳＧＧＳＧＮＳ　（第６図、ヌクレオチド４２９−５３０及び第５図参 照〕。

これらのペプチドの各々は、ウサギにおいてウェスタン・プロット免疫螢光染色 法及び免疫沈降により２００ｋｄのシゾントタンパク及びプロセシングをうけた ８３ｋｄのメロゾイト表面タンパクと反応する抗体を生じた。驚（ことに、これ らの抗体は間接的な免疫沈降試験でＰ、ファルシパルムの種々の分離株から得ら れたシゾントの内部構成物及びメロゾイトの表面と反応した。また、これらの結 果は、この抗原がメロゾイトの成熟過程で変化したものであり、かつマラリア感 染に対して広範囲のワクチンとして価値があることを示している。

ここでは、通常のグルタルアルデヒド法によってペプチドＡを破傷風トキソイド に結合させた後、フロイントの完全アジュバントを含む混合剤をサルのワクチン 化に用いた。

マラリア寄生虫で挑戦したあと、ワクチン化されたサルはこのペプチドによって 部分的に（〉９０％）耐性化されていた。従って、これらの抗原はインビボで予 防効果がある。

工乏」ア感染の診断方法及び手段における本発明の抗原及びＤＮＡ配列の利用 本発明による抗原、その抗体及びＤＮＡ配列は各種の血液サンプル中のマラリア 感染の存在を検知するための方法及び手段として使用しうる。

たとえば、本発明で生産される抗原及びそれに対して生じる抗体は、種々の診断 手段及び方法、たとえばラジオイム、ノアノセイ、ＥＬＩＳＡあるいは非放射性 イムノアッセイなどに用いられうる。本発明のＤＮＡ配列はサザン・ハイブリダ イゼーションに基づく診断手段及び方法として用いられうる。

たとえば、ラジオイムノアッセイ法の一つの型として、少なくとも１つの本発明 の抗原に対し実験動物で生じた抗体を固体相（たとえば、試験管の内側）に固定 する。次いで、抗原を抗体に結合させるように加える。患者の血清サンプルを既 知量の放射活性（たとえば１２５０抗体と共ｒ試験管に加、：Ｓ６患者の血清に 存在する全ゆる後期シゾントーメロゾイト期特異的抗体は、フリーな抗原部位に より支持体上の抗原−抗体複合体部位で標識抗体と競合しあう。

血清を反応させた後、試験管を洗浄し、試験管に残った放射能量を測定する。陽 性、すなわちこの患者の血清がマラｑ請昭６１−５０１５４７　（１１） リアの抗原を含んでいれＣく、低レベルの放射活性を示す。

ＥＬ［ＳＡ試験の１つの型としては、ミクロタイタープレートを本発明の抗原で コーティングし、患者の血清サンプルを加える。血清中の全ゆる後期シゾントー メロゾイト期特異的抗体と抗原との相互作用が進行する°ような一定の時間にわ たり保温した後、プレートを洗浄し、酵素標識に結合した抗ヒト抗体を加える。

保温の後、プレートを再洗浄する。次いで、酵素物質を加え、最終的なプレート の吸光度を測定する。吸光度が大きく変化すれば、陽性である。

マラリア感Ｂｏ予防方法と組成物への本発明の抗原の利用 本発明の抗原は、マラリア感染を予防するために各種の医薬上許容しうる組成物 に使用しうる。このような組成物としては、医薬上許容しうるキャリヤーやアジ ュバントが含まれる。また、免疫応答を増幅する化合物も含まれる。これらは各 種のリンフ才力インやインターフェロンを含む。

この種のワクチンは、本発明の１２ｆ！類から２個以上選ばれた抗原の混合物を 含んでいることが望ましい。

さらに、本発明のワクチンはマルチバレント、すなわちヒトに感染する他のプラ スモディウム属の１つ以上の抗原を含んでいることが望ましい。これらの混合物 は、ヒトをマラリア感染から予防するのに最も効果的であろう。

