JPH0829110B2 - イソマルツロ−スの酵素による連続式製造法 - Google Patents
イソマルツロ−スの酵素による連続式製造法Info
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- JPH0829110B2 JPH0829110B2 JP61093530A JP9353086A JPH0829110B2 JP H0829110 B2 JPH0829110 B2 JP H0829110B2 JP 61093530 A JP61093530 A JP 61093530A JP 9353086 A JP9353086 A JP 9353086A JP H0829110 B2 JPH0829110 B2 JP H0829110B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はイソマルツロースの酵素による連続式製造法
に関する。
に関する。
今回、無菌条件下に運転できる反応器系において、 ａ）スクロース・ムターゼを生成する微生物の発酵によ
ってスクロース・ムターゼを製造し、但し対数的生長相
の終了前にこの細胞を塩溶液と表面活性試薬ですでに処
理してあり、 ｂ）細胞の消化及び交流ミクロ過による公知の方法に
よって細胞を含まない粗酵素抽出物を製造し、 ｃ）この粗抽出物からのスクロース・ムターゼを、アニ
オン化しうる担体マトリツクスへの選択的な結合によっ
て、同時に精製且つ固定化し、そして ｄ）このようにして得たマトリツクスをスクロースと接
触させる、 イソマルツロースの酵素による連続式製造法が発見され
た。
ってスクロース・ムターゼを製造し、但し対数的生長相
の終了前にこの細胞を塩溶液と表面活性試薬ですでに処
理してあり、 ｂ）細胞の消化及び交流ミクロ過による公知の方法に
よって細胞を含まない粗酵素抽出物を製造し、 ｃ）この粗抽出物からのスクロース・ムターゼを、アニ
オン化しうる担体マトリツクスへの選択的な結合によっ
て、同時に精製且つ固定化し、そして ｄ）このようにして得たマトリツクスをスクロースと接
触させる、 イソマルツロースの酵素による連続式製造法が発見され
た。
独国特許第1,049,800号によると、スクロースは微生
物起源の酵素によってイソマルツロースに転化される。
プロタミノバクター・ルブラム（Protaminobacter rubr
um）の他に、他のバクテリア例えばエルウイニア・カロ
トボラ（Erwinia carotovora）、霊菌（Serratia marce
scens）、セラシア・プリムシカ（Serratia plymuthic
a）及びロイコノストク・メセンテロイデス（Leuconost
oc mesenteroides）はこの転位反応を行なう［S.シユミ
ツト（Schmidt）−ベルグ（Berg）−ロレンツ（Lorent
z）、W.マウフ（Mauch）、Z.ツツカーインダストリー
（Zuckerindustrie），14,625〜627（1964）;F.H.スト
ドラ（Stodola）,126回米国化学会年会,1954年９月，ア
ブストラクツ・オブ・ペーパーズ（Abstr.of Papers）,
S.D5;W.マウフ,S.シユミツトーベルグーロレンツ,Z.ツ
ツカーインダストリー，14,309〜315及び375〜383（196
4）］。
物起源の酵素によってイソマルツロースに転化される。
プロタミノバクター・ルブラム（Protaminobacter rubr
um）の他に、他のバクテリア例えばエルウイニア・カロ
トボラ（Erwinia carotovora）、霊菌（Serratia marce
scens）、セラシア・プリムシカ（Serratia plymuthic
a）及びロイコノストク・メセンテロイデス（Leuconost
oc mesenteroides）はこの転位反応を行なう［S.シユミ
ツト（Schmidt）−ベルグ（Berg）−ロレンツ（Lorent
z）、W.マウフ（Mauch）、Z.ツツカーインダストリー
（Zuckerindustrie），14,625〜627（1964）;F.H.スト
ドラ（Stodola）,126回米国化学会年会,1954年９月，ア
ブストラクツ・オブ・ペーパーズ（Abstr.of Papers）,
S.D5;W.マウフ,S.シユミツトーベルグーロレンツ,Z.ツ
ツカーインダストリー，14,309〜315及び375〜383（196
4）］。
これに基づけば、イソマルツロースの微生物又は酵素
による種々の製造法が開示されている。
による種々の製造法が開示されている。
例えばヨーロッパ特許第1,009号は、スクロースのイ
ソマルツロースへの同時的転化を伴なう微生物の連続式
発酵法を記述している。米国特許第4,386,158号、独国
公開特許第3,038,219号及びヨーロツパ特許第28,900号
は、固定化した微生物を用いるイソマルツロースの種々
の製造法を記述している。
ソマルツロースへの同時的転化を伴なう微生物の連続式
発酵法を記述している。米国特許第4,386,158号、独国
公開特許第3,038,219号及びヨーロツパ特許第28,900号
は、固定化した微生物を用いるイソマルツロースの種々
の製造法を記述している。
独国公開特許第3,038,218号には、最初に酵素スクロ
ース・ムターゼが記述され且つ特徴づけられ、その固定
化とイソマルツロースの製造のための使用法が記録され
ている。
ース・ムターゼが記述され且つ特徴づけられ、その固定
化とイソマルツロースの製造のための使用法が記録され
ている。
これによると、酵素スクロース・ムターゼの単離を多
段式によるバツチ式として記述し、続く固定化を別の反
応工程として記述している。特にこれで使用されるCM−
セフアデツクスでのクロマトグラフイーは時間のかかる
工程である。また発酵工程、細胞の潤浸、酵素の精製及
び精製した酵素の固定化は一連のだらだらした工程で行
なわれ、更にこれらは細菌のない条件で行なう困難さが
伴なう。
段式によるバツチ式として記述し、続く固定化を別の反
応工程として記述している。特にこれで使用されるCM−
セフアデツクスでのクロマトグラフイーは時間のかかる
工程である。また発酵工程、細胞の潤浸、酵素の精製及
び精製した酵素の固定化は一連のだらだらした工程で行
なわれ、更にこれらは細菌のない条件で行なう困難さが
伴なう。
従来記述されている方法は、発酵から最終生成物のイ
ソマルツロースに至るまでバツチ式によってのみ行なう
ことのできる固定化微生物による或いは固定化スクロー
ス・ムターゼによるイソマルツロースの無殺菌製造法で
ある。
ソマルツロースに至るまでバツチ式によってのみ行なう
ことのできる固定化微生物による或いは固定化スクロー
ス・ムターゼによるイソマルツロースの無殺菌製造法で
ある。
これに対し、本発明による方法は、無菌条件下に運転
される反応器系において、スクロース・ムターゼを生成
する微生物の発酵によるペリプラズマ性の（periplasma
tic）スクロース・ムターゼの生成、細胞の消化による
及び交流ミクロ過（cross−flowmicrofiltration）に
よる細胞を含まない粗酵素の製造、スクロース・ムター
ゼの、ジアフイルトレーシヨン（diafiltration）によ
って調整した細胞を含まない粗抽出物からの、アニオン
化しうる担体マトリツクスへの選択的結合によるスクロ
ース・ムターゼの同時的精製と固定、そして好ましくは
カートリツジ形又は長円形筒の対応するアニオン化しう
る担体マトリツクスへ結合させたスクロース・ムターゼ
によるスクロースのイソマルツロースへの直接的転化、
からなる連続法である。
される反応器系において、スクロース・ムターゼを生成
