WO2016076037A1 - 粒子分析装置、粒子分析方法 - Google Patents

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voltage signal
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irradiation
particle
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克俊 田原
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ソニー株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers

Definitions

  • This technology relates to a particle analysis apparatus and a particle analysis method. More specifically, the present invention relates to a particle analyzer and a particle analysis method for irradiating particles flowing through a flow path with light.
  • a flow cytometer is known as a typical example of a known particle analyzer. Conventionally, as a flow cytometer, there is one that irradiates a particle flowing through a flow path with a plurality of lights (for example, see Patent Document 1).
  • a voltage signal acquired based on an optical signal emitted from a particle irradiated with light contains as little noise as possible.
  • a second irradiation unit that irradiates second light downstream of the flow path is provided for the first irradiation unit that irradiates the first light. It has been.
  • This technique is mainly intended to provide a particle analysis apparatus and a particle analysis method capable of determining an acquisition position based on the time axis of the second voltage signal.
  • the inventors of the present application have determined that the first voltage signal output based on the first light irradiation and the flow velocity of the particles are The present inventors have newly found that it is possible to determine the acquisition position based on the time axis of the second voltage signal acquired based on the irradiation of the second light, and have completed the present technology.
  • the particle analyzer includes a first irradiation unit that irradiates particles flowing through the flow path at a first position on the flow path, and a first irradiation unit that is downstream of the first position.
  • a second irradiation unit that irradiates the particle with second light at a second position; a light detection unit that obtains an optical signal emitted from the particle; and outputs a voltage signal; and the first irradiation unit performs the first irradiation.
  • the first output from the light detection unit based on the irradiation of the second light by the second irradiation unit A signal processing unit that determines an acquisition position based on a time axis of the second voltage signal.
  • the signal processing unit is configured to determine an acquisition position based on a time axis of the second voltage signal based on a time when the first voltage signal exceeds a threshold and a flow velocity of the particles. May be.
  • variation based on a temperature change further may be sufficient as the said signal processing part.
  • variation based on the flow velocity adjustment error further may be sufficient as the said signal processing part.
  • the signal processing unit is configured to output a first voltage signal output from the light detection unit based on a value defined based on the particle size and a time when the first voltage signal exceeds a threshold value.
  • the acquisition position based on the time axis may be determined.
  • grain further may be sufficient as the said signal processing part.
  • the acquisition position based on the time axis of the first voltage signal and the second voltage signal determined by the signal acquisition unit may include an acquisition start time and an acquisition time range.
  • the particle analysis method according to the present technology includes a first irradiation step of irradiating a first light to particles flowing through the flow path at a first position on the flow path, and a second irradiation downstream of the first position.
  • the second output in the light detection step based on the second light irradiation in the second irradiation step.
  • the acquisition position based on the time axis of the second voltage signal can be determined.
  • the effect described in this specification is an illustration to the last, and is not limited, Moreover, there may exist another effect.
  • FIG. 1 is a schematic conceptual diagram schematically showing an embodiment of a particle analyzer 1 according to the present technology.
  • the particle analysis device 1 according to the present technology is a device that analyzes the characteristics of the particles 2 flowing through the flow path 3, and includes at least a light irradiation unit 11, a light detection unit 12, and a signal processing unit 13. Each part will be described below.
  • the light irradiation unit 11 irradiates a plurality of light beams LD1 and LD2 corresponding to the positions P1 and P2, respectively, to different positions P1 and P2 of the flow path 3 through which the particles 2 flow. To do.
  • the positions P1 and P2 are displaced from each other in the flow direction of the particles 2.
  • the number of lights irradiated by the light irradiation unit 11 is not limited to two as shown in FIG.
  • the nth position (n is 1 to the total number of lights) counted from the upstream side in the flow direction is defined as the nth position, and the light irradiated to the nth position is defined as the nth light. To do.
  • the light irradiation unit 11 includes a first irradiation unit 11a that irradiates the first light LD1 and a second irradiation unit 11b that irradiates the second light LD2.
  • the light sources of the first irradiation unit 11a and the second irradiation unit 11b are not limited, and may be, for example, a semiconductor laser, that is, a laser diode, a solid laser, or a gas laser. Among these, by using a semiconductor laser, the apparatus can be configured to be small and inexpensive.
  • the wavelengths of the light beams LD1 and LD2 are not limited, and different wavelengths can be appropriately selected.
  • the first light LD1 is preferably light having a shorter wavelength than the second light LD2, and more preferably.
  • the wavelength of the first light LD1 is 488 nm corresponding to blue light
  • the wavelength of the second light LD2 is 638 nm corresponding to red light.
  • the first and second positions P1 and P2 may be the respective focal points of the first and second lights LD1 and LD2.
  • a description will be given of an apparatus in which blue laser light is irradiated as the first light LD1 and red laser light is irradiated as the second light LD2.
  • the configuration for displacing the first and second positions P1 and P2 in the flow direction of the particles 2 is not limited.
  • the light sources of the respective light LD1 and LD2 may be arranged at intervals in the flow direction.
  • the light irradiation unit 11 may include a position adjustment structure that adjusts the positions P1 and P2 of the respective lights LD1 and LD2.
  • the position adjustment structure may include a focus adjustment optical system such as a lens or a prism.
  • the light detection unit 12 is configured to acquire a voltage signal based on the fluorescence FL (LD1) and FL (LD2) emitted from the particle 2 by irradiation with the laser beams LD1 and LD2.
  • the aspect of the light detection part 12 is not limited, as an example of a preferable aspect, as shown in FIG. 1, the light detection part 12 may include a light separation element 121, a fluorescence detection part 122, and a scattered light detection part 123. .
  • the light detection unit 12 may include a zero-order light removal element 124.
  • the light separation element 121 separates the optical signal emitted from the particle 2 by the irradiation of the first laser light LD1 into the fluorescence FL (LD1) and the scattered light S, and the fluorescence FL (LD1) is transmitted to the fluorescence detection unit 122.
  • the light separation element 121 may be configured to transmit the fluorescent light FL (LD1) and reflect the scattered light S.
  • the optical signal emitted from the particle 2 by the irradiation of the second laser beam LD2 is not separated by the light separation element 121, but as the fluorescence FL (LD2), the fluorescence detection unit 122. To guide the light.
  • the light separation element 121 may be configured to separate the fluorescence FL (LD2) emitted from the particles 2 by the irradiation of the second laser light LD2 from the scattered light.
  • a plurality of the light separation elements 121 may be arranged so as to correspond to the respective laser beams LD1 and LD2.
  • the light separating element 121 may be arranged so as to be inclined with respect to the incident direction of the optical signal from the particle 2.
