JPS61249396A - イソマルツロ−スの酵素による連続式製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はイソマルツロースの酵素による連続式製造法に
関する。

今回、無菌条件下に運転できる反応器系において、 ａ）　スクロース・ムターゼを生成する微生物の発酵に
よってスクロース・ムターゼを製造し、但し対数的生長
相の終了前にこの細胞を塩溶液と表面活性試薬ですでに
処理してあり、 ｂ）　細胞の潤浸及び交流ミクロ濾過による公知の方法
によって細胞を含まない粗酵素抽出物を製造し、 Ｃ）　この粗抽出物からのスクロース中ムターゼを、ア
ニオン化しうる担体マトリックスへの選択的な結合によ
って、同時に精製且つ固定化し、そして ｄ）　このようにして得たマトリックスをスクロースと
接触させる、 イソマルツロースの酵素による連続式製造法が発見され
た。

独国特許第１，０４９，８００号によると、スクロース
は微生物起源の酵素によってイソマルツロースに軟化さ
れる。プロタミノバクター・ルブラム（Ｐ　ｒｏｔａｍ
ｉｎｏｂａｃｔｅｒ　　ｒｕｂｒｕｍ）の他に、他のバ
クテリヤ例えばエルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎ
ｉａ　　ｅａｒｏｔｏｖｏｒａ）、霊菌（Ｓ　ｅｒｒａ
ｔｉａ　　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、セラシア・プリム
シカ（Ｓ　ｅｒｒａｔｉａ　　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）
及びロイコノストク・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎ
ｏｓｔｏｃ　　ｓ＋ｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）はこの
軟便反応を行なう［Ｓ、シュミット（Ｓ　ｃｈｍｉｄｔ
）−ベルブ（Ｂｅｒｇ）−ｏレンツ（Ｌｏｒｅｎｔｚ）
、Ｗ、ｖつ７（Ｍａｕｃｈ）、Ｚ、ラッカーインダスト
リー（Ｚ　ｕｃｋｅｒｉｎｄｕｓｔｒｉｅ）、　１４　
、６２５〜６２７（１９６４）：Ｆ、Ｈ，ストドラ（Ｓ
　ｔ。

ｄｏｌａ）、　１２６回米国化学会年・会、１９５４年
９月。

７プストラクツ・オプ・ペーパーズ（Ａ　ｂｓｔｒ、　
ｏｆＰａｐｅｒｓ）、Ｓ、Ｄ５；Ｗ、Ｗつ７．Ｓ、シュ
・ミツト−ベルグーロレンツ、Ｚ、ツッヵー″インダス
トリー、Ｌ支、３０９〜３１５及び３７５〜３８３（１
９６４）］。

これに基づけば、イソマルツロースの微生物又は酵素に
よる種々の製造法が開示されている。

例えばヨーロッパ特許第１　、ＯＯ９号は、スクロース
のイソマルツロースへの同時的軟化を（！１う微生物の
連続式発酵法を記述している。米国特許第４，３８６，
１５８号、独国公開特許第３，０３８．２１９号及びヨ
ーロッパ特許第２８，９００号は、固定化した微生物を
用いるイソマルツロースの種々の製造法を記述している
。

独国公開特許第３，０３８，２１８号には、最初に酵素
スクロース曇ムターゼが記述され且つ特徴づけられ、そ
の固定化とイソマルツロースの製造のための使用法が記
録されている。

これによると、酵素スクロース・ムターゼの単離を多段
式によるパッチ式として記述し、続く固定化を別の反応
工程として記述している。特にこれで使用されるＣＭ−
セファデックスでのクロマトグラフィーは時間のかかる
工程である。＊た発酵工程、細胞の温浸、酵素の精製及
び精製した酵素の固定化は一連のだらだらした工程で行
なわれ、更にこれらは細菌のない条件で行なう困難さが
伴なう。

従来記述されている方法は、発酵から最終生成物のイソ
マルツロースに至るまでパッチ式によってのみ行なうこ
とのできる固定化微生物による或いは固定化スクロース
・ムターゼによるイソマルツロースの無殺菌製造法であ
る。