これらの１成物は、種々のワクチン技術において、よく知られた医薬上許容しう る投与もしくは治療方法に用いられうる。

本発明の微生物は、ドインチェ・ザンムルンク・フォノ・ミクロオルガニスメン （西ドイツ・ゲノチンゲン在）に１９８４年２月１３日に寄託し、ＰＦ−１〜１ ４として同定される培養物によって例証される： ＰＦ−１：Ｅ、ｃｏ旦ＨＢＩＯＩ　（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ　）　／　１４）Ｐ Ｆ−２・Ｅ　ｃｏｌｉ　ＨＢ＋、０１　（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ　）　／Ｇ２） ＰＦ−３：　Ｅ　ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ　）　／　Ｖ ４）ｒ’Ｆ−４：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ　）　 １０８）ＰＦ　−５：　Ｅ、ｃｏｌｊ　ＨＢＩＯＩ　（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ　 ）　／　Ｘｌｌ　）ＰＦ−６：　Ｂ、ｃｏｌｉ　）ＩＢＩＯＩ　（ｐＢＲ３２２ （Ｐｓｔ　）　／Ｍ２）ＰＦ−７：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（ｐＢＲ３２ ２（Ｐｓｔ　）　／　Ｍ？）ＰＦ−８：　Ｅ、ｃｏｌｊ）ＩＢＩＯＩ　（ｐＢＲ ３２２（Ｐｓｔ　）　／　Ｅ８）ＰＦ　９　：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（ ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ　）　／Ｒ１４）ＰＦ　−１０：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩ ＯＩ　（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ　）　／　Ｄ４）ＰＦ　−１１：　Ｅ、ｃｏｌｉ 　ＨＢＩＯＩ　（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ　）　／　Ｖ１４　）ＰＦ−１２：　Ｅ 、ｃｏ１ｉ１１８１０１（ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｔ５）ＰＦ−１３：　Ｅ、 ｃｏ１ｉ５３７（１）ＰＬ３１八−Ｐｓｔ　（Ｐｓｔ　）　／　Ｘ１ｌ−０１１ ）ＰＦ　−１４：　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２λ　（ｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓｔ　（Ｐｓ ｔ　）　／　１　）これらは受託番号ＤＳＭ２８７８〜２８９１で受託された。

本発明の微生物及びＤＮＡ配列はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ンに１９８５年２月１９日に寄託され、ＰＦ−１５として同定される培養物によ っても例証される。

ＰＦ−１５：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３　（ｐＦＣＣ−１）これは、受託番号 ５３０３５で受託された。

以上、本発明の幾つかの実施例につき説明したが、本発明の基本的な作製物は本 発明の方法や組成物を利用する他の実施例をも与えるために改変することができ る。従って、本発明の範囲は、むしろ上記に例として示した特定の実施例の２・ でなく、以下の請求の範囲によって規定されるべきである。

Ｆ／θ、４ ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＴｙｒＧｌｎＧｌｕＬａｕｖａｌＬｙｓ　Ｌｙ ｓ　ＬｅｕＧｌｕＡｌ　ａＬｅｕＧｌｕＡｓｐＡｌ　ａ　Ｖ≠■ ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＧＴＣＡＡＡＡ ＡＡＣＴＡＧＭＧＣＴＴＴＡＧＭＧＡＴＧＣＡＣＬａｕ’ｒｈｒＧｌｙＴｙｒＳ ｅｒＬｅｕ　ＰｈｅＧｌｎＬｙｓＧｌｕＬｙｓＭｅｔＶａｌＬｅｕＡｓ　ｎＧｌ ｕＧｌｙτｈｒｓｅｒＧＩＹＴＡＴＴＧＡＣＡＧＧＴＴＡＴＡＧ？ｒＴＡＴＴＴ ＣＡＡＡＡＧＧ　ＡＡＡＡＡＡＴＧＧＴＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡＡＧ ＴＧＴｈｒＡｌａＶａｌＴｈｒＴｈｒＳｅｒＴｈｒＰｒｏＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧ １ｙＳｅｒＶａｌＴｈｒＳｅｒＧ１ｙＧ１ｙＳｅｒＧ１ｙＧＡＡＣＡＧＣＴＧＴ ＴＡＣＭＣＴＡＧＴＡＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＴＡＣＴ ＴＣＡＧＧＴＧＧＴ’ｒＣＡＧＧｌｙＳｅｒＶａｌＡｌ　ａｓ　ｅｒＶａｌＡｌ ａｓｅｒＧ　ｌｙＧ　１ｙＳ　ｅ　ｒＧｌｙＧｌｙ　Ｓ　ｅ　ｒＶａｌ　ＡＸ　 ａ　５ｅｒfｌ　ｙＧ　ｌｙ　Ｓ　ｅｒ ＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＧＣＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＴＣＡＧ ＧＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＧＣＴｒＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧｌｙＡ、ＳｎＳｅ１：Ａ Ｊ：　ｑＡＸｑＴｈｒＡｓｎＰ　ｒｏＳｅｒＡｓ　ｐＡｓｎｓａｒ　５ｅｒＡｓ ｐ　５ｅｒＡｓｐＡ１ａＬｙＳ　rｅｒ　Ｓｅｒ ＣＡＧＧＴＡＡＴＴＣＡＡＧＡＣＧＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴｒＣＡＧＡＴＡＡＴＴ ＣＭＧＴＧＡＴＴＣＡＧＡＴＧＣＴＡＡＡＴＣＴＴＦｉｇ、５ 図面の簡単な説明 第１図はＰ、ファルシパルムのいろいろな無性赤血球段階の３５３−メチオニン 標識タンパクの５ＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラフである：輪状体（Ｒ）、 栄養体（Ｔ）、初期シゾント（Ｓ）及び成熟分裂シゾント（Ｓｅｇ）。矢印は後 期シゾントーメロゾイト（ＳＥＧ）期特有のポリペプチドバンドを示している。

