JPS6147498A - ニワトリカルシトニンの合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ニワトリカルシトニンの合成法に関し、更に
詳しくは、ニワトリ鱈後体から抽出精製され、構造が決
定されたカルシトニンの固相合成法に関するものである
。

〔従来技術及びその問題点〕

カルシトニン（以下ｒｃＴＪと称する）は、鳥類、魚類
、内口類などの鯰後体、哺乳類などの甲状腺に存在する
ペプチドホルモンである。

このホルモンは、副甲状腺ホルモンと拮抗する作用を示
し、骨などに作用し血液中のＣａ　　　濃度を低下させ
る作用が知られている。現在までのところ、ブタ、ウシ
、ヒツジ、ヒト、ラット、サケ、ウナギからＣＴが抽出
精製され、これら動物由来ＣＴのホルモン作用は、ラッ
トにＣＴを静注したときの血液中のＣａ　　濃度の低下
割合を指標とする生物活性を例として比較すると、哺乳
類由来ＣＴの生物活性より魚類（内口類を含む）のそれ
の方が高値を示すことが見い出されている。

前記ＣＴの構造は、動物種によシ少しずつ異なるが、そ
の基本構造は３２個のアミノ酸よりなる単鎖のポリペプ
チドで、１位と７位のアミノ酸カシスルフィド結合をし
、カルボキシル基末端がプロリンアミドである。

最近、本発明者らは、ニワトリ鯰後体からＣＴを抽出精
製し、その構造決定を行なったところ、 次式（■）： Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｎ
Ｈｚ（式中、ＣｙＳはシスティンを、Ａｌａはアラニン
を、Ｓｅｒはセリンを、Ｌｅｕはロイシンを、’ｌ’ｈ
ｒはスレオニンを、ｖａｌはバリンを、Ｇｌｙはグリシ
ンを、Ｌｙｓはリジンを、Ｑｌｎはグルタミンを、Ｑｌ
ｕはグルタミン酸を、Ｈｌｓはヒスチジンを、Ｔｙｒは
チロシンを、Ｐｒｏはプロリンを、Ａｒｇはアルギニン
を、　ＡＳｐはアスパラギン酸を表わす。）で示される
、従来既知ＯＣＴとは全く異なる構造を有することを見
い出した。このＣＴは、魚類と同等又はそれ以上の生物
活性を有するものであり、特願昭５８−２３０５９３号
として既に出願されている。

このニワトリＣＴは、骨ベージェット病や骨粗髭症、ま
た血液中のＣａ　　濃度が異常に高い高Ｃａ庄症などの
諸症状に有用な新規医薬品となることが期待される。そ
れ故、ニワトリＣＴを医薬品とするため広くニワトリＣ
Ｔのホルモン作用や毒性を検討する必要があるが、ニワ
トリ鯰後体は甲状腺や上皮小体の近くに位置する成鶏で
もなお直径１間程度の微小な臓器であり、この臓器から
抽出精製されるＣＴの収量は極わずかであることから、
ニワトリＣＴを安定に供給できる実用的な合成法の出現
が望まれている。

そこで、本発明者らはそのような合成法を見い出すべく
研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

〔発明の構成〕

本発明のニワトリＣＴの合成法は、Ｎ−保護プロリンを
アミノ基を有する不溶性樹脂に結合させた後、前記式（
Ｉ）で示されるニワトリＣＴ０３１位から１位までの保
護アミノ酸を同相合成法に従って順次結合し、次いで、
フッ化水素で処理することにより該不溶性樹脂及びアミ
ノ酸の保護基を脱離させて、 次式（■）： Ｈ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｔｈｒ
−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　−ＮＨ３（式中、Ｃ１８％　Ａｌａ、
　Ｓｅｒ、　Ｉ、ｅｕ１’ｐｈｒ、　Ｖａｌ、Ｇｌｙ。

Ｌ）ｒ８％　Ｑｌｎ、　Ｇｌｕ％Ｈｉ８％　Ｔｙｒ、　
Ｐｒ０％　Ａｒｇ及びＡＳＩ）は前記と同義である。以
下同様） で示されるＣＴ前駆体を得、その１位及び７位のシステ
ィンをそれぞれのメルカプト基を介して結合させ、ジス
ルフィド結合を形成させることを特徴とするものである
。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において、アミン基を有する不溶性樹脂としては
、そのアミノ基を介してＮ〜保護プロリンのカルボキシ
ル基と結合可能であり、かつ、本発明の合成過程で得ら
れるニワ）　！Ｊ　ＣＴと該不溶性樹脂との結合体（以
下ｒＣＴ−樹脂」と称する）をフッ化水素で処理した場
合に、該不溶性樹脂のアミノ基とこの樹脂の残りの部分
との間で開裂が起こり、プロリン残基のカルボキシル基
がアミド化され、ニワトリＣＴのＣ末端がプロリンアミ
ドを形成するものであれば如何なるものでもよい。かか
る不溶性樹脂としてハ、例えば、ベンズヒドリルアミン
樹脂（以下ｒＢＨＡ樹脂」と称する）が挙げられる。こ
の樹脂は、官能基当量や架橋度の違いによって所望の性
状を有する樹脂が人手可能であり、市販品を購入するこ
ともできる。