  • the light separation element 121 may be a wavelength selective mirror that transmits light having a wavelength equal to or greater than a specific wavelength and reflects light having a wavelength less than the specific wavelength.
  • the mirror may be a dichroic mirror or the like.
  • the fluorescence detection unit 122 is disposed on the traveling direction side of the fluorescence FL (LD1) and FL (LD2) with respect to the light separation element 121. Fluorescence FL (LD1) and FL (LD2) are incident on the fluorescence detection unit 122. The fluorescence detection unit 122 converts the incident fluorescence FL (LD1) and FL (LD2) into voltage signals and outputs them to the signal processing unit 13.
  • the fluorescence detection unit 122 may be a PMT (Photomultiplier Tube) or the like.
  • the particle analyzer 1 of the present disclosure includes a scattered light detection unit 123 at a position on the traveling direction side of the scattered light S with respect to the light separation element 121.
  • the scattered light S separated by the light separation element 121 is incident on the scattered light detection unit 123.
  • the scattered light detection unit 123 converts the incident scattered light S into a voltage signal and outputs the voltage signal to the signal processing unit 13.
  • the scattered light detection unit 123 may be a photo detector or the like.
  • the 0th-order light removal element 124 blocks the 0th-order light ZL1 and ZL2 such as the laser beams LD1 and LD2 that have traveled straight without being scattered.
  • the zero-order light removal element 124 may be a mask or an optical filter that selectively blocks specific light, but is not limited thereto.
  • the arrangement position of the zero-order light removal element 124 is not limited, and a suitable position in front of the fluorescence detection unit 122 may be selected.
  • the signal processing unit 13 is configured to control the irradiation of the light irradiation unit 11. That is, the signal processing unit 13 is configured to process the voltage signal output from the fluorescence detection unit 122 and the scattered light detection unit 123. The signal processing unit 13 is based on the first voltage signal output by the light detection unit 12 based on the irradiation of the first blue laser light LD1 by the first irradiation unit 11a and the flow velocity of the particles 2. Thus, the acquisition position is determined based on the time axis of the second voltage signal output from the light detection unit 12 based on the irradiation of the second red laser beam LD2 by the second irradiation unit 11b.
  • the signal processing unit 13 is configured to determine an acquisition position based on a time axis of the second voltage signal based on a time when the first voltage signal exceeds a threshold and a flow velocity of the particle 2. May be. Further, the signal processing unit 13 may be configured to determine an acquisition position based on the time axis of the second voltage signal based on a flow fluctuation based on a temperature change in the flow path 3. Further, the signal processing unit 13 may be configured to determine an acquisition position based on a time axis of the second voltage signal based on a flow fluctuation based on a flow velocity adjustment error.
  • the signal processing unit 13 outputs the first output from the light detection unit 12 based on a value defined based on the size of the particle 2 and a time when the first voltage signal exceeds a threshold value.
  • the acquisition position based on the time axis of the voltage signal may be determined.
  • the signal processing unit 13 may be configured to determine an acquisition position based on a time axis of the second voltage signal based on a value defined based on the size of the particle. An acquisition position determination mechanism based on the time axis of the second voltage signal by the signal processing unit 13 will be described later.
  • the flow velocity of the particle 2 according to the present technology is stored.
  • spot distance the distance from the position P1 to the position P2 in the flow path 3
  • window extension A value defined based on the size
  • the flow velocity and size of the particle 2 are appropriately determined by the user of the particle analyzer according to the present technology. It is possible to change and set.
  • the processing in the signal processing unit 13 may include various types of processing for analyzing the characteristics of the particle 2 such as signal quantification, fluorescence correction, and image generation, but is not limited thereto.
  • the signal processing unit 13 may be configured by an electronic device or the like.
  • the electronic device may include an arithmetic processing device such as a CPU or MPU and a storage device such as a RAM or ROM.
  • the ROM may store a program and data for realizing the function of the signal processing unit 13.
  • the arithmetic processing unit may realize the function of the signal processing unit 13 by executing a program stored in the ROM.
  • the RAM may be used as a work area for the arithmetic processing unit. However, it is not limited to such a configuration.
  • Particle 2 Particles 2 to be analyzed by the particle analyzer 1 include bio-related microparticles such as cells, microorganisms, and ribosomes, synthetic particles such as latex particles, gel particles, and industrial particles, and initial settings of the particle analyzer 1. Sample particles used in the above may be widely included.
  • the living body-related microparticles may include chromosomes, ribosomes, mitochondria, and organelles, that is, organelles that constitute various cells.
  • the cells may include plant cells, animal cells, blood cells, and the like.
  • microorganisms may include bacteria such as Escherichia coli, viruses such as tobacco mosaic virus, and bacteria such as yeast.
  • the biologically relevant microparticles may also include biologically relevant polymers such as nucleic acids, proteins and complexes thereof.
  • Industrial particles may be particles formed of an organic polymer material, an inorganic material, a metal material, or the like.
  • organic polymer material polystyrene, styrene / divinylbenzene, polymethyl methacrylate, or the like may be used.
  • inorganic material glass, silica, a magnetic material, or the like may be used.
  • metal material for example, gold colloid and aluminum may be used.
  • the shape of the microparticles may be spherical or non-spherical, and the size and mass are not particularly limited.
  • the particles 2 applicable to the present technology are modified with a fluorescent substance such as a fluorescent dye, a radioactive substance, an intercalator, or a labeling substance such as microbeads so that the light detection unit 12 can detect a signal.
  • a fluorescent substance such as a fluorescent dye, a radioactive substance, an intercalator, or a labeling substance such as microbeads
  • the type thereof is not particularly limited, and any known fluorescent dye can be used.
  • the flow path 3 is provided in the microchip 30.
  • a sample liquid containing particles 2 is introduced into the flow path 3.
  • the microchip 30 may be formed of various plastics such as glass, polypropylene, polycarbonate, cycloolefin polymer, and polydimethylsiloxane.
  • the material of the microchip 30 is not particularly limited, but as an example of a preferred embodiment, a material having translucency and a small optical error may be employed.
  • the flow path 3 may be provided in advance in the particle analysis apparatus 1 according to the present technology, but a commercially available flow path or the like may be installed in the particle analysis apparatus for analysis.
  • the form of the flow path 3 that can be used in the particle analyzer 1 according to the present technology is not particularly limited, and can be freely designed.
  • those formed in a known two-dimensional or three-dimensional plastic or glass substrate T, or those used in conventional flow cytometers may be used in the particle analyzer 1 according to the present technology. Can do.
  • the channel width, the channel depth, and the channel cross-sectional shape of the channel 3 are not particularly limited, and can be freely designed.
  • a microchannel having a channel width of 1 mm or less can also be used in the particle analyzer according to the present technology.