第２図は１回選択した後期シゾントーメロゾイト期特有のクローンを含む格子フ ィルターのオートラジオグラフである。

（Ａ）：後期シゾントーメロゾイトリソチなプローブでのスクリーニング、（Ｂ ）：輪状体リンチなプローブでのスクリーニング。

第３図は後期シゾントーメロゾイト期特有ｃＤＮＡ配列を含むように、本発明に そって選択された２つのクローン（ＡとＢ）での輪状体期待をＲＮＡ　（Ｒ）と 後期シゾントーメロゾイト期特有ＲＮＡ　（Ｍ）のノーザン・ブロンド・ハイブ リダイゼーションのオートラジオグラフである。矢印は、「２８Ｓ」とｒ１８ｓ Ｊのヒト肝臓リポソームＲＮＡの位置と、Ｐ。

ファルシパルムリポソームｒ２８ｓＪとｒ１８ｓＪの位置を示す。

第４図は後期シゾントーメロゾイト期特異的クローンＤ４（Ａ）とＶ１４（Ｂ） の挿入物より調製されたプローブとの「関連」ハイブリダイゼーションのオート ラジオグラフである。

第５図はマラリア挿入物ｐ３１−１のヌクレオチド配列とそこからよみとれるア ミノ酸配列である。

第６図はマラリア挿入物ｐ　ＦＣＣ−１のヌクレオチド配列及びそこからよみと れるアミノ酸配列である。

手続補正書 昭和６１年　５月：Ｌ７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／ｖ１４のＤＮＡ挿入物、２２×ＳＳＣかつ６５℃に 実質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイプリド化するＤＮ Ａ配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの 発現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 ２．ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｇ２のＤＮＡ挿入物、２ｘＳＳＣかつ６５℃に実 質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイプリド化するＤＮＡ 配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの発 現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 ３．ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｒ１４のＤＮＡ挿入物、２×ＳＳＣかつ６５℃に 実質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイプリド化するＤＮ Ａ配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの 発現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 ４．ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｄ４のＤＮＡ挿入物、２×ＳＳＣかつ６５℃に実 質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイプリド化するＤＮＡ 配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの発 現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 ５．ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｘ１１のＤＮＡ挿入物、２ＸＳＳＣかつ６５℃に 実質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイブリド化するＤＮ Ａ配列に並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの 発現をコードするＤＮＡ配列より成る群から選択されるＤＮＡ配列。 ６．ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｍ２のＤＮＡ挿入物、２ｘＳＳＣかつ６５℃に実 質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイブリド化するＤＮＡ 配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの発 現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 ７。ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｔ５のＤＮＡ挿入物、２×ＳＳＣかつ６５℃に実 質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイブリド化するＤＮＡ 配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの発 現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 ８．ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｍ７のＤＮＡ挿入物、２×ＳＳＣかつ６５℃に実 質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイブリド化するＤＮＡ 配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの発 現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 ９．ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｖ４のＤＮＡ挿入物、２ｘＳＳＣかつ６５℃に実 質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイブリド化するＤＮＡ 配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの発 現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 １０．ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｄ８のＤＮＡ挿入物、２×ＳＳＣかつ６５℃に 実質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイブリド化するＤＮ Ａ配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの 発現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 １１．ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／１４のＤＮＡ挿入物、２ｘＳＳＣかつ６５℃に 実質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイブリド化するＤＮ Ａ配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの 発現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 １２．ｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ）／Ｅ８のＤＮＡ挿入物、２×ＳＳＣかつ６５℃に 実質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイブリド化するＤＮ Ａ配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの 発現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 １３．ｐＰＬ３１Ａ−Ｐｓｔ（Ｐｓｔ）／１のＤＮＡ挿入物、２ＸＳＳＣかつ６ ５℃に実質的に等しい塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイブリド化す るＤＮＡ配列、並びに全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプ チドの発現をコードするＤＮＡ配列より成る群がら選択されるＤＮＡ配列。 １４．ＰＦＣＣ−１のマラリア挿入物、２×ＳＳＣかつ６５℃に実質的に等しい 塩及び温度の条件下で前記ＤＮＡ挿入物にハイブリド化するＤＮＡ配列、並びに 全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列から発現するポリペプチドの発現をコードす るＤＮＡ配列より成る群から選択される請求の範囲第１３項記載のＤＮＡ配列。 １５．後期ゾントーメロゾイト期特異的マラリア抗原の発現をコードし、かつブ ラスモディウム菌株によりシゾントが８０％以上になるまで寄生虫症化させた赤 血球を培養し、培養物からシゾントを精製し、未感染赤血球に精製シゾントを約 ６時間感染させ、残余の成熟型を溶解させ、細胞を分散かつ培養し、約６時間後 に細胞の第１部分から輪上体に濃縮されたＲＮＡを採取し、約３３時間後に細胞 の第２部分から後期シゾントーメロゾイト型に濃縮されたＲＮＡを採取し、前記 ＲＮＡを逆転写することによってｃＤＮＡを得るという一連の工程でＤＮＡ濃縮 を行ない、２×ＳＳＣ及び６５℃に実質的に等しい塩及び温度の条件下で後期シ ゾントーメロゾイトＤＮＡに濃縮したＤＮＡ配列とはハイブリド化するが、同条 件下で輪状体ＤＮＡに濃縮したＤＮＡ配列とはハイブリド化しないようなＤＮＡ 配列、並びに２ＸＳＳＣ及び６５℃に実質的に等しい塩及び温度条件で前記ＤＮ Ａ挿入物にハイブリド化するＤＮＡ配列及び全ゆる外来性ＤＮＡ挿入物及び配列 から発現するポリペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列より成る群から選択さ れるＤＮＡ配列。 １６．マラリア抗原がＰ．ファルシパルム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕ）．Ｐ．ビ バックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ），Ｐ．マラリアェ（Ｐｍａｌａｌｉａｅ）及びＰオ バーレ（ＰｏｖａＩｅ）の抗原群から選択される請求の範囲第１５項記載のＤＮ Ａ配列。 １７．請求の範囲第１項乃至第１６項のいずれかに記載のＤＮＡ配列群から選択 されたＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子。 １８．請求の範囲第１項乃至第１６項のいずれかに記載のＤＮＡ配列に作用結合 した発現制御配列をさらに含む請求の範囲第１７項記載の組換えＤＮＡ分子。 １９．請求の範囲第１７項または第１８項記載の組換えＤＮＡ分子群より選択さ れた組換えＤＮＡ分子の少なくとも１つで形質転換された宿主。 ２０大腸菌（Ｅｃｏ１１），バチルス（Ｂａｃｌｌｕｓ），シュードモナス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），酵母，他の菌類，ストレプトマイセス，マウスまたは 他の動物細胞，昆虫細胞，植物細胞及びヒト組織細胞より成る群から選択される 請求の範囲第１９項記載の宿主。 ２１．請求の範囲第１項乃至第１６項のいずれかに記載のＤＮＡ配列群から選択 されたＤＮＡ配列によって発現の際にコードされるポリペプチド。 ２２．請求の範囲第１８項記載の組換えＤＮＡ分子群から選択された組換えＤＮ Ａ分子で形質転換された宿主を培養することによって産生されるポリペプチド。 ２３．２×ＳＳＣかつ６５℃に実質的に等しい塩及び温度の条件下で、請求の範 囲第１項乃至第１６項のいずれかに記載のＤＮＡ配列群から選択されたＤＮＡ配 列にどの配列がハイブリド化するかを決定することを特徴とする後期シゾントー メロゾイト期特異的マラリア抗原を発現の際にコードするＤＮＡ配列の選択方法 。 ２４．プラスモディウム菌株によりシゾントが８０％以上になるまで寄生虫症化 させた赤血球を培養し、培養物からシゾントを精製し、未感染赤血球に精製シゾ ントを約６時間感染させ、残余の成熟型を溶解させ、細胞を分散かっ培養し、約 ６時間後に細胞の第１部分から輪状体に濃縮されたＲＮＡを採取し、約３３時間 後に細胞の第２部分から後期シゾントーメロゾイト型に濃縮されたＲＮＡを採取 し、前記ＲＮＡを逆転写することによってｃＤＮＡを得るという一連の工程でＤ ＮＡ濃縮を行ない、どの配列が２ＸＳＳＣ及び６５℃に実質的に等しい塩及び温 度の条件下で後期シゾトトーメロゾイトＤＮＡに濃縮したＤＮＡ配列とはハイブ リド化するが、同条件下で輪状体ＤＮＡに濃縮したＤＮＡ配列とはハイブリド化 しないかを決定することを特徴とする、ＤＮＡ配列群から後期シゾントーメロゾ イト期特異的マラリア抗原を発現の際にコードするＤＮＡ配列の選択方法。 ２５．ＤＮＡ配列群を天然，合成もしくは半合成源に由来するＤＮＡ配列から選 択する請求の範囲第２３項または第２４項記載の方法。 ２６．マラリア抗原をＰ．ファルシパルム，Ｐ．ビバフクス，Ｐ，マラリアエ， 及びＰ．オバーレの抗原群から選択する請求の範囲第２３項乃至第２５項のいず れかに記載の方法。 ２７．請求の範囲第１８項記載の組換えＤＮＡ分子により形質転換された宿主を 培養し、かつ抗原を採取することを特徴とする後期シゾントーメロゾイト期特異 的抗原の生産方法。 ２８．上記宿主を大腸菌，バチルス，シュードモナス，酵母，他の菌類，ストレ プトマイセス，マウスまたは他の動物細胞，昆虫細胞，植物細胞及びヒト組織細 胞より成る群がら選択する請求の範囲第２７項記載の方法。 ２９．請求の範囲第２１項または第２２項記載のポリペプチド群から選択され、 かつ赤血球からのメロゾイトの放出に際し、予防効果レベルの循環抗体を生じさ せるのに有効な量の少なくとも一種のポリペプチドからなることを特徴とするマ ラリア感染予防用の医薬上許容しうる組成物。 ３０．請求の範囲第２９項記載の組成物より成る群から選択される組成物を用い て患者を医薬上許容しうる方法で治療することを特徴とするマラリア感染予防方 法。 ３１．請求の範囲第１項乃至第１６項のいずれかに記載のＤＮＡ配列の少なくと も１種、請求の範囲第２１項または第２２項記載のポリペプチドの少なくとも１ 種、及び請求の範囲第２１項または第２２項記載のポリペプチドに対する抗体の 少なくとも１種から成る群のうちの少なくとも１種選択した組成物からなる血清 サンプル中のマラリア感染診断手段。 ３２．請求の範囲第１項乃至第１６項のいずれかに記載のＤＮＡ配列の少なくと も１種、請求の範囲第２１項または第２２項記載のポリペプチドの少なくとも１ 種及び請求の範囲第２１項または第２２項記載のポリペプチドに対する抗体の少 なくとも１種から成る群のうちの少なくとも１種から選択した組成物の存在につ き、血清サンプルを分析することを特徴とするマラリア感染診断方法。