JPS5833864B2 - ペプチド類の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はペプチド類の環化に関し、さらに詳しくはシス
ティン基を含むペプチドを処理して鉄基とかく形成され
た環構造の間にジスルフィド結合を生成させる方法に関
するものである。

そのような方法は生物学的活性をもちそしてヒト及び動
物のある種の病気を治療するのに有用なペプチドの合成
において有用である。

また本発明は、環式ジスルフィドペプチドの前駆物質た
る非環式ペプチド（即ち中間体）及びそれらの環式ペプ
チドの製法にも関する。

本発明を為すに到った背景は次のようである。

生物活性をもち病気の治療に有用であって、ジスルフィ
ド環をもつところのペプチドは沢山知られている。

ベージェット病の治療に有用なカルシトニンはそのアミ
ノ酸鎖の１位及び７位にシスティン基をもつ環構造をも
っている。

オキシトシンはヒト及び動物の労働の刺激又は治療誘導
に有用であり、また分べん后の子宮出血を調節するのに
も有用である。

それはアミノ酸鎖の１位及び６位のシスティン基の間に
ジスルフィド環構造をもっている。

バンプレッシン及び同族体たるリプレッシンはヒトに刻
し抗利尿剤として用いられ、そのアミノ酸連鎖の１位及
び６位のシスティン基間にジスルフィド環構造をもつ（
ハンドブック・オフ・バイオケミストリー、Ｃ−１６４
頁からＣ−１８８頁）。

最近発見されたジスルフィド含有ペプチドたるンマトス
タチン（Ｐ、 ブラシーほか：サイエンス １７９巻
７７頁 １９７３年）は上端症及び糖尿病の治療に価
値ありと提案されている。

このンマトスクチンはアミノ酸鎖の３位及び１４位のシ
スティン残基の間にジスルフィド結合を有する（Ｒ，バ
ーガスほか：プロシーデインクス・オフ・ナチュラル・
アカデミ−１・オフ・すイエンス Ｕ、８．７０巻 ６
８４頁 １９７３年）。

カルシトニン、オキシトシン、パンプレツシン、ソマト
スタチンその他の天然産ペプチドのアミノ酸の種類と連
鎖はその原料の種類によって異ったりするが、ヒト、家
畜、魚類、蛙又は爬虫類の腺※※から抽出したりして天
然原料からその儂で得られろペプチド類はすべて上述の
ような環構造をもっている。

環構造中でジスルフィド結合で合一されたシスティン基
を有する公知の生物活性ペプチドのあるもののアミノ酸
連鎖を第１表に掲げる。

第１表に述べたようなペプチドを合成しようとするこれ
迄の試みにおいて、閉じたジスルフィド環構造を製造で
きる唯一の方法は、まず所望のアミノ酸鎖をもつ非環式
ペプチドを形成させ、次いでこのペプチドを酸化剤を用
いて酸化反応にふし、２コのシスティン残基間にジスル
フィド結合を形成させるという試みであった。

そのような酸化方法はカツオヤニス、Ｐ、Ｇ：ザ・ケミ
ストリー・オフ・ポリペプタイズ、プレナム・プレス社
１９７４年 ６０−８５ページに記載されている。

これらの方法の主な不利は、高度に不安定なペプチド分
子を酸化剤にさらす事である。

こういう処理はペプチドの不活性化をおこし、生物活性
生産物の収率低下をまねく。

酸化剤の使用を要しないところの、ペプチドのシスティ
ン部分間のジスルフィド結合の形成方法は、当技術分野
において待望されていた。

よって本発明者らはペプチドのシスティン部分の間の環
状ジスルフィド結合形成のための実際的かつ効果的な方
法を発見すべく努力したのである。

以下にそのサマリーを述べる。

我々は、ペプチドを酸化剤で処理する必要のない簡単な
方法によって、ペプチド中の２コのシスティン残基の間
にジスルフィド結合が形成される環状ジスルフィドペプ
チドを合成する方法を見出した。

本発明の方法は、アミノ酸鎖中に少くとも２個のシステ
ィン部分を有し、該部分の一つは遊離スルフヒドリル基
を有し、そして他方は該部分のスルフヒドリル基と共に
ジスルフィド結合を形成するｎ−アルキルチオ基によっ
て保護されたスルフヒドリル基を有するペプチドを製造
することを含む。

そのようなペプチドは、ペプチドのアミノ酸連続の合成
において、次の分解工程で除去されないような、システ
ィン基の１つのスルフヒドリル基を保護する保護基、す
なわちｎ−アルキルチオ基を用いることにより得られる
。

１コのシスティン部分に結合したｎ−アルキルチオ基を
含むところの、このようにして得られた非環式ペプチド
は、自発的な転位がおこりｎ−アルキルチオ保護基の移
動によりシスティン部分間にジスルフィド環が完成され
る迄、酸素不含液中に保持される。

さて以下に本発明を更に詳細に述べよう。

我々のこの改良方法は、アミノ酸鎖中の２コのシスティ
ン残基間にジスルフィド結合のあるところの如何なる環
状ジスルフィドペプチドの合成にも用い得る。

本方法は不安定な生物活性ペプチドの合成に特に有利で
ある。

何故ならばこのジスルフィド結合の生成は酸化を避けた
条件下で行われそれ以外にペプチド構造を妨害しないか
らである。

我々は非環式ペプチドの製造からまず開始し、２コのシ
スティン残基を含むオキシトシン、カルシトニン、又は
他のそのようなペプチドのいかなるものをも形成できる
。

アミノ酸鎖は古典的な合成法又は新しい固相技術（Ｒ，
Ｂ、メリフィールド「アドバンシズ・イン・エンザイモ
ロジー」インターサイエンス、ニュー−１−り、１９６
９年、Ｋ３２章 ２２１−２９６ページ；Ｊ、スチュア
ート及びＪ、ヤング「ソリッド・フェーズ・ペプタイド
・シンセシスＪＷ、Ｈ，フリーマン・アンド・カンハニ
ー、サンフランシスコ １９６９年）の応用により組み
合わされる。

固相タイプの合成法を用いるのが望ましい。

本合成においては、すべてのペプチド連鎖が樹脂上に完
成する迄、アミノ酸を１度に１つ宛樹脂に付加させる。

アミノ酸の機能基は遮へい基によって保護される。

アミノ酸のα−アミノ基は３級ブチルオキシカルボニル
基又はその均等基によって保護されるこの３級ブチルオ
キシカルボニル基なりｏｃで表わすことにする。

セリンやスレオニンの水酸基はベンジル基又はベンジル
誘導体基たとえば４−メトキシベンジル；４−メチルベ
ンジル；３・４−ジメチルベンジル；４−クロロベンジ
ル；２・６−ジクロロベンジル；４−ニトロベンジル；
ベンズヒドリル又はそれらの均等基で保護される。

これらのベンジル基及びベンジル誘導体基を８２で表わ
すことにする。

チロシンの水酸基は保護しなくとも良いし、又は上記Ｂ
Ｚで表わされるベンジル基又はベンジル保護基で保護し
ても良いし、又はベンジルオキシカルボニル基又はベン
ジルオキシカルボニル誘導体基たとえば２−クロロベン
ジルオキシカルボニル基、２−ブロモベンジルオキシカ
ルボニル基又はそれらの均等基で保護しても良い。