これに対し、本発明による方法は、無菌条件下に運啄さ
れる反応器系においで、スクロース・ムターゼを生成す
る微生物の発酵による外賓性の（ｐｅｒｉｐｌａｓｍａ
ｔｉｃ）スクロース・ムターゼの生成、細胞の温浸によ
る及び交流ミクロ濾過（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗｓ＋１ｃ
ｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による細胞を含まないＩＬ
酵素の製造、スクロース・ムターゼの、シフフィルトレ
ージョン（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって調整
した細胞を含まない粗抽出物からの、アニオン化しろる
担体マトリックスへの選択的結合によるスクロース・ム
ターゼの同時的精製と固定、そして好ましくはカートリ
ッジ形又は長円形筒の対応するアニオン化しろる担体マ
トリックスへ結合させたスクロース働ムターゼによるス
クロースのイソマルツロースへの直接的転化、からなる
連続法である。

特にウェッブ・マトリックス形のスルホン酸カチオン交
換樹脂の使用は、非常に高流速において粗酵素抽出物か
らのスクロース・ムターゼの例外的に選択的な結合を可
能にし、従って１段で酵素を精製する。この人クロース
・ムターゼを、スクロースのイソマルツロースへの転化
のバイオ触媒としで用いる場合には、酵素を最早やカチ
オン交換樹脂から流出させ、濃縮する必要がない、７ニ
オン化しうる担体マトリックス、特にスルホン酸カチオ
ン交換樹脂は、バイオ反応器としての操作が活性の損失
なしに長期にわたって可能であるというふうにスクロー
ス・ムターゼをしつかり結合させる。

カーシリツジ又は長円形筒形のスルホン酸マトリックス
、例えばＡＭＦ、モレキュラー・セパレーション・デイ
ビクン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｓ　ｅｐａｒａｔｉｏ
ｎＤ　１ｖｉｓｉｏｎ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ　、Ｕ　
Ｓ　Ａ　）からの種々ノ［Ｆ］ 市販形ゼタプレプ（Ｚ　ｅｔａｐｒｅｐ）　１００−　
Ｓ　Ｐ　　又はゼタプレプ３０００−８Ｐ■の使用は特
に有利である。これは紙シートに加工でき且つカーシリ
ツノ形に巻けるスルホン酸含有の架橋セルロースである
。

種々の製造業者からの７ニオン性の無菌フィルターカー
トリッジ例えばボール（Ｐａｌｌ）からのウルチボ７　
（Ｕ　１ｔｉｐｏｒ）Ｇ　Ｆ■フィルター媒体も同様の
方法で使用できる。この場合ガラス繊維物質は高度に負
に衡電した官能基を有する樹脂によって内包されている
。

しかしながら市販の無菌フィルターカートリッジは、ク
ロマトグラフィーの目的で市場にもたらされたＡＭＦゼ
タプレプーＳＰ■系と比較して、祈りたたまれた膜又は
ウェッブであり、物質流は膜又はウェッブの１層だけを
通過する。これに対して円筒形に巻かれたウェッブ又は
膜シート、本発明の方法の好適な態様に特徴的なそれの
場合には、物質流は円筒の軸に放射的に多くのウェッブ
又は膜層を通過しうる。

スクロース・ムターゼの粗抽出物からの選択的単離にお
いて可能な高流速も、高パーセントのスクロースＶ＃液
を用いて反応器を運転するのに有利である。これはスク
ロース働ムターゼのバイオ反応器の高生産性に対する予
備条件の１つである。

発酵工程、細胞の温浸、１段の同時的処理及び固定化法
及び生物変換工程の組合せは、従って細菌のない条件下
に非常に簡単な方法で運転することのできるイソマルツ
ロースの酵素による連続式全製造法を可能にする（第１
　ａ、ｂ図）。

本発明の方法によって特に有利に具現化されるｐ＆曹条
件下に運転されるイソマルツロースの酵素による全製造
法は、細菌のバイオ反応器中への侵入を、従って基質ス
クロースからの副生物の生成を防止する。このような副
生物は普通有機酸であり、この微生物の代謝生成物はバ
イオ反応器のｐＨ値を減少させ、従ってスクロース・ム
ターゼを不活性化する。

スクロース働ムターゼは４０℃よりも高温の場合非常に
短期間で触媒活性を失ない、斯（してオートクレーブ処
理は殺菌法として不向きである。

細菌の死滅に対する多くの殺バクテリヤ剤又は殺菌剤の
使用は、生成物のイソマルツロースを糖代替物として使
用するから、非常に管用のかかる生成物の精製と関連す
る分析とを必要とする。

カチオン交換樹脂マトリックスがスルホン酸官能基を高
濃度で有するならばそれは特に有利である。実施例１に
よると、１ｇ以上の純粋なスクロース・ムターゼを１つ
のＡＭＦゼタブレプ１００■ 一８Ｐ　上に結合させることが可能である。例えば製造
業者の仕様によれば、ゼタプレプ１０〇−ＤＥＡＥ■ユ
、ット。能力は牛。血清７．。左。

