JPS61280287A - 微生物によるエチレンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は糸状菌の培養によりエチレンを製造する方法に
関する。

〔従来の技術〕

微生物によるエチレンの生成については、２２８種のカ
ビについての調査研究（Ｌ、Ｉｌａｇら２）、５ｃｉｅ
ｎｃｅ　　１５９．１３５７−１３５８（１９６８）〕
９Ｍｕｃｏｒ属菌およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　ｃ
ｌａｖａｔｕｓについての研究（Ｊ、Ｍ、Ｌｙｎｃｈ　
　、Ｎａｔｕｒｅ　　２４０．４５−４６、（１９７２
）；Ｊ、Ｍ、Ｌｙｎｃｈ、ａｎｄ　Ｓ、Ｈ，Ｈａｒｐｅ
ｒ４）、　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、８０．
１８７−１９５（１９７４）〕、土土壌菌についての調
査研究（Ｓ、Ｂ、Ｐｒｉｍｒ。

５ｅ５）＋Ｊ、Ｇｅｎ、￥１ｃｒｏｂｉｏ１．．９７，
３４３−３４６（１９７６）　）　、　Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉやＰｓｅｕｄｏｍ。

ｎａｓｆｉ菌についての研究（Ｓ、Ｂ、Ｐｒｉｍｒｏｓ
ｅ６）。

Ｊ　、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、　９５　、１
５９−１６５（１９７６）’；　Ｓ、Ｂ、Ｐｒｉｍｒｏ
ｓｅら　Ｊ　、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、　。

９３．１７７　　１８１（１９７６）；Ｈ，Ｔ、Ｆｒｅ
ｅｂａｉｒｎら８）、Ｎａｔｕｒｅ　　２０２，３１３
−３１４（１９６４））、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　についての研究（Ｋ、Ｃ９
Ｔｈｏｍａｓ　　ら９）、Ｃａｎ　、Ｊ　、Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ　、、２３　＋１６６９−１６７４（１，９７
７））、マノシュルームについての研究（Ｅ、Ｍ、Ｔｕ
ｒｎｅｒ　　、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

、９１．１６７−１７６（１，９７５））、　　ならび
にこれらについての総説ＣＭ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ　　
、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｐｌａｎｔ　　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、３０，５３３−５９
１（１９７９））などの報告がある。しかし、これらの
報告は、調査段階の研究報告が大部分であり、エチレン
を生成する微生物の種類について充分な記載がなされて
いない。

ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）　　属菌によ
るエチレンの生成については前記のＩｌａｇ’ｉｚ”　
の報告にＰ、ｃｏｒｙｌｏｐｂｉｌｕｍ、Ｐ、ｌｕｔｅ
ｕｍ、Ｐ、ｐａｔｕｌｕｍについて記載され、またペニ
シリウム・ジギテイタム（Ｐ　、　ｄｊｇｉｔａｔｕｍ
　）によるエチレンの生成については、菌株番号の言及
なしに前記のし１ｅｂｅｒｍａｎ　　およびり、Ｌ、Ｋ
ｅｔｒｉｎｇら　、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＰｈｙｉｏ
１．．９，６１７（１９６Ｂ）に記載され、またＡＴＣ
Ｃ１００３０株についてＳｐａｌｄｉｎｇら　。

Ｐｌａｎｔ　、Ｐｈｙｓｉｏｌ　、　、　４０　、６４
５（１９６５）に記載されている。しかし、これらはい
ずれも調査研究の報告であり、確立したエチレンの製造
法を開示するものではない。

エチレンの生合成経路について、植物ではメチオニンを
経由する経路がＤ　、　Ｏ、Ａｄａｍｓら　（Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、７６．１７０
（１９７９）〕によって確定されているが、微生物によ
るエチレンの生合成経路についてはまだ確定されていな
い。たとえば、Ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍのエチレン生合
成の前駆物質としてＤ　、Ｗ、　Ｊａｃｏｂｓｏｎら　
（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、、４３．１９５９（１９
６８））はアクリール酸、Ｄ、Ｌ、Ｋｅｔｒｉｎｇら　
はインクエン酸、Ｔ。