する微生物の発酵によるペリプラズマ性の（periplasma
tic）スクロース・ムターゼの生成、細胞の消化による
及び交流ミクロ過（cross−flowmicrofiltration）に
よる細胞を含まない粗酵素の製造、スクロース・ムター
ゼの、ジアフイルトレーシヨン（diafiltration）によ
って調整した細胞を含まない粗抽出物からの、アニオン
化しうる担体マトリツクスへの選択的結合によるスクロ
ース・ムターゼの同時的精製と固定、そして好ましくは
カートリツジ形又は長円形筒の対応するアニオン化しう
る担体マトリツクスへ結合させたスクロース・ムターゼ
によるスクロースのイソマルツロースへの直接的転化、
からなる連続法である。
特にウエツブ・マトリツクス形のスルホン酸カチオン
交換樹脂の使用は、非常に高流速において粗酵素抽出物
からのスクロース・ムターゼの例外的に選択的な結合を
可能にし、従って１段で酵素を精製する。このスクロー
ス・ムターゼを、スクロースのイソマルツロースへの転
化のバイオ触媒として用いる場合には、酵素を最早やカ
チオン交換樹脂から流出させ、濃縮する必要がない。ア
ニオン化しうる担体マトリツクス、特にスルホン酸カチ
オン交換樹脂は、バイオ反応器としての操作が活性の損
失なしに長期にわたって可能であるというふうにスクロ
ース・ムターゼをしっかり結合させる。
交換樹脂の使用は、非常に高流速において粗酵素抽出物
からのスクロース・ムターゼの例外的に選択的な結合を
可能にし、従って１段で酵素を精製する。このスクロー
ス・ムターゼを、スクロースのイソマルツロースへの転
化のバイオ触媒として用いる場合には、酵素を最早やカ
チオン交換樹脂から流出させ、濃縮する必要がない。ア
ニオン化しうる担体マトリツクス、特にスルホン酸カチ
オン交換樹脂は、バイオ反応器としての操作が活性の損
失なしに長期にわたって可能であるというふうにスクロ
ース・ムターゼをしっかり結合させる。
カートリツジ又は長円形筒形のスルホン酸マトリツク
ス、例えばAMF、モレキユラー・セパレーシヨン・デイ
ビジン（Molecular Separation Division,Meriden,CT,U
SA）からの種々の市販形ゼタプレプ（Zetaprep）100−S
P 又はゼタプレプ3000−SP の使用は特に有利であ
る。これは紙シートに加工でき且つカートリツジ形に巻
けるスルホン酸含有の架橋セルロースである。
ス、例えばAMF、モレキユラー・セパレーシヨン・デイ
ビジン（Molecular Separation Division,Meriden,CT,U
SA）からの種々の市販形ゼタプレプ（Zetaprep）100−S
P 又はゼタプレプ3000−SP の使用は特に有利であ
る。これは紙シートに加工でき且つカートリツジ形に巻
けるスルホン酸含有の架橋セルロースである。
種々の製造業者からのアニオン性の無菌フイルターカ
ートリツジ例えばポール（Pall）からのウルチポア（Yl
tipor）GF フイルター媒体も同様の方法で使用でき
る。この場合ガラス繊維物質は高度に負に荷電した官能
基を有する樹脂によって内包されている。
ートリツジ例えばポール（Pall）からのウルチポア（Yl
tipor）GF フイルター媒体も同様の方法で使用でき
る。この場合ガラス繊維物質は高度に負に荷電した官能
基を有する樹脂によって内包されている。
しかしながら市販の無菌フイルターカートリツジは、
クロマトグラフイーの目的で市場にもたらされたAMFゼ
タプレプ−SP 系と比較して、折りたたまれた膜又はウ
エツブであり、物質流は膜又はウエツブの１層だけを通
過する。これに対して円筒形に巻かれたウエツブ又は膜
シート、本発明の方法の好適な態様に特徴的なそれの場
合には、物質流は円筒の軸に放射的に多くのウエツブ又
は膜層を通過しうる。
クロマトグラフイーの目的で市場にもたらされたAMFゼ
タプレプ−SP 系と比較して、折りたたまれた膜又はウ
エツブであり、物質流は膜又はウエツブの１層だけを通
過する。これに対して円筒形に巻かれたウエツブ又は膜
シート、本発明の方法の好適な態様に特徴的なそれの場
合には、物質流は円筒の軸に放射的に多くのウエツブ又
は膜層を通過しうる。
スクロース・ムターゼの粗抽出物からの選択的単離に
おいて可能な高流速も、高パーセントのスクロース溶液
を用いて反応器を運転するのに有利である。これはスク
ロース・ムターゼのバイオ反応器の高生産性に対する予
備条件の１つである。
おいて可能な高流速も、高パーセントのスクロース溶液
を用いて反応器を運転するのに有利である。これはスク
ロース・ムターゼのバイオ反応器の高生産性に対する予
備条件の１つである。
発酵工程、細胞の潤浸、１段の同時的処理及び固定化
法及び生物変換工程の組合せは、従って細菌のない条件
下に非常に簡単な方法で運転することのできるイソマル
ツロースの酵素による連続式全製造法を可能にする（第
1a,b図）。
法及び生物変換工程の組合せは、従って細菌のない条件
下に非常に簡単な方法で運転することのできるイソマル
ツロースの酵素による連続式全製造法を可能にする（第
1a,b図）。
本発明の方法によって特に有利に具現化される無菌条
件下に運転されるイソマルツロースの酵素による全製造
法は、細菌のバイオ反応器中への侵入を、従って基質ス
クロースからの副生物の生成を防止する。このような副
生物は普通有機酸であり、この微生物の代謝生成物はバ
イオ反応器のpH値を減少させ、従ってスクロース・ムタ
ーゼを不活性化する。
件下に運転されるイソマルツロースの酵素による全製造
法は、細菌のバイオ反応器中への侵入を、従って基質ス
クロースからの副生物の生成を防止する。このような副
生物は普通有機酸であり、この微生物の代謝生成物はバ
イオ反応器のpH値を減少させ、従ってスクロース・ムタ
ーゼを不活性化する。
スクロース・ムターゼは40℃よりも高温の場合非常に
短期間で触媒活性を失ない、斯くしてオートクレーブ処
理は殺菌法として不向きである。細菌の死滅に対する多
くの殺バクテリア剤又は殺菌剤の使用は、生成物のイソ
マルツロースを糖代替物として使用するから、非常に費
用のかかる生成物の精製と関連する分析とを必要とす
る。
短期間で触媒活性を失ない、斯くしてオートクレーブ処
理は殺菌法として不向きである。細菌の死滅に対する多
くの殺バクテリア剤又は殺菌剤の使用は、生成物のイソ
マルツロースを糖代替物として使用するから、非常に費
用のかかる生成物の精製と関連する分析とを必要とす
る。
カチオン交換樹脂マトリツクスがスルホン酸官能基を
高濃度で有するならばそれは特に有利である。実施例１
によると、1g以上の純粋なスクロース・ムターゼを１つ
のAMFゼタプレプ100−SP 上に結合させることが可能で
ある。例えば製造業者の仕様によれば、ゼタプレプ100
−DEAE ユニツトの能力は牛の血清アルブミン４〜6gで
ある［AMF社、1984年11月30日、LC10.10］。従って多分
同様にしてスクロース・ムターゼに対する能力の上限は
ゼタプレプ100−SP 当り約4gである。
高濃度で有するならばそれは特に有利である。実施例１
によると、1g以上の純粋なスクロース・ムターゼを１つ
のAMFゼタプレプ100−SP 上に結合させることが可能で
ある。例えば製造業者の仕様によれば、ゼタプレプ100
−DEAE ユニツトの能力は牛の血清アルブミン４〜6gで
ある［AMF社、1984年11月30日、LC10.10］。従って多分
同様にしてスクロース・ムターゼに対する能力の上限は
ゼタプレプ100−SP 当り約4gである。
製品AMFゼタプレプ の場合、蛋白含有水溶液のクロ
マトグラフイーに対する最高流速としては約30反応器容
量／時が示されている［AMF社、1983年９月28日、LC10.