このように無保護基か、又はＢ７．基か、又はベンジル
オキシカルボニル基もしくはその誘導体基かをＷで表わ
すことＳする。

アルギニンのグアニジノ基はニトロ基、トシル基又はそ
れらの均等基で保護されていて良い。

ニトロ基やトシル基をＴで表わすことＳする。

リジンのε−アミノ基はベンジルオキシカルボニル基又
はベンジルオキシカルボニル誘導体基たとえば２−クロ
ロベンジルオキシカルボニル；２−ブロモベンジルオキ
シカルボニル；３・４−ジメチルベンジルオキシカルボ
ニル又はそれらの均等基で保護されていて良イ。

ベンジルオキシカルボニル基又はベンジルオキシカルボ
ニル誘導体基をＶで表わすこと呈する。

ヒスチジンのイミダゾール窒素に用いる保護基は、リジ
ンに用いＶで表わされるようなベンジルオキシカルボニ
ル基及びベンジルオキシカルボニル誘導体基である。

グルタミン酸及びアスパラギン酸のω−カルボン酸基は
、セリンやスレオニンの水酸基の保護に用いたようなベ
ンジル基又はベンジル誘導体基で保護される。

これらの保護基はＢ、で表わすことへする。

本発明の改良環化法の適用しうるペプチドは少くとも２
コのシスティン基をもっており、これらの１コ又は他の
１コをｎ−アルキルチオ基で保護し、他方なりＺ基で保
護することができる。

このＢ、Ｚ、基は、次の酸処理の段階で、その時まで残
つている他の保護基と共に除去される。

このｎ−アルキルチオ基をＳＲで表わすこと〜する。

こへにＲはアルキル基であって、好ましくはメチル、エ
チル、プロピル又はブチルであり、中でもエチルが通常
は更に好ましい。

ｎ−アルキルチオ保護基をもつシスティンは、所望の連
鎖中の２コのシスティン位置の１方でアミノ酸鎖に付加
され、一方ＢＺ保護基をもつシスティンは他のシスティ
ン位置で付加される。

たとえばオキシトシンは１位及び６位にシスティン残基
をもっているが、ｎ−アルキルチオ基は６位に用いられ
一方Ｂ２基は１位に用いられる。

又はＢＺ基が６位に用いられｎ−アルキルチオ基は１位
に用いられる。

固相技術によれば、合成さるべきペプチドの鎖の最も大
きい番号の位置にあるアミノ酸は、上述の如き保護基を
用い次いでα−アミノ基のＢｏｃ保護基除去により樹脂
とカップリンクされる。

次いで、その次に大きい番号の位置の、次なるアミノ酸
が、上述の如き適当な保護基を用いて、さきに付加した
アミノ酸基とカップリングし、Ｂｏｃ保護基が脱離され
、等々と反応が進み、最后に所望のアミノ酸鎖が完成す
る。

アミノ酸基と保護基の適切な結合が得られ、これらの結
合はさきに形成されたペプチドと反応して次々のアミノ
酸基を付加する。

そのような結合は化学品提供所から商業的に入手できる
。

本発明方法の適用されるペプチドのアミノ酸鎖の合成を
説明するため、第２表から第８表にかげて、典型的なア
ミノ酸連鎖の合成に用いる典型的反応剤のいくつか（そ
れらはアミノ酸基と保護基を含んでいる）を示す。

第２〜８表の反応剤の夫夫は化学品供給所から購入でき
る。

但し多分ＢｏｃＳ−アルキルチオ基は例外で、■、ラウ
ェ−−及びＰ、ハルター：ホツペ・ザイラース・ツアイ
トシュリフト・ヒュール・フイジオロギツシエ・ヘミ−
３５１巻 １３８４−８ページ １９７０年の文献記載
の方法で製造することができる。

位置 アミノ酸反応剤 ３ Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン ２ Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−チロシン、ＢｏｃＬ−チロ
シン、又はＢｏｃ−０−２−７。