Ｗ、ＣｈＯｕら　（Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ　、。

１５７．７３（１９７３））は２−ケト・グルタール酸
およびＬ−グルタミン酸、Ｅ、Ｃｈａｌｕｔｚら　　〔
ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　、　、　６０　、４０２
（１９７７）　）はＬ−メチオニンについて報告してい
る。なお、Ｃｈａｕら１６）は、２−ケト・グルタール
酸とＬ−グルタミン酸のどちらが真の前駆体であるかを
きめることはできなかった。

また、ムコール（Ｍｕｃｏｒ　）属菌については、Ｍｕ
ｃａｒ　　ｈｉｅｍａｌｉｓ　によるエチレン生成にメ
チオニンが関与している口とを示した前記の文献４）が
ある。

このように、それぞれの報告によってエチレン生合成の
前駆物質が異るという事実は、微生物によるエチレン生
合成の経路が、まだ確定されていないことを如実に示す
ものである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

前記のように微生物によるエチレンの生成については調
査研究の段階であり、その生合成経路についても定説が
ない。まして、微生物を用いて、充分な再現性の下にエ
チレンを製造できる、工業生産に応用できるような方法
は未だ知られていない。

〔問題を解決するための手段〕 本発明者らは、先ず微生物のエチレン生合成経路につい
て詳細に研究し、次のような実験結果を得た。

〔実験１〕　エチレン生産微生物のし一メチオニンに対
する応答： 表１に示す培地、培養条件で代表的なエチレン生成細菌
８株、酵母１０株、糸状菌７株を選んで培養し、エチレ
ンの生成速度をガスクロマトグラフ法で測定した。実験
結果の一部分が表２に示されている。たソし、表１に示
す培地にＬ−メチオニンを添加した場合と無添加の場合
を対比させ、Ｌ−メチオニンに対する応答を調べた。こ
れらの実験結果から、細菌、酵母、糸状菌を通じて、計
２４株のエチレン生産菌はＬ−メチオニンに応答するが
、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　　Ｉ
ＦＯ９３７２だけがし一メチオニンに応答しなかった。

表１　エチレン生産菌の培地組成と培養条件（単位二ｆ
／ｌ） ■　無機塩溶液：クエン酸ナトリウム５　ｆ／ｌ　。

ＭｎＣ１２・４　Ｈ２Ｏ３ｆ　／（１、ＺｎＣ１２２ｆ
／（１。

ＦｅＣＪａ　−６Ｈ２０２ｆ／／ｌ、　ＣｕＳＯ４−５
Ｈ２００，２１／Ｉｌｌ　ＣｏＣ１□−６Ｈ２００，２
（１／（ｌ　ｌ　Ｎａ２Ｍ０Ｏ４６２１（２００，１ｆ
／ＩＩ　、に２Ｂ４０７　”　ｘＨ２Ｏ０−１ダ／１−
１−　　Ｃ，Ｍ。Ｃ０：カルボキシメチルセルロース（
ナトリウム塩） 〔実験２）　　ＡＣＣ”合成酵素活性とエチレン生成速
度 植物でのメチオニン経路における代表的な酵素であるＡ
ＣＣ合成酵素活性を測定した結果が表３に示されている
。前掲表２の添加メチオニンに応答しなかったＰ、ｄｉ
ｇｉｔａｔｕｍ　　ＴＦＯ９３７２と、添加メチオニン
に応答した２４株中で最高のエチレン生成速度を示した
Ｃｒｙ、ａｌｂｉｄｕＳＩＦＯ１３２０の両者について
表３では比較しである。Ｐ　、　ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　
ＩＦＯ９３７２ではＡＣＣ合成酵素活性が検出されない
にか＼わらず、多量のエチレンを生成した。なお、ＡＣ
Ｃ合成酵素活性は、培養菌体から調製した無細胞抽出液
に、Ｓ−アデノシール・メチオニンを基質として添加し
て反応させ、次亜塩素酸ソーダー試薬でエチレンを発生
させて、ガスクロマトグラフ法で測定した。

