JPS61187798A - 補酵素の再生方法 - Google Patents
補酵素の再生方法Info
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- JPS61187798A JPS61187798A JP61033676A JP3367686A JPS61187798A JP S61187798 A JPS61187798 A JP S61187798A JP 61033676 A JP61033676 A JP 61033676A JP 3367686 A JP3367686 A JP 3367686A JP S61187798 A JPS61187798 A JP S61187798A
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- Mycology (AREA)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、多くの補酵素、例えばアデノシン三リン酸（
ＡＴＰ）、アセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）、ア
セチルリン酸、酸化または還元ニコチンアミド−アデニ
ンジヌクレオチドおよびニコチンアミド−アデニンジヌ
クレオチドリン酸を、生化学反応中に消費すると同時に
もとの形に戻すことを可能にする簡単な方法に関する。
ＡＴＰ）、アセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）、ア
セチルリン酸、酸化または還元ニコチンアミド−アデニ
ンジヌクレオチドおよびニコチンアミド−アデニンジヌ
クレオチドリン酸を、生化学反応中に消費すると同時に
もとの形に戻すことを可能にする簡単な方法に関する。
消費される物質はアルコールまたはアルデヒド（例えば
エタノールまたはエタナール）のみである。触媒は、ク
ロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｋｌｕｙｖｅｒｉ）種の微生物の溶解質である。
エタノールまたはエタナール）のみである。触媒は、ク
ロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｋｌｕｙｖｅｒｉ）種の微生物の溶解質である。
［従来技術］
酵素反応は、緩やかな条件下で起こり、多くの場合能の
既知の製法よりも選択的であるので、化学工業分野にお
いて重要性が高まりつつあることがよく知られている。
既知の製法よりも選択的であるので、化学工業分野にお
いて重要性が高まりつつあることがよく知られている。
しかし、文献に記載の既知の酵素で工業的に使用し得る
ものはほとんどない。
ものはほとんどない。
例えば、細胞内に存在、単細胞タンパク質の細胞外代謝
生成物ではない酵素の使用例は非常に少ない。これらの
酵素のうち、補基質依存性酵素群が化学研究において使
用されるだけである。補基質依存性酵素は、化学反応を
触媒するために、基質と化学量論的量の補基質（補酵素
ともいう）を消費する酵素であると理解される。化学工
業においてこのような酵素があまり使用されないことは
、補基質が非常に高価なので大量に製造できず、そのた
め通例補基質依存性酵素を必要とする酵素的方法は他の
合成法に匹敵し得ないという事実によって説明される。
生成物ではない酵素の使用例は非常に少ない。これらの
酵素のうち、補基質依存性酵素群が化学研究において使
用されるだけである。補基質依存性酵素は、化学反応を
触媒するために、基質と化学量論的量の補基質（補酵素
ともいう）を消費する酵素であると理解される。化学工
業においてこのような酵素があまり使用されないことは
、補基質が非常に高価なので大量に製造できず、そのた
め通例補基質依存性酵素を必要とする酵素的方法は他の
合成法に匹敵し得ないという事実によって説明される。
この状態を改善するために、個々の補酵素を再生する試
みがすでになされてきた。例えば、リボアミド脱水素酵
素（ＥＣ１，６゜４，３）または種々の微生物の抽出物
を、水素およびヒドロゲナーゼまたは直流電流によって
再生された還元メチルビオロゲン（ｖｉｏｌｏｇｅｎ）
（１、１’−ジメチルー４．４−ビピリジニウム）の存
在下にＮＡＤ（Ｐ）に作用させる方法などによってＮＡ
Ｄ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換し得ることが知られて
いる（シーエッチ・エム・ワン（Ｃｈ、 −Ｍ、 Ｗｏ
ｎｇ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサエティ（Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、
Ｓｏｃ、 ）１０３（１９８１）、６２２７頁およ
びジェイ・バグ−（Ｊ、 Ｂａｄｅｒ）ら、ジャーナル
・オブ・バイオテクノロジー（Ｊ。
みがすでになされてきた。例えば、リボアミド脱水素酵
素（ＥＣ１，６゜４，３）または種々の微生物の抽出物
を、水素およびヒドロゲナーゼまたは直流電流によって
再生された還元メチルビオロゲン（ｖｉｏｌｏｇｅｎ）
（１、１’−ジメチルー４．４−ビピリジニウム）の存
在下にＮＡＤ（Ｐ）に作用させる方法などによってＮＡ
Ｄ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換し得ることが知られて
いる（シーエッチ・エム・ワン（Ｃｈ、 −Ｍ、 Ｗｏ
ｎｇ）ら、ザ・ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサエティ（Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、
Ｓｏｃ、 ）１０３（１９８１）、６２２７頁およ
びジェイ・バグ−（Ｊ、 Ｂａｄｅｒ）ら、ジャーナル
・オブ・バイオテクノロジー（Ｊ。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎ、 ）ｌ（１９８４）、９５参照）。
この方法で特定の酵素反応に使用するＮ Ａ Ｄ （Ｐ
）Ｈの量を厳重に制限し得るが、電気化学セル中で行な
うことは比較的困難である。例えばアセチル−ＣｏＡ、
アセチルリン酸またはＡＴＰのような他の酵素を再生す
る同様な反応も提案されてきたが、このような方法には
、複雑な方法で単離精製した酵素および／または入手が
困難な他の基質が必要である（ジー・エム・ホワイトサ
イズ（Ｇ。
）Ｈの量を厳重に制限し得るが、電気化学セル中で行な
うことは比較的困難である。例えばアセチル−ＣｏＡ、
アセチルリン酸またはＡＴＰのような他の酵素を再生す
る同様な反応も提案されてきたが、このような方法には
、複雑な方法で単離精製した酵素および／または入手が
困難な他の基質が必要である（ジー・エム・ホワイトサ