４〜６ｇである［ＡＭＦ社、１９８４年１１月３０日、
ＬＣｌｏ、１０］、従って多分同様にしてスクロース・
ムターゼに対する能力の上限はゼタブレプ１００−８Ｐ
■当り約４ｇである。

製品ＡＭＦゼタプレプ■の場合、蛋白含有水溶液のクロ
マトグラフィーに対する最高流速としては約３０反応器
容量／時が示されている［ＡＭＦ社、１９８３年９月２
８日、ＬＣＩＯ，ＩＧＩ。

実施例１によれば、実験室に通常のぜん動式ポンプを用
いる場合、５０％スクロース溶液からの生産量において
７反応器容量／時が達成された。

より高性能のポンプ、例えば製糖業でしばしば使用され
るはめば（ｃｏｇ　　ｗｈｅｅｌ）式ポンプを用いると
、増大した供給が可能であり、高い酵素負荷が利用でき
る。

一般に触媒反応に対しては、反応器容量をできる限り小
さく、即ち例えば粒状形の固定化されたバイオ触媒の固
定床容量に保つことはかなり重要である。これ単位容量
当り高活性の、高負衛密度の又は高活性密度のバイオ触
媒を必要とする。

この結果、より小さい反応器装置での生産が可能となり
、従ってかなりの建設、エネルギー及び維持冑が節約と
なる。

本発明の方法に基づけば、５０％スクロース溶液ヲ用い
る場合、スクロースのイソマルツロースへの転化に対し
て５〜１０反応器容量／時の生成物流が達成できる（実
施例１）、比較すると、固定化された細胞を用いて可能
な生成物流は０．５〜１．０反応器容量／時程度である
。

それ故に本発明の方法はバイオ変換反応において放射型
バイオ反応器を使用することを含む、第２ａ及Ｖｂ図が
示すように、基質流は円筒形反応容器中のセルロースウ
ェッブのい（つかの巻きを通して放射的に円筒形の輪方
向、即ち放出方向へ向う、この時これがセルロースウェ
ッブを通流する時、巻す当りの面積勾配及び全ウェッブ
表面上での滞留時間勾配が生ずる。

セルロースウェッブを通流する速度は一番外側の巻きか
ら一番内側の巻きへと増大する；同時に巻き取りのウェ
ッブ表面は減少する。酵素を均一に仕込む時、一番内側
の巻きに向って巻き取りの酵素の量は減少する。斯くし
て物質流の滞留時間は、低転化率に対して、即ち低生成
物濃度及び高基質濃度に対してよりも高転化率に対して
、即ち高生成物濃度及び低基質濃度において低い。これ
は生成するグルコース、フルクトース、１．１’−二糖
類及びオリゴ糖類の助けを借りるスクロース・ムターゼ
触媒によるスクロースのイソマルツロースへの転化にお
いて観察されるような酵素起源の副生物の生成を減少さ
せる。

実施例１から理解できるように、スクロースの転化が完
結した場合、グルコース（約１．０％）及びフルクトー
ス（約２．０％）の濃度は、他に固定化されたスクロー
ス・ムターゼを用いるパッチ法（参照、独国公開特許第
３，０３８，２１８号）と比べて低い、これは本発明の
方法の他の利点である。

本発明の方法は、特にＮａＣｌ、ＫＣＩ又は他の塩それ
自体での或いは表面活性化合物例えばツウイーン（Ｔｗ
ｅｅｎ）、スパン（Ｓｐａｎ）又はプリズ（Ｂｒｉｊ）
と組合せての処理がバクテリヤ細胞からの酵素を分離す
るのに十分であることでも特徴づけられる（粗酵素抽出
物の製造）。

しかしながら粗酵素抽出物の製造における収率に対して
は発酵時令が決定的である。

第１表が示すように、塩及びツウイーンで処理後の細胞
を含まない上澄中のスクロース・ムターゼの、細胞懸濁
液の全活性に対する比は細胞培養物の時令と共に減少す
る。それ故に、細胞の温浸の量、酵素収率及び発酵経過
の間には決定的な関係がある。

第１表ニ プロタミノバクター・ルブラムの細胞の温浸塩溶液及び
表面活性剤での潤没後の、発酵時開力関数としての細胞
を含まない上澄（粗酵素抽出物）中のスクロース・ムタ
ーゼの収率。