〔実験３　）　　Ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ＩＦＯ９３
７２培養液への添加物の影響 Ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ＩＦＯ９３７２が、他の大部
分のエチレン生産菌とちがって、メチオニン以外の経路
からエチレンを生成していると考えられるので、その前
駆物質になり得ると予想される各種化合物の添加効果に
ついて実験した。前掲表１に示す改変ＮＢ培地で、常法
通り２５°Ｃで３日間培養したＰ　、　ｄｉｇｉｔａｔ
ｕｍ　　ＩＦＯ９３７２の洗浄菌体を、０．１Ｍ　ＩＪ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に再懸濁し、飢餓培養４日目
の菌体を用い、各種化合物を添加して常法通りの休止細
胞によるエチレン生成速度を測定した。結果が表４に示
されている。Ｌ−グルタミン酸の添加効果が最大で、Ｌ
−メチオニンなどの添加効果は、はとんど認められなか
った。

表４　　Ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ＩＦＯ９３７２洗浄
休止細胞への添加物の影響゛ 使用休止細胞： 飢餓培養４日間の洗浄菌体を使用した。

反応条件： 休止細胞濃度＝１８■／ｒｎ１反応液 添加物添加濃度：１ｍＭ（反応液当り）反応条件：２５
°Ｃ９往復振盪、２４時間〔実験４　）　　ｐ、ｄｉｇ
ｉｔａｔｕｍ　ＩＦＯ９３７２のエチレン生成酵素の抽
出、精製 前掲表１に示す改変ＮＢ培地で常法通り培養したＰ、ｄ
ｉｇｉｔａｔｕｍ　ＩＦＯ９３７２の洗浄菌体を、表５
に示す手順に従って処理し、エチレン生成酵素を抽出、
精製、分離した。

表５　エチレン生成酵素の抽出精製工程表無細胞抽出液
（Ａ） エチレン生成酵素画分ＣＤ） 〔実験５〕　無細胞抽出液（Ａ）への添加物の影響 表５に示す無細胞抽出液（Ａ）に、基質になり得ると予
想される各種化合物を添加してエチレン生成速度を測定
したところ、表６に示すように、α−ケト・グルタール
酸添加時にエチレン生成速度が最大となり、Ｌ−グルタ
ミン酸、Ｌ−メチオニン添加時には、はとんどエチレン
を生成しなかった。エチレン生成酵素の本来の基質はα
−ケト・グルタール酸であると考えられる。

〔実験６〕　粗酵素液ＣＢ）への金属塩添加の影響 表５に示す粗酵素液〔Ｂ〕、つまり、無細胞抽出液〔Ａ
〕を硫安塩析、透析した液について、α−ケト・グルタ
ール酸を基質にして酵素反応したところ、表７に示すよ
うに、何も添加しない場合にはエチレン生成速度が表６
のα−ケト・グルタール酸添加のときの約Ｌ／１０に低
下した。そこで、透析によって失なわれた因子による影
響と考え、表７に示す金属塩の添加実験を行なったとこ
ろ、二価の鉄イオンがエチレン生成酵素の反応には必要
であるとわかった。なお、硫酸第一鉄の最適添加濃Ｍ 度は０．０５〜０．３ｍＭ　の範囲であった。

表７　粗酵素液〔Ｂ〕への金属塩添加の影響反応条件゛
： 粗酵ｄＢ）’　：反応液中の蛋白質濃度（最終）　：　
３．４７７７９／、ｄ反応液基質α−ケト・グルタール
酸添加濃度（最終）：　１ｍＭ添加金属塩濃度（最終）
：　０．１ｍＭ反応条件：２５°Ｃ１往復振盪、１時間
〔実験７）　　ＤＥＡＥセファローズ分画液〔Ｃ）、（
Ｄ）のエチレン生成 表５のＤ　Ｅ　Ａ、　ＥセファローズＣＬ−６Ｂイオン
交換カラムの通過液画分（Ｃ）について、α−ケト・グ
ルタール酸を基質として添加し、反応に必要な二価の鉄
イオンとして硫酸第一鉄を添加して酵素反応したところ
、表８に示すように、エチレンを全く生成しなかった。

表５のＤＥＡＥセファ０−ズＣＬ−６Ｂイオン交換カラ
ムの吸着物質を食塩の濃度勾配液で溶出し、約０−１５
　Ｍｏ１食塩溶出液のエチレン生成酵素画分ＣＤ）につ
いて、α−ケトゲルタール酸を基質として添加し、反応
に必要な硫酸第一鉄を添加して酵素反応したが、表８に
示すように、エチレンをごくわずかしか生成しなかった
。