モベンジルオキシカルボニルーＬ−チロシン １ Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン ０ Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン ｐ−ニトロフェニルニス゛フ
ール Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン ８ Ｂｏｃ −ｅ −ＣＢｚ −Ｌ−リジン又はＢｏｃ
−ε−２−クロロベンジルオキシカルボニル＝Ｌ〜リジ
ン Ｂｏｃ−Ｎ（ｉｍ ） −ＣＢｚ−Ｌ−ヒスチジン６ Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン Ｂｏｃ−Ｌ−クルタミン酸 γ−ベンジルエステル ４ Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン ｐ−ニトロフェニルエステル ■ Ｂｏｃ−Ｌ−ベンジル−Ｌ−セリン Ｂ ｏｃ −Ｌ＝ロイシン ■ Ｂｏｃ −ｅ −ＣＢｚ −Ｌ−リジン又はＢｏｃ−ε
−２−クロロベンジルオキシカルボニルＬ−リジン ０ Ｂｏｃ−グリシン Ｂ ｏｃ −Ｌ−ロイシン Ｂ ｏｃ −Ｌ−バリン Ｂｏｃ−８−エチルチオ−Ｌ−システィン、Ｂｏｃ−８
−メチルチオ−Ｌ−システィン、Ｂｏｃ−８−ｎ−プロ
ピルチオ−Ｌ−システィン、又はＢｏｃ−８−ｎ−ブチ
ルチオ−Ｌ−システイン Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−セリン Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン Ｂｏｃ−Ｌ−７スハラキン ｐ−ニトロフェニルエステ
ル Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−セリン Ｂｏｃ−８−ｐ−メトキシベンジル−Ｌ−システィン、
Ｂ ｏｃ −Ｓ−ベンジル−Ｌ−システィン又はＢｏｃ
−８−３・４−ジメチルベンジル−Ｌ−システィン 第 ４ 表 （ヒト・カルシトニン台底に用いる典型的反応剤）位置 ２ １ ０ ９ ８ ７ ６ ５ ４ ３ ２ １ ０ ９ ８ アミノ酸反応剤 Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン Ｂ ｏｃ −Ｌ−アラニン Ｂｏｃ−グリシン Ｂｏｃ−Ｌ−バリン Ｂｏｃ−グリシン Ｂｏｃ−Ｌ−インロイシン Ｂ ｏｃ −Ｌ−アラニン Ｂｏｃ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニン Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン ｐ−ニトロフェニルエステル Ｂ ｏｃ − Ｌ−プロリン Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン Ｂｏｃ−Ｎ（ ｉｍ） −ＣＢｚ−Ｌ−ヒスチジンＢ
ｏｃ − Ｌ−フェニルアラニン Ｂｏｃ−ε−ＣＢＺ−Ｌ−リジン又はＢｏｃε−２−ク
ロロベンジルオキシカルボニルＬ−リジン ７ Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン ｐ−ニトロフェニルエステ
ル ６ Ｂｏｃ フ ェニルアラニン Ｂｏｃ−Ｌ エステル アスパラギン酸 γーベンジル ４ Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン ルエステル ｐ−ニトロフエニ ３ Ｂｏｃ Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニン ２ Ｂｏｃ−Ｏ−ベンジル− Ｉ，−チロシン、ＢｏｃＬ−
チロシン又はＢｏｃ−０２−７０モ ベンジルオキシ力ルボニルーＬ−チロシン１ ０ Ｂｏｃ Ｂｏｃ Ｂｏｃ Ｂｏｃ ０−ベンジル−Ｌ グリシン Ｌ−ロイシン Ｌ−メチオニン チロシン 位置 アミノ酸反応剤 Ｂｏｃ−８−エチルチオ−Ｌ−システィン、Ｂｏｃ−８
−メチルチオ−Ｌ−システィン、Ｂｏｃ−８−ｎ−プロ
ピルチオ−Ｌ−システィン又はＢｏｃ−８−ｎ−ブチル
チオ−Ｌ−システイン Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−セリン Ｂ ｏｃ −Ｌ−ロイシン Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン ｐ−ニトロフェニルエステ
ル Ｂｏｃ−グリシン Ｂ ｏｃ −Ｓ −ｐ−メトキシベンジル−Ｌ−システ
ィン、Ｂ ｏｃ −Ｓ−ベンジル−Ｌ−システィン又は
Ｂｏｃ−８−３・４−ジメチルベンジル−Ｌ−システィ
ン 第 ５ 表 （バンプレソシン合成における典型的反応剤）位置 アミノ酸反応剤 Ｂｏｃ−グリシン Ｂｏｃ−ω−トシル−Ｌ−アルギニン又はＢｏｃ−ω−
ニトロ−Ｌ−アルギニン Ｂｏｃ−Ｌ−フロリン Ｂｏｃ−８−エチルチオ−Ｌ−システィン、Ｂｏｃ−８
−メチルチオ−Ｌ−システィン、Ｂｏｃ−８−ｎ−プロ
ピルチオ−Ｌ−システィン又はＢ ｏｃ −５−ｎ−ブ
チルチオ−Ｌシスティン Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン ｐ−ニトロフェニルエステ
ル ４ Ｂ ｏｃ −Ｌ −クルクミン ｐ−ニトロフェニルニ
スアル Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン ２ Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｉ、−チロシン、Ｂｏｃ−Ｌ−
チロシン又はＢｏｃ−０−２−ブロモベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−チロシンＢｏｃ −８−ｐ−メトキシベ
ンジル−Ｌ−システィン、Ｂｏｃ−８−ベンジル−Ｌ−
システィン又はＢｏｃ−８−３・４−ジメチルベンジル
−Ｌ−システィン 第 ６ 表 （ソマトスタチン合成における典型的反応剤）位置 アミノ酸反応剤 ４ Ｂｏｃ−８−３・４−ジメチルベンジル−Ｌシスティン ３ ２ １ ０ Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−セリン Ｂｏｃ−０−ベンジルーＬ−スレオニン Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン Ｂｏｃ−ε−ＣＢＺ −Ｌ−リジン又はＢｏｃ−ε−２
−クロロベンジルオキシカルボニルＬ−リジン Ｂ ｏｃ −Ｌ −）リプトファン Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン ｐ−ニトロフェニルエステ
ル Ｂｏａ−ｅ −ＣＢｚ −Ｌ−リジン又はＢｏｃε−
２−クロロベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン Ｂ ｏｃ−８−エチルチオ−Ｌ−システィン、Ｂｏｃ−
８−メチルチオ−Ｌ−システィン、Ｂｏｃ−８−ｎ−プ
ロピルチオ−Ｌ−システィン、又はＢｏｃ−８−ｎ−ブ
チルチオ−Ｌシスティン Ｂｏｃ−グリシン Ｂ ｏｃ−Ｌ−アラニン 第 ７ 表 （ブタ・カルシトニン合成における典型的反応剤）位置 ２ １ ０ アミノ酸反応剤 Ｂｏｃ−Ｌ−７０リン Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン Ｂ ｏｃ −Ｌ −クルタミン酸 γ−ベンジルエステ
ル ９ Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン ８ Ｂｏｃ−グリシン ７ Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン 位置 ２６ ５ ４ ３ ２ １ アミノ酸反応剤 Ｂｏｃ−グリシン Ｂ ｏｃ −Ｌ−メチオニン Ｂｏｃ−グリシン Ｂｏａ−０−ベンジル−Ｌ−セリ Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン ン Ｂｏｃ−ω−トシル−Ｌ−アルギニン又はＢｏｃ−ω−
ニトロ−Ｌ−アルギニン ０ ９ ８ Ｂｏｃ−Ｎ（ｉｍ ） −ＣＢｚ−Ｌ−ヒスチジンＢｏ
ｃ−Ｌ−フェニルアラニン Ｂ ｏｃ −Ｌ−アスパラギン ｐ−ニトロフェニルニ
スアル ７ Ｂ ｏｃ−Ｌ −７スハラキン ｐ−ニトロフェニルエ
ステル ６ Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン ５ Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギ／ ｐ−ニトロフェニルエステ
ル ４ Ｂｏｃ−ω−トシル−Ｌ−アルギニン 又はＢｏｃ−ω
−ニトロ−Ｌ−アルギニン ３ Ｂｏｃ−Ｌ−）リプトファン ２ Ｂｏｃ−０−ベンジ／Ｌ／ −Ｌ−チロシン、Ｂｏｃ−
Ｌ−チロシン、又はＢｏｃ−２−ブロモベンジルオキシ
カルボニル−Ｌ−チロシン １ ０ Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン Ｂｏｃ−Ｏ−ベンジル−Ｌ Ｂ ｏｃ −Ｌ−ロイシン Ｂｏｃ−Ｌ−バリン スレオニン Ｂ ｏｃ −Ｓ−エチルチオ−Ｌ−システィン、Ｂ ｏ
ｃ −Ｓ−メチルチオ−Ｌ−システィン、Ｂｏｃ−８−
ｎ−プロピルチオ−Ｌ−システィン又はＢ ｏｃ −Ｓ
−ｎ−ブチルチオシスティン Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニン Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−セリン Ｂ ｏｃ −Ｌ−ロイシン Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン ｐ−ニトロフェニルエステ
ル Ｂ ｏｃ −０−ベンジル−Ｌ−セリン 位置 アミノ酸反応剤 Ｂｏｃ−８−ｐ−メトキシベンジル−Ｌ−システィン、
Ｂｏｃ−８−ベンジル−８−ベンジル−Ｌ−システィン
又はＢｏｃ−８−３・４−ジメチルベンジル−Ｌ−シス
ティン 第 ８ 表 （ウシ・カルシトニン合成における典型的反応剤）位置 ２ １ ０ ９ ８ ７ ６ ５ ４ ３ ２ １ アミノ酸反応剤 Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン Ｂｏｃ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−スレオニン Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミン酸 ｒ−ベンジルエステル Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン Ｂｏｃ−グリシン Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン Ｂｏｃ−グリシン Ｂｏｃ−Ｌ−メチオニン Ｂｏｃ−グリシン Ｂｏｃ＝Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン Ｂｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン Ｂｏｃ−ω−トシル−Ｌ−アルギニン又はＢｏｃ−ω−
ニトロ−Ｌ−アルギニン ０ Ｂｏｃ−Ｎ（ｉｍ） −ＣＢｚ−Ｌ−ヒスチジン９ Ｂｏｃ−０−ベンジル−Ｌ−チロシン、Ｂｏｃ−Ｌ−チ
ロシン、又はＢｏｃ−０−２−ブロモベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−チロシン ８ Ｂｏｃ−Ｌ７スパラギン ｐ−ニトロフェニルエステル ７ Ｂｏｃ−Ｌ−７スハラキン ｐ−ニトロフェニルエステ
ル Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシン ５ Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸 γ−ベンジルエステル Ｂｏｃ−ｅ −ＣＢｚ −Ｌ−リジン又はＢｏｃ−ε
−２−クロロベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リジン ３ Ｂ ｏｃ −Ｌ−トリプトファン 第２表の一連の反応で得られる非環式ペプチドの合成及
び樹脂の分解において、ｎ−アルキルチオ保護基はシス
ティン残基の６位にあり、Ｂｚ基は１位にある。