1G］。
マトグラフイーに対する最高流速としては約30反応器容
量／時が示されている［AMF社、1983年９月28日、LC10.
1G］。
実施例１によれば、実験室に通常のぜん動式ポンプを
用いる場合、50％スクロース溶液からの生産量において
７反応器容量／時が達成された。より高性能のポンプ、
例えば製糖業でしばしば使用されるはめば（cog whee
l）式ポンプを用いると、増大した供給が可能であり、
高い酵素負荷が利用できる。
用いる場合、50％スクロース溶液からの生産量において
７反応器容量／時が達成された。より高性能のポンプ、
例えば製糖業でしばしば使用されるはめば（cog whee
l）式ポンプを用いると、増大した供給が可能であり、
高い酵素負荷が利用できる。
一般に触媒反応に対しては、反応器容量をできる限り
小さく、即ち例えば粒状形の固定化されたバイオ触媒の
固定床容量に保つことはかなり重要である。これ単位容
量当り高活性の、高負荷密度の又は高活性密度のバイオ
触媒を必要とする。
小さく、即ち例えば粒状形の固定化されたバイオ触媒の
固定床容量に保つことはかなり重要である。これ単位容
量当り高活性の、高負荷密度の又は高活性密度のバイオ
触媒を必要とする。
この結果、より小さい反応器装置での生産が可能とな
り、従ってかなりの建設、エネルギー及び維持費が節約
となる。
り、従ってかなりの建設、エネルギー及び維持費が節約
となる。
本発明の方法に基づけば、50％スクロース溶液を用い
る場合、スクロースのイソマルツロースへの転化に対し
て５〜10反応器容量／時の生成物流が達成できる（実施
例１）。比較すると、固定化された細胞を用いて可能な
生成物流は0.5〜1.0反応器容量／時程度である。
る場合、スクロースのイソマルツロースへの転化に対し
て５〜10反応器容量／時の生成物流が達成できる（実施
例１）。比較すると、固定化された細胞を用いて可能な
生成物流は0.5〜1.0反応器容量／時程度である。
それ故に本発明の方法はバイオ変換反応において放射
型バイオ反応器を使用することを含む。第2a及びｂ図が
示すように、基質流は円筒形反応容器中のセルロースウ
エツブのいくつかの巻きを通して放射的に円筒形の軸方
向、即ち放出方向へ向う。この時これがセルロースウエ
ツブを通流する時、巻き当りの面積勾配及び全ウエツブ
表面上での滞留時間勾配が生ずる。
型バイオ反応器を使用することを含む。第2a及びｂ図が
示すように、基質流は円筒形反応容器中のセルロースウ
エツブのいくつかの巻きを通して放射的に円筒形の軸方
向、即ち放出方向へ向う。この時これがセルロースウエ
ツブを通流する時、巻き当りの面積勾配及び全ウエツブ
表面上での滞留時間勾配が生ずる。
セルロースウエツブを通流する速度は一番外側の巻き
から一番内側の巻きへと増大する；同時に巻き取りのウ
エツブ表面は減少する。酵素を均一に仕込む時、一番内
側の巻きに向って巻き取りの酵素の量は減少する。斯く
して物質流の滞留時間は、低転化率に対して、即ち低生
成物濃度及び高基質濃度に対してよりも高転化率に対し
て、即ち高生成物濃度及び低基質濃度において低い。こ
れは生成するグルコース、フルクトース、1,1′−二糖
類及びオリゴ糖類の助けを借りるスクロース・ムターゼ
触媒によるスクロースのイソマルツロースへの転化にお
いて観察されるような酵素起源の副生物の生成を減少さ
せる。
から一番内側の巻きへと増大する；同時に巻き取りのウ
エツブ表面は減少する。酵素を均一に仕込む時、一番内
側の巻きに向って巻き取りの酵素の量は減少する。斯く
して物質流の滞留時間は、低転化率に対して、即ち低生
成物濃度及び高基質濃度に対してよりも高転化率に対し
て、即ち高生成物濃度及び低基質濃度において低い。こ
れは生成するグルコース、フルクトース、1,1′−二糖
類及びオリゴ糖類の助けを借りるスクロース・ムターゼ
触媒によるスクロースのイソマルツロースへの転化にお
いて観察されるような酵素起源の副生物の生成を減少さ
せる。
実施例１から理解できるように、スクロースの転化が
完結した場合、グルコース（約1.0％）及びフルクトー
ス（約2.0％）の濃度は、他に固定化されたスクロース
・ムターゼを用いるバツチ法（参照、独国公開特許第3,
038,218号）と比べて低い。これは本発明の方法の他の
利点である。
完結した場合、グルコース（約1.0％）及びフルクトー
ス（約2.0％）の濃度は、他に固定化されたスクロース
・ムターゼを用いるバツチ法（参照、独国公開特許第3,
038,218号）と比べて低い。これは本発明の方法の他の
利点である。
本発明の方法は、特にNaCl、KCl又は他の塩それ自体
での或いは表面活性化合物例えばツウイーン（Twee
n）、スパン（Span）又はブリズ（Brij）と組合せての
処理がバクテリヤ細胞からの酵素を分離するのに十分で
あることでも特徴づけられる（粗酵素抽出物の製造）。
での或いは表面活性化合物例えばツウイーン（Twee
n）、スパン（Span）又はブリズ（Brij）と組合せての
処理がバクテリヤ細胞からの酵素を分離するのに十分で
あることでも特徴づけられる（粗酵素抽出物の製造）。
しかしながら粗酵素抽出物の製造における収率に対し
ては発酵時令が決定的である。
ては発酵時令が決定的である。
第１表が示すように、塩及びツウイーンで処理後の細
胞を含まない上澄中のスクロース・ムターゼの、細胞懸
濁液の全活性に対する比は細胞培養物の時令と共に減少
する。それ故に、細胞の消化の量、酵素収率及び発酵経
過の間には決定的な関係がある。
胞を含まない上澄中のスクロース・ムターゼの、細胞懸
濁液の全活性に対する比は細胞培養物の時令と共に減少
する。それ故に、細胞の消化の量、酵素収率及び発酵経
過の間には決定的な関係がある。
第１表： プロタミノバクター・ルブラムの細胞の潤浸塩溶液及
び表面活性剤での消化後の、発酵時間の関数としての細
胞を含まない上澄（粗酵素抽出物）中のスクロース・ム
ターゼの収率。
び表面活性剤での消化後の、発酵時間の関数としての細
胞を含まない上澄（粗酵素抽出物）中のスクロース・ム
ターゼの収率。
参照因子：発酵溶液の容量活性（単位/ml）＝100％ 本発明の方法は、特にスクロース・ムターゼの粗抽出
物の選択的結合を、0.2M以下の塩濃度、好ましくは１μ
Ｍ〜10mMにおいて４〜12、好ましくは５〜９のpH範囲下
に行なうことでも特徴づけられる。それ故に粗酵素抽出
物は有利には最初にジアフイルトレーシヨンによる対応
する塩の濃縮に供され、１段の精製とバイオ変換のため
に調整される。スルホン酸カチオン交換マトリツクスへ
の選択的結合も高パーセントの、例えば40〜60％のスク
ロース溶液の存在下に行なうことができる。
物の選択的結合を、0.2M以下の塩濃度、好ましくは１μ
Ｍ〜10mMにおいて４〜12、好ましくは５〜９のpH範囲下
に行なうことでも特徴づけられる。それ故に粗酵素抽出
物は有利には最初にジアフイルトレーシヨンによる対応
する塩の濃縮に供され、１段の精製とバイオ変換のため
に調整される。スルホン酸カチオン交換マトリツクスへ
の選択的結合も高パーセントの、例えば40〜60％のスク
