JPS61283848A - フロ−サイトメ−タ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の目的 本発明は連続的に流れる懸濁液中の微小粒子サンプルの
特性等を自動的に測定するフローサイトメータに関し、
特に複数の照射光束系を設け、各特性に応じた最適な条
件での測定を可能とするフローサイトメータに関する。

従来技術 フローサイトメータは毎秒数千個又はそれ以上の速さで
細胞を分析測定するもので、分析の結果に基き細胞の性
状を高速で判断できるため、病状診断や遺伝子生物学の
分野等で需要が増加しつつある。

一般にフローサイトメータは、不活性流体（シース液）
を層流状とし、このシース液の流れの中心に細胞懸濁液
等のサンプルを流すフロー部、このサンプル流にレーザ
ビームを照射する照射光束系、レーザビーム照射による
サンプルからの散乱光、螢光等を検出する光検出系、及
び光検出系からの信号を電気的に処理して必要な光情報
を得る処理表示系を備えている。

第１図は一般的なフロー部の一部を模式的に示したもの
で、サンプル流１とこれを取巻くシース流２がフローセ
ル３内を層流状態を保ちながら流れている。図中、４が
サンプル流１に照射されるレーザビームで照射方向から
見たところを模式的に示しており、ａがビーム中、ｂが
ビーム厚である。

従来法は１本のレーザビームがサンプル流へ照射され、
照射同一サンプルからの散乱光、螢光等を同時に検出処
理しているため、例えば、検出される２つの信号の時間
的関係は第２図に示すようになる。つまり、図中Ｘ軸は
時間（１）、Ｙ軸は相対強度（１１１圧Ｖ）、５は散乱
光による電気信号・９ルス（以下「パルス」）、６は螢
光のパルスで、両ノ９ルス５．６が時間的に重なった関
係で検出測定される。

発明が解決しようとする問題点 しかしながら、従来のようなフローサイトメ　　′−タ
を実際に使用し測定を行った場合、サンプル流に照射す
るレーザビームの形状が測定結果に重大な影響を及ぼす
ことが判明した。例えば、（１）変動係数（ＬＶ値）の
小さな再現性の良いデータを得たい場合には第１図のビ
ーム中ａを広くすることが望ましい；（２）弱い螢光を
発するサンプルを感度良く測定する場合はビーム中１を
狭くし、ビームのエネルギー密度を高くする必要がｈる
：（３）−ｆルス巾からサンプルの長さく大きさ）を測
定する場合はビーム厚すを目的粒子に比べてできるだけ
小さくする必要がある。

すなわち、同一サンプルから複数の光情報を得る場合そ
れぞれに最適なビーム形状が異なるため、従来の装置で
は他を犠牲にして１つの条件だけを最適にするか、又は
それぞれの条件の中間で妥協するかしかなかった０例え
ば第２図のように前方散乱光と螢光を測定する場合には
中間的条件とせざるを得す、いずれのスペクトル強度も
ある程度の犠牲を強いられた。

又、光情報をパルスの高さではなく、パルスの時間積分
値として取り扱う場合、例えば最も一般的に行なわれて
いる方法として散乱光ノ９ルスで粒子が来たことを検知
し、その間螢光ノ９ルスの積分を行なうが、この場合散
乱光ノヤルスがトリガーレベルＣを越えている間だけ螢
光パルスの積分が行なわれる（　ｉｌ！　２　（ａ）　
、　（ｂ）図の螢光ノ９ルス中、斜視部分が積分領域で
ある）。トリが一レベルは電気ノイズと信号パルスを区
別する閾値で、Ｔｏす、ノイズレベルより少し高目に設
定される。第２（−図の５や第２（ｂ）図の５Ｌのよう
に散乱光のパルスがノイズに比べて充分大きい場合には
これでもほとんど問題は無いが、！！２（ｂ）図の５８
のように散乱光ノ９ルスが小さい場合（例えば粒子が小
さい場合）、ノｆルスがトリが一レベルを越えている時
間が短くなり、螢光の積分値が期待される値より小さく
なってしまう。

１１９１里 問題点を解決するための手段 従来技術におけるこの問題を解消するため本発明による
フローサイトメータは、不活性流体から成るシース液の
層流中心に細胞懸濁液等のサンプルを流すフロー部、該
フロー部において少くとも２本のレーザビームをサンプ
ル流の異った個所に照射する複数の照射光束系、各レー
ザビーム照射によるサンプルからの散乱光、螢光等の光
情報を検出するため各レーザ光照射位置に対応して設け
られた光検出系、及び該光検出系からの信号に基き、上
記サンプル流のレーザビーム照射位置間の時間差を考慮
しながら同一サンプルに関する必要な複数の光情報を電
気的に処理して得る処理表示系を備えていることを特徴
とし、必要な光情報に最適な条件下での測定を可能にす
ると共に、螢光ノ々ルスについて常に充分な積分時間を
得られるようにしたものである。