イズ（Ｇ。
Ｍ、 Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ）、シー・エッチ・−エッ
チ・ワン（Ｃｈ、 −Ｈ，Ｗｏｎｇ）、アルドリヒミカ
・アクタ（Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ）１
６ （１９８３）２７）。
チ・ワン（Ｃｈ、 −Ｈ，Ｗｏｎｇ）、アルドリヒミカ
・アクタ（Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ）１
６ （１９８３）２７）。
従って、当分野において、補酵素混合物または個々の補
酵素を再生する簡単な方法が必要である。
酵素を再生する簡単な方法が必要である。
［発明の目的コ
本発明は、炭素原子２〜４個を有するアルカノールまた
はアルカナール、および細胞懸濁液の溶菌により容易に
得られる酵素を用いる再生方法を提供することである。
はアルカナール、および細胞懸濁液の溶菌により容易に
得られる酵素を用いる再生方法を提供することである。
［発明の構成コ
本発明は、補酵素、例えばアデノシン三リン酸、アセチ
ル補酵素Ａ１アセチルリン酸、還元ニコチンアミド−ア
デニンジヌクレオチド、還元ニコチンアミド−アデニン
ジヌクレオチドリン酸を、生理的条件下に生じるその直
接初期生成物から酵素的に調製する方法であって、該初
期生成物と、還元剤として炭素原子２〜４個を有する１
級アルカノールおよび／またはアルカナールまたは酸化
剤として炭素原子２〜４個を有するアルカナールとを、
クロストリジウム・クルイベリ（ＣＩｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍｋｌｕｙｖｅｒｉ）種の微生物株の細胞溶解質および
要すれば他の酵素の存在下に反応させることを含んで成
る方法に関する。
ル補酵素Ａ１アセチルリン酸、還元ニコチンアミド−ア
デニンジヌクレオチド、還元ニコチンアミド−アデニン
ジヌクレオチドリン酸を、生理的条件下に生じるその直
接初期生成物から酵素的に調製する方法であって、該初
期生成物と、還元剤として炭素原子２〜４個を有する１
級アルカノールおよび／またはアルカナールまたは酸化
剤として炭素原子２〜４個を有するアルカナールとを、
クロストリジウム・クルイベリ（ＣＩｏｓｔｒｉｄｉｕ
ｍｋｌｕｙｖｅｒｉ）種の微生物株の細胞溶解質および
要すれば他の酵素の存在下に反応させることを含んで成
る方法に関する。
クロストリジウム・クルイベリ種の微生物は、長年知ら
れてきた。この微生物は、エタノールおよびアセテート
をブチレート、カプロエートお上び分子状水素に変換し
得る嫌気性細菌である。この種に属する種々の株の多数
の細胞内酵素も科学文献に記載されてきた。例えば、ア
ール・エム・バートン（Ｒ，Ｍ、 Ｂｕｒｔｏｎ）らは
、アセトアルデヒドのアセデル補酵素Ａへの酸化につい
て記載している（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ）
２０２（１９５３）、８７３頁）。アール・ラーズ（Ｒ
、Ｌ ｕｒｚ）は、クロストリジウム・クルイベリから
特定のアルコール−アセトアル脱水素酵素複合体の単離
について記載している（アーカイブズ・ミクロバイオロ
ジー（Ａｒｃｈ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ） ｌ ２
０（１９７９）、２５５頁）。また、ジェイ・バダーら
は、クロストリジウム・クルイベリの溶解質を使用する
α。
れてきた。この微生物は、エタノールおよびアセテート
をブチレート、カプロエートお上び分子状水素に変換し
得る嫌気性細菌である。この種に属する種々の株の多数
の細胞内酵素も科学文献に記載されてきた。例えば、ア
ール・エム・バートン（Ｒ，Ｍ、 Ｂｕｒｔｏｎ）らは
、アセトアルデヒドのアセデル補酵素Ａへの酸化につい
て記載している（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ）
２０２（１９５３）、８７３頁）。アール・ラーズ（Ｒ
、Ｌ ｕｒｚ）は、クロストリジウム・クルイベリから
特定のアルコール−アセトアル脱水素酵素複合体の単離
について記載している（アーカイブズ・ミクロバイオロ
ジー（Ａｒｃｈ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ） ｌ ２
０（１９７９）、２５５頁）。また、ジェイ・バダーら
は、クロストリジウム・クルイベリの溶解質を使用する
α。
β−不飽和カルボン酸化合物の水素化について記載して
いる（アーカイブズ・ミクロバイオロジー）１２７（１
９８０）、２７９頁）。すなわち、前記微生物が補酵素
再生可能な酵素を有していることが当業者に知られて、
クロストリジウム・クルイベリの溶解質は特定の立体選
択的水素什にすでに使用されてきたが、それにもかかわ
らず驚くべきことに、このような溶解質は、工業的方法
で十分安定な酵素活性を示し、数種の補酵素（例えばＡ
ＴＰ、アセチル補酵素Ａ、アセチルリン酸およびＮＡＤ
（Ｐ））（）を互いの補酵素の存在下に再生し得るとい
うように、複雑な酵素活性を有する。溶解質の酵素活性
が驚くほど安定である理由は科学的に実証し得ないが、
該微生物（クロストリジウム・クルイベリ）が、プロテ
アーゼも、アデノシンヌクレオチドおよび／またはピリ
ジンヌクレオチドを攻撃する酵素ら全く持たないか、ま
たはせいぜいそのような酵素を極めて少量しか持たない
という性質に基づくものと考えられる。すなわち、例え
ばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏ−
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはカンジダ
・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）種の酵
母菌細胞の溶解質は、同様の酵素を含有しているにもか
かわらず、タンパク質分解酵素が存在するので本発明の
方法には不適当である。
いる（アーカイブズ・ミクロバイオロジー）１２７（１
９８０）、２７９頁）。すなわち、前記微生物が補酵素
再生可能な酵素を有していることが当業者に知られて、
クロストリジウム・クルイベリの溶解質は特定の立体選
択的水素什にすでに使用されてきたが、それにもかかわ
らず驚くべきことに、このような溶解質は、工業的方法
で十分安定な酵素活性を示し、数種の補酵素（例えばＡ
ＴＰ、アセチル補酵素Ａ、アセチルリン酸およびＮＡＤ
（Ｐ））（）を互いの補酵素の存在下に再生し得るとい
うように、複雑な酵素活性を有する。溶解質の酵素活性
が驚くほど安定である理由は科学的に実証し得ないが、
該微生物（クロストリジウム・クルイベリ）が、プロテ
アーゼも、アデノシンヌクレオチドおよび／またはピリ