ロース溶液の存在下に行なうことができる。
本発明の方法はスルホン酸マトリツクスに純イオン的
又は吸着的に結合するスクロース・ムターゼん制限され
ない。むしろ粗酵素抽出物から選択的に結合したスクロ
ース・ムターゼを、架橋剤、例えば多官能性アルデヒド
例えばグルタルアルデヒド或いはヘキサメチレンジアミ
ン／カルボジイミドでの処理によってスルホン酸マトリ
ツクス上に安定化させることが有利である。
又は吸着的に結合するスクロース・ムターゼん制限され
ない。むしろ粗酵素抽出物から選択的に結合したスクロ
ース・ムターゼを、架橋剤、例えば多官能性アルデヒド
例えばグルタルアルデヒド或いはヘキサメチレンジアミ
ン／カルボジイミドでの処理によってスルホン酸マトリ
ツクス上に安定化させることが有利である。
本発明の方法は、特に反応に必要とされる酵素スクロ
ース・ムターゼが微生物、中でもプロタミノバクター・
ルブラム（DSM 2414号）、エルウイニア・カロトボラ
（ATCC 25206号）及びセラシア・プリムシカ（ATCC 159
28号）によって生産されることでも特徴づけられる。微
生物（接種物の0.1〜10.0％）の、炭水化物、窒素及び
無機塩を含有する栄養溶液への接種及び最適条件下での
培養後に、発酵を対数的相の終了前に中断する。栄養溶
液は例えば乾燥物質含量が１〜25％、好ましくは２〜７
％の糖工場からの希薄液／濃縮液又は／及び希薄液／清
澄化混合物からなる。
ース・ムターゼが微生物、中でもプロタミノバクター・
ルブラム（DSM 2414号）、エルウイニア・カロトボラ
（ATCC 25206号）及びセラシア・プリムシカ（ATCC 159
28号）によって生産されることでも特徴づけられる。微
生物（接種物の0.1〜10.0％）の、炭水化物、窒素及び
無機塩を含有する栄養溶液への接種及び最適条件下での
培養後に、発酵を対数的相の終了前に中断する。栄養溶
液は例えば乾燥物質含量が１〜25％、好ましくは２〜７
％の糖工場からの希薄液／濃縮液又は／及び希薄液／清
澄化混合物からなる。
更に細胞が対数的生長相の終了前にすでに塩溶液及び
表面活性剤で処理されているならば、スクロース・ムタ
ーゼの最適収量が達成されるということが発見された。
静置相又は熟成発酵汁への転化をすでに受けた発酵バツ
チはスクロース・ムターゼに関して有利な潤浸性を示さ
ない：塩溶液及び表面剤での処理後の細胞を含まない上
澄のスクロース・ムターゼ活性と消化してない細胞の全
活性との比は著しく減少する（第１表）。
表面活性剤で処理されているならば、スクロース・ムタ
ーゼの最適収量が達成されるということが発見された。
静置相又は熟成発酵汁への転化をすでに受けた発酵バツ
チはスクロース・ムターゼに関して有利な潤浸性を示さ
ない：塩溶液及び表面剤での処理後の細胞を含まない上
澄のスクロース・ムターゼ活性と消化してない細胞の全
活性との比は著しく減少する（第１表）。
第1a,b図は本発明の全工程のフローチヤートを示す。
発酵溶液は直接消化しても、或いは例えば交流ミクロ
過で1:10の比で濃縮し、次いで容量の減じた細胞懸濁液
を用いて細胞の消化をしてもよい。交流ミクロ過は例
えばメンブラナ（Membrana）又はミリポア（Millipor
e）からの生成物を用いて行なうことができる。ジアフ
イルトレーシヨンは、アミコン（Amicon）限外過装
置、メンブレンPM1000を用いることにより実験室規模で
或いは分子量6000の膜排除のDDS系を用いることにより
パイロツト規模で行なった。
発酵溶液は直接消化しても、或いは例えば交流ミクロ
過で1:10の比で濃縮し、次いで容量の減じた細胞懸濁液
を用いて細胞の消化をしてもよい。交流ミクロ過は例
えばメンブラナ（Membrana）又はミリポア（Millipor
e）からの生成物を用いて行なうことができる。ジアフ
イルトレーシヨンは、アミコン（Amicon）限外過装
置、メンブレンPM1000を用いることにより実験室規模で
或いは分子量6000の膜排除のDDS系を用いることにより
パイロツト規模で行なった。
イソマルツロースの酵素による連続式製造に対して第
1b図に示した反応器配置は、発酵装置、交流ミクロ過
装置、ジアフイルトレーシヨン装置及びスクロース・ム
ターゼの１段の同時的精製及び固定化に対して及び続く
スクロースのイソマルツロースへのバイオ転化に対して
用いるバイオ反応器を含んでなる。
1b図に示した反応器配置は、発酵装置、交流ミクロ過
装置、ジアフイルトレーシヨン装置及びスクロース・ム
ターゼの１段の同時的精製及び固定化に対して及び続く
スクロースのイソマルツロースへのバイオ転化に対して
用いるバイオ反応器を含んでなる。
第1b図において、反応器は相対的大きさで示されてい
ない。種々の装置の容量はイソマルツロースの生産の必
要条件：スクロースの生産量、バイオ反応器の生産性及
び必要とされるイソマルツロースの生産量に依存する。
ない。種々の装置の容量はイソマルツロースの生産の必
要条件：スクロースの生産量、バイオ反応器の生産性及
び必要とされるイソマルツロースの生産量に依存する。
要約すると、イソマルツロースを酵素によって製造す
るための本発明の連続法は従来開示された方法と比べて
次の利点を有する： −発酵から生成物イソマルツロースに至る方法の連続
運転が可能である； −全工程の無菌運転にかなり有利である； −カルボキシレート、サルフエート、ホスフエート又
は他のアニオン性担体物質、特に有利にはスルホン酸マ
トリツクスへの選択的結合によってスクロース・ムター
ゼの精製と固定化が同時の工程で行なわれる； −ウエツブ形のアニオン交換樹脂マトリツクス、特に
放射型バイオ反応器として巻かれたカートリツジ形のス
ルホン酸を含む架橋セルロースウエツブが高流速を可能
にする； −この方法で結合させたスクロース・ムターゼはバイ
オ変換反応のスクロース・イソマルツロース変換反応に
直接使用することができる； −放射型反応器は反応器の出口へ向う酵素活性勾配に
基づいて副成分の濃度を減ずる効果をもつ。
るための本発明の連続法は従来開示された方法と比べて
次の利点を有する： −発酵から生成物イソマルツロースに至る方法の連続
運転が可能である； −全工程の無菌運転にかなり有利である； −カルボキシレート、サルフエート、ホスフエート又
は他のアニオン性担体物質、特に有利にはスルホン酸マ
トリツクスへの選択的結合によってスクロース・ムター
ゼの精製と固定化が同時の工程で行なわれる； −ウエツブ形のアニオン交換樹脂マトリツクス、特に
放射型バイオ反応器として巻かれたカートリツジ形のス
ルホン酸を含む架橋セルロースウエツブが高流速を可能
にする； −この方法で結合させたスクロース・ムターゼはバイ
オ変換反応のスクロース・イソマルツロース変換反応に
直接使用することができる； −放射型反応器は反応器の出口へ向う酵素活性勾配に
基づいて副成分の濃度を減ずる効果をもつ。
実施例１ プロタミノバクター・ルブラムZ12種［DSM 2414号］
の予備培養物からの細胞を、濃縮液（乾燥物質＝７％）
１部及び水道水10部＋(NH4)2HPO40.5g/lの無水混合物10