この非環式ペプチドの形成においては、これらの基は反
応になり、つまりＢ７．基は６位に位置しｎ−アルキル
チオ基は１位に位置することは理解されねばならぬ。

同様にして第３表においては７位と１位の保護基は反対
になり、これは第４．７及び８表においても同じである
。

第５表では６位と１位の保護基が反対になる。

ソマトスタチンの合成に関する第６表では、その表に示
すように１４位にｎ−アルキルチオ基を、そして３位に
ＢＺ基を置（のが好ましい。

この合成においてもまた、カルシトニン類の合成に賞用
されるベンズヒドリルアミンポリスチレン樹脂の代すに
クロロメチル化ポリスチレン樹脂を用いるのが好ましい
。

本発明で中間体として作られるところの、シスナインア
ミノ酸残基２コをもつ非環式ペプチドはなる構造をもつ
ことで特徴づけられる。

但しこ工に Ａはアミノ酸残基であり Ｘは０（ゼロ）又は整数であり Ｃｙｓはシスティン残基であり Ｒはｎ−アルキル基であり Ｂ７はベンジル又はベンジル誘導体基である。

このように分解されたペプチドは遊離のスルフヒドリル
基をもつシスティン残基とｎ−アルキルチオ基と共にジ
スルフィド結合を形成するスルフヒドリル基をもつシス
ティン残基をもっている。

第２−８表の各々における反応で生成されるペプチドは
夫々そのようにして特徴づけられている。

上述のように特徴づけられるいかなるペプチド類もまた
本発明において中間体として使用され、本発明の閉環反
応に付される。

２コのシスティン残基をもち但しその１つは遊離スルフ
ヒドリル基をもち他方はそのスルフヒドリル基がｎ−ア
ルキルチオ基でブロックされているような構造をもつい
かなる左様なペプチドも、ｎ−アルキルメルカプタンの
移動により所望の環式ジスルフィドシスティンペプチド
へ自動的に転位をうけるまで約５から１０のｐＨで溶液
（中間体が溶解すればいかなる溶液でも良い）好ましく
は水溶液又はアルコール溶液中に保持される。

この転位反応は、溶液のｐＨを５．０から８．５好まし
くは６．０から８．５、最も良いのは水酸化アンモニア
又は水酸化アルカリを加えてｐＨ約７．５に調節するこ
とにより行われる。

６．０以下のｐＨも用いられるが転位は所望よりも遅く
進行し、また約１０．０又は１０．５に達するｐＨも用
いられるが、ｐＨが８．５以上になると収率が減すると
いう危険がある。

さらにこの転位反応の間は攪拌するのが望ましく、約２
から４８時間で良く、普通は約２４時間で完結する。

この反応はかきませるか又はその他の攪拌形態で行われ
る。

また酸素又は酸素を生ずる物質の存在を避けるように注
意すべく、溶液は実質的に酸素のないように保つ。

ペプチド含有液は不活性気体たとえば窒素の流れの丁に
おくのが好ましい。

反応の結果移動したｎ−アルキルメルカプタンは窒素又
は他の不活性気体で除去され、該気体がメルカプタンを
含まなくなった時はその反応は完結したとみなして良い
。

−ＣＹＳ （Ａ ） ｘ−ＣＹＳ−構造（ここでＣＹＳ
基の一つは遊離のスルフヒドリル基を有しそしてＣＹＳ
基の他方はスルフヒドリル基と共にジスルフィド結合を
形成するアルキルチオ基によって保護されたスルフヒド
リル基を有する）を有する中間体ペプチドは、本発明の
閉環操作によりペプチドとなり、その際前述の構造は となる。

こ＼にＣｙｓはシスティン残基であり Ａはアミノ酸残基であり Ｘは０又は整数である。

もし上述したような手段と注意により該方法を注意深く
行えば該閉環反応においては、２コのシスティン間のジ
スルフィド形成及びｎ−アルキルチオメルカプタンの移
動という転位以外にはペプチド中では何の変化も生じな
い。

※ 上述の本発明の閉環反応で得られたペプチド溶液は本技
術分野で公知の方法で精製しうる。

該溶液はゲルカゴ過及びイオン交換クロマトグラフィー
を併せ用いて処理する。

最終精製物は溶液を凍結乾燥して得られる。

得られたペプチドは天然源から得たペプチドと化学的に
も生物学的にも均等である。

本改良方法の応用の一つとしてサケ・カルシトニンの合
成があり、之は既に出願中の「サケカルシトニンの製法
」の中で述べられている。

該出願の実施例１は、本発明方法に従ってサケ・カルシ
トニンの合成の例としてこ＼に合一される。

該実施例１に述べているようにＢ ｏｃ−Ｌ−プロリン
を用いプロリンを３２位で樹脂に結合させ、次いでＢｏ
ｃ−０−ベンジル−Ｌ−スレオニンヲ用いてスレオニン
を３１位で結合させ、以下第３表に示すような反応剤を
その順に用いて結合（カップリング）を続ける。

７位に達した時にｎ−アルキルチオ基をもつ反応剤を用
い、そして１位に達した時にＢＺ基をもつ反応剤を用い
る。

所望のアミノ酸鎖が完結したら樹脂ペプチドをフッ化水
素で処理して樹脂及びすべての残りの保護基（７位のｎ
アルキルチオ基を除く）を除去する。

この酸分解工程で得られた溶液を水でうすめ、水酸化ア
ンモニウムを加えてｐＨ７，５にする。

ついで溶液を、発生する窒素流の中にメルカプタンが検
出されなくなる迄窒素ガス気流中で攪拌する。

得られた製品を精製すれば、それは天然のサケカルシト
ニンと化学的にも生物学的にも均等であることがわかる
。

第３表に述べた反応で得られたペプチドの式は、樹脂の
分解前は次のようである。

無水の酸で分解して得られたこのペプチドの式は次のよ
うになる これはサケカルシトニンの前駆物質である。

このペプチドを、上述のような本発明の環化方法に付す
ると該ペプチドは次のようになる これはサケカルシトニンである。

本改良法の他の応用はオキシトシンの合成である。

オキシトシンは９コのアミノ酸を包含し、オキシトシン
のアミノ酸鎖は９位でグリシンから始まって作られる。

このグリシンはＢｏｃ−グリシンを用いてＢＨＡ樹脂と
カップリングされる。

次いでＢ ｏｃ −Ｌ−ロイシンを用いてロイシンをカ
ップリングさせ、以下第２表のアミノ酸基及び保護基を
その順に用いて、固相法でカップリングと保護＊＊基脱
離のサイクルをくり返して行う。