上記画分〔ＣＤと〔Ｄ〕を等量混合し、これに基質とし
てα−ケト・グルタール酸を添加し、反応に必要な硫酸
第一鉄を添加して酵素反応したところ、表８に示すよう
にエチレンの生成が認められた。

画分〔ＣＤの主成分が、低分子であり、ニンヒドリン反
応を呈することから、アミノ酸ではないかと考え、画分
〔ＣＤの代りにカザミノ酸に置きかえて、画分（Ｄ）と
混合して酵素反応したところ、表８に示すように、多量
のエチレンが生成した。この結果から、画分（Ｃ）はア
ミノ酸であり、前掲表５の処理工程から、硫安塩析、透
析操作によって、この有効成分の相当量が失なわれたも
のと思われる。

表８　ＤＥＡＥセルローズ分画液（Ｃ）、ＣＤ）のエチ
レン生成 反応条件： ■　画分〔ＣＤ：反応液中の蛋白質濃度（最終）二〇、
５９■／−（反応液） ■矢　　画分〔Ｄ〕：反応液中の蛋白質濃度（最終）＝
０．９５■／ｍ！（反応液） （最終）：２■／ｒｒｉ（反応液） 基質α−ケトダルタール酸添加濃度（最終）：１ｍＭ硫
酸第一鉄添加濃度（最終）：　０−０７５ｍＭ反応条件
：２５°Ｃ１往復振盪、１時間（０，４ｍ１）　　（０
，１ｍ１）　　（０，１ｍ１）〔実験８〕　エチレン生
成酵素画分（Ｄ）へのアミノ酸添加効果 表５のエチレン生成酵素画分（Ｄ、ｌについて、両分（
Ｃ）やカザミノ酸を添加する代りに、各種アミノ酸をそ
れぞれ添加し、さらに基質としてのα−ケト・グルター
ル酸と、反応に必要な硫酸第一鉄を添加して酵素反応し
たところ、表９に示すように、Ｌ−アルギニン添加のと
きに、著量のエチレンが生成した。

そこで、前記通過液画分（Ｃ）中のし一アルギニンを分
析したところ、約０．０５　ｍＭ　濃度相当のし一アル
ギニンが検出された。

以上の実験結果から、両分〔ＣＤの有効成分はＬ−アル
ギニンと判明した。表５の処理工程では、このような低
分子の成分は透析時に殆ど失なわれる筈であるが、酵素
蛋白質に付着して、少量が残存したのではないかと思わ
れる。

以上の実験結果から、α−ケト・グルタール酸を基質と
するｉｎ　　ｖｉｔｒｏでのエチレン生成系が、次のよ
うに確立された。すなわち、１０ｍＭα−ケト・グルタ
ール酸液０．１ｉ、１０ｍＭアルギニン液０、１　ｍ７
．０．７５　ｍＭ硫酸第一鉄液０．１ｍｌ、　１０ｍＭ
ヘペス緩衝液（ＰＨ８，０）　０．４　ｍｔ、エチレン
生成酵素フラクションＯ０］、ｍ／ｓ水０．２−の反応
液組成で、２５°ＣＩＯ分間、密栓をほどこして往復振
盪する。

なお、Ｄ、Ｔ、Ｔ、　（ヂ・チオスレイトール）を反応
最終濃度として１ｍＭ添加した方が反応性は良くなる。

Ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ＩＦＯ９３７２のエチレン生
合成経路は、以上の実験結果から、資化し得る炭素化合
物から、ＴＣＡサイクルを経由してα−ケＮゲルタール
酸に至り、アルギニンと二価の鉄塩の共存下で、ａ−ケ
ト・グルタール酸から直接エチレンを生成するものと推
定できる。

しかし、このエチレン生合成経路はＰ、ｄｉｇｉｔａｔ
ｕｍ　ＩＦＯ９３７２の場合であり、前掲の表２に示す
ように、他の糸状菌では、むしろ添加し一メチオニンに
応答するようなメチオニン経路を経由するものが多い。

また、同じＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属菌でも必ずしもα
−ケトゲルタール酸経路を経由するとは限らず、種によ
って相異することが多い。また、同じｐ、ｄｉｇｉｔａ
ｔｕｍでも株によってα−ケト・グルタール酸の生成能
およびα−ケト・グルタール酸からのエチレン生成酵素
活性に強弱があり、エチレン生成速度に大きな相異が認
められる。これらの事実が、以下の実験結果に示されて
いる。