mlと共に懸濁した。この懸濁液を、上記組成物の栄養溶
液（121℃で20分間殺菌）200mlを含む１のフラスコに
よる振とう機での予備培養の接種物として用いた。30℃
で７時間の培養時間後、30lの小さい発酵器中の上記組
成の栄養溶液20lに２つのフラスコ内容物（0.4l）を接
種し、空気20l/分及び攪拌機速度350rpmで30℃下に発酵
を行なった。対数期の終了の短期間前、すなわち８時間
後に培養物を冷却し、消化した。このために先ず発酵汁
（スクロース・ムターゼ活性14.4単位/ml）20lを、ペリ
コン（Pellicon）系のデユラポア（Durapore）フイルタ
ー（0.5μｍ）（ミリポア）を用い、交流ミクロ過に
より細胞懸濁液（93.7単位/ml）約3lまで濃縮した。
の予備培養物からの細胞を、濃縮液（乾燥物質＝７％）
１部及び水道水10部＋(NH4)2HPO40.5g/lの無水混合物10
mlと共に懸濁した。この懸濁液を、上記組成物の栄養溶
液（121℃で20分間殺菌）200mlを含む１のフラスコに
よる振とう機での予備培養の接種物として用いた。30℃
で７時間の培養時間後、30lの小さい発酵器中の上記組
成の栄養溶液20lに２つのフラスコ内容物（0.4l）を接
種し、空気20l/分及び攪拌機速度350rpmで30℃下に発酵
を行なった。対数期の終了の短期間前、すなわち８時間
後に培養物を冷却し、消化した。このために先ず発酵汁
（スクロース・ムターゼ活性14.4単位/ml）20lを、ペリ
コン（Pellicon）系のデユラポア（Durapore）フイルタ
ー（0.5μｍ）（ミリポア）を用い、交流ミクロ過に
より細胞懸濁液（93.7単位/ml）約3lまで濃縮した。
30℃まで予じめ暖めた塩溶液0.5M NaCl、0.05M燐酸カ
リウム、pH7.0、及びツウイーン20の１％からなる溶液3
lを無菌フイルターを通して細胞懸濁液3lに添加し、全
懸濁液を室温で16時間、発酵器中において30rpmで攪拌
した。次いで全懸濁液を無菌過した脱イオン水24lで
希釈し、ポンプによりペリコン系を通過させて細胞及び
細胞のかすを除去した。次いで液（7.6単位/ml）をポ
ンプにより貯蔵容器から他のペリコン系のポリスルホン
膜10000（ミリポア）へ送入し、約3lに濃縮した。発酵
器を再び無菌の脱イオン水で30lまで満し、混合物をミ
クロ過に供し、そして貯蔵容器へ混合した後、液を
再びペリコン系のポリスルホン膜を通して3lまで濃縮し
た。次いで1mM燐酸カリウム、pH7.0、約60lを用いるこ
とにより貯蔵容器を通してジアフイルタレーシヨンを行
ない、これによって生成物を所謂調整した粗酵素抽出物
（17.6単位/ml、蛋白1.9mg/ml）9lまで希釈した。
リウム、pH7.0、及びツウイーン20の１％からなる溶液3
lを無菌フイルターを通して細胞懸濁液3lに添加し、全
懸濁液を室温で16時間、発酵器中において30rpmで攪拌
した。次いで全懸濁液を無菌過した脱イオン水24lで
希釈し、ポンプによりペリコン系を通過させて細胞及び
細胞のかすを除去した。次いで液（7.6単位/ml）をポ
ンプにより貯蔵容器から他のペリコン系のポリスルホン
膜10000（ミリポア）へ送入し、約3lに濃縮した。発酵
器を再び無菌の脱イオン水で30lまで満し、混合物をミ
クロ過に供し、そして貯蔵容器へ混合した後、液を
再びペリコン系のポリスルホン膜を通して3lまで濃縮し
た。次いで1mM燐酸カリウム、pH7.0、約60lを用いるこ
とにより貯蔵容器を通してジアフイルタレーシヨンを行
ない、これによって生成物を所謂調整した粗酵素抽出物
（17.6単位/ml、蛋白1.9mg/ml）9lまで希釈した。
この0.5lを直ぐにポンプにより2.0l/時の流速でAMF−
100SP長円形筒に送入した。流出物では、依然蛋白が1.9
mg/mlであるが、蛋白0.5単位/ml以下が測定された。即
ちスクロース・ムターゼは粗酵素抽出物から殆んど選択
的にAMF長円形筒の架橋したスルホン酸ウエツブ上に結
合した。
100SP長円形筒に送入した。流出物では、依然蛋白が1.9
mg/mlであるが、蛋白0.5単位/ml以下が測定された。即
ちスクロース・ムターゼは粗酵素抽出物から殆んど選択
的にAMF長円形筒の架橋したスルホン酸ウエツブ上に結
合した。
無菌過した50％スクロース溶液を、室温下に65ml/
時の流速で、ポンプによりAMF長円形筒中を通過させ
た。流出物にはスクロース約10〜12％（全糖の含量の
％）が依然検出され、転化率は従って80〜90％であっ
た。連続運転の３日後に、先ずバイオ反応器を連続的に
25℃、次いで30℃にもって行った。それぞれ25℃及び30
℃において、転化率は非常に増大し、50％スクロース溶
液の生産速度は120〜140ml/時に増加した。この結果ス
クロースの転化率は65〜75％間で変化した。
時の流速で、ポンプによりAMF長円形筒中を通過させ
た。流出物にはスクロース約10〜12％（全糖の含量の
％）が依然検出され、転化率は従って80〜90％であっ
た。連続運転の３日後に、先ずバイオ反応器を連続的に
25℃、次いで30℃にもって行った。それぞれ25℃及び30
℃において、転化率は非常に増大し、50％スクロース溶
液の生産速度は120〜140ml/時に増加した。この結果ス
クロースの転化率は65〜75％間で変化した。
この長期間の実験を第３図に示すが、これはスクロー
ス・ムターゼが、スクロースのイソマルツロースへの生
物変換に関して上述した放射型バイオ反応器において、
記述する運転条件下に約１ヶ月間、高精製形で活性を保
持したまま使用できることを示す。
ス・ムターゼが、スクロースのイソマルツロースへの生
物変換に関して上述した放射型バイオ反応器において、
記述する運転条件下に約１ヶ月間、高精製形で活性を保
持したまま使用できることを示す。
次いで貯蔵容器中に冷条件下に貯蔵した粗酵素抽出物
（17.6単位/ml）の更に2lをポンプによって上記バイオ
反応器へ供給した。流出物中には1.4単位/mlが測定でき
ただけであり、斯くして更に32,000単位がスルホン酸AM
F長円形筒に結合した。50％スクロース溶液及び約210〜
220ml/時の流速を用いた時次の流出物の組成が得られ
た：イソマルツロース85.5％、1,1′−二糖類11.0％、
フルクトース2.5％、及びグルコース1.0％。スクロース
は検知できなかった。
（17.6単位/ml）の更に2lをポンプによって上記バイオ
反応器へ供給した。流出物中には1.4単位/mlが測定でき
ただけであり、斯くして更に32,000単位がスルホン酸AM
F長円形筒に結合した。50％スクロース溶液及び約210〜
220ml/時の流速を用いた時次の流出物の組成が得られ
た：イソマルツロース85.5％、1,1′−二糖類11.0％、
フルクトース2.5％、及びグルコース1.0％。スクロース
は検知できなかった。
次いで粗酵素抽出物の残り6.5lをポンプにより貯蔵容
器からバイオ反応器へ送入した。約1.2単位/mlが結合せ
ず、斯くしてバイオ反応器に更に110,000単位が負荷さ
れた。
器からバイオ反応器へ送入した。約1.2単位/mlが結合せ