６位に到達すればシスティン基と共にｎ−アルキルチオ
保護基を用い、次いで１位に到達すれば、ＢＺ保護基を
用いて他のシスティン基がカップリングされる。

もしくはＢ、Ｚ、保護基を６位で用い、ｎ−アルキルチ
オ基を１位で用いても良い。

該アミノ酸鎖の完結后のペプチドは次の式をもつ こＳに■は樹脂のポリエチレン部であり Ｗは保護基がないか、又は８２基、ペンジルオキシカル
ホ゛ニル基もしくはベンジルオキシカルボニル誘導体基
であり Ｒはｎ−アルキル基である。

樹脂を酸処理で分解した后は次のよ うになる。

この分解されたペプチドはまだ６位にｎ−アルキルチオ
基をもっているが、溶媒中で好ましくはｐＨ６，０〜８
．５に保つと、６位のシスティンとそのｎ−アルキルチ
オ保護基及び１位のシスティンのスルフヒドリル機能の
間のジスルフィド結合の転位をうけて次で示されるペプ
チドを生ずる。

これはオキシトシンである。

本発明方法を用いたオキシトシン合成の例を、次に実施
例Ａとして示す。

実施例 Ａ （オキシトシンの合成） 樹脂の活性化 アミン当量０．４３ ｍｅｑ ／ ？のベンズヒドリル
アミン（ＢＨＡ） 樹脂５？を、ニューヨーク州オレ
ンジハークのシュワルツマン・インコーホレーテッドか
ら市販されているペプチド合成器の反応容器に入れ、樹
脂を次の溶媒２０ｍ１で処理し、各々の処理のあとは１
過する メチレンクロライド ２分クロロ
ホルム ２回、各２分１０％トリエ
チルアミン（クロロ ２回、各５分ホルム中） クロロホルム ２分メチ
レンクロライド ３回、各２分サイクル９ （カップリング） ＢＨＡ樹脂、メチレンクロライド２
０ＴＬｌ及びＢｏｃ−グリシン ０．７Ｆｌ（０，００
４３モル）を１０分間攪拌する。

ジシクロへキシルカルボジイミドのメチレンクロライド
溶液（溶液ＩＴＬｌに対しＤＣＣｌｌｍｅｑ）の４．３
ＴＬｌを反応器に加え、混合物を６時間攪拌する。

反応混合物を１過して反応器から除き、Ｂｏｃ−グリシ
ルＢＨＡ 樹脂を次のものでひきつｇいて２分間、２０
１７１１で洗滌し、各々１過して洗液を除くメチレンク
ロライド ２回 メチルアルコール ２回 メチレンクロライド ２回 （アセチル化） ついで樹脂を無水酢酸１．６ｍｌ、ト
リエチルアミン（ＴＥＡ）２．４ｍｌ及びクロロホルム
２０ｍ１の混合物と３０分攪拌する。

反応混合物は１過して除き、樹脂を次のもので２分間、
２０ｍ１宛で洗う。

クロロホルム ２回 メチルアルコール ２回 メチレンクロライド ３回 ニンヒドリンテストは陰性であった。

（保護基脱離） Ｂｏｃで保護された樹脂を、トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）１２ｍｌ及びメチレンクロライド
１２ｍ１の混合物で５分間攪拌、混合物を１去し、樹脂
をＴＦＡ １２ｍｌとメチレンクロリド１２ｍ１の第２
の混合物で３０分攪拌し、反応混合物を１去し、樹脂を
次のもの２０７７１１宛で洗うメチレンクロライド
２回、各２分 メチルアルコール ２回、各２分 クロロホルム ２回、各２分 １０％ＴＥＡ （クロロ ２回（５分と１０分）ホルム
中） クロロホルム ２回、各２分 メチレンクロライド ２回、各２分 し−グリシンＢＨＡ樹脂を滴定しくり、 ドーマン：
テトラヒドロン、レターズ １９６９年２３１９−２１
頁）アミン乃至グリシンカ価を求める。

その結果は樹脂１ｚ当りアミン乃至グリシン０．３８４
ｍｅｑである。

サイクル８ （カップリング） Ｌ−グリシン樹脂、メチレンクロラ
イド２０ＴＬｌ及びＢｏｃ−Ｌ−ロイシン、Ｈ２Ｏ２，
９５Ｓ’（０，００３８モル）を１０分攪拌する。

ジシクロへキシルカルボジイミドのメチレンクロライド
溶液（溶液ＩＴＩＬｌあたりＤＣＣＩ １ｍｅｑ又は
ＤＣＣＩ 総量０．００３８ モル） ３．８ｍｌを
反応器に加え混合物を２時間攪拌する。

反応混合物を反応器から除き、樹脂を次のもので継続し
て２分間、２０ＴＬｌで洗い各々溶液を１去する。

メチレンクロライド ２回 メチルアルコール ２回 メチレンクロライド ２回 ニンヒドリンテストは陰性である。

（保護基脱離） サイクル９に用いたと同様のことをこ
のサイクルでも行なう。

サイクル７ このサイクルでのカップリングと保護基脱離方法はサイ
クル８におけると同じ、但しロイシン誘導体の代りにＢ
ｏｃ−Ｌ−プロリン Ｑ、８２Ｐ（０，００３８モル）
を使用する。

サイクルに のサイクルでのカップリングと保護基脱離方法はサイク
ル８におけると同様であり、アセチル化方法はサイクル
９におけると同様である。

カップリングではＢｏｃ−８−エチルチオ−Ｌ−システ
ィン１．０７１（０，００３８モル）をアミノ酸として
使う。

サイクル５ （カップリング） サイクル６で得られたペプチド樹脂
をジメチルホルムアミド（Ｄ■゛）２０就宛で２回洗い
、次いで樹脂をＤＭＦ ２５１′ＩＬｌ中のＢｏｃ−Ｌ
−７スパラギン ｐ−ニトロフェニルエステル２．０１
ｆ（０，００５７モル）の溶液で２４時間攪拌し、反応
混合物を１過し次いで樹脂ペプチドを次の溶媒２０１ｒ
Ｌｌ宛で連続２回、２分間洗う。

即ちＤＭＦ、メチレンクロライド、メタノール、メチレ
ンクロライド。

各々の溶媒洗液は１去する。ニンヒドリンテストは陰性
。

（保護基脱離）サイクル８におけると同様。

サイクル４ このサイクルで用いるカップリング方法はサイクル５に
おけると同じであり、アセチル化方法はサイクル９にお
けると同じであり、保護基脱離方法はサイクル８におけ
ると同じである。

次のアミノ酸誘導体を使用する。

Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミンｐ−ニトロフェニルエステル２
．０９ ｆ （０，００５７モル）。