実施例 以下本発明の好ましい例を第３〜６図を参照しながら説
明する。尚第１，２図との対応部分は同一番号で表わす
。

第３図は本発明によるフローサイトメータの構成を示す
ブロック図で、図中７がフロー部。

８．９が照射光束系、１０．１１が光検出系、１２が処
理表示系である。

フロー部７は例えば従来と同じ構成の７０−セル３から
成り、不活性流体等のシース液１３のフローの中心軸と
してサンプル１４を注入しながら第１図に示すようにサ
ンプル流１とそれを取巻くシース流２が層流状態を保持
しながらフローセル３中を上向きに流れ、このフローセ
ル中の流れが検知領域を形成する。

尚フロー部７として第５図に示すようなジェットノズル
３′を用いることもできる。

図示例において照射光学系は、平行な第１及び第２照射
元束系８，９として２系統設けられている。レーザ光源
２１からのレーザビームが半透過鏡２２で２つのビーム
に分割され、反射ビームが第２照射光束系９となる一方
、透過ビームが平面鏡２３で反射されてＷＬ１照射光束
系８となった後、適当な光学系を介して集束され、フロ
ーセル３中を流れるサンプル流の異なった個所Ａ、ＢＫ
照射される。各照射光束系８，９の光学系は集束される
ビーム形状を任意に変えられるように独立に調整可能で
、必要な光情報の検出に最適なビーム形状とされる。

照射光束は測定すべき光情報く合わせた所望の形状とす
る他、適切な異なった波長にするのが好ましいことが多
いが、このための照射系の例を第６　（ａ）　ｅ　（ｂ
）図に示す。

第６（ａ）図の例では、第３図と同様のレーザ光源２１
を用い、半透過鏡２２で反射したレーザビームはレーザ
光源と同一波長の第２照射光学系９を形成する。−男手
透過＠２２を透過したビームはダイ（Ｄｙｅ　）レーザ
等別のレーザ光源２４の励起光として使われ、この別の
レーザ光源２４からのレーザ光源２１と異なる波長のレ
ーザビームが第１照射光学系８を形成する。

［６（ｂ）図の例では、多波長のビームを同時に発する
マルチ発振形のレーザ光源２１′を用い、この光源から
のレーザビームは纂３図の例と同様半透過鏡２２と反射
鏡２３を経て、２つの照射光束系８，９を形成する。各
照射光学系には干渉フィルタ等適切な分光素子２５　、
２５’が配置され、レーザビーム中から所望の波長だけ
をそれぞれ選択通過させるので、両干渉フィルタを出た
ビームは互いに異なった波長となる。尚以上の各側で照
射光学系は２つとしたが、当然のことながら必要な光情
報の数に応じそれより多くしてもよい。

光検出系１０．１１は上記のレーザビーム照射位置Ａ、
Ｂにそれぞれ対応して設けられ、図示例においてｌＯは
サンプルの前方散乱光測定用、１１は試料の螢光測定用
である。各光検出系１０．１１は分光器、検知器、増巾
器等を備えて成り、それぞれの検知器−増巾器から散乱
光及び螢光の強度に応じた電気信号が発せられる。これ
ら光検出系は周知の構成なので、ここでは説明を省略す
る。

以上の構成でサンプルを流し、そのサンプル流Ｋ　２　
系統のレーザビームを照射すると同一サンプルについて
見れば、まず照射位置ムで生じた散乱光が測定され、次
いで照射位置Ｂで生じた螢光が測定される。両測定間の
時間差Δｔは。

ＡＢ間をサンプル流が流れるのに要する時間に対応する
。つまり、この時間差を知れば同一サンプルについて別
々の位置で測定を行っても、処理上同一サンプルに関す
る複数の光情報を正しく得ることができる。このように
して本発明の装置の両党検出系から得られる同一サンプ
ルに関する２つの信号を示せば、Ｋ４図のようになる。

第２図と同様、Ｘ軸は時間（１）、Ｙ軸は相対強度（電
圧Ｖ）、５′は散乱光パルス、６′は螢光パルスで、両
ノ譬ルス間は一定の時間差Δｔだけ離れている。

両党検出系１０．１１からの信号はそれぞれ信号取込／
演算処理部１５．１６に入り、データインターフェイス
１７を経てデータ処理系１８に導かれ、周知の方法によ
って散乱光、螢光の強度を表示記録等するための電気的
処理が行われる。図中１９はトリが一回路、２０は遅延
回路であり、散乱光処理用のトリが一しベルＣ及び同一
サンプルの両・母ルス間の時間差Δｔに対応した遅延時
間をそれぞれ与える。つまり、螢光用の信号取込／演算
処理部１６を散乱光のピークから一定時間遅らせて作動
させ、螢光パルス６′の積分を行うことで、同一サンプ
ルに関する両党情報が正しく対応付けられて測定される
。尚、時間差Δｔはあらかじめ既知のサンプル粒子を流
し、例えば第１のノ４ルスの−一りと第２のパルスのピ
ークの時間差を電気的に計測することで容易に知ること
ができ、同時に自動的に遅延時間を設定することもでき
ろ。もちろん多現象のオシロスコープ等で両パルスの時
間差を目視計測することも可能である。