〔実験９　、ｌ　　Ｐｅｎｉｃｉｌｉｌｉｕｍ口属菌の
エチレン生成経路 表１の改変ＮＢ培地、培養条件でエチレン生成Ｐｅｎｉ
ｃｉｌｌｉｕｍ属菌を通常通り培養し、４日間飢餓培養
した休止洗浄菌体にＬ−メチオニン、およびＬ−グルタ
ミン酸をそれぞれ添加して常法通りシール反応したもの
と、上記改変ＮＢ培地で培養した菌体の無細胞抽出液（
表５の（Ａ）に相当）についてα−ケト・グルタール酸
を基質として反応させたものについて、エチレン生成速
度を測定した結果が表１０に示されている。この実験結
果にょねば、Ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　　ｒＦｏ　９３
７２以外のこの実験に使ったＰｅ旧ｅｉｌｌｉｕｍ属菌
の範囲では、α−ケト・グルタール酸（休止細胞ではＬ
−グルタミン酸）を経由するものは見出せなかった。

〔実験Ｉ　Ｑ　’：Ｊ　　Ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍの株
によるエチレン生成速度の相違 Ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍは、エチレン生成菌として著名
な菌であるが、その株間の比較をする目的で、表１に示
す改変ＮＢ培地、培養条件でＰ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍＪ
、Ｆｏ　７７５８　、　ＩＦＦ　７００６　、７８７６
　、９３９２およびＩＦＯ９３７２を常法通り培養して
、エチレン生成速度を比較した。結果が表１１に示され
ている。こ〜にＩＦＯ７００６は文献１２）に記載され
ているＡＴＣＣ１００３０と同じ菌株であり、文献記載
の値からエチレン生成速度に換算すると、表１１に示す
ように約３５０ｎ＃／−培養液／ｈｒ　　となる。しか
し、本発明者らがこの菌株を使って培養実験した結果で
は１８　ｎ（１／　ｍ／／　ｈｒのエチレン生成速度し
か得られなかった。いずれにしても、この表１１の結果
から、林間にも大きな相異があり、その原因は糖質から
のα−ケト・グルタール酸の生成能、エチレン生成酵素
活性、およびアルギニンの生成能に関連するものと考え
られる。

表１１中の糖質からのα−ケト・グルタール酸生成能の
試験は、菌体内の該酸を既発のペーパークロマトグラフ
法、および必要に応じてフリーデマン・ハウダン法によ
る比色法を併用した。表１１中のα−ケトゲルタール酸
からのエチレン生成酵素活性の測定法は、基質としてα
−ケト・グルタール酸を使用する前記ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
でのエチレン生成系を活用した。表１１中のアルギニン
生成能の試験は、表５に示す無細胞抽出液（Ａ）につい
て、高速液体クロマトグラフィーで分画して螢光分析法
を使用した。

以上の実験結果から、ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ＩＦＯ
９３７２のように多量にエチレンを生成させるための必
要条件としては次のように考えられる。

（１）資化し得る炭素源からのα−ケト・グルタール酸
の生成能が強いこと。前掲の諸実験結果からもわかるよ
うに、メチオニン経由のエチレン生合成経路では、エチ
レンの生成速度、生成量が少く、α−ケト・グルタール
酸経由のエチレン生合成経路の方が遥に多量のエチレン
を生成し得ると考えられる。

（２）　　α−ケト・グルタール酸からのエチレン生成
酵素活性が強いこと。前掲の表１１からもわかるように
、この酵素活性の強弱がエチレン生成速度に大きく影響
している。

（３）アルギニンの生成能が強いこと。前掲表９の実験
結果、前記α−ケト・グルタール酸からエチレンへのｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏの系、ならびに、前掲表１１の実験結果
から、アルギニンの作用機作はまだ明らかではないが、
アルギニンはα−ケトゲルタール酸からエチレンの生成
には必須の因子であることは明らかである。

（４）培地中に二価の鉄塩を含有すること。前掲の表７
の実験結果および前記α−ケト・グルタール酸からエチ
レンへのｉｎ　ｖｉｔｒｏの系からもわかるように、二
価の鉄塩の存在は必須の因子である。