ジンヌクレオチドを攻撃する酵素ら全く持たないか、ま
たはせいぜいそのような酵素を極めて少量しか持たない
という性質に基づくものと考えられる。すなわち、例え
ばサツカロミセス・セレビシェ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏ−
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはカンジダ
・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）種の酵
母菌細胞の溶解質は、同様の酵素を含有しているにもか
かわらず、タンパク質分解酵素が存在するので本発明の
方法には不適当である。
本発明による方法を使用して、炭素原子２〜４個を有す
るアルカノールまたはアルカナール（特にエタノールま
たはエタナール）の酸化を伴いながら、ＡＴＰ、アセチ
ル−ＣｏＡ、 アセチルリン酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
のような補酵素を容易に再生することか可能である。Ｎ
ＡＤまたはＮＡＤＰを再生する場合、アルカナール、特
にエタナールを使用する必要がある。数種の補酵素の再
生およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ単独の再生において、エタノー
ルを使用することが好ましい。単純化すると、再生反応
を以下の式で説明し得る（実線の矢印は、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｉ−［、アセチル−ＣｏＡ、 アセチルリン酸または
ＡＴＰの再生反応を示し、点線の矢印は、ＮＡＤ（Ｐ）
の再生反応を示す）。
るアルカノールまたはアルカナール（特にエタノールま
たはエタナール）の酸化を伴いながら、ＡＴＰ、アセチ
ル−ＣｏＡ、 アセチルリン酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
のような補酵素を容易に再生することか可能である。Ｎ
ＡＤまたはＮＡＤＰを再生する場合、アルカナール、特
にエタナールを使用する必要がある。数種の補酵素の再
生およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ単独の再生において、エタノー
ルを使用することが好ましい。単純化すると、再生反応
を以下の式で説明し得る（実線の矢印は、ＮＡＤ（Ｐ）
Ｉ−［、アセチル−ＣｏＡ、 アセチルリン酸または
ＡＴＰの再生反応を示し、点線の矢印は、ＮＡＤ（Ｐ）
の再生反応を示す）。
触媒として使用する細胞溶解質は、クロストリジウム・
クルイベリの株の細胞培養によって調製される。適当な
株は、とりわけクロストリジウム・クルイベリＤＳＭ５
５５（ＡＴＣＣ８５２７）およびＡＴＣＣ１２４８９株
である。ＤＳＭ５５６．５５７．５６０．５６２．５６
３および５６４株も適当である。特に適当な株を選択す
るために、通例当業者は、後述の実施例に示すように、
溶解質の補酵素再生能力を試験すればよい。酵素単位に
対してＤＳＭ５５５株が達成する値は、少なくとも２０
％、好ましくは少なくとも６０％に達する。
クルイベリの株の細胞培養によって調製される。適当な
株は、とりわけクロストリジウム・クルイベリＤＳＭ５
５５（ＡＴＣＣ８５２７）およびＡＴＣＣ１２４８９株
である。ＤＳＭ５５６．５５７．５６０．５６２．５６
３および５６４株も適当である。特に適当な株を選択す
るために、通例当業者は、後述の実施例に示すように、
溶解質の補酵素再生能力を試験すればよい。酵素単位に
対してＤＳＭ５５５株が達成する値は、少なくとも２０
％、好ましくは少なくとも６０％に達する。
細胞溶解質を得るために、最初に既知の方法でクロスト
リジウム・クルイベリ株を嫌気培養する。
リジウム・クルイベリ株を嫌気培養する。
文献に記載のいずれの培地を用いてもよい（例えば、ス
タットマン（Ｓｔａｄｔｍａｎ）ら、メソッズ・インー
ｚンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）、第１巻、ニス・ビー・コロビック（Ｓ、
Ｐ、Ｃｏｌｏｗｉｃｋ）、エヌ・オー・カブラン（Ｎ、
Ｏ，Ｋａｐｌａｎ）編、５１８〜５２３頁、ニューヨー
ク：アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅａ＋ｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ）（１９５５）に記載の培地）。他の適当な培
地は、ジェイ・バダーら、ホッペーセイラーズ・ツァイ
トシュリフト・フェア・フィジオロージブシュ・ヘミ−
（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ ｓＺ、 Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、 Ｃｈｅｍ、）第３５９巻、２０頁に記載の培地で
あり、その記載によると、エタノール１６Ｊ！１２、酢
酸ナトリウム７．５ｇ、氷酢酸２．５ｇ、リン酸水素ジ
アンモニウム１５０ｊ１９、リン酸水素ジカリウム１Ｑ
Ｏｉｙ、塩化マグネシウム・６ Ｈｔ Ｏ３３’Ｈ１硫
酸マグネシウム・７Ｈ，ＯＯ，６ｍｇ、塩化カルシウム
・２１−Ｉ＊０４０１９、硫酸マグネシウム・２ｌ−１
ｔＯＯ，４ｙ、９、硫酸鉄・’１ｔｔｏ ０．４ｍ９
、塩化アンモニウム５０所、モリブデン酸アンモニウム
・４Ｈ，０１０次２、ビオチン０．０４度９、パラアミ
ノ安息香酸０ 、８ ｘｇ、リザズリンｌａｇ、５０％
炭酸カリウム溶液６頭および脱塩水１ｆ２を使用する。
タットマン（Ｓｔａｄｔｍａｎ）ら、メソッズ・インー
ｚンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ）、第１巻、ニス・ビー・コロビック（Ｓ、
Ｐ、Ｃｏｌｏｗｉｃｋ）、エヌ・オー・カブラン（Ｎ、
Ｏ，Ｋａｐｌａｎ）編、５１８〜５２３頁、ニューヨー
ク：アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅａ＋ｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ）（１９５５）に記載の培地）。他の適当な培
地は、ジェイ・バダーら、ホッペーセイラーズ・ツァイ
トシュリフト・フェア・フィジオロージブシュ・ヘミ−
（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ ｓＺ、 Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、 Ｃｈｅｍ、）第３５９巻、２０頁に記載の培地で
あり、その記載によると、エタノール１６Ｊ！１２、酢
酸ナトリウム７．５ｇ、氷酢酸２．５ｇ、リン酸水素ジ