サイクル３ このサイクルでのカップリング方法はサイクル８におけ
ると同じである。

該カップリングはＤＭＦ １０ｒｎｌ及びメチレンク
ロライド１０ｍ１の溶媒系および同量のアミノ酸とＤＣ
Ｃを用いて行う。

またアセチル化方法はサイクル９におけると同じであり
、保護基脱離方法はサイクル８におけると同じである。

各カップリング反応では次のアミノ酸を用いる。

Ｂｏｃ−Ｌ−イソロイシン０．８８ｆ（０，００３８モ
ル） サイクル２ （カップリング） サイクル３で得られた樹脂ペプチド
をＤＭＦ ２０ ｍｌ宛で２回連続して洗い、次いで
樹脂ペプチドをＢｏｃ−０−ベンジ／ｌ／−Ｌチロシン
２．１１ｆ（０，００５７モル）とＤ■゛２０ｍ１の混
合物で１０分攪拌し、次いでＤＣＣＩのメチレンクロラ
イド溶液（ＤＣＣＩ ０．００５７モルに相当）５．
７ｍｌを加え混合物を１６時間攪拌し、反応混合物を１
去し、ついで樹脂ペプチドをＤＭＦ、メチレンクロライ
ド、メタノール及びメチレンクロライドの順に２０ｒＩ
ｌｌ宛２回２分間洗う。

カップリン反応はメチレンクロライド中ＤＣＣＩ及びア
ミノ酸誘導体半量を用いて６時間攪拌して繰返す。

（アセチル化）サイクル９に用いたアセチル化方法をく
りかえす。

（保護基脱離）サイクル９に用いた保護基脱離方法をく
りかえす。

サイクル１ このサイクルで用いるカップリング方法はサイクル８に
おけると同じで、メチレンクロライド中のＤＣＣＩ
及びアミノ酸誘導体の半量を用いて行なう。

またこのサイクルにおける保護基脱離方法はサイクル９
におけると同じである。

最初のカップリング反応に用いるアミノ酸とその量は次
のとオリ。

Ｂｏｃ−８−メトキシベンジル−Ｌ−システィン１．３
ｆ（０，００３８モル）。

サイクル１の完結后、樹脂ペプチドをヘキサン２０１７
１１宛で２回洗い、次いでペプチドを反応器からとり、
２４時間０．１ ｍｍＨｇ、 ４０℃で電気真空オー
プンで乾燥する。

ブロックされたオキシトシンペプチド樹脂の得量は６，
０りである。

フッ化水素を用いての分解 乾燥樹脂ペプチド２ｚ及びアニソール２ＴＬｌをテフロ
ン反応器に入れる。

テフロン被覆されたマグネチック・スターラーを装えた
容器をドライアイス−アセトン浴に入れ、フッ化水素ガ
ス１５ｍ１を容器へ送り凝縮させる。

この混合物を水浴中で１時間ｏ ’ｃで攪拌する。

フッ化水素は減圧下で蒸発して除かれる。

残渣を酢酸エチル２５７７１１宛で４回すりつぶる。

樹脂粒を氷酢酸５０ｍ１宛で２回処理してペプチドを抽
出する。

この抽出液を真空凍結乾燥すると分解ペプチド４８６■
を得る。

ペプチドのオキシトシンへの環化 粗ペプチド２００ｍｆＩを、氷酢酸１ｍｌの入った酸素
不含蒸溜水５０ｍ１に部分的にとかし、この溶液のｐＨ
を濃アンモニア水で７．５に調節し、この混合物を窒素
流で閉容器中２４時間攪拌する。

この時には、発生する窒素流の中にはエチルメルカプタ
ンは検出されない。

窒素気流中のエチルメルカプタン含量は、気流をエルマ
ン試薬（ＧＬ、 エルマン：アーカイブズ・オフ・バ
イオケミストリー・アンド・バイオフィジックス ８２
巻 ７０−７ページ １９５９年）の溶液に適すことに
より測定されるこの反応混合物に氷酢酸を加えてｐＨを
３．２にし、減圧凍結乾燥すると固形の残渣を得る。

粗オキシトシンの精製 この固形残渣を０．５ Ｎ酢酸溶液にとかし、次いでセ
ファデックスＧ−２５（微細）ゲル１過カラムを通し０
．５Ｎ酢酸で溶離することによって精製される。

このカラムからのオキシトシン分画を集め、減圧凍結乾
燥して白色固体５４■をうる。

この固体をもう１度０．５Ｎ酢酸にとかし、七フ※※ア
デツクスＧ−２５（微細）ケル１過カラムに適シ０１５
Ｎ酢酸で溶離して精製する。

このカラムからのオキシトシン分画を集め減圧凍結乾燥
して綿毛状の白い固体をうる。

これを分析したところ次のアミノ酸比率が見出された。

Ｇｌｙｌ、Ｏ，Ｌｅｕｏ、９８、ＰｒｏＯ，９７、Ａｓ
ｐＯ，８９、ＧｌｕＯ，８４，１１ｅ０．７４、Ｔｙｒ
Ｏ，７２、理論値は１．０であるべきである。

ＣｙｓＯ値は出てこなかったが之は分析操（’Ｆ＝によ
りこのアミノ酸が破壊されるからである。

水晶の生物活性度は■あたり３０５．４単位であった。

本発明の方法はまたソマトスタチンの合成にも類似の態
様で適用することができる。

その時の樹脂はポリスチレン樹脂たとえば当技術分野で
公知のクロロメチル化ポリスチレン樹脂であって良い。

１４位のシスティンはＢ ｏｃ −Ｓ −３・４−ジメ
チルベンジル−Ｌ−システィンを用いて樹脂とまずカッ
プリングさせ、次いでセリン、次いでスレオニン等々と
いうように、第４表に述べた順でアミノ酸及び保護基を
もった反応剤を用いる。

３位に達した時に、ｎ−アルキルチオ基をもったシステ
ィン基を用いる。

アミノ酸鎖が完結して、まだ樹脂を分解する酸処理を行
ってない折のペプチドは次のようである。

酸処理して樹脂を分解したときは、 ペプチドは 次のようになる。

次いで、 この非環式分解ペプチドを本発明の環 化方法の条件下で転位させれば、 次のようになる 本発明による改良方法は、サケカルシトニンにおいて述
べたと類似の態様でヒトカルシトニンの合成に応用でき
る。

ヒトカルシトニンはそのアミノ酸鎖に３２コのアミノ酸
をもつ。

プロリンから出発して、３２位のこのアミノ酸はＢＨＡ
樹脂とカップリングさせ、ついで３１位のアラニン、３
０位のグリシンというように第４表にのべた順序で、ア
ミノ酸基と保護基をもつ反応剤を用い、すでに述べた保
護、カップリング及び保護基脱離というように行う。

システィン基が７位及び１位※※に到達したとき、これ
らの位置に１つにｎ−アルキルチオ保護基が、そして他
の位置にふつうのＢ、Ｌ基が用いられる。

アミノ酸鎖が完結したときのペプチドは、ｎ−アルキル
チオ基が７位にあるとすれば次のようになる。

酸処理して樹脂を除去した后のペプチドは次のようであ
る。

このペプチドを、ジスルフィド環を完結させるためこ〜
に述べた条件下で転位させると、次のよ：うになる。

これはヒトカルシトニンの構造である。

本発明による改良方法を用いたヒトカルシトニンの合成
例を実施例Ｂとして掲げる。

実施例 Ｂ （ヒトカルシトニンの合成） 樹脂の活性化 アミン力価の５５ｍｅｑ／Ｐのベンズヒドリルアミン（
ＢＨＡ） 樹脂４ｆ？をニューヨーク州オレンジハーグ
のシュワルツマン・インコーホレーテッドから販売され
ているペプチド合成画の反応容器に入れる。