樹脂ペプチドの合成 この合成法では、樹脂に前記式（Ｉ）で示されるニワト
リＣＴの３１位から１位までのアミノ酸を順次一つずつ
付加する。アミノ酸の官能基は公知の方法により保護基
で保護する。各種の保護アミノ酸が市販されている。先
ず、アミノ酸のα−７ミノ基をｔ−ブチルオキシカルボ
ニル基（以下ｒＢｏｃ、Ｊと称する）やその均等基で保
護する。セリン（Ｓｅｒ）とスレオニン（Ｔｈｒ）のヒ
ドロキシ官能基は、通常、ベンジル基（以下［１３ｚｇ
Ｊと称する）やＢＺＱ誘導体基（例えば、４−メトキシ
ベンジル（以下ｒＭ−ＢＺＱＪと称する）、４−メチル
ベンジル（以下ｒ４ｃＨ３・Ｂｚρ」という）、３．４
−ジメチルベンジル、４−１０ロペンジル、２．６−ジ
クロロベンジル、４−ニトロベンジル、ベンズヒドリル
又はそれらの均等基）で保護する。システィンのメルカ
プト官能基は１３ｚＱ又はＢＺＡ誘導体基で採掘しても
よいし、ｎ−アルキル基、ｔ−ブチル基（以下ｒＢｕｔ
Ｊと称する）、アセトアミドメチル基（以下ｒ、Ａｃｍ
Ｊと称する）、４ＣＨ３ｅＢｙ４　、　Ｍ　１１　ＢＺ
Ｑ又はそれらの均等基で保護してもよい。リジンのε−
アミン官能基ハ、　通常、ベンジルオキシカルボニル基
（以下ｒＺＪと称する）又は２誘導体基、例えば、２−
クロロベンジルオキシカルボニル（以下「Ｃρ・ＺＪと
称スる）１２−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，
４−ジメチルベンジルオキシカルボニル又はそれらの均
等基で保護する。市販の保護リジンはカルボキシル基が
ｔ−ブチルアミノ基（以下ｒＴ　Ｂ　ＡＪと称する）又
はその均等基で保護されているので固相合成に供する場
合あらかじめこの保護基を脱離してから保獲りジンとし
て用いる。グルタミン酸のカルボキシル官能基は、通常
、ベンジルエステル基（以下ｒＯＢｚ１２　Ｊと称する
）で保護する。ヒスチジンのイミダゾリル官能基は、通
常、トシル基（以下「Ｔｏｓ」と称する）で保護する。

チロシンのヒドロキシ官能基は、保護し外くてもよいし
、Ｂｚｆｆｉ、２−ブロモベンジルオキシカルボニル基
（以下「Ｂｒ＠ｚ」と称する）、２．６−ジクロロベン
ジル基（以下「ＣＱ２・ＢｚＱ」と称する）又はそれら
の均等基で保護してもよい。アルギニンのグアニジノ官
能基は、通常、ニトロ基（ＮＯ２）　、Ｔｏｓ又はそれ
らの均等基で保護する。その他、アラニン（Ａｌａ）、
ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、グリシン（Ｇ
ｌｙ）、グルタミ＞　（Ｇｉｎ　）　、プロリン（Ｐｒ
ｏ）のアミノ酸は、通常、ＢｏＣ−アミノ酸として用い
ることができる。

本発明の合成法では、前記式（Ｉ）に従い、Ｃ末端の３
２位プロリン（Ｐｒｏ）アミドからＮ末端の１位システ
ィン（Ｃｙｓ）へ順次カップリング反応させる。アミノ
酸のカップリング反応段階をペプチド中のアミノ酸の位
置に対応させて表記すると、３２の反応段階で用いられ
る好まＩ〜い保護アミノ酸（略称）は表１のようになる
。ここで、表１における保護アミノ酸はほとんどすべて
市販されている。

表中、ＯＮｐハ、ｐ−ニトロフェニルエステル基を表わ
す。樹脂ペプチド合成には自動固相合成機がよく用いら
れるが、手動法、自動化法のいずれにおいても得られる
樹脂ペプチドに本質的差異はなく、自動化法における反
応設定条件の相違は得られるペプチドが前記式（Ｉ）で
示されるニワトリＣＴである限り本発明の範囲に含まれ
る。