アンモニウム１５０ｊ１９、リン酸水素ジカリウム１Ｑ
Ｏｉｙ、塩化マグネシウム・６ Ｈｔ Ｏ３３’Ｈ１硫
酸マグネシウム・７Ｈ，ＯＯ，６ｍｇ、塩化カルシウム
・２１−Ｉ＊０４０１９、硫酸マグネシウム・２ｌ−１
ｔＯＯ，４ｙ、９、硫酸鉄・’１ｔｔｏ ０．４ｍ９
、塩化アンモニウム５０所、モリブデン酸アンモニウム
・４Ｈ，０１０次２、ビオチン０．０４度９、パラアミ
ノ安息香酸０ 、８ ｘｇ、リザズリンｌａｇ、５０％
炭酸カリウム溶液６頭および脱塩水１ｆ２を使用する。
嫌気的にした培地に、３７℃で接種するのが適当である
。細胞が増殖する間、培地を撹拌してよい。培養中に、
酸素を含有しない殺菌した気体（例えば窒素）を通すこ
とが有利である。細胞を採るために、培地を遠心分離す
ることが好ましい。洗浄が必要な場合、窒素雰囲気中θ
℃で、細胞塊を０．０５Ｍリン酸緩衝液（１１２当たり
塩化ナトリウム０．１４ｍｏｌおよびリザズリン１９含
有、ｐＨ７）中に懸濁させる。ｔＱ当たり亜ニチオン酸
ナトリウム１Ｏｚｔｔを添加し得る（詳細は、ジエイ・
バダーらの前記引用文献参照）。
。細胞が増殖する間、培地を撹拌してよい。培養中に、
酸素を含有しない殺菌した気体（例えば窒素）を通すこ
とが有利である。細胞を採るために、培地を遠心分離す
ることが好ましい。洗浄が必要な場合、窒素雰囲気中θ
℃で、細胞塊を０．０５Ｍリン酸緩衝液（１１２当たり
塩化ナトリウム０．１４ｍｏｌおよびリザズリン１９含
有、ｐＨ７）中に懸濁させる。ｔＱ当たり亜ニチオン酸
ナトリウム１Ｏｚｔｔを添加し得る（詳細は、ジエイ・
バダーらの前記引用文献参照）。
細胞溶解質を調製するために、新鮮な細胞または冷凍保
存条件下（−１０℃以下）で冷凍した細胞懸濁液を解凍
したものを、嫌気的に細胞膜破損処理に付す。細胞膜の
破損は、酵素的に行なうことが好ましい。しかし、物理
的に（例えば超音波処理により）破損することも可能で
ある。特殊な場合、化学的または生理化学的破損（例え
ば界面活性剤の添加）を行なうことも可能であるが、あ
まり好ましくない。細胞溶解質は、その中に存在するＤ
ＮＳの分子量が大きいために、多くの用途において不適
当な粘性液体であるので、ＤＮＳを分解して粘度を低下
させることが望ましい。これは、ＤＮＳ分解酵素（ＤＮ
アーゼ）によって行なうことが好ましい。
存条件下（−１０℃以下）で冷凍した細胞懸濁液を解凍
したものを、嫌気的に細胞膜破損処理に付す。細胞膜の
破損は、酵素的に行なうことが好ましい。しかし、物理
的に（例えば超音波処理により）破損することも可能で
ある。特殊な場合、化学的または生理化学的破損（例え
ば界面活性剤の添加）を行なうことも可能であるが、あ
まり好ましくない。細胞溶解質は、その中に存在するＤ
ＮＳの分子量が大きいために、多くの用途において不適
当な粘性液体であるので、ＤＮＳを分解して粘度を低下
させることが望ましい。これは、ＤＮＳ分解酵素（ＤＮ
アーゼ）によって行なうことが好ましい。
特に適当な細胞懸濁液を調製するために、濃度が０．ｌ
〜０．５ｉｏ１／Ｑの緩衝液、特にリン酸緩衝液に細胞
を懸詞させることが好ましい。この溶液のｐＨは６〜８
、好ましくは約７である。すなわち、とりわけｐＨ６，
７５〜７．５の緩衝液を使用することが可能である。細
胞壁を破損する酵素は、湿潤細胞材料ｔｇ当たり５〜３
０１１９、好ましくは１５〜２０１１ｇの量で使用する
。市販リゾチーム、例えばベーリンガーーマンハイム（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製リゾチ
ーム（Ｌ ｙｓｏｚｙｍ、塩酸塩）をこの目的に使用す
ることが好ましい。湿潤細胞材料１ｇ当たり０．５〜３
ｍｇ、好ましくは１．５〜５１Ｎ９の市販ＤＮアーゼを
、リゾチーム処理中または処理後に加える。溶解質は、
２５〜４０℃、好ましくは３７℃付近、すなわち３５〜
３７℃で調製される。酵素的細胞破損工程およびＤＮア
ーゼ分解の反応時間は、２０〜９０分間、好ましくは６
０〜８０分間である。要すれば、活性を高めるために０
℃での超音波処理を加えてよい。試料の量（すなわち、
例えば湿潤細胞１ｇ当たりの溶解質）が少ない場合の超
音波処理時間は、３０ワツト（Ｗａｔｔ）装置内で２分
間である。多くの場合、溶解質に抗生物質を加えること
が望ましい。すなわち、細胞材料１ｇ当たり１ｍｇのテ
トラサイクリンまたはその塩酸塩を添加し得る。
〜０．５ｉｏ１／Ｑの緩衝液、特にリン酸緩衝液に細胞
を懸詞させることが好ましい。この溶液のｐＨは６〜８
、好ましくは約７である。すなわち、とりわけｐＨ６，
７５〜７．５の緩衝液を使用することが可能である。細
胞壁を破損する酵素は、湿潤細胞材料ｔｇ当たり５〜３
０１１９、好ましくは１５〜２０１１ｇの量で使用する
。市販リゾチーム、例えばベーリンガーーマンハイム（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製リゾチ
ーム（Ｌ ｙｓｏｚｙｍ、塩酸塩）をこの目的に使用す
ることが好ましい。湿潤細胞材料１ｇ当たり０．５〜３
ｍｇ、好ましくは１．５〜５１Ｎ９の市販ＤＮアーゼを
、リゾチーム処理中または処理後に加える。溶解質は、
２５〜４０℃、好ましくは３７℃付近、すなわち３５〜
３７℃で調製される。酵素的細胞破損工程およびＤＮア
ーゼ分解の反応時間は、２０〜９０分間、好ましくは６
０〜８０分間である。要すれば、活性を高めるために０
℃での超音波処理を加えてよい。試料の量（すなわち、
例えば湿潤細胞１ｇ当たりの溶解質）が少ない場合の超
音波処理時間は、３０ワツト（Ｗａｔｔ）装置内で２分
間である。多くの場合、溶解質に抗生物質を加えること
が望ましい。すなわち、細胞材料１ｇ当たり１ｍｇのテ
トラサイクリンまたはその塩酸塩を添加し得る。
このように調製された細胞溶解質は、高い酵素活性を示
す。本発明によると、これらを補酵素の再生に使用する
。例えば、触媒量のＡＤＰ存在下にＡＭＰ（アデノシン
−リン酸）から、または特にＡＤＰ（アデノシンニリン
酸）からＡＴＰを調製し得る。その他の反応として、例
えばアセトアルデヒドおよびＨＳ−ＣｏＡまたは補酵素
Ａからのアセチル補酵素Ａの再生がある。さらに、ＮＡ
ＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨは、それぞれＮＡＤＰお
よびＮＡＤから調製し得る。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）は、
Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ ）Ｈからも調製し得る。使用する生
物的触媒の性質によって、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＡＴＰ
もしくはアセチルＣｏＡまたはアセチルリン酸を同時に
再生することが可能である。前記補基質を個々に再生す