  • the first laser irradiation unit 11a irradiates the particle 2 with the blue laser light LD1.
  • the optical signal emitted from the particle 2 is separated into scattered light S and fluorescence FL (LD1) by the light separation element 121.
  • the scattered light S is incident on the scattered light detection unit 123, and the scattered light detection unit 123 converts the scattered light S into a voltage signal and outputs the voltage signal to the signal processing unit 13.
  • the second irradiation unit 11b irradiates the particle 2 with the red laser light LD2.
  • the optical signal generated from the particle 2 is detected as fluorescence FL (LD2) by the fluorescence detection unit 122 and converted into a voltage signal.
  • the acquisition start time and the acquisition time range of the voltage signal based on the second red laser beam LD2 (hereinafter referred to as “based on the second red laser beam LD2”). If the “acquisition position based on the time axis of the voltage signal” is fixed, the particle diameter of the particles 2 flowing through the flow path 3 is on the time axis of the voltage signal based on the second red laser light LD2. If it is larger than the acquisition position based on it, there is a risk of loss of the voltage signal acquired by the second red laser beam LD2.
  • the signal processing unit 13 mainly acquires the acquisition position based on the time axis of the voltage signal based on the second red laser light LD2 irradiated by the second irradiation unit 11b. A decision is made.
  • FIG. 2 is a time chart showing an example of signal processing by the signal processing unit 13.
  • the detection target particle 2 that emits fluorescence is caused to flow based on at least one of the first blue laser beam LD1 and the second red laser beam LD2.
  • voltage signals 40 and 50 based on the first blue laser beam LD1 and the second red laser beam LD2 are output to the signal processing unit 13.
  • the time 41 hereinafter referred to as “cross-up 41” when the voltage signal 40 based on the first blue laser light LD1 exceeds the threshold 60 is stored in the signal processing unit 13.
  • the acquisition start time 43 of the voltage signal 40 based on the first blue laser light LD1 is determined by the pre-window extension 42 defined based on the size of the particle 2.
  • the time 44 (hereinafter referred to as “trigger section 44”) during which the voltage signal 40 is output with the threshold 60 or more is stored in the signal processing unit 13.
  • the acquisition time range 46 of the voltage signal 40 is determined based on the trigger period 44, the pre-window extension 42, and the post-window extension 45 defined based on the size of the particle 2.
  • the pre-window extension 42 and the post-window extension 45 are values defined based on the size of the particles 2 and can be appropriately changed. As shown in FIG.
  • the pre-window extension 42 indicates the time from the start time of the acquisition time range 46 of the voltage signal 40 based on the first blue laser light LD1 to the start time of the trigger section 44. Further, as shown in FIG. 2, the post window extension 45 is detected from the end time of the trigger section 44, that is, from the time when the voltage signal 40 acquired based on the first blue laser light LD 1 divides the threshold 60. The time until the end time of the acquisition time range 46 of the voltage signal 40 is indicated.
  • the signal processing unit 13 detects a value 48 (hereinafter referred to as “interval 48”) obtained by dividing the distance between spots stored in advance in the signal processing unit 13 by the flow velocity of the particles 2. Thereby, the signal processing unit 13 determines the time 51 during which the voltage signal 50 based on the second red laser light LD2 exceeds the threshold 60 based on the cross-up 41 and the interval 48.
  • interval 48 a value 48 obtained by dividing the distance between spots stored in advance in the signal processing unit 13 by the flow velocity of the particles 2.
  • the pre-offset 52 is a value calculated based on the flow velocity of the particles 2, and in order to obtain the voltage signal 50 based on the second red laser beam LD2 without omission. This is a value (margin) to be provided.
  • the pre-offset 52 indicates the time from the acquisition start time 54 of the voltage signal 50 based on the second red laser beam LD2 to the start time of the pre-window extension 53, as shown in FIG.
  • the pre-window extension 53 according to the formula (1) is a value calculated based on the size of the particle 2 and can be changed as appropriate. As shown in FIG. 2, the pre-window extension 53 indicates the time from the end time of the pre-offset 52 to the time when the voltage signal 50 acquired from the second red laser beam LD2 reaches the threshold 60. .
  • the signal processing unit 13 calculates the pre-offset 52 and the post-offset 56 calculated based on the flow velocity of the particles 2, the pre-window extension 53 and the post-window extension 57 recorded in the signal processing unit 13 in advance, and the trigger section 44. Then, the acquisition time range 58 of the voltage signal 50 acquired based on the second red laser beam LD2 is determined. Specifically, the acquisition time range 58 of the voltage signal 50 acquired based on the second red laser beam LD2 is determined in accordance with the following equation (2).
  • the post window extension 57 is a value calculated based on the size of the particle 2 and can be changed as appropriate. As shown in FIG. 2, the post window extension 57 sets the time from the time when the voltage signal 50 acquired based on the second red laser beam LD2 divides the threshold 60 to the start time of the post offset 56. Point to. Further, the post-offset 56 according to the above formula is a value calculated based on the flow velocity of the particle 2, and is a value provided for acquiring the voltage signal 50 based on the second red laser light LD2 without omission. . As shown in FIG. 2, the post offset 56 indicates the time from the end time of the post window extension 57 to the end time of the acquisition time range 58 of the voltage signal 50 based on the second red laser beam LD2.
  • the signal processing unit 13 determines the acquisition start time 54 of the voltage signal 50 based on the second red laser beam LD2 and the acquisition time range 58 of the voltage signal 50. Although it is a structure, these determinations can be made by using the first voltage signal based on the scattered light detected by the scattered light detection unit 123 as a trigger. Or it can also be performed by using the first voltage signal based on the fluorescence detected by the fluorescence detector 122 as a trigger.
  • the signal processing unit 13 causes the acquisition start time 54 of the voltage signal 50 based on the second red laser light LD2, the acquisition time range 58 of the voltage signal 50, and
  • the flow rate of the particles 2 fluctuates according to the temperature change of the flow path 3.
  • the pre-offset 52 and the post-offset 56 that determine the acquisition time range 58 of the voltage signal 50 based on the second red laser beam LD2 are calculated based on the flow velocity of the particles 2. That is, the pre-offset 52 and the post-offset 56 vary according to the temperature change of the flow path 3.
  • the acquisition time range 58 of the voltage signal 50 based on the second red laser light LD2 is also set to a large value.
  • the values of the pre-offset 52 and the post-offset 56 are preferably as small as possible.
  • the following method can be considered as a method of calculating the offset. Note that the following method is merely an example of a method for obtaining an offset, and the method for obtaining an offset is not limited to these.