以下、自動同相合成機を用いた場合の樹脂ペプチド合成
法について詳述する。

ＢＨＡｉｓ！ｉ脂へのプロリンの導入 ＢＨＡ樹脂を反応容器に入れ、ジクロルメタン、クロロ
ホルム、ジメチルホルムアミド、ベンゼン又はＢＨＡ樹
脂を膨潤させる溶媒を樹脂１ｇに対し溶媒２〜２０ｒｎ
ｌの割合で添加する０次に、ＢＨＡ樹脂中のアミノ基１
当量に対し１〜６当量のＢＯＣ−ｐｒｏを加える。２〜
２０分攪拌後、ジシクロへキシルカルボジイミド（以下
ｒＤｃｃＪと称する）のようなカップリング試薬を添加
する。カップリング試薬はＤＣＣの他、水溶性カルボジ
イミド、カルボニルジイミダゾール、ウッドワード試薬
”Ｋ”、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１゜
２−ジヒドロキノリン、２−エチル−７−オキシベンズ
イソキサゾリウムトリフルオロホウ素塩、ジフェニルリ
ン酸アジド、ジエチルリン酸シアニドなどが用いられる
。カップリング試薬はＢｏｃ−Ｐｒｏ　１当量に対し０
．５〜２．０当量を用いる。

Ｂｏｃ　−ｐｒｏの代りに、その活性エステル誘導体を
カップリング試薬なしに用いることができる。

活性エステル誘導体としては、ｐ−ニトロフェニルエス
テル、クロロ化フェニルエステル、Ｎ−オキシコハク酸
イミドエステル又はその均等物を用いる。活性エステル
体けＢ　ＨＡ　ｉｆ　Ｂｂの遊離アミノ基１当量に対し
１〜１０機量用いる。

ＢＨＡ樹脂、溶媒、Ｂｏｃ　−ｐｒｏ　　及びカップリ
ング試薬又はＢｏｃ　−ｐｒｏ　　活性エステルを反応
容器内で１０〜１０００分攪拌する。カップリング反応
の進行の程度は、微量のＢＨＡ樹脂を採取しこれをニン
ヒドリン試験することにより容易に判定できる。カップ
リング反応終了後、ＢＯＣ−Ｐｒｏ　−ＢＨＡ樹脂をジ
クロルメタン、クロロホルム、メタノール、ジメチルホ
ルムアミド、ベンゼン又は酢酸のような溶媒で繰り返し
洗滌する。当初に用いられたＢＨＡ樹脂１９に対し各２
〜２０ｍ１の洗滌用溶媒で１〜数回洗滌する。

得られたＢｏａ　−Ｐｒｏ　−ＢＨＡ樹脂の一部（２０
即位）を採取し、常法（Ｔ、Ｆａｉｒｗｅｌｌ、　ｅｔ
　ａＱ、、１３ｉｏｃｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ、　２２　、
２６９１　（１９８３）　）に従い反応したＢｏｃ−ｐ
ｒｏ量を測定する。この反応した１３ｏｃ　−ｐｒ。

量が過少の場合、最終的に得られるニワ）　ＩＪ　ＣＴ
量が少なく、過多の場合、ペプチド鎖の途中の反応段階
で立体障害などのため反応が進行しにくくなる。このた
め、ＢＨＡ樹脂と反応した１３ｏｃ−ｐｒｏ量は、０．
０５〜１．００　ｍｍｏｆｆ／９・ＢＨＡ　＠脂、好ま
しくは０１〜０．６ｍｍ０Ｑ／９・ＢＨＡ樹脂とする。

このように、ＢＨＡ樹脂上のＢＯ（！−ｐｒｏを適当な
カップリング量とするため、　ＢＨＡ樹脂中のアミン車
量やカップリング反応時間が適宜選択されるが、この際
、ＢＨＡ樹脂上の未反応の遊離アミノ基は過剰のアセチ
ル化剤でアセチル化して停止反応を行なう。アセチル化
剤としては、通常、１−アセチルイミダゾールのジクロ
ルメタン溶液又は無水酢酸・トリエチルアミン混合物の
クロロホルム溶液を用いる。アセチル化剤はＢＨＡＩ１
１脂の遊離アミン基１当量に対し０．５〜５．０当量を
用い、反応時間は０．１〜１２時間が適当である。

Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＢＨＡ樹ＪＪＴｈ（ｍ）を生成するカ
ップリング反応は下式の通りである。

（式中、ＮＨｘ−Ｂ’ＨＡはＢＨＡ樹脂を、−Ｎｕ−Ｂ
ＨＡはＢＩ（Ａ樹脂残基を表わす。以下同様）３１位ス
レオニンの導入 ３２位プロリン（ｐｒｏ）に３１位スレオニン（Ｔｈｒ
）を付加させるため、前述のようにして生成てれたＢＯ
（！　−Ｐｒｏ　−ＢＨＡ樹脂の保護基を脱離する。