之こともできる。例えばＡＴＰだけを再生したい場合、
形成されたＮＡＤＨが再酸化されてエタノールの生成を
伴いＮＡＤとなるので、ＮＡＤは触媒量しか必要でない
。
す。本発明によると、これらを補酵素の再生に使用する
。例えば、触媒量のＡＤＰ存在下にＡＭＰ（アデノシン
−リン酸）から、または特にＡＤＰ（アデノシンニリン
酸）からＡＴＰを調製し得る。その他の反応として、例
えばアセトアルデヒドおよびＨＳ−ＣｏＡまたは補酵素
Ａからのアセチル補酵素Ａの再生がある。さらに、ＮＡ
ＤＰＨおよび／またはＮＡＤＨは、それぞれＮＡＤＰお
よびＮＡＤから調製し得る。しかし、ＮＡＤ（Ｐ）は、
Ｎ Ａ Ｄ （Ｐ ）Ｈからも調製し得る。使用する生
物的触媒の性質によって、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＡＴＰ
もしくはアセチルＣｏＡまたはアセチルリン酸を同時に
再生することが可能である。前記補基質を個々に再生す
之こともできる。例えばＡＴＰだけを再生したい場合、
形成されたＮＡＤＨが再酸化されてエタノールの生成を
伴いＮＡＤとなるので、ＮＡＤは触媒量しか必要でない
。
前記再生反応において、補助物質が還元剤として消費さ
れる。本発明による方法においては、炭素原子２〜４個
を有するアルカノールまたはアルカナールを補助物質と
して、特にアルカノールもしくはアルカナールをＮＡＤ
（Ｐ）の還元剤としてまたはアルカナールをＮＡＤ（Ｐ
）Ｈの酸化剤として使用し得る。原則としてれ一ブタノ
ール、ｎ−ブタナール、ｎ−プロパツール、ｎ−プロパ
ナールを用いてもこの方法を行ない得るが、通例エタノ
ールおよび／またはアセトアルデヒドを使用することが
好ましい。還元剤（アルカノールおよび／またはアルカ
ナール）および酸化剤（アルカナール）を、補酵素再生
用基質に対して化学量論的にわずかに過剰に使用する。
れる。本発明による方法においては、炭素原子２〜４個
を有するアルカノールまたはアルカナールを補助物質と
して、特にアルカノールもしくはアルカナールをＮＡＤ
（Ｐ）の還元剤としてまたはアルカナールをＮＡＤ（Ｐ
）Ｈの酸化剤として使用し得る。原則としてれ一ブタノ
ール、ｎ−ブタナール、ｎ−プロパツール、ｎ−プロパ
ナールを用いてもこの方法を行ない得るが、通例エタノ
ールおよび／またはアセトアルデヒドを使用することが
好ましい。還元剤（アルカノールおよび／またはアルカ
ナール）および酸化剤（アルカナール）を、補酵素再生
用基質に対して化学量論的にわずかに過剰に使用する。
存在する補酵素は、繰り返し再生される（例えば数百回
）。還元剤または酸化剤を！θ〜５０ｍｏ１％過剰に、
要すれば数百モル大過剰に使用することが最も良い。
）。還元剤または酸化剤を！θ〜５０ｍｏ１％過剰に、
要すれば数百モル大過剰に使用することが最も良い。
本発明による方法を比較的長期間適用する場合、還元剤
の酸化生成物として生じる酸が反応を確実に妨害しない
ようにすること力５重要である。従って、適当な強度の
緩衝液、好ましくはｐＨ６〜８、特に、ｐＨ６，７５〜
７．５の緩衝液中で反応を行なう。適当な緩衝液は、リ
ン酸緩衝液または池の生理学的に適合性のある緩衝液で
ある。すなわち、特にアセチル−ＣｏＡを再生する場合
には、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ナト
リウム塩系緩衡液を使用することができる。２−アミノ
−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（
トリス（ＴＲ［Ｓ）、商標）系およびＨＣｇのような無
機酸系緩衝液は、原則として使用し得るが、その使用が
不適当な反応もある。
の酸化生成物として生じる酸が反応を確実に妨害しない
ようにすること力５重要である。従って、適当な強度の
緩衝液、好ましくはｐＨ６〜８、特に、ｐＨ６，７５〜
７．５の緩衝液中で反応を行なう。適当な緩衝液は、リ
ン酸緩衝液または池の生理学的に適合性のある緩衝液で
ある。すなわち、特にアセチル−ＣｏＡを再生する場合
には、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ナト
リウム塩系緩衡液を使用することができる。２−アミノ
−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（
トリス（ＴＲ［Ｓ）、商標）系およびＨＣｇのような無
機酸系緩衝液は、原則として使用し得るが、その使用が
不適当な反応もある。
本発明による方法では、クロストリジウム・クルイベリ
種の微生物の溶解質が触媒量だけ使用される。すなわち
、例えば、補酵素再生によって生成する生成物１ ｍｍ
ｏｌ当たり、４〜７時間に、溶解質タンパク質を２〜５
０即、好ましくは２０〜４０Ｊ！９（ブラッドフォード
（Ｂ ｒａｄｆｏｒｄ）法による測定値）しか使用しな
い（ニス・エム・リード（Ｓ、Ｍ。
種の微生物の溶解質が触媒量だけ使用される。すなわち
、例えば、補酵素再生によって生成する生成物１ ｍｍ
ｏｌ当たり、４〜７時間に、溶解質タンパク質を２〜５
０即、好ましくは２０〜４０Ｊ！９（ブラッドフォード
（Ｂ ｒａｄｆｏｒｄ）法による測定値）しか使用しな
い（ニス・エム・リード（Ｓ、Ｍ。
Ｒｅａｄ）、ディー・エッチ・ノスコフ（Ｄ、Ｈ。
Ｎｏｒｔｈｃｏｒｅ）、アナリティカル・バイオケミス
トリー（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）Ｉ １６（
１９８１）、５３頁参照）。長時間の反応には相応して
大型に使用し得る。
トリー（Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）Ｉ １６（
１９８１）、５３頁参照）。長時間の反応には相応して
大型に使用し得る。
クロストリジウム・クルイベリの溶解質の活性は、酢酸
キナーゼ活性によって制限される。すなわち本発明の他
の態様においては、酢酸キナーゼをさらに加える。例え
ば、ＡＴＰの消費を伴って反応する基質１ｍｍｏｌ当た
り酢酸キナーゼを５〜２０Ｕ、好ましくは１０〜１５Ｕ
添加し得る。生理的条件下、１分間に基質１μｍｏｌと
反応する酵素の量をＩＵと定義する。例えば大腸菌から
適当な酢酸キナーゼ（ＥＣ２，７，２，１）を得ること
小でき、そのまま市販されている（ベーリンガー・マン
ハイム社）。さらに、適度の活性を有していれば、他の
いずれの微生物から得られる酢酸キナーゼを使用しても
よい。
キナーゼ活性によって制限される。すなわち本発明の他
の態様においては、酢酸キナーゼをさらに加える。例え
ば、ＡＴＰの消費を伴って反応する基質１ｍｍｏｌ当た
り酢酸キナーゼを５〜２０Ｕ、好ましくは１０〜１５Ｕ
添加し得る。生理的条件下、１分間に基質１μｍｏｌと
反応する酵素の量をＩＵと定義する。例えば大腸菌から
適当な酢酸キナーゼ（ＥＣ２，７，２，１）を得ること