  • Offset calculation method [First method: Method using flow velocity adjustment center value]
  • First step The flow rate of the sample particles is adjusted by allowing the sample particles that emit fluorescence based on both the first blue laser light LD1 and the second red laser light LD2 to flow through the flow path 3. . At this time, an adjustment error is taken in a range of ⁇ 5% with respect to the flow velocity of the sample particles, and a flow velocity adjustment center value is obtained.
  • the interval is calculated based on the flow velocity adjustment center value (flow velocity) calculated in the first step and the inter-spot distance stored in the signal processing unit 13. Then, the offset is calculated in consideration of the flow velocity adjustment error in the first process stored in the signal processing unit 13 in advance and the flow fluctuation due to the temperature change.
  • the flow rate of the sample particles in the first step is 5 m / s
  • the range of 4.75 to 5.25 m / s is set as the adjustment error range.
  • the interval is 16 us (80 ⁇ m / 5 m / s).
  • the flow fluctuation due to the temperature change is set to ⁇ 1.5% flow rate fluctuation width, and further, ⁇ 2 to prevent noise from occurring in the voltage signal based on the second red laser beam LD2 as much as possible.
  • an offset of 1.36 us (16 * (5 + 1.5 + 2) / 100) is calculated as a result of considering the flow rate adjustment error, the fluctuation width of the flow fluctuation due to the temperature change, and the margin. .
  • the signal processing unit 13 causes the acquisition start time 54 of the voltage signal 50 based on the second red laser light LD2 and the voltage to be obtained.
  • the acquisition time range 58 of the signal 50 can be determined, so that the second voltage signal 50 can be acquired with higher accuracy than before.
  • the S / N ratio signal-noise ratio
  • the offset value can be reduced by considering not only the flow velocity of the particles 2 but also the flow fluctuation based on the temperature change and the flow velocity adjustment error.
  • the acquisition time range 58 of the voltage signal 50 based on the second red laser beam LD2 can be reduced within a necessary range, and thus the second voltage signal 50 can be acquired with higher accuracy than before. Is possible.
  • the S / N ratio signal-noise ratio
  • the offset can be set to a smaller value, so that the second voltage signal 50 with higher accuracy can be acquired more reliably.
  • FIG. 3 is a flowchart of the particle analysis method according to the present technology.
  • the particle analysis method according to the present technology is roughly divided into a method of performing at least the first irradiation step I, the second irradiation step II, the light detection step III, and the signal processing step IV.
  • the details of the first irradiation step I, the second irradiation step II, the light detection step III, and the signal processing step IV are as follows: the first irradiation unit 11a, the second irradiation unit 11b of the particle analyzer 1 according to the present technology described above. Since the light detection unit 12 and the signal processing unit 13 are the same as the respective methods, the description is omitted here.
  • this technique can also take the following structures.
  • a particle processing apparatus comprising: a signal processing unit that determines an acquisition position based thereon.
  • the signal processing unit determines an acquisition position based on a time axis of the second voltage signal based on a time when the first voltage signal exceeds a threshold and a flow velocity of the particles (1 ) The particle analyzer described above.
  • the signal processing unit further determines an acquisition position based on a time axis of the second voltage signal based on a flow fluctuation based on a temperature change.
  • the signal processing unit further determines an acquisition position based on a time axis of the second voltage signal based on a flow fluctuation based on a flow velocity adjustment error.
  • the signal processing unit is configured to output a first voltage output from the light detection unit based on a value defined based on a size of the particle and a time when the first voltage signal exceeds a threshold value.
  • the acquisition position based on the time axis of the first voltage signal and the second voltage signal determined by the signal processing unit includes an acquisition start time and an acquisition time range. Analysis equipment.