参照因子：発酵溶液の容量活性（単位／１ｅｌ）＝１０
０％ ２　　　　　　　０、フ　　　　　　　　　　　　３１
４　　　　１．４　　　　　　　１０２６　　　　５．
６　　　　　　　７２ ８　　　　１４．４　　　　　　　７９１０　　　１４
．８　　　　　　　５５１２　　　１３．１　　　　　
　　３０本発明の方法は、特にスクロース・ムターゼの
粗抽出物の選択的結合を、０．２Ｍ以下の塩濃度、好ま
しくは１μＭ〜１０ｍＭにおいて４〜１２、好ましくは
５〜９のＤＨ範囲下に行なうことでも特徴づけられる。

それ故に粗酵素抽出物は有利には最初にシアフィルトレ
ージョンによる対応する塩の濃縮に供され、ＩＰｉの精
製とバイオ変換のために調整される。スルホン酸カチオ
ン交換マトリックスへの選択的結合も高パーセントの、
例えば４０〜６０％のスクロース溶液の存在下に行なう
ことができる。

本発明の方法はスルホン酸マトリックスに純イオン的又
は吸着的に結合するスクロース・ムターゼん制限されな
い、むしろ粗酵素抽出物から選択的に結合したスクロー
ス・ムターゼを、架橋剤、例えば多官能性アルデヒド例
えばグルグルアルデヒド或いはヘキサメチレンジアミン
／カルボッイミドでの処理によってスルホン酸マトリッ
クス上に安定化させることが有利である。

本発明の方法は、特に反応に必要とされる酵素スクロー
ス・ムターゼが微生物、中でもプロタミノバクター・ル
ブラム（ＤＳＭ２４１４号）、エルウィニア・カロトボ
ラ（ＡＴＣＣ２５２０６号）及びセラシフ・プリムシ力
（ＡＴＣＣ１５９２８号）によって生産されることでも
特徴づけられる。微生物（４１Ｉ種物の０．１〜１０．
０％）の、炭水化物、窒素及び無機塩を含有する栄養溶
液への接種及び最適条件下での培養後に、発酵を対数的
相の終了前に中断する。栄養溶液は例えば乾燥物質含量
が１〜２５％、好ましくは２〜７％の糖工場からの希１
１？Ｉｌ／濃縮液又は／及び希薄液／清澄化混合物から
なる。

更に細胞が対数的生長相の終了前にすでに塩溶液及び表
面活性剤で処理されでいるならば、スクロース・ムター
ゼの最適収量が達成されるということが発見された。静
置相又は熟成発酵汁への転化をすでに受けた発酵バッチ
はスクロース・ムターゼに関して有利な温浸性を示さな
い：塩溶液及び表面剤での処理後の細胞を含まない上澄
のスクロース・ムターゼ活性と温浸してない細胞の全活
性との比は看しく減少する（第１表）。

坑１　ａ、ＩＪ？ｌは本を朗の仝Ｔ稈の７０−チャート
を示す１発酵溶液は直接温浸しても、或いは例えば交流
ミクロ濾過で１：１０の比で濃縮し、次いで容量の減じ
た細胞懸濁液を用いて細胞の温浸をしてもよい、交流ミ
クロ濾過は例えばメンプラナ（Ｍ　ｅｍｂｒａｎａ）又
はミリボア（Ｍ　１ｌｌｉｐｏｒｅ）からの生成物を用
いて行なうことかで訃る。シアフィルトレージョンは、
７ミコン（Ａｍｉｃｏｎ）限外濾過装置、メンブレンＰ
Ｍ１００Ｏを用いることにより実験室規模で或いは分子
１６０００の膜排除のＤＤＳ系を用いることによりパイ
ロット規模で行なった。

イソマルツロースの酵素による連続式製造に対して第１
ｂ図に示した反応器配置は、発酵装置、交流ミクロ濾過
装置、シアフィルトレージョン装置及びスクロース・ム
ターゼの１段の同時的精製及び固定化に対して及び絖（
スクロースのイソマルツロースへのバイオ転化に対して
用いるバイオ反応器を含んでなる。

第１ｂ図においで、反応器は相対的大きさで示されてい
ない０種々の装置の容量はイソマルツロースの生産の必
要条件ニスクロースの生産量、パイオ反応器の生産性及
び必要とされるイソマルツロースの生産量に依存する。