先ず、前述の洗滌用溶媒で前記樹脂を洗滌し、トリフル
オロ酢酸（以下ｒＴＦＡｊと称する）で保護基を脱ｉす
る。ＴＦＡ溶液は、ＴＦＡを無溶媒で、又は、通常ジク
ロルメタン、クロロホルム又はそれらの均等物で１０チ
以上のＴＦＡ濃度に希釈して用いることができ、ＴＦＡ
溶液は、通常、ＢＨＡ樹脂１ｇ当り２〜２０ｍ１を用い
る。反応時間は５〜３００分が好ましい。脱離後、ＴＦ
Ａを渥過して取除き、前述の洗滌用溶媒にてｐｒｏ　−
ＢＨＡ樹脂を洗滌する。残存するＴＦＡをトリエチルア
ミン（以下ｒＴＥＡＪと称する）の５〜３０チ溶液（溶
媒はジクロルメタン、クロロホルム又はそれらの均等物
）ＢＨＡ樹脂１ｇ当り２〜２Ｑｍｌで中和後、前述の洗
滌用溶媒でこの樹脂を洗滌する。ＴＥＡの代りに、他の
３級又は２級有機アミン、例えば、トリメチルアミン、
Ｎ−エチルピペリジン、ジイソプロピルアミン又はそれ
らの均等物を用いてもよい。この脱離反応は以下の通シ
である。

Ｈｚ （ＩＩＴ） 得られたＰｒｏ　−ＢＨＡ　ｗ脂（ｒＶ）を溶媒に懸濁
し、この中に１３ｏｃ−スレオニン（Ｔｈｒ）誘導体と
カップリング試薬ＤＣＣを添加し、１０〜２０００分カ
ップリング反応を行なう。１３ｏｃ−スレオニン誘導体
量及びＤＣＣ量は、通常、それぞれ３２位プロリン１当
量に対し１〜５当量である。ニンヒドリン試験でカップ
リング反応が完結したことを確認するが、反応が完結し
ない場合、カップリング反応を繰り返し行ない又はアセ
チル化剤により遊離アミノ基をアセチル化して、反応を
停止させる。カップリング反応が終了後、Ｂｏｃ　−Ｔ
ｈｒ　−Ｐｒｏ　−ＢＨＡ樹脂を前述の洗滌用溶媒で洗
滌する。スレオニン誘導体のカップリング反応は以下の
通りである。

Ｉｈ （Ｖ） ３０〜１位の各アミノ酸の導入 本工程におけるＢＯＣ基の脱離反応、保護アミノ酸のカ
ップリング反応は、各構成アミノ酸Ｃに対応する表１に
示す保護アミノ酸を用いる点を除き前述の３１位スレオ
ニンの導入と同様に行方う。ＢＯＣ−グルタミンのカッ
プリング反応でおこる公知の副反応を避けるため、カッ
プリング反応の際に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
（以下ｒＨＯＢｔＪと称する）を添加するか、ＢＯＣ−
グルタミンの活性エステル誘導体を用いることが好まし
い。この反応はＢＨＡ樹脂の遊離アミン１当量に対し２
〜１０当量のＢＯＣ−グルタミンの活性エステル誘導体
を用い、当初使用したＢＨＡ樹脂１ｇ当り２〜２０ｍ１
の溶媒（ジメチルホルムアミド、ベンゼン、ジクロルメ
タン、クロロホルム又はそれらの均等物の単−溶媒又は
混合溶媒）中で行なう。反応時間は、通常、１〜７２時
間である。活性エステル誘導体としては、ｐ−二トロフ
ェニルエステル、クロロ化フェニルエステル、ジカルボ
ン酸イミドエステル又はそれらの均等物を用いる。

以上のようにして、各構成アミノ酸を導入して得られる
ニワトリＣＴ−樹脂の一例を示すと、次式（ＶＩ＞に示
すようになる。

ＣＱ−Ｚ　　　ＢＺＩ　　　　０Ｂｚｌ　　　ＴｏｓＩ
　　　　１　　　１　　　１ ：［、ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−：［、ｅｕ−８ｅｒ−Ｑ
ｌｎ−Ｑｌｕ−Ｌｅｕ−：１ｉｓ−３ｚｌ Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｎ
Ｈ−ＢＨＡ（Ｖｌ） 前述のようなニワトリＣＴ−樹脂（Ｖｌ）は反応容器か
ら取出し減圧乾燥する。乾燥ニワトリＣニー樹脂と当初
用いたＢＨＡ樹脂の重量差が大略の合成されたニワ１Ｊ
ｃＴｆｉｔである。

