JPS6125352B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はチトクロム酸化酵素の調製法に関す
る。更に詳しくは、本発明は、サーマスサーモフ
イラスHB菌体から耐熱性のチトクロム酸化酵素
を分離する方法に関する。

チトクロム酸化酵素は、細胞呼吸においてチト
クロム系の未端に位置し、呼吸基質からチトクロ
ム系を経て伝達されてきた電子を直接分子状酸素
に渡す酵素であり、酵素製剤、試薬としての用途
が期待されている。

本発明者等は、比較生化学研究上、サーマスサ
ーモフイラスHB8のチトクロム酸化酵素に着目
し、その分離を試み、本発明に到達した。

すなわち、本発明の要旨は、サーマスサーモフ
イラスHB8菌体を破砕し、その破砕物からチトク
ロム酸化酵素を分離することを特徴とするチトク
ロム酸化酵素の調製法に存する。

更に本発明方法を詳細に説明するに、本発明に
おいて用いられる材料サーマスサーモフイラス
（Thermus thermophilus）HB8（ATCC27634）
は、International J.of Systematic
Bacteriol.24，102〜112に記載されているサーマ
ス属に属する菌株である。該菌株の菌体からチト
クロム酸化酵素を分離するには、菌体を破砕し、
その破砕物から分離する。具体的に説明すると、
まず菌株を0.5％ペプトン、0.4％酵母エキス、0.2
％塩化ナトリウム及び0.1％グルコースを含む培
地を使用して、75℃で約６時間培養し、後期対数
増殖期で集菌し、得られた菌体を常法により、例
えば音波処理により破砕する。そして得られた破
砕物から常法によりチトクロム酸化酵素を分離す
る。分離法の１例を説明すると、破砕物に、
EDTA、塩化マグネシウム、塩化カリ、β―メル
カプトエタノールを含むトリス塩酸緩衝液（PH
7.8）を加えて撹拌し、7500r.p.m.で遠心して得
られる上清を、さらに22000g、15時間遠心し、
その沈澱（膜画分）に、10％トライトンＸ―100
（和光純薬工業社製、界画活性剤トライトン商
標）、塩化カリを含むトリス塩酸緩衝液PH7.5を加
えて撹拌し、遠心して上清を得る。上清を0.5％
トライトンＸ―100を含むトリス塩酸緩衝液PH8.5
で透析してのち、ジエチルアミノエチルセルロー
スカラムに加え、同緩衝液に0.05M塩化カリを加
えたもので溶出する。溶出液を限外過で濃縮
後、0.5％トライトンＸ―100を含むトリス塩酸緩
衝液PH8.5で透析したのち、ジエチルアミノエチ
ルセフアデツクスに通し、塩化カリウムの０→
0.2Mの線状濃度勾配で展開した。塩化カリウム
濃度0.15M付近にチトクロム酸化酵素が得られ
た。

このようにして得られたチトクロム酸化酵素の
酸化型は410，523，599nmに、還元型は416，
442，519，548，602nmに吸収極大を示した。至
適PHは6.5付近に存在し、塩による強い阻害がみ
られ、1mMCNで完全に阻害される。耐熱性を有
し、78℃で20分間熱処理後の残存活性は約75％で
ある。本酵素はサーマスサーモフイラスHB8由来
のチトクロムＣ―552とすみやかに反応し、また
カンデイダ（Candida）及びウマのチトクロムＣ
とも反応する。

(1) 培 養 サーマスサーモフイラスHB8
（ATCC27634）を１中にペプトン5g、酵母
エキス4g、グルコール1gおよび塩化ナトリウ
ム2gを含む培地を用いて培養した。即ち、先
ず、約３mlの上記培地の入つた20mlの試験管２
本は上記菌を接種し、インキユベーター（75
℃）中に２昼夜放置した。次いで上記培地１
の入つた５の坂口コルベン８本に植えつぎ、
75℃で一夜振とう培養した。更に20のジヤー
フアーメンター４基にこれを植えつぎ、75℃で
約８時間通気培養し、対数増殖後期（クレツト
数約400）で集菌し（シヤープレス型連続遠心
機使用）、生理食塩水約２で軽く洗つた。菌
体は、−20℃で凍結保存した。菌体収量は培地
80に対し、湿重量で約700gであつた。

(2) 菌体の磨砕 −20℃に凍結保存してあつた菌体500g（湿
重量）を室温に約30分間放置し、菌体がまだ溶
けないうちに包丁でサイコロ型に切断した（こ
の操作より以後は４℃でおこなつた。）これを
大きな乳鉢の中に入れ、磨砕用酸化アルミニウ
ム約500gでまぶして、乳棒を用いて機械的に
菌体をすりつぶした。約30分後に、上記の酸化
アルミニウムを適当量（約125g）加え、更に
約１時間磨砕を続けた。菌体がつぶれて全体が
とろりとして来たら次の抽出操作に移つた。