要約すると、イソマルツロースを酵素によって製造する
ための本発明の連続法は従来開示された方法と比べて大
の利点を有するニ ー発酵から生成物イソマルツロースに至る方法の連続運
転が可能である； 一全工程の無菌運転にかなり有利である；−カルボキシ
レート、サルフェート、ホスフェート又は他の７ニオン
性担体物質、特に有利にはスルホン酸マトリックスへの
選択的結合によってスクロース・ムターゼの精製と固定
化が同時の工程で行なわれる； −ウェッブ形の７ニオン交換樹脂マトリツクス、特に放
射型バイオ反応器として巻かれたカー）　＋７ツノ形の
スルホン酸を含む架橋セルロースウェッブが高流速を可
能にする； −この方法で結合させたスクロース・ムターゼはバイオ
ｃ換反応のスクロース・イソマルツロース変換反応に直
接使用することができる；−放射型反応器は反応器の出
口へ向う酵素活性勾配に基づいて副成分の濃度を減する
効果をもつ。

実施例１ プロタミノバクター・ルブラム２１２種［ＤＳＭ２４１
４号Ｊの予備培養物からの細胞を、濃縮［（乾燥物質＝
７％）１部及び水道水１０部＋（ＮＨ４）２８　Ｐ　Ｏ
４０、５ｇ／　ｌの無水混合物１０曽ｌと共に懸濁した
。この懸濁液を、上記組成物の栄養溶液（１２１℃で２
０分間殺菌）２００ｍｌを含む１１のフラスコによる振
とう機での予備培養の接種物として用いた。３０℃で７
時間の培養時間後、３０１の小さい発酵話中の上記組成
の栄養溶液２０１に２つのフラスコ内容物（０，４１）
を接種し、空気２０１７分及び攪拌機運度３５０　ｒｐ
ｍで３０℃下に発酵を行なった。対数的相の終了の短期
間前、すなわち８時間後に培養物を冷却し、温浸した。

このために先ず発酵汁（スクロース・ムターゼ活性１４
．４単位／蘭Ｉｔ　）２０１を、ベリコン（Ｐｅｌｌｉ
ｃｏｎ）系のデュラポア（Ｄ　ｕｒａｐｏｒｅ）　フィ
ルター（Ｏ，Ｓμ１１）（ミリボア）を用い、交流ミク
ロ濾過により細胞懸濁ｔ（９３，７単位／１ｅｌ）約３
１まで濃縮した。

３０℃まで予しめ暖めた塩溶液０．５Ｍ　ＮａＣ１、Ｇ
、０５Ｍ燐酸カリウム、ｐＨ７，０、及びツウイーン２
０の１％からなる溶液３１を無菌フィルターを通して細
胞懸濁液３１に添加し、全懸濁液を室温で１６時間、発
酵話中において３Ｏｒｐｍで攪拌した。次いで全懸濁液
を無菌枦遇した脱イオン水２４１で希釈し、ポンプによ
りペリコン系を通過させて細胞及び細胞のかすを除去し
た。次いで枦？１ｌ（７，６単位／−りをポンプにより
貯蔵容器から他のペリコン系のポリスルホンｇｉｏ。

００（ミリボア）へ送入し、約３ｉに濃縮した０発酵器
を再び無菌の脱イオン水で３０１＊で満し、混合物をミ
クロ濾過に供し、そして貯蔵容器へ混合した後、炉液を
再びペリコン系のポリスルホン膜を通して３１まで濃縮
した６次いで１舖Ｍ燐酸カリウム、ｐＨ７，０、約６（
ｌを用いることにより貯蔵容器を通してノアフィルタレ
−ジョンを行ない、これによって生成物を所謂１１１９
した粗酵素抽出物（１７，６単位／鵠！、蛋白１．９＋
ｓｇ／曽ｊ　）９１まで希釈した。

この０．５１を直ぐにポンプにより２，０１７時の流速
でＡＭＦ−１００ＳＰ長円形筒に送入した。流出物では
、依然蛋白が１．９Ｂ／ｍｊ！であるが、蛋白０．５単
位／ｌａｇ以下が測定された。

即ちスクロース・ムターゼは粗酵素抽出物から殆んど選
択的にＡＭＦ長円形簡の架橋したスルホン酸ウェッブ上
に結合した。

無菌枦遇した５０％スクロース溶液を、室温下に６５ｓ
ｊ！／時の流速で、ポンプによりＡＭＦ長円形筒中を通
過させた。流出物にはス、クロース約１０〜１２％（全
糖の含量の％）が依然検出され、転化率は従って８０〜
９０％であった。連続運転の３日後に、先ずバイオ反応
器を連続的に２５℃、次いで３０℃にもって行った。そ
れぞれ２５℃及び３０℃において、転化率は非常に増大
し、５０％スクロース溶液の生産速度は１２０〜１４０
ｍｊｌ／時に増加した。この結果スクロースの転化率は
６５〜７５％間で変化した。