小でき、そのまま市販されている（ベーリンガー・マン
ハイム社）。さらに、適度の活性を有していれば、他の
いずれの微生物から得られる酢酸キナーゼを使用しても
よい。
本発明による方法を、補酵素の調製に使用し得る。しか
し、基本的には、それらが消費される反応中で触媒量で
しか得難い補酵素を使用することができ、そのような反
応中にクロストリジウム・クルイベリの溶解質および還
元剤（すなわち例えばエタノールまたはエタナール）を
用いてその補酵素を連続的に再生し得る点で本発明は特
に有利である。すなわち、そのような反応中に補酵素Ａ
ＴＰおよび／または補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、３００回
またはそれ以上再生され得る。個々のまたは前記補酵素
との混合物中のアセチル−ＣｏＡおよび／またはアセチ
ルリン酸にも同じことが当てはまる。これと関連して、
本発明に従って使用する溶解質は、再生酵素濃度が一定
であることから単独で活性な酵素触媒であること（すな
わち混合物でないこと）がわかった。所望のＡＴＰ消費
反応にＮＡＤ（Ｐ））ｆも消費されるのでなければ、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）は（アセトアルデヒドから）エタノールの生
成を伴って再生される。
し、基本的には、それらが消費される反応中で触媒量で
しか得難い補酵素を使用することができ、そのような反
応中にクロストリジウム・クルイベリの溶解質および還
元剤（すなわち例えばエタノールまたはエタナール）を
用いてその補酵素を連続的に再生し得る点で本発明は特
に有利である。すなわち、そのような反応中に補酵素Ａ
ＴＰおよび／または補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、３００回
またはそれ以上再生され得る。個々のまたは前記補酵素
との混合物中のアセチル−ＣｏＡおよび／またはアセチ
ルリン酸にも同じことが当てはまる。これと関連して、
本発明に従って使用する溶解質は、再生酵素濃度が一定
であることから単独で活性な酵素触媒であること（すな
わち混合物でないこと）がわかった。所望のＡＴＰ消費
反応にＮＡＤ（Ｐ））ｆも消費されるのでなければ、Ｎ
ＡＤ（Ｐ）は（アセトアルデヒドから）エタノールの生
成を伴って再生される。
補酵素依存性反応を、以下の実施例により説明する。反
応速度論により、触媒濃度で使用する補酵素が、クロス
トリジウム・クルイベリＤＳＭ５５５の溶解質およびエ
タノールまたはエタナールの添加により連続的に再生さ
れることがわかる。
応速度論により、触媒濃度で使用する補酵素が、クロス
トリジウム・クルイベリＤＳＭ５５５の溶解質およびエ
タノールまたはエタナールの添加により連続的に再生さ
れることがわかる。
グルコース−６−リン酸の調製およびグリセロール−３
−リン酸の調製は、ＡＴＰ中間体再生の実施例として行
った。２−オキソグルタレートからグルタメートの還元
的アミノ化は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ再生の実施例
として行い、グルコース−６−リン酸から６−ホスホグ
ルコネートへの脱水素化またはグルコースからグルコネ
ートへの脱水素化は、ＮＡＤ（Ｐ）再生の実施例として
行った。生理化学文献に通例使用される略語を使用する
。
−リン酸の調製は、ＡＴＰ中間体再生の実施例として行
った。２−オキソグルタレートからグルタメートの還元
的アミノ化は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ再生の実施例
として行い、グルコース−６−リン酸から６−ホスホグ
ルコネートへの脱水素化またはグルコースからグルコネ
ートへの脱水素化は、ＮＡＤ（Ｐ）再生の実施例として
行った。生理化学文献に通例使用される略語を使用する
。
［実施例］
実施例１
グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）の調製一般的方
法： 条件（他の指示のない場合）：温度３６℃、窒素雰囲気
中、０．３Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７；全量Ｌ１；ワー
ルブルク（Ｗａｒｂｕｒｇ）振盪器に入れた、隔膜によ
って封止された細首円筒形容器中で並行実施。タンパク
質定量は、ブラッドフォード法により行なった。
法： 条件（他の指示のない場合）：温度３６℃、窒素雰囲気
中、０．３Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７；全量Ｌ１；ワー
ルブルク（Ｗａｒｂｕｒｇ）振盪器に入れた、隔膜によ
って封止された細首円筒形容器中で並行実施。タンパク
質定量は、ブラッドフォード法により行なった。
インキュベーション時の緩衝液： ＨＳ−ＣｏＡＯ。
３ｍＭ、ＮＡＤ（Ｐ）１．５ｍＭ（量の代わりに均一な
バッチ寸法に対する濃度を示す）、ＡＤＰ３．０ｍＭ、
ＭｇＣＱ＊、２．５ｍＭ、テトラサイクリン１５μＱＣ
１、５ｍｙ／ｙｘＱ）、クロストリジウム・クルイベリ
ＤＳＭ５５５溶解質３ 、２ ｚ９タンパク質（ブラッ
ドフォード試験による値）、グルコース１５０ｍＭ。
バッチ寸法に対する濃度を示す）、ＡＤＰ３．０ｍＭ、
ＭｇＣＱ＊、２．５ｍＭ、テトラサイクリン１５μＱＣ
１、５ｍｙ／ｙｘＱ）、クロストリジウム・クルイベリ
ＤＳＭ５５５溶解質３ 、２ ｚ９タンパク質（ブラッ
ドフォード試験による値）、グルコース１５０ｍＭ。
酢酸キナーゼ（ＥＣ２，７，２，１）（ベーリンガー社
製大腸菌）４Ｕ、ヘキソキナーゼ（ＥＣ２，７゜１．１
）（ベーリンガー社製酵母）約４Ｕ、ＩＭＫｆｉＨＰＯ
，中の１．７８Ｍ ＣＨ，ＣＨＯ溶液３０μｆｆ／ｈを
加えた。酢酸キナーゼ（Ａｋ）およびヘキソース−キナ
ーゼ（Ｈｋ）を加えた２０種の酵素を、３．２Ｍ ＮＨ
，ＳＯ，中の透明な懸濁液として供給するので、このバ
ッチは（ＮＨ，）ｔ６０．５０〜ｂ第１表に示すように
１時間毎にアセトアルデヒド４５〜５０ｍＭを供給した
。ＡＴＰの再生において、触媒量のＨＳ−ＣｏＡＱ、３
ｍＭは約３３０回およびＮＡＤは約６７回再生される。
製大腸菌）４Ｕ、ヘキソキナーゼ（ＥＣ２，７゜１．１
）（ベーリンガー社製酵母）約４Ｕ、ＩＭＫｆｉＨＰＯ
，中の１．７８Ｍ ＣＨ，ＣＨＯ溶液３０μｆｆ／ｈを
加えた。酢酸キナーゼ（Ａｋ）およびヘキソース−キナ
ーゼ（Ｈｋ）を加えた２０種の酵素を、３．２Ｍ ＮＨ
，ＳＯ，中の透明な懸濁液として供給するので、このバ
ッチは（ＮＨ，）ｔ６０．５０〜ｂ第１表に示すように
１時間毎にアセトアルデヒド４５〜５０ｍＭを供給した
。ＡＴＰの再生において、触媒量のＨＳ−ＣｏＡＱ、３
ｍＭは約３３０回およびＮＡＤは約６７回再生される。
第１表
ＮＡＤまたはＮＡＤＰｌ、５ｍＭ存在下のＧ−６−Ｐの