(3) 膜画分の分離 1mMEDTA，10mM塩化マグネシウム、
135mM塩化カリ及び7mMβ―メルカプトエタ
ノールを含んだ50mMトリス―塩酸緩衝液（PH
7.8）を1.3乳鉢中に加え、約30分間乳棒を１
本にして撹拌を続けた。

どろどろした懸濁液を、7500r.p.m.で約45分
間遠心した。上清を更に15000r.p.m.で15時間
遠心した。膜画分は沈澱として得られた。

(4) 膜画分の可溶化 得られた沈澱を、1mMEDTA，10mM塩化マ
グネシウム、135mM塩化カリ及び7mMβ―メ
ルカプトエタノールを含む50mMトリス―塩酸
緩衝液（PH7.8）でホモジエナイズし、30000r.
p.m.2時間遠心した。沈澱に10％トライトンＸ
―100（和光純薬工業社製、界面活性剤トライ
トンは商標）及び0.5Mトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）を加え、蛋白、トライトンＸ―100、トリ
ス塩酸緩衝液（PH５）の終濃度をそれぞれ20
mg／ml、２％、0.05Mとして、ホモジエナイズ
した。これに塩化カリウムを加えて1Mとし、
一夜撹拉を続けたのち、遠心し上清を得た。

(5) チトクロム酸化酵素の分離 上記上清を0.5％トライトンＸ―100を含む
0.05Mトリス塩酸緩衝液PH8.5以下、これを緩
衝液Ａと略称する）で透析し、透析液を緩衝液
Ａで平衡化しておいたDEAE―セルロースカラ
ム（φ５×30cm）に吸着させ、0.05M塩化カリ
ウムを含む緩衝液Ａにより溶出した。溶出液を
ダイアフローメンブレンPM―10（アミコン社
製膜、ダイアフローメンブレンは商標）を膜と
する限外過で濃縮したのち、0.5％トライト
ンＸ―100を含む0.05Mトリス塩酸緩衝液PH8.5
（以下、これを緩衝液Ｂと略称する）で透析し
たのち、緩衝液Ｂで平衡化しておいた、DEAE
―セフアデツクスＡ―50（フアルマシア社製、
陰イオン交換樹脂）のカラム（φ３×35cm）に
吸着させ、塩化カリウムの０→0.2Mの直線濃
度勾配の緩衝液Ｂで展開した。塩化カリウム濃
度約0.15M付近にチトクロム酸化活性画分が得
られた。これをダイアフローメンブレンPM―
10で濃縮したのち、0.5％トライトンＸ―100を
含む0.01Mリン酸カリ緩衝液PH7.0（以下、こ
れを緩衝液Ｃと略称する）で透析したのち、緩
衝液Ｃで平衡化しておいたリン酸カルシウムゲ
ルカラム（φ２×30cm）に吸着させ、塩化カリ
ウムの０→0.4Mの直線濃度勾配の緩衝液Ｃで
展開した。塩化カリウム濃度約0.2M付近にチ
トクロム酸化酵素が溶出された。収量は、約６
単位であつた。こゝで１単位は、室温でカンデ
イダ（Candida）チトクロムＣが１分間当り
1mmole酸化される活性を表わす。

なお、チトクロム酸化活性は還元型チトクロ
ムＣの酸化に伴なうα吸収帯の吸光度の減少の
時間変化を記録することにより測定された。

(6) チトクロム酸化酵素の性質の測定 (イ) 酸化型の吸収帯 誌料溶液にフエリシアン化カリをおよそ10
μＭになるように加え、10mMリン酸カリ緩
衝液（PH7.0）に透析し、スペクトルを測定
した。410，523，599nmに吸収極大を有して
いた。

(ロ) 還元型の吸収帯 上記(イ)の試料に微量のハイドロサルフアイ
ト紛未を加えスペクトルを測定した。416，
442，519，548，602nmに吸収極大を示し
た。

(ハ) その他 至適PHは6.5付近に存在し、塩による強い
阻害がみられ1mMCN^-で完全に阻害され
た。78℃、20分間熱処理したのちの残存活性
は約75％であつた。本酵素は高度好熱菌由来
のチトクロムＣ―552とすみやかに反応し、
またカンデイダ（Candida）及びウマのチト
クロムＣとも反応した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ サーマスサーモフイラスHB8菌体を破砕し、
   その破砕物からチトクロム酸化酸素を分離するこ
   とを特徴とするチトクロム酸化酵素の調製法。