ニワトリＣＴ−樹１ｆｆｉ　（ＶＩ）のフッ化水素によ
る分解 以上のようにして得られる前記式（ＶＩ）で示されるニ
ワトリＣＴ−樹脂をフッ化水累（ＨＦ）で分解して、前
記式（ＴＪ）で示されるニワトリＣＴ前駆体を得る。こ
のＨＦ分解には、副反応を防止するためにアニソール（
０，５〜５ｒｎｌ／９ＣＴ−樹脂）やチオアニソールの
よう力捕獲剤を添加することが好ましい。この混合物を
液状ＨＦ（２〜２０　ｍ１３／りＣＴ−樹脂）で−２０
〜＋１５Ｃにおいて、０．５〜２０時間処理する。ＨＦ
分解後、ＨＦを気化させながら除去し、得られるニワト
リＣＴ前駆体と樹脂粒の混合物を溶媒（例えば、酢酸エ
チル、ジエチルエーテル、ベンゼンなト）でＨＦ分解用
容器から回収し、残存ＨＦとアニソールを除去する。更
に、ニワ）　ＩＪ　ＣＴ前駆体は前記混合物を酸性水溶
液（例えば、酢酸、ギ酸などの７Ｘ溶液）で抽出するこ
とにより分離できる。

このＨＦ分解によって、ニワトリＣＴ−樹脂（ＶＩ）か
らすべての保護基が脱離するとともに、ペプチドと樹脂
とが切断され、ペプチドのＣ末端がプロリンアミドとな
る。但し、システィンのメルカプト基の保護基としてｎ
−アルキル基を用いた場合には、ＨＦ分解処理に対しこ
の保護基が安定であるため、ジスルフィド結合の形成に
は公知の方法（特公昭５８−３３８６３号公報）が用い
られる。

得られるニワトリＣＴ前駆体は前記式（ＩＴ）で示され
る非環式ペプチドである。

ニワトリＣＴ前駆体の環化 ＨＦ分解処理で得られたニワ）　ＩＪ　ＣＴ前駆体の１
位と７位のシスティン間で環化することにより活性ニワ
トリＣＴに変換できる。環化反応には公知の方法を用い
ることができ、通常、大気中の酸素やフェリシアン酸塩
（例えば、フェリシアン化カリウム）のような酸化剤を
用いる。

大気中の酸素を用いる場合、前述のニワトリＣＴ前駆体
の酸性抽出液を蒸留水で希釈し、こノニワトリＣＴ前駆
体１ｇ当、？　１００ｍＡ！　〜１０　Ｑ量とする。こ
の溶液をアルカリ性水溶液（例えば、アンモニア水）で
ｐＨ６，０〜８．５に調整し、空気と２〜２４時間接触
する。更に、酸性水溶液（例えば、酢酸水溶液）でｐ）
（３〜６に調整すると、環化された粗ニワトリＣＴが得
られる。

フェリシアン酸塩を用いる場合、前述のようにアルカリ
性水溶液（例えば、アンモニア水）でｐＨ６，０〜８．
５に調整した希釈ペプチド水溶液にフェリシアン酸塩水
溶液（１ｍＭ〜１００ｍＭ）をペプチド水溶液がやや黄
色に着色するまで添加する。この溶液を２〜２４時間放
置後、酸性水溶液（例えば、酢酸水溶液）でｐＨ３〜６
に調整し、イオン交換樹脂を少量添加して酸化剤として
用いたフェリシアン酸塩を除去することにより、前記式
（Ｉ）で示される環化された粗ニワ）　ＩＪ　ＣＴが得
られる。

粗ニワトリＣＴの精製 前述のようにして得られた粗ニワトリＣＴ溶液（ｐＨ３
〜６）の中には、本発明のニワトリＣＴ以外に、環化反
応の副生成物であるニワ）　ＩＪＣＴの２量体又は３量
体以上の重合体、ニワトＩＪ　ＣＴ中のアミノ酸の一部
が欠落した化合物などが含まれ、これらを除去するため
′Ｎ製操作が必要である。

先ず、粗ニワトリＣＴ溶液をイオン交換操作又は凍結乾
燥によって濃縮物又は固体物とし、これをゲル濾過法に
より分子量分画し環化されたニワトリＣＴを回収し凍結
乾燥する。この凍結乾燥物をＴＦＡ−水一アセトニトリ
ル溶媒を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーによっ
て精製する。精製されたニワトリＣＴは前記式（Ｉ）で
示される構造に相当するアミノ酸分析値を与えた。その
生物活性を特願昭５８−２３０，５９３号明細書記載の
方法に従い測定したところ、天然よシ単離・精製された
ニワトリＣＴの生物活性と同等であることが判明した。

〔発明の効果〕

本発明によれば、高い生物活性を有するニワトリＣＴを
安定に供給することができる。

〔発明の実施例〕

次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらによシ制限されるものではない。

実施例１ （１）　ＢＨＡ樹脂へのプロリンの導入ＢＨＡ樹脂（ペ
プチド研究新製、ジビニルベンゼン２％、１００〜２０
０メツシユ、アミノ基当量Ｏ１８ｍｍｏＱ／ｇ）　５９
をペプチド固相合成用反応容器（ベックマン社製）に入
れ、下記の溶媒各５０ｍ１で順次処理し、各々の処理後
に濾過した。