生成 ＮＡＤまたはＮＡＤＰ供給から各時間後のＧ−６−Ｐ濃
度 実施例２ 基質（ＣＨ３ＣＨＯ）を連続的に添加する方法ニ一般的
条件；反応開始時の液量３ ｘＱ、反応終了時の液ｆｉ
４ ｘ（１、温度３７℃、窒素雰囲気中、磁気撹拌機
、ＰＰＢ５００ｍＭ０ インキュベーション液： ＮＡＤ １．６６ｍＭ５ＡＤ
Ｐ３．３３ｍＭ、ＨＳＣｏＡｍｇ、５ｍＭ、ＮＨ，ＳＯ
。
生成 ＮＡＤまたはＮＡＤＰ供給から各時間後のＧ−６−Ｐ濃
度 実施例２ 基質（ＣＨ３ＣＨＯ）を連続的に添加する方法ニ一般的
条件；反応開始時の液量３ ｘＱ、反応終了時の液ｆｉ
４ ｘ（１、温度３７℃、窒素雰囲気中、磁気撹拌機
、ＰＰＢ５００ｍＭ０ インキュベーション液： ＮＡＤ １．６６ｍＭ５ＡＤ
Ｐ３．３３ｍＭ、ＨＳＣｏＡｍｇ、５ｍＭ、ＮＨ，ＳＯ
。
８５ ｍＭ、 ＭｇＳ ０４ １０ ｍＭ、テトラサイ
クリン５０μＣ（１、５ｘ９／ｚ（１’）、グルコース
３５０ｍＭ。
クリン５０μＣ（１、５ｘ９／ｚ（１’）、グルコース
３５０ｍＭ。
ＣＨ３ＣＨＯ： Ｋ！ＨＰＯ４中４Ｍ ＣＨ３ＣＨＯ（
２Ｍ）、流速５０μｍ２／ｈ、 Ｈｋ（酵母）約４０Ｕ
（ベーリンガー社製酵母）、Ａｋ（大腸菌）約２０Ｕ（
ベーリンガー社製大腸菌）、クロストリジウム・クルイ
ベ＋ＪＤＳＭ５５５溶解質： ６００μｅ−９，７２１
１９（消化における）タンパク質。
２Ｍ）、流速５０μｍ２／ｈ、 Ｈｋ（酵母）約４０Ｕ
（ベーリンガー社製酵母）、Ａｋ（大腸菌）約２０Ｕ（
ベーリンガー社製大腸菌）、クロストリジウム・クルイ
ベ＋ＪＤＳＭ５５５溶解質： ６００μｅ−９，７２１
１９（消化における）タンパク質。
１８．５時間後、浴中からＧ−６−Ｐ１９５ｍＭが検出
された（検出法：ハー・ウー・ベルクマイヤー（Ｈ，Ｕ
、 Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ）による、ゲー・ラング（Ｇ
、 Ｌ ａｎｇ）およびゲー・ミカル（Ｇ、 Ｍｉｃｈ
ａｌ）１、メト・デア・エンチーム・アナリーゼ（Ｍｅ
ｔｈ、ｄｅｒｅｎｚｙｍ、 Ａｎａｌｙｓｅ）、第３版
、第２巻、１２８３、フェルラーク・ヘミ−（Ｖｅｒｌ
ａｇ Ｃｈｅｍｉｅ）、ヴアインハイム（Ｗｅｉｎｈ
ｅｉｍ）、１９７４に記載の酵素的方法）。
された（検出法：ハー・ウー・ベルクマイヤー（Ｈ，Ｕ
、 Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ）による、ゲー・ラング（Ｇ
、 Ｌ ａｎｇ）およびゲー・ミカル（Ｇ、 Ｍｉｃｈ
ａｌ）１、メト・デア・エンチーム・アナリーゼ（Ｍｅ
ｔｈ、ｄｅｒｅｎｚｙｍ、 Ａｎａｌｙｓｅ）、第３版
、第２巻、１２８３、フェルラーク・ヘミ−（Ｖｅｒｌ
ａｇ Ｃｈｅｍｉｅ）、ヴアインハイム（Ｗｅｉｎｈ
ｅｉｍ）、１９７４に記載の酵素的方法）。
条件：温度３６℃、窒素雰囲気中、全量１ｍ（１、モッ
ブス（Ｍｏｐｓ）緩衝液０，１ＭＳｐＨ７，５（シグマ
（Ｓ ｉｇｎ＋ａ）社製）。
ブス（Ｍｏｐｓ）緩衝液０，１ＭＳｐＨ７，５（シグマ
（Ｓ ｉｇｎ＋ａ）社製）。
インキュベーション液： ＮＡＤ Ｉ、２５ｍＭ。
）［Ｓ ＣｏＡ ２０ ｍＭ、クロストリジウム・クル
イベリＤＳＭ５５５溶解質３ 、５ Ｈタンパク質／耐
、（０，１Ｍモツブス緩衝液（ｐＨ７，５）中、リゾチ
ーム消化）、ＣＨａＣＨＯ： ５０ｎ＋Ｍ（ＣＨ３ＣＨ
Ｏ溶液３０μＱ−モツブス（ｐＨ７，５）で１０倍希釈
）。
イベリＤＳＭ５５５溶解質３ 、５ Ｈタンパク質／耐
、（０，１Ｍモツブス緩衝液（ｐＨ７，５）中、リゾチ
ーム消化）、ＣＨａＣＨＯ： ５０ｎ＋Ｍ（ＣＨ３ＣＨ
Ｏ溶液３０μＱ−モツブス（ｐＨ７，５）で１０倍希釈
）。
１４４５時間後、ＣｏＡエステル１９．７５ｍＭ（収率
９Ｓ％）が検出された（ヒドロキサム酸試験によ、 る
）。
９Ｓ％）が検出された（ヒドロキサム酸試験によ、 る
）。
実施例４
ＡＴＰ生成を伴わないＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ■］再生
以下の反応を用いる；
ＣＨ，Ｃ０ＯＨ＋ ２ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
２ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋ ２−オキソグルタレート＋２ＮＨ
３ｇｌｕｔ−ＤＨ −一一→ ２グルタメート＋ＮＡＤ（Ｐ）計： ＣｔＨ
ｓＯＨ＋ ２−オキソゲルタレ−）＋２ＮＨ。
３ｇｌｕｔ−ＤＨ −一一→ ２グルタメート＋ＮＡＤ（Ｐ）計： ＣｔＨ
ｓＯＨ＋ ２−オキソゲルタレ−）＋２ＮＨ。
−〉 ２グルタメート十ＣＨ，Ｃ００Ｉｌバツチ組成（
ｍＭ）： リン酸カルシウム３００、ｐＨ８、ＮＡＤま
たはＮＡＤＰ １．５、ＨＳＣｏＡＯ，３、ＡＤＰ（グ
ルタメート脱水素酵素を活性化する）３．０．２−オキ
ソグルタレート１００、硫酸アンモニウム２００、硫酸
マンガン１．２、エタノール６８８、テトラサイクリン
０．０２２１１１９／叶、グルタメート脱水素酵素１５
Ｕおよびクロストリジウム・クルイベリＤＳＭ５５５溶
解質３゜５１１９タンパク質。
ｍＭ）： リン酸カルシウム３００、ｐＨ８、ＮＡＤま
たはＮＡＤＰ １．５、ＨＳＣｏＡＯ，３、ＡＤＰ（グ
ルタメート脱水素酵素を活性化する）３．０．２−オキ
ソグルタレート１００、硫酸アンモニウム２００、硫酸
マンガン１．２、エタノール６８８、テトラサイクリン
０．０２２１１１９／叶、グルタメート脱水素酵素１５
Ｕおよびクロストリジウム・クルイベリＤＳＭ５５５溶
解質３゜５１１９タンパク質。
この条件下では、補酵素Ａ（ＨＳＣｏＡ）を添加する必
要がない。反応速度は、補酵素Ａを用いても用いなくて
も同じである。
要がない。反応速度は、補酵素Ａを用いても用いなくて
も同じである。
触媒量のＮＡＤ存在下のグルタメートの生成を第２表に
示す。
示す。
この実験により、この系によってＮＡＤＨおよびＮ Ａ
Ｄ Ｐ Ｈを再生し得ることがわかる。この目的のた
めに、生成したアセチルリン酸を付加的な方法によって
分解する必要がない。ＮＡＤＨの再生中、溶解質の活性
が低下することなく触媒量のＮＡＤｌ、５ｍＭを６７回
再生する。
Ｄ Ｐ Ｈを再生し得ることがわかる。この目的のた
めに、生成したアセチルリン酸を付加的な方法によって
分解する必要がない。ＮＡＤＨの再生中、溶解質の活性
が低下することなく触媒量のＮＡＤｌ、５ｍＭを６７回
再生する。
第２表
実施例５
ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＡＴＰの同時再生第３表に、ＡＴ
ＰおよびＮＡＤＨを同時に再生し得ることを示す。実施
例２に記載の物質に加えて、本実施例のバッチは、グル
コース１１００ＩＩＩ。
ＰおよびＮＡＤＨを同時に再生し得ることを示す。実施
例２に記載の物質に加えて、本実施例のバッチは、グル
コース１１００ＩＩＩ。
ヘキソキナーゼ１５Ｕ１クロストリジウム・スポロゲネ