  • a particle processing method comprising: a signal processing step of determining a based acquisition position.

Abstract

　光照射された粒子から発せられる光に基づいて取得される信号のノイズを削減する粒子分析装置を提供する。　流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射部と、前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射部と、前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出部と、前記第一照射部による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射部による前記第二の光の照射に基づき前記光検出部で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理部と、を含む。

Description

粒子分析装置、粒子分析方法
　本技術は、粒子分析装置及び粒子分析方法に関する。より詳しくは、流路内を通流する粒子に光を照射する粒子分析装置及び粒子分析方法に関する。
　近年、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズなどの微小粒子等を流路中に通流させ、通流させる工程において前記微小粒子の測定、測定された微小粒子の分析を行う装置が開発されている。公知の粒子分析装置の代表的な一例として、フローサイトメーターが知られている。従来から、フローサイトメーターとしては、流路内を通流する粒子に複数の光を照射するものがある（例えば、特許文献１参照）。
特開昭６１－２８３８４８号公報
　フローサイトメーターに代表される、粒子分析装置では、光が照射された粒子から発せられる光信号に基づいて取得される電圧信号には、ノイズが可及的に含まれないことが望ましい。
　これに対し、複数の光を粒子に照射するフローサイトメーターでは、第一の光を照射する第一照射部に対し、前記流路の下流に第二の光を照射する第二照射部が設けられている。このような従来のフローサイトメーターの場合、第二照射部に由来して取得される第二の電圧信号の時間軸に基づく取得位置は固定されているため、前記流路内を通流する粒子の粒径が第二照射部に由来して取得される第二の電圧信号の時間軸に基づく取得位置よりも大きくなる、流速の変化、調整誤差、その他の要因により、第二の電圧信号が当該第二の電圧信号の時間軸に基づく取得位置からはみ出て、もって第二の電圧信号の欠損に繋がる虞がある。
　本技術は、前記第二の電圧信号の時間軸に基づく取得位置を決定することができる粒子分析装置及び粒子分析方法を提供することを主目的とする。
　本願発明者らは、前記の目的を達成するために鋭意研究を行った結果、第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二の光の照射に基づき取得された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定することができることを新たに見出し、本技術を完成させるに至った。
　すなわち、本技術に係る粒子分析装置は、流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射部と、前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射部と、前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出部と、前記第一照射部による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射部による前記第二の光の照射に基づき前記光検出部で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理部と、を含む。
　または、前記信号処理部は、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間と、前記粒子の流速に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。
　あるいは、前記信号処理部は、更に温度変化に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。
　もしくは、前記信号処理部は、更に流速調整誤差に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。
　または、前記信号処理部は、前記粒子の大きさに基づき定義される値と、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間とに基づき、前記光検出部で出力された第一の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。
　あるいは、前記信号処理部は、更に前記粒子の大きさに基づき定義される値に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。
　もしくは、前記信号取得部にて決定される前記第一の電圧信号及び第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置は、取得開始時間と取得時間範囲とを含む構成であってよい。
　本技術に係る粒子分析方法は、流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射工程と、前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射工程と、前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出工程と、前記第一照射工程による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射工程による前記第二の光の照射に基づき前記光検出工程で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理工程と、を含む。
　本技術によれば、前記第二の電圧信号の時間軸に基づく取得位置を決定することができる。なお、本明細書に記載された効果はあくまで例示であって限定されるものでは無く、また他の効果があってもよい。
本技術の第１の実施形態の粒子分析装置に係る構成例を模式的に示す図である。 本技術の第１の実施形態の粒子分析装置に係る信号処理例を示すタイムチャートである。 本技術に係る粒子分析方法のフローチャートである。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。また、実施形態の説明は以下の順序で行う。
１．粒子分析装置
　（１）光照射部１１
　（２）光検出部１２
　（３）信号処理部１３
　（４）粒子２
　（５）流路３
　（６）動作例
　（７）信号処理例
　（８）オフセットの算出方法
２．粒子分析方法
　＜１．粒子分析装置１＞
　図１は、本技術に係る粒子分析装置１の実施形態を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る粒子分析装置１は、流路３を通流する粒子２の特性を分析する装置であり、光照射部１１と、光検出部１２と、信号処理部１３と、を少なくとも備える。各部について、以下に説明する。
　（１）光照射部１１
　図１に示すように、光照射部１１は、粒子２が通流する流路３の相互に異なる位置Ｐ１、Ｐ２に対して各位置Ｐ１、Ｐ２にそれぞれ対応する複数の光ＬＤ１、ＬＤ２を照射する。各位置Ｐ１、Ｐ２は、粒子２の通流方向に互いに変位している。
　光照射部１１によって照射される光の数は、複数であれば図１のような２つには限定されない。以下、通流方向における上流側から数えてｎ番目（ｎは、１～光の総数）の位置をｎ番目の位置と定義し、ｎ番目の位置に照射される光をｎ番目の光と定義する。
　前記光照射部１１は、１番目の光ＬＤ１を照射する第一照射部１１ａと、２番目の光ＬＤ２を照射する第二照射部１１ｂと、を備える。尚、これら第一照射部１１ａ、第二照射部１１ｂの光源は限定されず、例えば、半導体レーザすなわちレーザダイオード、固体レーザまたはガスレーザ等であってもよい。このうち、半導体レーザを用いることで、装置を小型かつ安価に構成することができる。
　また、各光ＬＤ１、ＬＤ２の波長は限定されず、互いに異なる波長を適宜選択することができ、１番目の光ＬＤ１は、２番目の光ＬＤ２より短波長の光であることが好ましく、より好ましくは、１番目の光ＬＤ１の波長は青色の光に対応する４８８ｎｍ等であり、２番目の光ＬＤ２の波長は赤色の光に対応する６３８ｎｍ等である。１番目および２番目の位置Ｐ１、Ｐ２は、１番目および２番目の光ＬＤ１、ＬＤ２のそれぞれの焦点であってもよい。本実施形態に係る粒子分析装置では、１番目の光ＬＤ１として青色レーザ光が照射され、２番目の光ＬＤ２として赤色レーザ光が照射されるものを説明する。
　１番目および２番目の位置Ｐ１、Ｐ２を粒子２の通流方向に変位させる構成は限定されない。例えば、各光ＬＤ１、ＬＤ２の光源を通流方向に間隔を設けて配置してもよい。
　また、光照射部１１が、各光ＬＤ１、ＬＤ２の位置Ｐ１、Ｐ２を調整する位置調整構造を含んでもよい。位置調整構造は、レンズやプリズム等の焦点調整用の光学系を含んでもよい。
（２）光検出部１２
　光検出部１２は、各レーザ光ＬＤ１、ＬＤ２の照射によって粒子２から発せられた蛍光ＦＬ（ＬＤ１）、ＦＬ（ＬＤ２）に基づいて電圧信号を取得する構成である。光検出部１２の態様は限定されないが、好ましい態様の一例として、図１に示すように、光検出部１２は、光分離素子１２１、蛍光検出部１２２及び散乱光検出部１２３を備えてもよい。更に、光検出部１２は、０次光除去素子１２４を備えてもよい。
　［光分離素子１２１］