又、積分時間ｄ′は、上記の既知すｙデル粒子を流した
ときのノ臂ルス巾であるが、測定する粒子の大きさに依
り多少変動するため、あらかじめノ９ルス巾より若干長
目に設定することで実用上充分対応できる。この積分時
間ｄ′はノ９ルス巾を電気的に計測し、自動的に設定す
ることも容易であり、もちろんオシロスコープ等で目視
計測することも可能である。

発明の効果 以上述べたように本発明によれば、複数の照射光束系を
用いサンプル流の異なった地点で異なった形状及び種類
のレーザビームを照射するようにしたため、必要な各光
情報の検出に最適な条件下で同一サンプルに関する測定
を行うことができる１例えば散乱光と螢光を測定する場
合、従来のよう忙中間条件とする必要はなくそれぞれに
最適なビーム形状でレーザビームを照射できるので、両
方共に曳好な光信号が得られる。

又本発明では、両スペクトル間の時間差によって両スペ
クトルが対応付けられ、積分時間を任意に設定できるの
で、螢光測定の一層の改善が可能である。

又フローサイトメータに於いては、流速は光検出系とそ
れ以降の電気処理系の時定数や積分値の安定性、更には
サンプル流の安定性に至る迄、重大な影響を与えるが、
本発明では第１のピークと第２のピークの時間差を常時
監視することによシ流速を知ることができ、流速のコン
トロール中流速の変化によるデータの変動の補正等のシ
ステムを働かせることが可能になる利点もある。

【図面の簡単な説明】

第１図はフローサイトメータの７０−セル部の説明図、
第２図（耐、伽）は従来装置による散乱光と螢光両・々
ルスＯ関係の例を示す図、第３図は本発明によるフロー
サイトメータの一例の構成を示すブロック図、第４図は
本発明によるフローサイトメータによる散乱光と螢光両
ノ４ルスＯ関係の一例を示す図、第５図は本発明で用い
るジェットノズルを示す図、第６　（ａ）　ｊ　（ｂ）
図は照射系の変形例を示す図である。 １・・・サンプル流、２・・・シース流、３・・・７０
−セル、３′・・・ジェットノズル、４・・・レーザビ
ーム、？　・−７ａ一部、８．９−・・照射光束系、ｉ
ｏ、１１・・・光検出系、１２・・・処理表示系、１３
−・・シース液、１４・・・サンプル、２１．２１’−
２４・・・レーザ光源、２２・・・レーザ光束分割用半
透過鏡、２５　、２５’・・・分光素子。 出　願　人　　日本分光工業株式会社 代　還　人　　　丸　　山　　幸　　雄第　　　１　　
　図 第　　２　　図 （ｂ）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）不活性流体から成るシース液の層流中心に細胞懸
   濁液等のサンプルを流すフロー部、該フロー部において
   少くとも２本のレーザビームをサンプル流の異った個所
   に照射する複数の照射光束系、各レーザビーム照射によ
   るサンプルからの散乱光、螢光等の光情報を検出するた
   め各レーザ光照射位置に対応して設けられた光検出系、
   及び該光検出系からの信号に基き、上記サンプル流のレ
   ーザビーム照射位置間の時間差を考慮しながら同一サン
   プルに関する必要な複数の光情報を電気的に処理して得
   る処理表示系を備えて成ることを特徴とする複数の照射
   光束を備えたフローサイトメータ。
2. （２）前記フロー部がフローセルから成る特許請求の範
   囲第（１）項記載のフローサイトメータ。
3. （３）前記フロー部がジェットノズルから成る特許請求
   の範囲第（１）項記載のフローサイトメータ。
4. （４）１個のレーザ光源からの同一波長光束を複数に分
   岐し、それぞれの光束を適切な形状にしてサンプル流の
   異なる位置に照射する特許請求の範囲第（１）項記載の
   フローサイトメータ。
5. （５）１個のレーザ光源からの同一波長光束を複数に分
   岐し、一方はそのまま用い、他方はダイレーザ等、別の
   レーザ光源の励起光として用い、これら両レーザ光源か
   らの両光束をそれぞれ適切な形状にしてサンプル流の異
   なる位置に照射する特許請求の範囲第（１）項記載のフ
   ローサイトメータ。
6. （６）マルチ発振形の１つのレーザ光源からの光束を複
   数に分岐し、干渉フィルタ等の分光素子を用いて所望の
   異なった波長の光束とし、これらの光束をそれぞれ適切
   な形状にしてサンプル流の異なる位置に照射する特許請
   求の範囲第（１）項記載のフローサイトメータ。