ジクロルメタン（３回、各２分） クロロホルム　（３回、各２分） １０チドリエチルアミン（クロロホルム溶液）（２回、
各５分） クロロホルム　（３回、各２分） ジクロルメタン（３回、各２分） 次いで、ＢＨＡｍＪｍをジクロルメタン５０ｄ１１３ｏ
ｃ　−Ｐｒｏ　１．０３９　（４，８ｍｍｏＱ）ととも
に５分攪拌した。　ＤＣＣ１，２１ｇ（５，８ｍｍｏＱ
）（７）ジクロルメタン１５づ溶液を加え、３００分攪
拌した。′反応混合物を濾過して、Ｂｏｃ−ｐｒｏ−樹
脂を次の溶゛媒で洗滌・濾過した。

ジクロルメタン　（２回、各２分） メタノール　　　（１回、１分） ジクロルメタン　（１回、２分） 更に、　Ｂｏｃ−ｐｒｏ−樹脂に１−アセチルイミダゾ
ール１．５９のジクロルメタン２５Ｔｎｌ溶液を添加し
て３時間かけてアセチル化を行なった。これにより、Ｂ
ＨＡ樹脂中の未反応のアミン基が修飾され、以下、保護
アミノ酸の付加延長はプロリンのＮ末端が反応開始点と
なる。このプロリン量は０．３７２　ｍ　ｍｏＱ／　９
であった。総プロリン量は１．８６ｍｍｏＱであツ７’
ｃ。

＋２１　３１位スレオニンの導入 （１）で得られたＢｏｃ　−ｐｒｏ−樹脂全量をジクロ
ルメタンで２回、各２分洗滌し、濾過した。この樹脂に
５０％ＴＦＡ溶液（溶媒；ジクロルメタン）５０ｒＩＬ
ｌを添加し、３０分攪拌し、Ｂｏａ基を脱離させた。得
られた樹脂を（１）と同様にして下記の溶媒各５０−で
順次処理し、各々の処理後に濾過した。

ジクロルメタン　（３回、各２分） クロロホルム　（３回、各２分） １０　％　）　ＩＪエチルアミン（クロロホルム溶液）
（２回、各５分） クロロホルム　（３回、各２分） ジクロルメタン（３回、各２分） 次いで、ＢＨＡ樹脂をジクロルメタン５０ｍ１゜及び総
プロリン量に対して２．５当量の保護アミノ酸、即ち、
Ｂｏａ−Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ　）　１．４３９　（４，６
５ｍｍｏＱ）とともに５分攪拌した。ＤＣＣｏ、９５９
ｇのジクロルメタン１５−溶液を加え、６０分攪拌した
。

反応後、樹脂の極少量を採取し、この樹脂のニンヒドリ
ン試験が陰性であることを確認した。

この樹脂を更にジクロルメタンで２回、各２分洗滌した
後、前記と同様にして１３ｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）で１
２０分カップリング反応を行なった。得られたＢｏａ−
Ｔｈｒ　（Ｂｚ　１　）　−Ｐｒｏ−樹脂をジクＣＩＡ
／メタンで２回、各２分、メタノールで１回２分、ジク
ロルメタンで１回２分順次洗滌し、濾過した。

（３）３０〜１位の各アミノ酸の導入 （２）と同様にして、Ｂｏｃ　−’ｌ’ｈｒ　（Ｂｚｌ
）−ｐｒｏ−樹脂に、前記式（Ｉ）で示されるニワトリ
ＣＴの（９）位から１位までの各構成アミノ酸に対応す
る保護アミノ酸を順次カップリングした。表２に各反応
段階で用いた保護アミノ酸とその使用量を示す。

カップリング反応は（２）に述べた通シ、同一の保護ア
ミノ酸量で２回行ない、第１回目は６０分、第２回目は
３００分のカップリング反応時間とした。ココア、リジ
ンはＢｏＣ−Ｌｙｓ　（（Ｊｌｌ　−Ｚ）　ＴＢＡ（ペ
プチド研究新製）のＴＢＡを脱離して１３ｏｃ−Ｌｙｓ
　（ＣＱ−Ｚ）として用いた。Ｂｏｃ−Ｉ、ｅｕ＊Ｈ２
０はジクロルメタン単一溶媒には難溶のため、ジクロル
メタンの代りにジメチルホルムアミドとジクロルメタン
（１：１）の混合溶媒に溶解した。