この樹脂を次の溶媒２０ｍ１で処理し、各処理毎に１過
する。

メチレンクロライド ２分 クロロホルム １０％トリエチルアミン（クロロ ホルム中） ２回、各２分 ２回、各５分 クロロホルム ２分 メチレンクロライド ３回、各２分 サイクル３２ （カップリング） ＢＨＡ樹脂、メチレンクロリド２
０ ｍｌ及びＢｏｃ−Ｌ−プロリンＱ、９５Ｐ（０，０
０４４モル）を１０分間攪拌する。

ジシクロヘキシル力ルポジイミドのメチレンクロライド
溶液（溶液１１ｒＬｌあたりＤＣＣＩ １ミリ当量）
４４ｍｌを反応器に加え、混合物を６時間攪拌し、反応
混合物を１過して反応器から除去し、Ｂｏｃ−プロリル
ＢＨＡ樹脂を次の順で２分、２０ｒｎｌで洗い、各々で
ｒ過して洗液を除去する。

メチレンクロリド ２回 メチルアルコール ２回 メチレンクロリド ２回 （アセチル化） 次いで樹脂をトリエチルアミン（ＴＥ
Ａ） １．５ｒｆＬｌ、無水酢酸１ ｍｌ、及びクロ
ロホルム２０ｍ１の混合物で２時間攪拌し、反応混合物
を１去し、樹脂を次のもので２分、２０ＴＩｌｌで洗う クロロホルム ２回 メチルアルコール ２回 メチレンクロライド ３回 ニンヒドリンテストは陰性（Ｅ、カイザーほか：アナリ
チカル・バイオケミストリー ３４巻５９５−８頁 １
９７０年）。

（保護基脱離） Ｂｏｃで保護された樹脂を、トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）１２．５ｍｌ及びメチレンクロラ
イド１２．５ｍｌの混合物で５分間攪拌し、この混合物
をＰ去し、樹脂をＴＦＡ １２．５ＴＬｌとメチレンク
ロライド１２．５ｍｌの第２の混合物で３０分攪拌し、
反応混合物を１去し、樹脂を次のもので２０ｍ１で洗う メチレンクロライド ２回、各２分 ※※メ
チルアルコール ２回、クロロホルム
２回、１０％ＴＥＡ（クロロホルム中
） ２回、クロロホルム ２回、 メチレンクロライド ２回、 各２分 各２分 各１０分 各２分 各２分 このＬ−プロリンＢＨＡ樹脂のアミン乃至プロリンカ価
を測ると、樹脂１ｔあたりアミン乃至プロリン０．４９
４ミ！Ｊ当量であった。

サイクル３１ （カップリング） Ｌ−プロリル樹脂、メチレンクロラ
イド２０ＴＩｌｌ及びＢｏｃ−アラニン ０．８３Ｐ（
０，００４４モル）を１０分間攪拌する。

ついでジシクロへキシルカルボジイミドのメチレンクロ
ライド溶液（溶液１ ｍｌあたりＤＣＣＩ １ミリ当
量、又はＤＣＣＩ ｌａ量０．００４４モル） ４．４
７７１１ヲ反応器に加え、混合物を２時間攪拌する。

反応混合物を１過して反応器から除き、Ｂｏｃ−Ｌ−ア
ラニル−Ｌ−プロリルＢＨＡ樹脂を次のもので引きつｇ
いて２分、２０１７１１で洗い、各々で１過して洗液を
除（。

メチレンクロライド ２回 メチルアルコール ２回 メチレンクロライド ３回 ニンヒドリン陰性。

サイクル３０から２６迄 これらのサイクルで用いるカップリング及び脱保護基の
方法はサイクル３１におけると同様で、但しアラニン誘
導体の代りに次のアミノ酸誘導体を用いる サイクル２５ （カップリング） サイクル２６で得られたペプチド樹
脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２０ｒｎｌで２回
洗い、次いでこの樹脂ペプチドをＢｏｃ−０−ベンジル
−Ｌ−スレオニン２．０４ｆ（０，００６６−Ｅ−ル）
及びＤＭＦ ２０ ｒｎｌの混合物と１０分間攪拌し、
次いでＤＣＣＩ のメチレンクロライド溶液（ＤＣＣ
Ｉ ０．００６６モル相当）を加え、混合物を６時間
攪拌し、この反応混合物を１去し、次のもので引きつｇ
き２回宛２０ｍ１宛で２分間洗う。

ＤＭＦ、メチレンクロライド、メチルアルコール、メチ
レンクロライド、ニンヒドリンテスト陰性。

（保護基脱離）サイクル３２で用いたように行う。

サイクル２４ （カップリング） サイクル２４で得たペプチド樹脂な
りＭＦ ２０ｍ１宛で２度洗う。

ついで樹脂ヲ、Ｂ ｏｃ −Ｌ −グルタミン ｐ−ニ
トロフェニルエステル２．４２１（０，００６６モル）
のＤＭＦ２５ｍｌ溶液と２４時間攪拌し、反応混合物を
１過し、樹脂ペプチドを次の溶媒２０ＴＬｌ宛で２回宛
つづけて、２分間洗う。

即ちＤＭＦ、メチレンクロライド、メタノール、メチレ
ンクロライド。

各々の※昶溶媒は１去する。

ニンヒドリンテスト陰性。（保護基脱離）サイクル３２
で用いた保護基脱離を行う。

サイクル２３ （カップリング） サイクル２４で得たペプチド樹脂を
Ｂｏｃ−Ｌ−プロリン１．４．２ Ｐ （０，００６６
モル）のメチレンクロライド溶液２０ｍ１と１０分間攪
拌する。

ＤＣＣＩ のメチレンクロライド溶液６、６ ｍｌ
（ＤＣＣＩ の０．００６６モル相当）を加え、混合
物を１６時間かくはんし、反応混合物をＰ去し、樹脂ペ
プチドを次の溶媒の２０ＴＩｌｌ宛で、つｇいて２回宛
、２分間洗う。

メチレンクロライド、メチルアルコール、メチレンクロ
ライド、各溶液を１去す。

ニンヒドリンテスト陰性。（保護基脱離）サイクル３２
と同様 サイクル２２ 本サイクルでのカップリング及び保護基脱離はサイクル
２３におけると同じ、但しカップリングに於てＢｏｃ−
Ｌ−プロリンの代りにＢｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン１
，７５１（０，００６６モル）使用サイクル２１から１
８ これらのサイクルでのカップリング及び包護基脱離はサ
イクル３１におけると同じ、但しアラニン誘導体に代え
次のアミノ酸誘導体を使用。

サイクル１７ 本サイクルでのカップリング及び保護基脱離方法はサイ
クル２４におけると同じ、但しグルタミン誘導体に代え
Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン ｐ−ニトロフェニルエステ
ル ２．３．ｌ’（０，００６６モ＊＊ル）を使用。

サイクル１６及び１５ これらのサイクルでのカップリング及び保護基脱離方法
はサイクル３１と同じ、但しアラニン誘導体に代え次の
アミノ酸誘導体を使用 サイクル１３ サイクル２１に同じ サイクル１２ 本サイクルでのカップリング及び脱保護基方法は、サイ
クル２５と同じ、但しスレオニン誘導体に代えＢ ｏｃ
−０−ベンジル−Ｉ、−チロシン２．４５Ｐ（０，０
０６６モル）を用い、攪拌時間を１６時※※間に延長。