（５）好気的な条件下で培養すること。前掲の各実験に
使用したエチレン生産菌は、いずれも好気性の菌である
から、培養時に酸素供給が必要なことは当然であるが、
ざらにα−ケト・グルタール酸からのエチレン生成酵素
の反応時にも酸素の存在が必須因子であるとの実験デー
ターが得られた。

上記（１）〜（３）の生理的性質を兼ね具えたエチレン
生産菌を、（４）と（５）の条件下で培養することによ
って、はじめて、エチレンを著量生成させることが可能
になる。

本発明は以上の知見に基づくもので、Ｌ−アルギニンの
存在下でα−ケト◆ゲルタール酸からエチレンを生成す
る能力を有する、糸状菌に属する菌株を、２０ｐｐｍ以
上の二価鉄イオンを含有する培地に好気的に培養してエ
チレンを生成させ、これを採取することを特徴とする微
生物によるエチレンの製造法である。

本発明においては、微生物として、糸状菌に属し、Ｌ−
アルギニンの存在下でα−ケトｒゲルタール酸からエチ
レンを生産する能力を有する菌株が用いられる。

その菌株は、資化できる炭素源からα−ケト・グルター
ル酸を生成する能力が強く、ａ−ケト・グルタール酸か
らエチレンを生成する酵素の活性が強くそしてアルギニ
ンを生成する能力を有するのが望ましい。

上記の生理的特徴は属や種で規定できず、同じ種におい
ても株によって相違する。したがって上記の菌株は微生
物の分類学上の位置によって定められるべきものではな
く、菌株の生理学的性質によって定められるものである
。そして所望の菌株は前記の実験に示した方法により糸
状菌の中から入手することができる。

糸状菌のうち、好ましい属の例はペニシリウム属であり
、ペニシリウム属の好ましい種の例はペニシリウム・ジ
ギテイタムである。しかしながら、本発明の菌株が上記
の属や種以外の糸状菌からも選択できることは明らかで
ある。

本発明の微生物を培養する培地としては、２０ｐｐｍ　
以上の二価の鉄イオンを含有するものが用いられる。

二価の鉄イオンは無機または有機酸の第一鉄塩の形で培
地に添加するのが望ましい。鉄塩として硫酸第一鉄Ｆ　
ｅ　ＳＯ４・７Ｈ２０を用いる場合好ましい添加濃度は
０．０５−０．３　ｍＭである。

二価の鉄イオンは三価の鉄イオンと共に培地中に含有さ
れていてもよく、三価イオンとして培地に含有されてい
る鉄を還元的条件下に二価に変えてもよい。

培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類その他の栄養
素を含有する通常の糸状菌用の培地を用いることができ
る。

炭素源としては、グルコース、シコクロース。

マルトース、澱粉、キシロース、ソルビトール。

などの炭水化物、グリセリン、エタノールなどのアルコ
ール、酢酸、脂肪酸などの有機酸、さらにはこれらを含
有する粗原料が用いられる。とりわけ、天然界および人
為的に副生ずる再生産可能なバイオマス、たとえば農産
、林産、水産、畜産などから発生する廃資源、および、
あるいは、公共下排水、し尿、各種工場排水、各種産業
廃棄物などの生物的処理から副生ずる汚泥類などが、こ
の発明にとって有用な主原料として用いられる。これら
の主原料は使用する各種菌株によって異るが、必要に応
じて予め溶解または分解の前処理を行なうこともある。

窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アン
モニウム塩などが望ましい。なお、前記のようなバイオ
マスを主原料として使用する場合には、これらの窒素源
の添加を必要としないこともある。

無機塩類としては、リン酸塩、カリ塩、マグネシウム塩
、ナトリウム塩、カルシウム塩などの通常のものであり
、バイオマスの場合には不要のこともある。

ビタミン、アミノ酸およびこれらを含有する酵母エキス
、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカーなどは、
本菌株の生育促進もしくはエチレンの生成に寄与するこ
とがある。