１４位及び２０位のアミノ酸の導入においては、ＨＯＢ
ｔＯ，６２８ｇとＢｏａ−Ｇｉｎ　１．１４５ｇ　とを
同時に反応容器へ添加した。

１位アミノ酸の導入後、樹脂ペプチドをジクロルメタン
を用いてグラスフィルターに回収し、１昼夜減圧乾燥し
て、乾燥樹脂ペプチドを得た。

（４）　　フッ化水素による分解 乾燥した樹脂ペプチドの一部（３ｇ）を秤量し、ＨＦ分
解用反応容器（テフロン製）に入れ、アニソール３　ｍ
ｌを添加し、１夜暗所に保存した。

攪拌子を入れた前記反応容器をＨＦ分解装置（ペプチド
研究新製）に取りつけドライアイス−エタノール浴中に
置き、フッ化水素３０ｍ１を反応容器中へ凝縮させた。

この混合物を水浴中において１時間ＯＣで攪拌した。１
時間後、トラップをドライアイス−エタノールで冷却し
、反応容器中のＨＦが突沸しないように減圧下で徐々に
Ｉ（Ｆを除去した。３時間後、反応容器中のＨＦはほぼ
留去した。反応容器なＨＦ分解装置から取りはずし、水
酸化カリウムを入れたデシケータ−中で３０分乾燥した
。更に、酢酸エチルを用いて反応容器から樹脂ペプチド
分解物をグラスフィルターに移し取り、ジエチルエーテ
ルで洗滌した。グラスフィルターごと、３０分減圧乾燥
した後、１００ｍ１の２Ｍ酢酸中に樹脂ペプチド分解物
を添加し、ゆつくシ攪拌して脱保獲されたペプチドを溶
解した。この溶液を濾過し、ニワ）　ＩＪ　ＣＴ前駆体
の溶液を得た。

（５）　　ニワトリＣＴ前駆体の環化 前記溶液１００　ｍｌを脱気した蒸留水でＩＱに希釈し
、アンモニア水でｐＨ６，８Ｋ調整した０この溶液に０
．０１Ｍフェリシアン化カリウムを約３０ｍ１添加し、
１昼夜放置した。１昼夜後、２Ｍ酢酸でｐＨ５，０に調
整し、イオン交換＃４脂（バイオランド社製ＡＧ３Ｘ４
Ａ）を添加し、濾過した。

ν液を凍結乾燥して粗ニワ）　ＩＪ　ＣＴ　２６５ｍ９
を得た。

（６）　　粗ニワトリＣＴの精製 得られた粗ニワトリＣＴ溶液（５０ｍ９７ｍ１）４づを
１Ｍ酢酸で平衡化したセファデックスＧ−２５ゲル（直
径２．６ｃｍ×１７０ｃｍ）カラムに通じて、脱塩と分
子量分画を行々っだ。所望の分子量画分を採取し、凍結
乾燥し、白色粉末９６ｍｇを得た。

この白色粉末を１Ｍ酢酸に溶解＜１ｍ９／ｍ１）Ｌ、、
濃度勾配型高速液体クロマトグラフィーにて精製した。

カラムはケムコ社製ヌクレオシル５Ｃ１８（直径１０　
ｍｍ　Ｘ　２５０　ｇ　）を用い、溶媒はＡ液として水
（１，００）−１０％Ｔ　Ｆ　Ａ　（１）、Ｂ液として
水（４０）−アセトニトリル（６０）　−ＴＦＡ　（ｔ
ｌを用い、Ａ液からＢ液への直線濃度勾配条件下で溶出
した。ここで、（）内は溶媒の体積比である。ニワトリ
ＣＴに相当する両分を分取し、凍結乾燥した。得られた
白色粉末の生物活性を特願昭５８−２３０，５９３号明
細書記載の方法に従い測定したところ、６８００　ＭＲ
Ｃｔｙ、Ｍであった。そのアミノ酸分析値を表３に示す
。

表３　本発明ＯＣＴのアミノ酸組成 簀　アラニン（Ａｌａ）を２．００に換算して求めたＯ
−ｗ＋　　（：ｙｓの測定法：過ギ酸酸化後のアミノ酸
分析（Ｓ、Ｍｏｏｒｅ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ
、　、　２３８．２３５　（１９６３）　）測定法は、
活性粉末３．５μりを６Ｎ塩酸５０μＣを用いて１１０
Ｃで２２時間加水分解踵脱塩酸後２５０μαの０．２Ｎ
クエン酸緩衝液（ｐＨ３，２５）に溶解し、全量を分析
に供した。