サイクル１１ サイクル２５に同じ サイクル１０から７ これらのサイクルに於けるカップリング及び脱保護基方
法はサイクル３１におけると同じ、但しＢｏｃ−Ｌ−ア
ラニンの代りに次のものを使用サイクル６ サイクル２５に同じ サイクル５と４ これらサイクルにおけるカップリング及び脱保＊＊護基
方法はサイクル３１に同じ、但しカップリング反応にお
いてＢｏｃ−Ｌ−アラニンに代え次を使用 サイクル３ サイクル１７に同じ サイクル２と１ これらサイクルのカップリング及び脱保護基方法はサイ
クル３１と同じ、但しカップリングに於てＢｏｃ−Ｌ−
アラニンに代え次を使用 サイクル１の完結后、樹脂ペプチドをｎ−へキサン２０
ｍ１宛で２回洗う。

ペプチドは反応器から移し、２４時間０．１ ｍｍＨｇ
４０℃で電気真空オーブンで乾燥する。

このブロックされたヒトカルシトニンペプチドはＩＩＰ
あった。

フッ化水素による分解 アニソール２ＴｒＬｌと乾燥樹脂ペプチド２ｚをテフロ
ン反応器に入れる。

この容器はテフロン被覆のマグネチツクスターラーを具
えており、ドライアイス−アセトン浴に入れて、この容
器ヘフツ化水素１５ＴＬｌを凝縮導入する。

この混合物を水浴中で０℃に１時間攪拌し、フッ化水素
は減圧で留去し、残渣を酢酸エチル２５ｍ１宛で４回く
だき、この樹脂粒から氷酢酸を用いて（５０ｍｌ×２回
）ペプチドを抽出し、抽出物を減圧凍結乾燥すれば分解
されたペプチド１０６３■を得る。

ペプチドのヒトカルシトニンへの環化 粗ペプチド１０００■を、氷酢酸１扉ｌ添加の酸素不合
蒸溜水２５０ｒｌＬｌにとかし、濃アンモニア水でｐＨ
７，５とし、２４時間窒素流で閉容器中でかきまぜる。

この時、発生する窒素流中にはエチルメルカプタンは検
出されない。

窒素流中のエチルメルカプタン量ハエルマン試薬（Ｇ、
Ｌ、エルマン：アーカイブズ・オフ・バイオケミストリ
ー・アンド・バイオフィジックス ８２巻 ７０−７７
ページ １９５９年）の溶液を通して該窒素流を送るこ
とで測定される。

反応混合物のｐＨを氷酢酸で３．２とする。

減圧凍結乾燥すると、９８５■の固形生成物を与える。

粗ヒトカルシトニンの精製 粗生成物を０．５ Ｎ酢酸にとかし、セファデックスＧ
−２５（微細）ゲル１過カラムを通し０．５ Ｎ酢酸で
溶離して精製する。

このカラムから得るヒトカルシトニン分画を集め、減圧
凍結乾燥すると白色綿毛状固体をうる。

この白色綿毛状固体を０．０５Ｍ酢酸アンモン水溶液（
ｐＨ５）にとかし、ｐＨとし、ｓｐ−セファデックスＣ
−２５カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーと
酢酸アンモン緩衝液での溶離で精製する。

ヒトカルシトニン分画を集め、２回減圧凍結乾燥すると
綿毛状白色固体をうる。

水晶は文献（Ｐ、ジーベルほか：ヘルベチカ・キミ力・
アクタ ５３巻 ２１３５−５０頁 １９５０年）に報
告のものと生物学的にも化学的にも均等である。

アミノ酸分析（酸分解）は次の比率のアミノ酸を与える
。

但しカッコ内は理論値である。Ｌｙｓｌ、０２（１）、
ＨｉｓＯ，９９（１）、Ａ ５ｐ−３，２８（３）、Ｔ
ｈｒ５．２１ （５）、５ｅｒＯ，７４（１）、Ｇｌｕ
１．９５ （２）、Ｇｌｙ４．３３（４）、Ａｌａ
２．０３ （２１、Ｖａｌ １．０４（１）、Ｍｅｔｏ
、８６（１）、Ｉ ｌｅｌ、０７（１）、Ｌｅｕ ２．
２４ （２１、Ｔｙｎｏ、７（１）、Ｐ ｈｅ ３．０
（３）、ＰｒｏとＣｙｓ Ｏ値は求めず。

生物活性は■あたり１００ＭＲＣ単位。

同様に本発明方法は第５表記載の基又はその均等物をア
ミノ酸鎖の９位の反応剤として用いてパンプレツシンの
合成にも応用される。

第５表の反応からえられるペプチド、但し樹脂分解前の
ものは次の式をもつ。

このペプチドを酸処理して、 樹脂と大部分の保 護基を分解したものは次のようになる。

これはバンブレツシンの前駆体である。

このペプチドを本発明の環化方法に付すると、次のもの
になる これはパンプレツシンである。

ソマトスタチンの合成に本発明方法を応用するためには
、ソマトスタチン用のアミノ酸鎖を、第６表の反応剤又
はその均等物を用いて作る。

第６表により反応させたペプチドで樹脂分解前のものの
式は次のとおり。

これを酸処理して、樹脂と大部分の保護基を分解したも
のは となり、 これを本発明方法で環化すれば となるが之はツマスタチンである。

本発明方法をブタカルシトニン合成に応用するため、第
７表にのべた反応剤又は均等物を用いて、ブタカルシト
ニン用のアミノ酸鎖をつくる。

第７表にのべた反応から得られ、樹脂の分解前のペプチ
ドは次の式をもつ。

このペプチドを酸処理して樹脂と、大部分の保護基を分
解したものは次のものになる。

これはブタカルシトニン前駆体である。

これを本発明方法で環化させると次のものになる。

これ※※はブタカルシトニンである 本発明の方法をブタ・カルシトニンの合成に応用するた
め、ブタカルシトニンのアミノ酸鎖を、第８表に示す反
応剤又は均等物を用いて槽底してゆく。

第８表に示す反応で得られるペプチドで、樹脂の分解前
のものは次の式をもつ このペプチドを酸処理して、樹脂と大部分の保護基を分
解したものｓ式は次のようになるこれはブタカルシトニ
ンの前駆物質である。

このペプチドを本発明の環化方法に付すると、次のよう
になる。

これはブタカルシトニンである。

さて本発明は特定のペプチド類について特異的に記述さ
れ示されたが、次のことは当業者にとっては明白であろ
う。

即ち本発明は数多くの特定のペプチド構造に応用ができ
ること、また本発明はその精神の範囲内でまたクレーム
の範囲内でいろいろと変化され得ること。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アミノ酸鎖中に少くとも２個のシスティン部分を有
   し、該部分の一つは遊離スルフヒドリル基を有しそして
   他方は該部分のスルフヒドリル基と共ニジスルフィド結
   合を形成するｎ−アルキルチオ基によって保護されたス
   ルフヒドリル基を有するペプチドを製造し、そして該ペ
   プチドを約５〜約１０のｐＨで実質的に酸素を含まない
   溶液中に保持して環状ジスルフィド構造を形成すること
   からなるジスルフィド環状構造を有するペプチドを製造
   する方法。