二の長期間の実験を第３図に示すが、これはスクロース
・ムターゼが、スクロースのイソマルツロースへの生物
変換に関して上述した放射型バイオ反応器において、記
述する運転条件下に約１ケ月間、高精製形で活性を保持
したまま使用できることを示す。

次いで貯ＩＩ容器中に冷条件下に貯蔵した粗酵素抽出物
（１７，６単位／−１）の更に２１をポンプによって上
記バイオ反応器へ供給した。流出物中には１．４単位／
ｍｌが測定できただけであり、斯くシて更に３２，００
０単位がスルホン酸ＡＭＦｉ円形簡に結合した。５０％
スクロース溶液及び約２１０〜２２０ｍＪ！／時の流速
を用いた時次の流出物の組成が得られた：イソマルツロ
ース８５．５％、１，１′−二線ｊｌ［１ｔ、０％、フ
ルクトース２．５％、及びグルコース１．０％、スクロ
ースは検知できなかった。

次いで粗酵素抽出物の残１）６．５１をポンプにより貯
蔵容器からバイオ反応器へ送入した。約１゜２単位／ｍ
Ａが結合せず、斯くしてバイオ反応器に更に１１０，０
００単位が負荷された。

このバイオ反応器を連続的に５日間、６１０鐘ｉ／時の
流速で運転し、次の生成物分布を測定した：イソマルツ
ロース８５．２％、１．１′−二ｒ類１０．２％、フル
クトース２．１％及びグルコース０．８％。

流速を７００ｍｆ／時に増加させる時、残存スクロース
３．２％、イソマルツロース８３．７％、１．１′−二
線類１０．２％、フルクトース２゜１％及びグルコース
０．６％が得られた。

９７％の転化率において、これは５０％スクロース溶液
からの約７反応器容量／時の一定の生産量を意味する。

バイオ反応器の負荷能力を決定するために、プロタミノ
バクター・ルブラムを接種した培養溶液２０１を再び発
酵させ（１５，６単位／ｌ１ｌ）、そして粗酵素抽出物
（２２，１単位／ｍ１）９Ｊを同一の条件下に製造し、
約１，３２１７時の流速で一部ずつバイオ反応器に通過
させた。

部分１　：２１　、流出物１．９単位／ｍ１．斯くして
４０，４００単位が結合、 部分２：２１．流出物１．５単位／齢！、斯くして４１
，２００単位が結合、 部分３：５１．流出物１．５単位／ｍｊｉ、斯くして１
０３，０００単位が結合。

独国公開特許第３，０３８，２１８号に示される実質的
に電気泳動的に純粋なスクロース・ムターゼ４５０単位
７ｍｌを基準にとると、これは約３３５．０００単位が
純粋なスクロース・ムターゼ約０．７５．に相当し、ま
た１００鋤！のバイオ反応器中において粗酵素抽出物か
らスルホン酸ＡＭＦウェッブ・マトリックスに選択的に
結合できたことを意味する。

実施例２ セラシア・プリムシカ（ＡＴＣＣ１５９２８号）の予備
培養物からの細胞を濃縮液溶液（乾燥物質含量５％、添
加（ＮＨ４）＊ＨＰＯ４０，５ｇ／ＪりＩＣ）ａｔに懸
濁させた。この懸濁液を、適当な組成の無菌栄養溶液２
００ｍｊ！を含む１１のフラスコ中における振どう機で
の予備培養に対する接種物として使用した。３０℃で１
５時間の培養時間の後、上記組成の栄養溶液１８ｆを３
０１の小さな発酵器においてそれぞれの場合１０のフラ
スコ（２１）で接種し、空気２０１７分及び攪拌速度３
５０ｒｐ−において発酵を行なった。対数的相の終了直
前、１０時間後に培養物を冷却した。