ず、斯くしてバイオ反応器に更に110,000単位が負荷さ
れた。
このバイオ反応器を連続的に５日間、610ml/時の流速
で運転し、次の生成物分布を測定した：イソマルツロー
ス85.2％、1,1′−二糖類10.2％、フルクトース2.1％及
びグルコース0.8％。
で運転し、次の生成物分布を測定した：イソマルツロー
ス85.2％、1,1′−二糖類10.2％、フルクトース2.1％及
びグルコース0.8％。
流速を700ml/時に増加させる時、残存スクロース3.2
％、イソマルツロース83.7％、1,1′−二糖類10.2％、
フルクトース2.1％及びグルコース0.6％が得られた。
％、イソマルツロース83.7％、1,1′−二糖類10.2％、
フルクトース2.1％及びグルコース0.6％が得られた。
97％の転化率において、これは50％スクロース溶液か
らの約７反応器容量／時の一定の生産量を意味する。
らの約７反応器容量／時の一定の生産量を意味する。
バイオ反応器の負荷能力を決定するために、プロタミ
ノバクター・ルブラムを接種した培養溶液20lを再び発
酵させ（15.6単位/ml）、そして粗酵素抽出物（22.1単
位/ml）9lを同一の条件下に製造し、約1.32l/時の流速
で一部ずつバイオ反応器に通過させた。
ノバクター・ルブラムを接種した培養溶液20lを再び発
酵させ（15.6単位/ml）、そして粗酵素抽出物（22.1単
位/ml）9lを同一の条件下に製造し、約1.32l/時の流速
で一部ずつバイオ反応器に通過させた。
部分1:2l、流出物1.9単位/ml、斯くして40,400単位が
結合、 部分2:2l、流出物1.5単位/ml、斯くして41,200単位が
結合、 部分3:5l、流出物1.5単位/ml、斯くして103,000単位
が結合。
結合、 部分2:2l、流出物1.5単位/ml、斯くして41,200単位が
結合、 部分3:5l、流出物1.5単位/ml、斯くして103,000単位
が結合。
独国公開特許第3,038,218号に示される実質的に電気
泳動的に純粋なスクロース・ムターゼ450単位/mlを基準
にとると、これは約335,000単位が純粋なスクロース・
ムターゼ約0.75gに相当し、また100mlのバイオ反応器中
において粗酵素抽出物からスルホン酸AMFウエツブ・マ
トリツクスに選択的に結合できたことを意味する。
泳動的に純粋なスクロース・ムターゼ450単位/mlを基準
にとると、これは約335,000単位が純粋なスクロース・
ムターゼ約0.75gに相当し、また100mlのバイオ反応器中
において粗酵素抽出物からスルホン酸AMFウエツブ・マ
トリツクスに選択的に結合できたことを意味する。
実施例２ セラシア・プリムシカ（ATCC 15928号）の予備培養物
からの細胞を濃縮液溶液（乾燥物質含量５％、添加(N
H4)2HPO40.5g/l）10mlに懸濁させた。この懸濁液を、適
当な組成の無菌栄養溶液200mlを含む１のフラスコ中
における振とう機での予備培養に対する接種物として使
用した。30℃で15時間の培養時間の後、上記組成の栄養
溶液18lを30lの小さな発酵器においてそれぞれの場合10
のフラスコ（2l）で接種し、空気20l/分及び攪拌速度35
0rpmにおいて発酵を行なった。対数的相の終了直前、10
時間後に培養物を冷却した。
からの細胞を濃縮液溶液（乾燥物質含量５％、添加(N
H4)2HPO40.5g/l）10mlに懸濁させた。この懸濁液を、適
当な組成の無菌栄養溶液200mlを含む１のフラスコ中
における振とう機での予備培養に対する接種物として使
用した。30℃で15時間の培養時間の後、上記組成の栄養
溶液18lを30lの小さな発酵器においてそれぞれの場合10
のフラスコ（2l）で接種し、空気20l/分及び攪拌速度35
0rpmにおいて発酵を行なった。対数的相の終了直前、10
時間後に培養物を冷却した。
細胞の消化、交流ミクロ過及びジアフイルトレーシ
ヨンの工程を実施例１と同様に行なった。しかしながら
塩溶液中のNaClの濃度は１モル濃度であった。
ヨンの工程を実施例１と同様に行なった。しかしながら
塩溶液中のNaClの濃度は１モル濃度であった。
各工程に対するデータ:7.1単位/mlの発酵汁20l、44.7
単位/mlの濃縮物3l、3.9単位/mlのミクロ過液30l、1
0.8単位/ml（粗酵素抽出物）のジアフイルトレーシヨン
からの保留された物質10l。
単位/mlの濃縮物3l、3.9単位/mlのミクロ過液30l、1
0.8単位/ml（粗酵素抽出物）のジアフイルトレーシヨン
からの保留された物質10l。
ジアフイルトレーシヨン（1mM燐酸カリウム、pH7.0）
からの保留物質１を、ポンプにより流速1.2l/時でAMF
−100SP長円形筒上へ送った。流出物において0.45単位/
mlのスクロース・ムターゼ活性が測定された。50％スク
ロース溶液（無菌過したもの）からの連続的な生産に
おいて、生産速度90ml/時、30℃下にスクロースの転化
率94.5％が測定できた。粗酵素抽出物の他の9lもポンプ
により1.2l/時の流速でバイオ反応器に供給した。流出
物はスクロース・ムターゼ0.4単位/mlを有した。
からの保留物質１を、ポンプにより流速1.2l/時でAMF
−100SP長円形筒上へ送った。流出物において0.45単位/
mlのスクロース・ムターゼ活性が測定された。50％スク
ロース溶液（無菌過したもの）からの連続的な生産に
おいて、生産速度90ml/時、30℃下にスクロースの転化
率94.5％が測定できた。粗酵素抽出物の他の9lもポンプ
により1.2l/時の流速でバイオ反応器に供給した。流出
物はスクロース・ムターゼ0.4単位/mlを有した。
実施例３ エルウイニア・カロトボラ（ATCC 25206号）の予備培
養物からの細胞を濃縮液溶液（乾燥物質含量５％、添加
(NH4)2HPO40.5g/l）10mlに懸濁させた。この懸濁液を、
適当な組成の無菌栄養溶液200mlを含む１のフラスコ
中における振とう機での予備培養に対する接種物として
使用した。30℃で15時間の培養時間の後、上記組成の栄
養溶液18lを30lの小さな発酵器においてそれぞれの場合
10のフラスコ（2l）で接種し、空気20l/分及び攪拌速度
350rpmにおいて発酵を行なった。対数的相の終了直前、
18時間後に培養物を冷却し、消化させた。
養物からの細胞を濃縮液溶液（乾燥物質含量５％、添加
(NH4)2HPO40.5g/l）10mlに懸濁させた。この懸濁液を、
適当な組成の無菌栄養溶液200mlを含む１のフラスコ
中における振とう機での予備培養に対する接種物として
使用した。30℃で15時間の培養時間の後、上記組成の栄
養溶液18lを30lの小さな発酵器においてそれぞれの場合
10のフラスコ（2l）で接種し、空気20l/分及び攪拌速度
350rpmにおいて発酵を行なった。対数的相の終了直前、
18時間後に培養物を冷却し、消化させた。
3.9単位/mlの活性（発酵溶液5.6単位/ml）を有する全
容量10lの粗酵素抽出物のジアフイルトレーシヨンから
実施例２と同様にして得た保留物質を、ポンプにより1.