培養は好気的条件、たとえば通気攪拌培養、もしくは静
置培養で行ない、ｐＨは２〜９、温度は２０〜３５°Ｃ
に制御しっ一１各菌株によって最良の条件を設定した。

かくして１〜１０日間培養すると、著量のエチレンを含
有するバイオガスが生成される。

生成されたバイオがス中のエチレン量は、次のようにし
て測定する。培養途中または培養終了時の被検液ｘ　＝
　１〜５ｒｎｌを、予め滅菌した全容Ｖ＝１０〜５０”
の試験管に採取し、滅菌ゴムキャップで密栓し、２０〜
３５°Ｃでｔ＝ｌ〜７時間往復振とつする。使用菌株に
よって呼吸速度が異るので、振とう中に酸素が欠乏しな
いような条件設定、つまり、Ｖ、ｘ、ｔの水準を必要に
応じて、適宜かえることが好ましい。

往復振とう終了後、試験管上方の空間部からガスシリン
ジでｙ　＝　ｏ、ｉ〜２１ｎｌのガスを抜き取り、ＦＩ
Ｄ法（カラム温度５０〜１５０’Ｃ，注入温度１００〜
２００°Ｃ）、キャリアーガスに窒素ガスを使う常法の
ガスクロマトグラフィーにかけ、記録紙上の該当部の面
積から、標準ガスによる検量線を使って上記採取ガス中
のエチレン量Ｅｎｌを求める。なお、次式を使ってエチ
レン生成速度Ｐｎｌ／ｒｎｌ−ｈｒ　を求めることがで
きる。

生成されたバイオガス中のエチレンの分離採取方法は、
バイオガスをそのま＼ゼオライトあるいは活性炭などの
適当な吸着剤に吸着して不純ガスと分離後脱着したり、
もしくは、予め苛性ソーダ液に接触させて副生ずる炭酸
ガスを除去した後に、上記吸着剤に吸着・脱着すること
もできる。ゼオライトとしては、モレキュラーレーブス
４ＡＣユニオン昭和（株）製〕、ゼオラムＡ−４，Ａ−
５゜およびＦ−９〔東洋ツーダニ業（株）製〕などが使
用される。また、活性炭としては、モレキュラーシービ
ングカーボン〔武田薬品工業（株）製〕などが使用され
る。

以下実施例により本発明を説明する。

実施例１ 菌株葆存機関から既分譲保存糸状菌、および新たに分譲
受けた糸状菌について、表１の改変ＮＢ培地で常法通り
培養し、エチレン生成速度の大キいものについて表１１
に準じて、その生理的性質を調べ、前記必要条件を満た
す菌株を選択した結果が表１２に示されている（、　Ｐ
ｅｎｉｃｉＪＩｉｕｍ　ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ＴＦＯ９
３７２以外にα−ケト・グルタール酸を経由してエチレ
ンを生成するものと推定されるエチレン生産菌が３株得
られた。

エチレンの生成経路を確認する目的で表１０に準じて、
エチレン生成状況を調べた結果が、表１３に示されてい
る。いずれの菌株もα−ケト・グルタール酸を経由して
エチレンを生成していることが確認された。

実施例２ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ＩＦＯ
９３７２の培地中への二価鉄塩の添加量の影響、および
、エチレン生成反応時の酸素分圧の影響を調べた結果が
、表１４および表１５に示されている。

培地中の二価の鉄塩濃度に伴って、エチレン生成速度は
増加し、エチレン生成反応時の酸素分圧が０１つまり無
酸素状態になると、エチレンが生成しなくなる。

表１４　　Ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ＩＦＯ９３７２の
培地中べの二価鉄塩添加量の影響 １使用培地二表１の糸状菌合成培地からＦｅＳＯ４・７
Ｈ２０を除いた培地にＦｅＳＯ４・７Ｈ２０を表の如く
添加した。

培養条件：２５°Ｃ１回転振盪方法で５日間培養した。

表１５　　Ｐ、ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　ＩＦＯ９３７２の
シール反応時の酸素分圧の影響 使用培地：改変ＮＢ培地 培養条件＝２５°Ｃ１回転振盪で４日間培養した。

シール反応二上記４日目の菌体を各酸素分圧下に置換し
、２時間シール反応を行なった。

実施例３゜ ２゜６１のミニジャーファーメンタ−に、第１表の改変
ＮＢ培地１１を仕込み、１２０°Ｃｌ２Ｏ分間オートク
レーブに入れて滅菌し、冷却後、予め同じ培地で振盪培
養したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄｉｇｉｔａｔｕｍ　
　ＩＦＯ９３７２の培養液５０−を移植し、ＯＪＩ、。