　光分離素子１２１は、１番目のレーザ光ＬＤ１の照射によって粒子２から発せられた光信号を、蛍光ＦＬ（ＬＤ１）と散乱光Ｓとに分離し、蛍光ＦＬ（ＬＤ１）を蛍光検出部１２２に導光する。光分離素子１２１は、蛍光ＦＬ（ＬＤ１）を透過させ、散乱光Ｓを反射させる構成でもよい。本実施形態に係る粒子分析装置１では、２番目のレーザ光ＬＤ２の照射によって粒子２から発せられた光信号は、光分離素子１２１によって分離されず、蛍光ＦＬ（ＬＤ２）として前記蛍光検出部１２２に導光する。尚、光分離素子１２１は、２番目のレーザ光ＬＤ２の照射によって粒子２から発せられた蛍光ＦＬ（ＬＤ２）を、散乱光と分離する構成でもよい。光分離素子１２１は、各レーザ光ＬＤ１、ＬＤ２にそれぞれ対応するように複数配置されていてもよい。
　光分離素子１２１は、粒子２からの光信号の入射方向に対して傾きを有するように配置されていてもよい。光分離素子１２１は、特定の波長以上の波長の光を透過させ、特定の波長未満の波長の光を反射させる波長選択式のミラー等であってもよい。ミラーは、ダイクロイックミラー等であってもよい。
　［蛍光検出部１２２］
　蛍光検出部１２２は、光分離素子１２１に対して蛍光ＦＬ（ＬＤ１）、ＦＬ（ＬＤ２）の進行方向側に配置されている。蛍光検出部１２２には、蛍光ＦＬ（ＬＤ１）、ＦＬ（ＬＤ２）が入射する。蛍光検出部１２２は、入射した蛍光ＦＬ（ＬＤ１）、ＦＬ（ＬＤ２）を電圧信号に変換して信号処理部１３に出力する。蛍光検出部１２２は、ＰＭＴ(Photomultiplier Tube)等であってもよい。
　［散乱光検出部１２３］
　図１に示すように、本開示の粒子分析装置１は、光分離素子１２１に対して散乱光Ｓの進行方向側の位置に、散乱光検出部１２３を有する。散乱光検出部１２３には、光分離素子１２１によって分離された散乱光Ｓが入射する。散乱光検出部１２３は、入射した散乱光Ｓを電圧信号に変換して信号処理部１３に出力する。散乱光検出部１２３は、フォトディテクタ等であってもよい。
　［０次光除去素子１２４］
　０次光除去素子１２４は、散乱せずに直進してきたレーザ光ＬＤ１、ＬＤ２などの０次光ＺＬ１、ＺＬ２を遮断する。０次光除去素子１２４は、マスクや特定光を選択的に遮断する光学フィルタなどであってもよいが、これに限定されない。０次光除去素子１２４の配置位置も限定されず、蛍光検出部１２２の手前の好適な位置を選択してもよい。
　（３）信号処理部１３　
　前記信号処理部１３は、光照射部１１の照射を制御する構成である。すなわち、信号処理部１３は、前記蛍光検出部１２２及び散乱光検出部１２３から出力された電圧信号を処理する構成である。この信号処理部１３は、前記第一照射部１１ａによる１番目の青色レーザ光ＬＤ１の照射に基づいて前記光検出部１２により出力された第一の電圧信号と、前記粒子２の流速とに基づいて、前記第二照射部１１ｂによる前記２番目の赤色レーザ光ＬＤ２の照射に基づき前記光検出部１２で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成である。
　前記信号処理部１３は、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間と、前記粒子２の流速に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。また、前記信号処理部１３は、前記流路３における温度変化に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。また、前記信号処理部１３は、流速調整誤差に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。更に、前記信号処理部１３は、前記粒子２の大きさに基づき定義される値と、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間とに基づき、前記光検出部１２で出力された第一の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。また更に、前記信号処理部１３は、前記粒子の大きさに基づき定義される値に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。当該信号処理部１３による前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置の決定機構については後述する。
　前記信号処理部１３には、初期設定時に、本技術に係る前記粒子２の流速、前記流路３における位置Ｐ１から位置Ｐ２までの距離（以下、「スポット間距離」という）、前記粒子２の大きさに基づき定義される値（以下、「ウィンドウエクステンション（window extension）という）が記憶されている。ここで、前記粒子２の流速及び大きさは、本技術に係る粒子分析装置のユーザーによって適宜変更・設定することが可能である。
　更に、信号処理部１３における処理には、信号の定量化、蛍光補正および画像の生成などといった粒子２の特性を分析するための各種の処理が含まれてもよいが、これらに限定されない。
　また、信号処理部１３は、電子装置等によって構成してもよい。電子装置は、ＣＰＵやＭＰＵ等の演算処理装置およびＲＡＭやＲＯＭなどの記憶装置等を備えてもよい。ＲＯＭには、信号処理部１３の機能を実現するためのプログラムやデータを格納してもよい。演算処理装置は、ＲＯＭに格納されたプログラムを実行することで、信号処理部１３の機能を実現してもよい。ＲＡＭは、演算処理装置の作業領域等として利用してもよい。ただし、かかる構成に限定されない。
　（４）　粒子２
　本技術に係る粒子分析装置１によって分析される粒子２は、細胞、微生物及びリボゾームなどの生体関連微小粒子、ラテックス粒子、ゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子及び前記粒子分析装置１の初期設定に用いられるサンプル粒子等が広く含まれてもよい。
　生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リボゾーム、ミトコンドリア及びオルガネラすなわち細胞小器官などが含まれてもよい。また、細胞には、植物細胞、動物細胞及び血球系細胞などが含まれてもよい。更に、微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類及びイースト菌などの細菌等が含まれてもよい。
　生体関連微小粒子には、核酸や蛋白質及びこれらの複合体などの生体関連高分子も包含されてもよい。
　工業用粒子は、有機高分子材料、無機材料又は金属材料などで形成された粒子でもよい。有機高分子材料としては、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン及びポリメチルメタクリレートなどを使用してもよい。無機材料としては、ガラス、シリカ及び磁性材料などを使用してもよい。金属材料としては、例えば金コロイド及びアルミニウムなどを使用してもよい。微小粒子の形状は、球形または非球形であってもよく、大きさや質量も特に限定されない。
　また、本技術に適用可能な粒子２には、光検出部１２が信号を検出できるように、蛍光色素等の蛍光物質、放射性物質、インターカレーター、またはマイクロビーズなどの標識物質で修飾しておくことが好ましい。例えば、蛍光色素を用いる場合、その種類は特に限定されず、公知のあらゆる蛍光色素を用いることができる。
　（５）流路３
　流路３は、マイクロチップ３０に設けられている。流路３内には、粒子２を含むサンプル液が導入される。マイクロチップ３０は、ガラスや、ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー及びポリジメチルシロキサンなどといった各種プラスチックによって形成してもよい。マイクロチップ３０の材質は特に限定されないが、好ましい態様の一例として、透光性を有する光学誤差が少ない材質を採用してもよい。この流路３は、本技術に係る粒子分析装置１に予め備えていてもよいが、市販の流路などを、粒子分析装置に設置して分析を行うことも可能である。
　本技術に係る粒子分析装置１に用いることができる流路３の形態は特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、公知の２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ内に形成したものや、従来のフローサイトメーターで用いられているようなものも、本技術に係る粒子分析装置１に用いることができる。
　また、前記流路３の流路幅、流路深さ、流路断面形状も特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路も、本技術に係る粒子分析装置に用いることが可能である。
　（６）粒子分析装置の動作例
　本技術に係る粒子分析装置１の動作例を説明する。
　先ず、前記流路３を通流する粒子２が１番目の位置Ｐ１に到達すると、当該粒子２に対して第一照射部１１ａにより青色レーザ光ＬＤ１が照射される。これによって当該粒子２から発せられた光信号は前記光分離素子１２１によって、散乱光Ｓと、蛍光ＦＬ（ＬＤ１）に分離される。前記散乱光Ｓは、前記散乱光検出部１２３に入射され、当該散乱光検出部１２３は散乱光Ｓを電圧信号に変換して信号処理部１３に出力する。
　次いで、前記粒子２が１番目の位置Ｐ１を通過し、２番目の位置Ｐ２に到達すると、当該粒子２に対して第二照射部１１ｂにより赤色レーザ光ＬＤ２が照射される。これによって粒子２から発生された光信号は、蛍光ＦＬ（ＬＤ２）として蛍光検出部１２２によって検出され、電圧信号に変換される。
　このように、二つ以上の光が照射される粒子分析装置において、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号の取得開始時間及び取得時間範囲（以下、「２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号の時間軸に基づいた取得位置」ともいう）が固定されていると、前記流路３を通流する粒子２の粒径が２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号の時間軸に基づいた取得位置よりも大きい場合、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２により取得される電圧信号の欠損を招く虞がある。または、前記流路３を通流する粒子２の粒径が２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号の取得時間範囲よりも小さい場合、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号にノイズの不要な増大を招く虞がある。