2l/時の流速でAMF−100SP長円形筒に供給した。流出物
はスクロース・ムターゼ0.15単位/mlを含有した。続く
無菌過した50％スクロース溶液からの連続生産量にお
いて、190ml/時及び30℃下に残存スクロースは２％（全
糖中含量％）にすぎなかった。
容量10lの粗酵素抽出物のジアフイルトレーシヨンから
実施例２と同様にして得た保留物質を、ポンプにより1.
2l/時の流速でAMF−100SP長円形筒に供給した。流出物
はスクロース・ムターゼ0.15単位/mlを含有した。続く
無菌過した50％スクロース溶液からの連続生産量にお
いて、190ml/時及び30℃下に残存スクロースは２％（全
糖中含量％）にすぎなかった。
第1a図は本発明の方法のフローチヤートである。
「調整された粗酵素抽出物」とは、スクロース・ムタ
ーゼを含有し且つアニオン化しうる担体マトリツクスへ
の選択的結合のための因子例えば塩濃度、伝導度及びpH
値に調節した細胞を含まない培養物上澄液或いは対応す
るジアフイルトレーシヨン（diafiltrate）を意味す
る。
ーゼを含有し且つアニオン化しうる担体マトリツクスへ
の選択的結合のための因子例えば塩濃度、伝導度及びpH
値に調節した細胞を含まない培養物上澄液或いは対応す
るジアフイルトレーシヨン（diafiltrate）を意味す
る。
「放射型バイオ反応器」とは、第ａ及びｂ図と関連し
て本明細書で説明される。
て本明細書で説明される。
第1b図はイソマルツロースの酵素による連続式製造の
ための反応器装置である。
ための反応器装置である。
この装置は４つの反応器の準装置からなる： （Ａ）発酵器 （Ｂ）交流ミクロ過に対する装置 （Ｃ）ジアフイルトレーシヨンに対する装置 （Ｄ）放射型バイオ反応器。
本発明による工程ａ）〜ｄ）は次のように装置に関し
て分類される:a）及びｂ）は発酵器（Ａ）で行なわれ、
ｂ）は単位（Ｂ）で行なわれ、そしてｃ）及びｄ）は放
射型バイオ反応器（Ｄ）で行なわれる。ジアフイルトレ
ーシヨン装置は粗酵素抽出物の調整に使用される。
て分類される:a）及びｂ）は発酵器（Ａ）で行なわれ、
ｂ）は単位（Ｂ）で行なわれ、そしてｃ）及びｄ）は放
射型バイオ反応器（Ｄ）で行なわれる。ジアフイルトレ
ーシヨン装置は粗酵素抽出物の調整に使用される。
装置の他の詳細は次の通りである： （１）無菌フイルター／フイルター・キヤンドル（cand
le） （２）制御遮閉バルブ （３）供給方向を指示するポンプ （４）ジアフイルトレーシヨン用の貯蔵容器 （５）、（６）、（７）発酵器の測定検知管、例えば圧
力、温度、ガス採取、液体用検知管 （８）貯蔵容器への試料検知管 （９）、（10）放射型バイオ反応器のサーモスタツト式
供給及び放出口 （11）発酵器の無菌ばつ気を伴なう攪拌機。
le） （２）制御遮閉バルブ （３）供給方向を指示するポンプ （４）ジアフイルトレーシヨン用の貯蔵容器 （５）、（６）、（７）発酵器の測定検知管、例えば圧
力、温度、ガス採取、液体用検知管 （８）貯蔵容器への試料検知管 （９）、（10）放射型バイオ反応器のサーモスタツト式
供給及び放出口 （11）発酵器の無菌ばつ気を伴なう攪拌機。
反応器装置の他の工程は次の通りである： ｅ）連続的殺菌、接種を経る栄養溶液の添加 ｆ）塩溶液例えばNaCl又はKClの添加 ｇ）表面活性剤の添加 ｈ）調整溶液例えば1mM燐酸カリウムpH7.0の添加 ｉ）放射型バイオ反応器を通してのスクロース溶液から
の生産量及び ｋ）イソマルツロースの結晶化のための生成物流の除去 ｌ）放射型バイオ反応器の負荷後のスクロース・ムター
ゼを含まない粗酵素抽出物の放出 ｍ）部分装置の水蒸気での殺菌 第2a及びｂ図は放射型バイオ反応器の断面である。
の生産量及び ｋ）イソマルツロースの結晶化のための生成物流の除去 ｌ）放射型バイオ反応器の負荷後のスクロース・ムター
ゼを含まない粗酵素抽出物の放出 ｍ）部分装置の水蒸気での殺菌 第2a及びｂ図は放射型バイオ反応器の断面である。
酵素が選択的に負荷された膜様担体又はウエツブマト
リツクスは、円筒形に巻かれている（2a）か或いは同心
円的に配列された円筒シート（2b）の形で使用される。
巻かれた形（2a）は同心円の理想的な形に近くて、同心
円のものよりも容易に作ることができる。しかしながら
双方の場合、物質流は外側から円筒の軸に対する内側方
向へ放射的にウエツブ層を通過する。巻いた形は特に流
速が増大するにつれて同心円形に良好に近似する。
リツクスは、円筒形に巻かれている（2a）か或いは同心
円的に配列された円筒シート（2b）の形で使用される。
巻かれた形（2a）は同心円の理想的な形に近くて、同心
円のものよりも容易に作ることができる。しかしながら
双方の場合、物質流は外側から円筒の軸に対する内側方
向へ放射的にウエツブ層を通過する。巻いた形は特に流
速が増大するにつれて同心円形に良好に近似する。
第３図はスクローム・ムターゼを用いる放射型バイオ
反応器におけるスクロースからの生産量及びその転化率
及び担体に結合した酵素の安定性を示す（参照実施例
１）。但し縦軸： △−△：残存スクロース％ ○−○：流速ml/時 ●−●：イソマルツロースkg/日 横軸の時間は日で示してある。
反応器におけるスクロースからの生産量及びその転化率
及び担体に結合した酵素の安定性を示す（参照実施例
１）。但し縦軸： △−△：残存スクロース％ ○−○：流速ml/時 ●−●：イソマルツロースkg/日 横軸の時間は日で示してある。
第1a図は本発明の方法のフローチヤートであり、第1b図
はイソマルツロースの酵素による連続式製造の反応器装
置であり、第2a及びｂ図は放射型バイオ反応器の断面図
であり、そして第３図は放射型バイオ反応器の運転結果
である。
はイソマルツロースの酵素による連続式製造の反応器装
置であり、第2a及びｂ図は放射型バイオ反応器の断面図
であり、そして第３図は放射型バイオ反応器の運転結果
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−99194（ＪＰ，Ａ)
Claims (10)
- 【請求項１】無菌条件下に運転できるイソマルツロース
の酵素による連続式製造法において、 ａ）スクロース・ムターゼを生成する微生物の発酵によ
ってスクロース・ムターゼを製造し、対数増殖期の終了
前に微生物細胞を塩溶液と表面活性剤で処理する工程、 ｂ）細胞の消化及び交流ミクロ濾過によって細胞を含ま
ない粗酵素抽出物を製造する工程、 ｃ）この粗抽出物からのスクロース・ムターゼを、スル
ホン酸カチオン交換マトリツクスへの選択的な結合によ
って、同時に、精製し且つ固定化する工程、並びに ｄ）このようにして得たマトリツクスをスクロースと接
触させる工程、 を含んでなる製造法。 - 【請求項２】工程ｃ）を0.2M以下の塩濃度下に４〜12の
pH範囲で行なう特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - 【請求項３】工程ｂ）を、0.1M〜3.0Mの塩濃度下で４〜
12のpH範囲にある発酵溶液を処理することによって行な
う特許請求の範囲第１項記載の製造法。 - 【請求項４】工程ｂ）を、0.1〜5.0％（重量／容量）の
濃度範囲の表面活性剤の存在下に行なう特許請求の範囲
第３項記載の製造法。 - 【請求項５】２官能性重合体によって架橋され且つビニ
ル重合体を経て結合する官能性スルホン酸基を有するカ
ートリツジ形又は長円形筒のセルロースウエツブを、ス
ルホン酸交換樹脂マトリツクスとして使用し、この担体
材料はセルロースウエツブの層間に空間を有して或いは
有さずに円筒形に巻き上げられ且つ物質が外側か内側へ
放射的に通流しうるようなものである特許請求の範囲第
１項記載の製造法。 - 【請求項６】工程ａ）においてプロタミノバクター・ル
ブラム（Protaminobacter rubrum）を発酵させることに
よって酵素スクロース・ムターゼを製造する特許請求の
範囲第１項記載の製造法。 - 【請求項７】工程ａ）においてセラシア・プリムシカ
（Serratia phymuthica）を発酵させることによって酵
素スクロース・ムターゼを製造する特許請求の範囲第１
項記載の製造法。 - 【請求項８】工程ａ）においてエルウイニア（Erwini
a）属の微生物を発酵させることによって酵素スクロー
ス・ムターゼを製造する特許請求の範囲第１項記載の製
造法。 - 【請求項９】pH範囲４〜８、スクロース溶液濃度10〜70
％、及び温度範囲10〜40℃において工程ｄ）を行なう特
許請求の範囲第１項記載の製造法。 - 【請求項１０】放射型反応器を、酵素の固定化に使用
し、こうして調製された放射型バイオリアクターにより
バイオ変換を行なう特許請求の範囲第１項記載の製造
法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3515284 | 1985-04-27 | ||
| DE3515284.2 | 1985-04-27 | ||
| DE19853528752 DE3528752A1 (de) | 1985-04-27 | 1985-08-10 | Kontinuierliches verfahren zur enzymatischen herstellung von isomaltulose |
| DE3528752.7 | 1985-08-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61249396A JPS61249396A (ja) | 1986-11-06 |
| JPH0829110B2 true JPH0829110B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