細胞の温浸、交流ミクロ濾過及びシアフィルトレージョ
ンの工程を実施例１と同様に行なった。

しかしながら塩溶液中のＮａＣｌの濃度は１モル濃度で
あった。

各工程に対するデータニア、１単位／ｌａ１の発酵汁２
０１．４４．７単位／ｗｒｌｌの濃縮物３１．３゜９単
位／　ｍ　１１　（Ｆ）　ｚ　り’濾過［３０１１０，
８単位／ｌｌｌ１（粗酵素抽出物）のシフフィルトレー
ジョンからの保留された物質１０１゜ ノアフィルトレージョン（１−Ｍ燐酸カリウム、ｐＨ７
，０）からの保留物質１１を、ポンプにより流速１，２
１／時でＡＭＦ−１００ＳＰ長円形筒上へ送った。流出
物において０．４５単位／１ａｌｌのスクロース・ムタ
ーゼ活性が測定された。５０％スクロース溶液（無菌濾
過したもの）からの連続的な生産において、生産速度９
０ｗ１／時、３０℃下にスクロースの転化率９４．５％
が測定できた。粗酵素抽出物の他の９１もポンプにより
１゜２１／時の流速でバイオ反応器に供給した。流出物
はスクロース・ムターゼ０．４単位／鋤ｌを有した。

実施例３ エルウィニア・カロトボラ（ＡＴＣＣ２５２０６号）の
予備培養物からの細胞を濃縮液溶液（乾燥１１＆ｌ質含
量５％、添加（ＮＨ−）２８Ｐ０４０．５ｇ／ｌ）１０
ｍｊ！に懸濁させた。この懸濁液を、適当な組成の無菌
栄養溶液２００鵬ｊ！を含む１１のフラスコ中における
振どう機での予備培養に対する接種物として使用した。

３０℃で１５時間の培養時間の後、上記組成の栄養溶液
１８１を３０１の小さな発酵器においてそれぞれの場合
１０のフラスコ（２１）で接種し、空気２０１／分及び
攪拌速度３５０ｒｐｍにおいて発酵を行なった。対数的
相の終了直前、１８時間後に培養物を冷却し、温浸させ
た。

３．９単位／ｍｌの活性（発酵溶液５．６単位／ｍｌ）
を有する全容量１０ｆの粗酵素抽出物のシアフィルトレ
ージョンから実施例２と同様にして得た保留物質を、ポ
ンプにより１．２１１７時の流速でＡＭＦ−１００ＳＰ
長円形簡に供給した。流出物はスクロース・ムターゼ０
．１５単位／−！を含有した。続く無菌濾過した５０％
スクロース溶液からの連続生産量において、１９０ｍ１
／時及び３０℃下に残存スクロースは２％（全線中含量
％）にすぎなかった。

第１ａ図は本発明の方法の７０−チャートである。

「調整された粗酵素抽出物」とは、スクロース・ムター
ゼを含有し且つアニオン化しうる担体マトリックスへの
選択的結合のための因子例えば塩濃度、伝導度及びｐＨ
値に調節した細胞を含まない培養物上澄液或いは対応す
るりアフイルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）
を意味する。

［放射型バイオ反応器］とは、第ａ及びｂ図と関連して
本明細書で説明される。

第１ｂ図はイソマルツロースの酵素による連続式製造の
ための反応器装置である。

この装置は４つの反応器の準装宜からなる：（Ａ）　　
発酵器 （Ｂ）　　交流ミクロ濾過に対する装置（Ｃ）　　シア
フィルトレージョンに対する装置ＣＤ）　　放射型バイ
オ反応器。

本発明による工程ａ）〜ｄ）は次のように装置に関して
分類される：ａ）及びｂ）は発酵器（Ａ）で行なわれ、
ｂ）は単位（Ｂ）で行なわれ、モしてＣ）及びｄ）は放
射型バイオ反応器（Ｄ）で行なわれる。シアフィルトレ
ージョン装置は粗酵素抽出物の調整に使用される。

装置の他の詳細は次の通りである： （１）無菌フィルター７フイルター◆キヤンドル（ｃ＋
ａｎｄｌｅ） （２）制御週間パルプ （３）供給方向を指示するポンプ （４）　シアフィルトレージョン用の貯蔵容器（５）、
（６）、（７）　発酵器の測定検知管、例えば圧力、温
度、ガス採取、液体用検知管 （８）　貯蔵容器への試料検知管 （９）、（１０）放射型バイオ反応器のサーモスタット
式供給及び放出口 （１，１）　　発酵器の無菌ばつ気を伴なう攪拌慨。

反応器装置の他の工程は次の通りである：ｅ）　連続的
殺菌、接種を経る栄養溶液の添加ｆ）　塩溶液例えばＮ
ａＣ１又はＫＣＩの添加ｇ）　表面活性剤の添加 ｈ）　調整溶液例えば１ｍＭ燐酸カリウムｐＨ７，０の
添加 ｉ）放射型バイオ反応器を通してのスクロース溶液から
の生産量及び ｋ）イソマルツロースの結晶化のための生成物流の除去 １）　放射型バイオ反応器の負荷後のスクロース・ムタ
ーゼを含まない粗酵素抽出物の放出−）　部分装置の水
蒸気での殺菌 第２ａ及びｂ図は放射型バイオ反応器の断面である。