　そこで、本技術に係る粒子分析装置１では、前記信号処理部１３により、主に、第二照射部１１ｂが照射する２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号の時間軸に基づいた取得位置の決定が行われる。
　（７）　粒子分析装置の信号処理例
　以下、前記信号処理部１３による信号処理例について、図２を用いて説明する。図２は、前記信号処理部１３による信号処理例を示すタイムチャートである。
　先ず、１番目の青色レーザ光ＬＤ１と２番目の赤色レーザ光ＬＤ２のうち少なくとも一方に基づいて蛍光を発する検出対象の粒子２を通流させる。
　これにより、１番目の青色レーザ光ＬＤ１及び２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号４０，５０が信号処理部１３に出力される。その結果、１番目の青色レーザ光ＬＤ１に基づく電圧信号４０が閾値６０を超えた時間４１（以下、「クロスアップ４１」という）が前記信号処理部１３に記憶される。
　これと同時に、前記粒子２の大きさに基づき定義されるプレウィンドウエクステンション４２により、１番目の青色レーザ光ＬＤ１に基づく電圧信号４０の取得開始時間４３が決定される。更に、前記信号処理部１３に対して、前記電圧信号４０が閾値６０以上で出力されている時間４４（以下、「トリガ区間４４」という）が記憶される。その結果、トリガ区間４４、前記プレウィンドウエクステンション４２、前記粒子２の大きさに基づき定義されるポストウィンドウエクステンション４５に基づいて、前記電圧信号４０の取得時間範囲４６が決定される。ここで、前記プレウィンドウエクステンション４２及びポストウィンドウエクステンション４５は、前記粒子２の大きさに基づき定義される値であり、適宜変更することができる値である。そして、このプレウィンドウエクステンション４２は、図２に示すように、１番目の青色レーザ光ＬＤ１に基づく電圧信号４０の取得時間範囲４６の開始時間から前記トリガ区間４４の開始時間までの時間を指す。また、前記ポストウィンドウエクステンション４５は、図２に示すように、前記トリガ区間４４の終了時間、すなわち、１番目の青色レーザ光ＬＤ１に基づいて取得された電圧信号４０が閾値６０を割る時間から当該電圧信号４０の取得時間範囲４６の終了時間までの時間を指す。
　また、前記信号処理部１３により、当該信号処理部１３に予め記憶されたスポット間距離を前記粒子２の流速で除した値４８（以下、「インターバル４８」という）が検出される。これにより、信号処理部１３により、クロスアップ４１と、インターバル４８と、に基づいて、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０が閾値６０を超える時間５１が決定される。
　更に、前記信号処理部１３により、前記インターバル４８と、前記粒子２の流速に基づいて算出されるプレオフセット５２、及びプレウィンドウエクステンション５３に基づき、以下の式（１）に即して、２番目の光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得開始時間５４が決定される。

式（１）　クロスアップ４１　＋　インターバル４８　－　プレオフセット５２　－　プレウィンドウエクステンション５３
　ここで、前記式（１）に係るプレオフセット５２とは、前記粒子２の流速に基づいて算出される値であり、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０を漏れなく取得するために設けられる値（マージン）である。そして、このプレオフセット５２は、図２に示すように、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得開始時間５４から前記プレウィンドウエクステンション５３の開始時間までの時間を指す。また、前記式（１）に係るプレウィンドウエクステンション５３は、前記粒子２の大きさに基づいて算出される値であり、適宜変更することができる値である。そして、このプレウィンドウエクステンション５３は、図２に示すように、前記プレオフセット５２の終了時間から２番目の赤色レーザ光ＬＤ２から取得された電圧信号５０が閾値６０に到達した時間までの時間を指す。
　そして、信号処理部１３により、粒子２の流速に基づいて算出されたプレオフセット５２及びポストオフセット５６、前記信号処理部１３に予め記録されたプレウィンドウエクステンション５３及びポストウィンドウエクステンション５７、前記トリガ区間４４と、に基づいて、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づいて取得される電圧信号５０の取得時間範囲５８が決定される。
　具体的には、以下の式（２）に即して、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づいて取得される電圧信号５０の取得時間範囲５８が決定される。

　式（２）　プレオフセット５２　＋　プレウィンドウエクステンション５３　＋　トリガ区間４４　＋　ポストウィンドウエクステンション５７　＋　ポストオフセット５６
　ここで、式（２）に係るポストウィンドウエクステンション５７とは、前記粒子２の大きさに基づいて算出される値であり、適宜変更することができる値である。そして、このポストウィンドウエクステンション５７は、図２に示すように、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づいて取得された電圧信号５０が閾値６０を割る時間から前記ポストオフセット５６の開始時間までの時間を指す。
　また、前記式に係るポストオフセット５６とは、粒子２の流速に基づいて算出される値であり、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０を漏れなく取得するために設けられる値である。そして、このポストオフセット５６は、図２に示すように、前記ポストウィンドウエクステンション５７の終了時間から２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得時間範囲５８の終了時間までの時間を指す。
　本技術に係る粒子分析装置１では前記信号処理部１３により、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得開始時間５４と、当該電圧信号５０の取得時間範囲５８と、が決定される構成であるが、これらの決定は、前記散乱光検出部１２３により検出される散乱光に基づく第一の電圧信号をトリガとすることで行うことができる。あるいは、前記蛍光検出部１２２により検出される蛍光に基づく第一電圧信号をトリガとすることで行うこともできる。
　以上のように、本技術に係る粒子分析装置１では前記信号処理部１３により、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得開始時間５４と、当該電圧信号５０の取得時間範囲５８と、が決定されるものの、粒子２の流速は、流路３の温度変化に応じて流動変動する。
　ここで、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得時間範囲５８を決定するプレオフセット５２及びポストオフセット５６は、粒子２の流速に基づいて算出される。すなわち、プレオフセット５２及びポストオフセット５６は、前記流路３の温度変化に応じて変動する。
　プレオフセット５２及びポストオフセット５６が必要以上に大きな値に設定されると、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得時間範囲５８も大きな値に設定される。その結果、例えば、レーザ光に起因するノイズが、第二の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０に不要に増大する虞がある。
　このため、プレオフセット５２及びポストオフセット５６の値はできる限り小さい値とすることが好ましい。このオフセットを算出する方法として以下の方法が考えられる。尚、以下に示す方法は、オフセットを求めるための方法の例示に過ぎず、オフセットを求める方法はこれらに限定されるわけではない。
　（８）オフセットの算出方法
　［第一の方法：流速調整センター値を使用する方法］
　（第一工程）１番目の青色レーザ光ＬＤ１及び２番目の赤色レーザ光ＬＤ２の両方の光に基づいて蛍光を発するサンプル粒子を流路３に対して通流させてサンプル粒子の流速を調整する。
　この際、調整誤差をサンプル粒子の流速に対して±５％の範囲で取り、流速調整センター値を求める。
　（第二工程）第一工程により算出された流速調整センター値（流速）と、信号処理部１３に記憶されたスポット間距離とに基づいて、前記インターバルを算出する。
　そして、予め信号処理部１３に記憶された第一工程における流速調整誤差と、温度変化による流動変動とを考慮し、オフセットを算出する。
　以下、実数値を用いた第一の方法によるオフセットの求め方を説明する。
　すなわち、第一工程におけるサンプル粒子の流速が５ｍ／ｓである場合、４．７５～５．２５ｍ／ｓの範囲を調整誤差の範囲とする。
　更に、スポット間距離が８０ｕｍとした場合、インターバルは、１６ｕｓ（８０ｕｍ÷５ｍ／ｓ）となる。
　そして、温度変化による流動変動を±１．５％の流速の振れ幅とし、更に、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づいた電圧信号にノイズが発生することを可及的に防ぐため、±２．０％のマージンを確保した場合、これら流速調整誤差、温度変化による流動変動の振れ幅、マージンを考慮した結果、１．３６ｕｓ（１６＊（５＋１．５＋２）／１００）のオフセットが算出される。