の無菌空気を通気し、攪拌回転数４０Ｏｒｐｍ、培養温
度２５°Ｃで６日間培養した。

この全培養期間を通じて、排気を１０％苛性ソーダ液槽
、水洗槽、水分分離槽に順次導いて不純ガスを除去し、
ついでゼオラムＡ−４（東洋ツーダニ業（株）製〕の層
を通過させてさらに不純ガスを吸着除去し、通過ガスを
ゼオラムＡ−４〔東洋ツーダニ業（株）製〕の充填管に
導ひき、吸着したエチレンを真空吸引して脱着回収した
。得られたエチレンは約１００■であった。

〔発明の効果〕

この発明の特長は、使用する主原料として、容易に入手
可能で、しかも再生産可能なバイオマス、とりわけ農産
、林産、水産、畜産などから発生する廃資源、および、
あるいは、公共下排水、し尿、各種工場排水、各種産業
廃棄物などの生物的処理から副生ずる汚泥類などが有利
に使用できること、および、本発明の方法によるエチレ
ン発酵を行うことによって、上記主原料として使用する
バイオマスの一種の微生物学的な廃棄物処理、排水処理
を行うことに相当すること、などをあげることができる
。さらに、原油や天然ガスからの現行エチレン製造法に
較べると、主原料が再生産可能なバイオマスであるから
枯渇する恐れのないこと、微生物の作用を利用する反応
であるから比較的低温、低圧の緩和な条件のもとて製造
できること、本発明の方法に使用する微生物の生成する
バイオガス中には、エチレン以外の副生ガスとして炭酸
ガスがその大部分を占め、従ってエチレンの精製が容易
であり、製品の純度も高いこと、などの特長があげられ
る。なお、最近、容易に入手可能で、しかも再生産可能
なバイオマスを主原料として、微生物を使ってアルコー
ル発酵を行ない、次いで、化学反応によってアルコール
をエチレンに変換する研究が盛んに行なわれているが、
本発明の方法によれば１段の発酵法だけでエチレンを直
接製造できる利点がある。

（鮭）手続補正書 昭和６０年７月３日 ３、　補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住　所　大阪府大阪市住吉区帝塚山中３丁目５番１０号 氏名　福田秀雄 （発送日。昭和　　年　　月　　日付）６、　補正によ
り増加する発明の数　　　　　０補正の内容 １　明細書の第４頁上から１２２行目（Ａｒｃｈ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、を（Ａｒｃｈ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、と
訂正します。

Ｚ　同、第１１頁、表３の１行目、右端のエチレン生成
速度の欄の（ｎｆｆ／−＝／（培養液／ｈｒ）を（ｎ６
／、ｚ（培養液）／ｈｒ）と訂正します。

３、同、第１９頁、表７の８行目（ＮＨ４）６ＭＯ，・
０□４・４Ｈ２０を（ＮＨ４）６Ｍｏ７０ｕ・４　Ｈ２
Ｏと訂正します。

４、　同、第２５頁、上から５行目、１０ｍＭヘペスを
　５ＱｍＭヘペス　と訂正します。

５、　同、第２８頁、表１０の下から３行目の最終蛋白
質濃度　１７哩／−を　１■／−と訂正します。

６、　同、第２９頁、上から６行目、ｌＦＦ７００６を
　ＩＦＯ７００６と訂正します。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｌ−アルギニンの存在下でα−ケト・グルタール酸
   からエチレンを生成する能力を有する、糸状菌に属する
   菌株を、２０ｐｐｍ以上の二価鉄イオンを含有する培地
   に好気的に培養してエチレンを生成させ、これを採取す
   ることを特徴とする微生物によるエチレンの製造法。 ２、菌株が、資化できる炭素源からのα−ケト・グルタ
   ール酸生成能が強く、α−ケト・グルタール酸からエチ
   レンを生成する酵素の活性が強く、そしてアルギニンを
   生成する能力を有する特許請求の範囲第１項記載の製造
   法。 ３、菌株がペニシリウム属に属する特許請求の範囲第１
   項記載の製造法。