酵素が選択的に負荷された膜様担体又はウェッブマトリ
ックスは、円筒形に巻かれている（２ａ）か或いは同心
円的に配列された円筒シー）（２ｂ）の形で使用される
０巻かれた形（２ａ）は同心円の理想的な形に近くて、
同心円のものよりも容易に作ることができる。しかしな
がら双方の場合、物質流は外側から円筒の釉に対する内
側方向へ放射的にウェッブ層を通過する０巻いた形は特
に流速が増大するにつれて同心円形に良好に近似する。

９３図はスクロース・ムターゼを用いる放射型バイオ反
応器におけるスクロースからの生産量及びその転化率及
び担体に結合した酵素の安定性を示す（参照実施例１）
、但し縦紬： Δ−Δ：残存スクロース％ ○−○：流速−！／時 ・−・：イソマルツロースｋｇ／日 横軸の時間は日で示しである。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図は本発明の方法の７０−チャートであり、ｖｉ
ｌｂ図はインマルッロースの酵素によル連続式製造の反
応器装置であり、ＭＳ２　ｍ及びｂ図は放射型バイオ反
応器の断面図であり、そして第３図は放射型バイオ反応
器の運転結果である。 ＦＩＧ、　Ｉａ ：ｆ４卜木 ＦＩＧ、　２ｂ Ｌ％４＆ｌ’１．　　　　　　　−　　　　　　　−　
　　　　　〇−〇

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、無菌条件下に運転できる反応器系において、 ａ）スクロース・ムターゼを生成する微生物の発酵によ
   ってスクロース・ムターゼを製造し、但し対数的生長相
   の終了前にこの細胞は塩溶液と表面活性試薬ですでに処
   理してある、 ｂ）細胞の潤浸及び交流ミクロろ過により、それ自体公
   知の方法によって細胞を含まない粗酵素抽出物を製造し
   、 ｃ）この粗抽出物からのスクロース・ムターゼを、アニ
   オン化しうる担体マトリツクスへの選択的な結合によっ
   て、同時に精製し且つ固定化し、そして ｄ）このようにして得たマトリックスをスクロースと接
   触させる、 イソマルツロースの酵素による連続式製造法。 ２、スルホン酸カチオン交換樹脂マトリックスを工程ｃ
   ）に用いる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、工程ｃ）を０．２Ｍ以下、好ましくは１μＭ〜１０
   ｍＭの塩濃度下に４〜１２のｐＨ範囲で行なう特許請求
   の範囲第１または２項記載の方法。 ４、工程ｂ）を、ｐＨ範囲４〜１２及び塩溶液０．１〜
   ３．０Ｍにおいて、好ましくはアルカリ金属塩化物の存
   在下に、発酵溶液を処理することによって行なう特許請
   求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５、工程ｂ）を、０．１〜５．０％（重量／容量）の濃
   度範囲の表面活性剤の存在下に行なう特許請求の範囲第
   ４項記載の方法。 ６、２官能性重合体によって架橋され且つビニル重合体
   を経て結合する官能性スルホン酸基を有するカートリッ
   ジ形又は長円形筒のセルロースウエツブを、スルホン酸
   交換樹脂マトリックスとして使用し、この担体材料はセ
   ルロースウエツブの層間に空間を有して或いは有さずに
   円筒形に巻き上げられ且つ物質が外側が内側へ放射的に
   通流しうるようなものである特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ７、工程ａ）においてプロタミノバクター・ルブラムを
   発酵させることによるそれ自体公知の方法で酵素スクロ
   ース・ムターゼを製造する特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ８、工程ａ）においてセラシア・プリムシカを発酵させ
   ることによるそれ自体公知の方法で酵素スクロース・ム
   ターゼを製造する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、工程ａ）においでエルウイニア属の微生物を発酵さ
   せるそれ自体公知の方法で酵素スクロース・ムターゼを
   製造する特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、ｐＨ範囲４〜８、好ましくは４．５〜７．５、ス
   クロース溶液濃度１０〜７０％、好ましくは３０〜６０
   ％、及び温度範囲１０〜４０℃、好ましくは２５〜３５
   ℃において、それ自体公知の方法で工程ｄ）を行なう特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、酵素の固定化のための放射型反応器の使用法及び
   バイオ変換反応のためのそのように調製した放射型バイ
   オ反応器の使用法。