以上のことから、実施例１によって得られた本品は、化
学的にも生物学的にも天然品と同等であることが判明し
た。

これまでに記載し又は実施例１に述べた化合物の製法は
多くの点で変更可能である。しかし、二つ以上の因子を
同時に変更すれば、変更した因子のいずれの一つをも評
価することが困難となる。それ故、−因子のみを変えた
一連のテストを行ない、以下の実施例に示すＯ 実施例２ ２４位アミノ酸の導入において、ＢＯＣ−Ａｒｇ（ＴＯ
８）の代りにＢｏａ−Ａｒｇ（ＮＯ２）　１．４８ｇ（
４，６５ｍｍｏＱ）を用いる以外は、実施例１と同様の
条件にて反応を行ない、同一の精製を行なった。得られ
た結果は実施例１で得られたアミノ酸分析値と一致し、
その生物活性も同等であったＯ実施例３ ２２位アミノ酸の導入において、　Ｂｏｃ−’ｌ’ｙｒ
（Ｂｒ−Ｚ）の代りにＢｏａ　−Ｔｙｒ　（Ｂｚｌ）　
Ｌ７２９　（４，６５ｍｍｏ９）を用いる以外は、実施
例１と同様の条件にて反応を行ない、同一の精製を行な
った。

得られた結果は実施例１で得られたアミノ酸分析値と一
致し、その生物活性も同等であった。

実施例４ １４位及び２０位のアミノ酸の導入において、ＨＯＢｔ
を用いることｉ　＜　ＢｏＣ−Ｇｌｎ　１．１４ｇ（４
，６５ｍｍｏＱ）及びＤＣＣＯ，９５９ｇ（１５ｍＪ）
を用イテカッフリング反応した。第２回目のカップリン
グ反応を３００分の代りに９００分とし、その後、１−
アセチルイミダゾール１ｇでアセチル化を行なった。そ
の他の条件は実施例１と同様にした。得られた結果は実
施例１で得られたアミノ酸分析値と一致し、その生物活
性も同等であった。

実施例５ １１位及び１８位のアミノ酸の導入において、Ｂｏａ−
ＬＹ８（ＣＱ、−Ｚ）ノ代りＩｃ　Ｂｏａ−Ｌｙｓ　（
Ｚ）　１．７７９（４，６５ｍ　ｍｏｌ　）を用いる以
外は、実施例１と同様の条件にて反応を行ない、同一の
精製を行なった。得られた結果は実施例１で得られたア
ミノ酸分析値と一致し、その生物活性も同等であった。

実施例６ １位及び７位のアミノ酸の導入において、Ｂｏａ−Ｃｙ
ｓ　（Ｍ−Ｂｚｌ　）の代シにＢｏａ−Ｃｙｓ　（Ａｃ
ｍ）　１．３６ｑ（４，６５ｍｍｏＱ　）を用いる以外
は、実施例１と同様の条件にて反応を行ない、同一の精
製を行なった。得られた結果は実施例１で得られたアミ
ノ酸分析値と一致し、その生物活性も同等であった。

実施例７ 実施例１と同様にしてニワトリＣＴ前駆体溶液１００−
を得、フェリシアン化カリウムを用いる代りに酸素雰囲
気下でニワトリＣＴＯ猿化処理を折々った。即ち、この
溶液を蒸留水でＩＱに希釈し、アンモニア水でｐＨ６，
８に調整した。

次いで、この希釈液中にキャピラリーを通じて５時間空
気を吹き込んだ。更に、この希釈液を２Ｍ酢酸でｐＨｓ
、　ｏに調整した。この希釈液を凍結乾燥して粗製ニワ
）　ＩＪ　ＣＴを得、以下、実施例１と同様にして精製
ニワトリＣＴを得た。この生物活性は実施例１で得られ
たものと同等であった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｎ−保護プロリンをアミノ基を有する不溶性樹脂
   に結合させた後、ニワトリカルシトニンの３１位から１
   位までの保護アミノ酸を固相合成法に従つて順次結合し
   、次いで、フッ化水素で処理することにより該不溶性樹
   脂及びアミノ酸の保護基を脱離させて、 次式： 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｃｙｓはシステインを、Ａｌａはアラニンを、
   Ｓｅｒはセリンを、Ｌｅｕはロイシンを、Ｔｈｒはスレ
   オニンを、Ｖａｌはバリンを、Ｇｌｙはグリシンを、Ｌ
   ｙｓはリジンを、Ｇｌｎはグルタミンを、Ｇｌｕはグル
   タミン酸を、Ｈｉｓはヒスチジンを、Ｔｙｒはチロシン
   を、Ｐｒｏはプロリンを、Ａｒｇはアルギニンを、Ａｓ
   ｐはアスパラギン酸を表わす。） で示されるカルシトニン前駆体を得、その１位及び７位
   のシステインをそれぞれのメルカプト基を介して結合さ
   せ、ジスルフイド結合を形成させることを特徴とする次
   式： 【アミノ酸配列があります】 （式中、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｖ
   ａｌ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙ
   ｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ及びＡｓｐは前記と同義である。） で示されるカルシトニンの合成法。
2. （２）不溶性樹脂がベンズヒドリルアミン樹脂である特
   許請求の範囲第１項記載の合成法。
3. （３）ジスルフイド結合の形成を酸化剤の存在下又は酸
   素雰囲気下で行なう特許請求の範囲第１項記載の合成法
   。