　［第二の方法：流速調整時の測定値を使用する方法］
　（第一工程）１番目の青色レーザ光ＬＤ１及び２番目の赤色レーザ光ＬＤ２の両方の光に基づいて蛍光を発するサンプル粒子を流路３に対して通流させ、サンプル粒子の流速を測定する。
　（第二工程）第一工程にて測定された流速の値から、インターバルを算出する。
　そして、温度変化による流動変動を考慮して、オフセットを算出する。
　実数値を用いてこの第二の方法を説明する。
　第一の方法と同様、インターバルは１６ｕｓとなる。
　更に、この第二方法では、第一工程における測定値を用いていることから、流速調整誤差を考慮する必要がない。このため、温度変化による流動変動の振れ幅とマージンのみを考慮してオフセットを算出することができ、オフセットは、０．５７ｕｓ（１６＊（１．５＋２）／１００）となる。
　［第三の方法：流速調整時の測定値と温度変化を使用する方法］
　この第三の方法における第一工程と、第二工程は、前記第二の方法の第一工程及び第二工程と同一であるため、ここではこれらの説明を割愛する。
　また、本技術に係る粒子分析装置では、外部装置等により流路３における水圧を一定とすることにより、温度変化による流動変動を可及的に抑えることができる。
　更に、この第三の方法では、前記サンプル粒子の流速を随時測定し、この流速に基づいてインターバルを検出する。
　このため、第三の方法では、マージンのみを考慮してオフセットを算出することができる。
　すなわち、±２．０％のマージンを確保した場合、オフセットは、０．３２ｕｓ（１６＊２／１００）となる。
　以上のように、本技術の粒子分析装置１では、図２に示した如く、前記信号処理部１３により、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づいた電圧信号５０の取得開始時間５４、及び当該電圧信号５０の取得時間範囲５８を決定することができ、もって従来よりも第二の電圧信号５０を高精度に取得することが可能となる。これにより、Ｓ／Ｎ比(signal-noise ratio)を向上させることができ、これに伴って、粒子２の分析精度を向上させることも可能となる。
　また、本技術の粒子分析装置１において、前記粒子２の流速だけでなく、温度変化に基づく流動変動と、流速調整誤差と、を考慮することで、前記オフセットの値を小さくすることできる。その結果、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得時間範囲５８を必要な範囲で小さくすることができ、もって従来よりも確実に高精度な第二の電圧信号５０を取得することが可能となる。これにより、Ｓ／Ｎ比(signal-noise ratio)を向上させることができる。更に、オフセットを算出する上で、前記粒子２の流速の実際の測定値を用いることにより、温度変化に基づく流動変動を主としてオフセットを算出することが可能となる。その結果、オフセットを更に小さい値に設定することができるため、より確実に高精度な第二の電圧信号５０を取得することが可能となる。
　＜２．粒子分析方法＞
　図３は、本技術に係る粒子分析方法のフロー図である。本技術に係る粒子分析方法は、大別すると、第一照射工程Ｉ、第二照射工程ＩＩ、光検出工程ＩＩＩ、信号処理工程ＩＶを少なくとも行う方法である。なお、第一照射工程Ｉ、第二照射工程ＩＩ、光検出工程ＩＩＩ、信号処理工程ＩＶの詳細は、前述した本技術に係る粒子分析装置１の第一照射部１１ａ、第二照射部１１ｂ、光検出部１２、信号処理部１３が、それぞれ行う方法と同一であるため、ここでは説明を省略する。
　また、本技術は、以下のような構成をとることもできる。
（１）流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射部と、前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射部と、前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出部と、前記第一照射部による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射部による前記第二の光の照射に基づき前記光検出部で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理部と、を含む粒子分析装置。
（２）前記信号処理部は、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間と、前記粒子の流速に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する（１）記載の粒子分析装置。
（３）前記信号処理部は、更に温度変化に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する（２）記載の粒子分析装置。
（４）前記信号処理部は、更に流速調整誤差に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する（３）記載の粒子分析装置。
（５）前記信号処理部は、前記粒子の大きさに基づき定義される値と、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間とに基づき、前記光検出部で出力された第一の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する（４）記載の粒子分析装置。
（６）前記信号処理部は、更に前記粒子の大きさに基づき定義される値に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する（５）記載の粒子分析装置。
（７）前記信号処理部にて決定される前記第一の電圧信号及び第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置は、取得開始時間と取得時間範囲とを含む（６）記載の粒子分析装置。
（８）流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射工程と、前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射工程と、前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出工程と、前記第一照射工程による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射工程による前記第二の光の照射に基づき前記光検出工程で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理工程と、を含む粒子分析方法。

Claims (8)

  1. 流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射部と、
    前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射部と、
    前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出部と、
    前記第一照射部による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射部による前記第二の光の照射に基づき前記光検出部で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理部と、
    を含む粒子分析装置。
  2. 前記信号処理部は、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間と、前記粒子の流速に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する、
    請求項１記載の粒子分析装置。
  3. 前記信号処理部は、更に温度変化に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する、
    請求項２記載の粒子分析装置。
  4. 前記信号処理部は、更に流速調整誤差に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する、
    請求項３記載の粒子分析装置。
  5. 前記信号処理部は、前記粒子の大きさに基づき定義される値と、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間とに基づき、前記光検出部で出力された前記第一の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する、
    請求項４記載の粒子分析装置。
  6. 前記信号処理部は、更に前記粒子の大きさに基づき定義される値に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する、
    請求項５記載の粒子分析装置。
  7. 前記信号処理部にて決定される前記第一の電圧信号及び前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置は、取得開始時間と取得時間範囲とを含む、
    請求項６記載の粒子分析装置。
  8. 流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射工程と、
    前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射工程と、
    前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出工程と、
    前記第一照射工程による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射工程による前記第二の光の照射に基づき前記光検出工程で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理工程と、
    を含む粒子分析方法。
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