ID=25831779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61093530A Expired - Lifetime JPH0829110B2 (ja) | 1985-04-27 | 1986-04-24 | イソマルツロ−スの酵素による連続式製造法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4857461A (ja) |
| EP (1) | EP0200069B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0829110B2 (ja) |
| DE (2) | DE3528752A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01199592A (ja) * | 1987-07-27 | 1989-08-10 | Showa Denko Kk | イソマルツロースの製造方法 |
| JPH02273192A (ja) * | 1989-04-13 | 1990-11-07 | Meito Sangyo Kk | イソマルチユロースの製造方法 |
| DE69404848T2 (de) * | 1993-08-13 | 1998-03-19 | Minnesota Mining & Mfg | Filterpatrone mit darauf angeordneten unlöslichen enzympartikeln |
| US6884611B2 (en) * | 1994-01-19 | 2005-04-26 | Sudzucker Aktiengesellschaft | Preparation of acariogenic sugar substitutes |
| DE4447472C2 (de) * | 1994-01-19 | 1996-04-11 | Suedzucker Ag | Organismen mit reduziertem Palatinose- und Trehalulosestoffwechsel |
| US5468847A (en) * | 1994-03-10 | 1995-11-21 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method of isolating and purifying a biomacromolecule |
| DE19523560A1 (de) * | 1995-06-28 | 1997-01-02 | Suedzucker Ag | Saccharose-Stoffwechsel-Mutanten |
| FI104563B (fi) * | 1996-05-17 | 2000-02-29 | Xyrofin Oy | Menetelmä ja kantaja isomaltuloosin tuottamiseksi immobilisoitujen mikro-organismien avulla |
| FI105048B (fi) * | 1997-05-22 | 2000-05-31 | Xyrofin Oy | Menetelmä isomaltuloosin ja muiden tuotteiden valmistamiseksi |
| US20030157676A1 (en) * | 2000-06-19 | 2003-08-21 | Marc Arnaut | Immobilising comprising a porous medium |
| DE102009060935A1 (de) * | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Südzucker AG Mannheim/Ochsenfurt, 68165 | Sucrosemutase mit verbesserter Produktspezifität |
| US9695411B2 (en) | 2012-04-17 | 2017-07-04 | Petiva Private Limited | Polynucleotide for recombinant expression of isomaltulose synthase |
| MX2019006047A (es) | 2016-12-16 | 2019-10-02 | Nestle Sa | Oligosacaridos para generacion de sabor. |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1049800B (de) * | 1957-10-11 | 1959-01-29 | Süddeutsche Zucker-Aktiengesellschaft, Mannheim | VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON PALATINOSE (6-a-GLUCOSIDO-FRUCTOFURANOSE) |
| CH592141A5 (ja) * | 1972-04-12 | 1977-10-14 | Sueddeutsche Zucker Ag | |
| DE2860239D1 (en) * | 1977-09-13 | 1980-12-04 | Bayer Ag | Process for the continuous isomerisation if saccharose to isomaltulose by means of microorganisms |
| ATE6163T1 (de) * | 1979-11-07 | 1984-02-15 | Tate & Lyle Public Limited Company | Herstellung von isomaltulose. |
| DE3038219A1 (de) * | 1980-10-09 | 1982-04-15 | Süddeutsche Zucker AG, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung von isomaltulose (6-o-(alpha)-d-glucopyranosido-d-fructose) mit hilfe von immobilisierten bakterienzellen |
| DE3038218A1 (de) * | 1980-10-09 | 1982-05-06 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Saccharose-mutase, immobilisierte saccharose-mutase und verwendung von dieser immobilisierten saccharose-mutase zu herstellung von isomaltulose (6-o- a -d-glucopyranosido-d-fructose) |
| US4390627A (en) * | 1981-10-26 | 1983-06-28 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of the sucrose mutase in whole cells of protaminobacter rubrum |
| JPS58187188A (ja) * | 1982-04-27 | 1983-11-01 | Nippon Oil Co Ltd | 酵素活性物質の固定化法 |
| CA1210719A (en) * | 1982-08-13 | 1986-09-02 | Stanley N. Cohen | Method of immobilizing enzymes |
| US4663163A (en) * | 1983-02-14 | 1987-05-05 | Hou Kenneth C | Modified polysaccharide supports |
-
1985
- 1985-08-10 DE DE19853528752 patent/DE3528752A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-04-14 DE DE8686105091T patent/DE3680139D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-14 EP EP86105091A patent/EP0200069B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-23 US US07/855,222 patent/US4857461A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-04-24 JP JP61093530A patent/JPH0829110B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0200069A3 (en) | 1988-06-01 |
| DE3680139D1 (de) | 1991-08-14 |
| EP0200069A2 (de) | 1986-11-05 |
| DE3528752A1 (de) | 1986-10-30 |
| JPS61249396A (ja) | 1986-11-06 |
| EP0200069B1 (de) | 1991-07-10 |
| US4857461A (en) | 1989-08-15 |
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