ス（ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）Ａ Ｔ ＣＣ３５８４の粗
溶解質２１９タンパク質を含有し、１時間毎にアセトア
ルデヒド５０ｍＭを加えた。Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｈの再生
も同様に行なう。
ス（ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）Ａ Ｔ ＣＣ３５８４の粗
溶解質２１９タンパク質を含有し、１時間毎にアセトア
ルデヒド５０ｍＭを加えた。Ｎ Ａ Ｄ Ｐ Ｈの再生
も同様に行なう。
第３表
実施例６
ＮＡＤＰの再生
以下の反応式で示されるように、ＮＡＤＰの再生は、ア
セトアルデヒド／クロストリジウム・クルイベリ粗抽出
物系を用いても行なうことができＧ−６−Ｐ、脱水素酵
素 Ｇ−６−Ｐ ＋ＮＡＤＰ ６−ホスホグルコネート＋ＮＡＤＰＩＩＣＨ，ＣＨ，Ｏ
Ｈ＋ ＮＡＤＰ 計二 Ｇ−６−Ｐ ＋ ＣＨ，Ｃ１０２−ホスホグ
ルコネート＋ＣＨ−ＣＩＩ＊ＯＨ第４表に、各時間後の
グルコース−６−リン酸の脱水素化を示す。バッチの組
成（＋ｎＭ）： リン酸カリウム緩衝液２００、ｐＨ７
、ＮＡＤＰ １．５、グルコース−６−リン酸Ｉ００、
アセトアルデヒド６０．２ｔｔｔｇタンパク質／ｚ（ｌ
およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素５Ｕ／Ｊ０ 第４表 実施例７ ＮＡＤの再生 ＮＡＤの再生を、以下の反応式のように行なった。
セトアルデヒド／クロストリジウム・クルイベリ粗抽出
物系を用いても行なうことができＧ−６−Ｐ、脱水素酵
素 Ｇ−６−Ｐ ＋ＮＡＤＰ ６−ホスホグルコネート＋ＮＡＤＰＩＩＣＨ，ＣＨ，Ｏ
Ｈ＋ ＮＡＤＰ 計二 Ｇ−６−Ｐ ＋ ＣＨ，Ｃ１０２−ホスホグ
ルコネート＋ＣＨ−ＣＩＩ＊ＯＨ第４表に、各時間後の
グルコース−６−リン酸の脱水素化を示す。バッチの組
成（＋ｎＭ）： リン酸カリウム緩衝液２００、ｐＨ７
、ＮＡＤＰ １．５、グルコース−６−リン酸Ｉ００、
アセトアルデヒド６０．２ｔｔｔｇタンパク質／ｚ（ｌ
およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素５Ｕ／Ｊ０ 第４表 実施例７ ＮＡＤの再生 ＮＡＤの再生を、以下の反応式のように行なった。
グルコース脱水素酵素
ＮＡＤ＋グルコース
Ｎ Ａ Ｄ Ｈ＋グルコン酸
Ｎ Ａ Ｄ ＋ ＣＨ３ＣＨｔ ＯＨ
第５表に、各時間後のグルコースの脱水素化を示す。
一般的反応条件下、以下の組成（ｍＭ）でインキュベー
トしたニリン酸カリウム緩衝液２００、ｐｌ（７，０、
ＮＡＤ １、グルコース１００、グルコース脱水素酵素
（ＥＣ１，１，１，４７）（メルク社製）２０Ｕ、クロ
ストリジウム・クルイベリ溶解質２ 、７ ｍｇタンパ
ク質、ＣＨ３０Ｈ０５３ｍＭ（ｔ＝０および０．５時間
の時に添加）。
トしたニリン酸カリウム緩衝液２００、ｐｌ（７，０、
ＮＡＤ １、グルコース１００、グルコース脱水素酵素
（ＥＣ１，１，１，４７）（メルク社製）２０Ｕ、クロ
ストリジウム・クルイベリ溶解質２ 、７ ｍｇタンパ
ク質、ＣＨ３０Ｈ０５３ｍＭ（ｔ＝０および０．５時間
の時に添加）。
第５表
特許出願人 ヘンケル・コマンデイットゲゼルシャフト
・アウフ・アクチェン
・アウフ・アクチェン
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、補酵素、例えば アデノシン三リン酸、 アセチル補酵素Ａ、 アセチルリン酸、 還元ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド、還元ニ
コチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸、 酸化ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドおよび／
または 酸化ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸 を、生理的条件下に生じるその直接初期生成物から酵素
的に調製する方法であって、該初期生成物と、還元剤と
して炭素原子２〜４個を有する１級アルカノールおよび
／またはアルカナールまたは酸化剤として炭素原子２〜
４個を有するアルカナールとを、クロストリジウム・ク
ルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ
）種の微生物株の細胞溶解質および要すれば他の酵素の
存在下に反応させることを含んで成る方法。 ２、細胞壁を酵素的、物理的または化学的に破損した細
胞および要すればＤＮアーゼによって解重合したＤＮＳ
を含んで成る懸濁液を細胞溶解質として使用する第１項
記載の方法。 ３、濃度０．１〜０．５ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液中の
、好ましくは新鮮なクロストリジウム・クライベリ種微
生物の細胞懸濁液を、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ約７
で、含水細胞材料１ｇ当たり５〜３０ｍｇ、好ましくは
１５〜２０ｍｇの標準的な市販リゾチームおよび０．５
〜３ｍｇ、好ましくは１．５〜２ｍｇの標準的な市販Ｄ
Ｎアーゼの存在下に、２５〜４０℃、好ましくは３５〜
３７℃の温度で、２０〜９０分間、好ましくは６０〜８
０分間消化し、要すれば０℃で超音波処理に付した細胞
溶解質を使用する第１項および第２項に記載の方法。 ４、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を、還元ニコチンア
ミド−アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／ま
たは還元ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン
酸（ＮＡＤＰＨ）並びに要すればアセチルリン酸および
／またはアセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）との混
合物中で調製する第１〜３項のいずれかに記載の方法。 ５、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを反応させ、エタノールの生成を伴
ってＮＡＤ（Ｐ）とする第１〜４項のいずれかに記載の
方法。 ６、アルカノールおよびアルカナールとしてそれぞれエ
タノールおよびアセトアルデヒドを、生成する補酵素ま
たは反応させる基質に対して化学量論的に過剰に使用す
る第１〜５項のいずれかに記載の方法。 ７、クロストリジウム・クルイベリ種のＡＴＣＣ８５２
７、ＡＴＣＣ１２４８９、ＤＳＭ５５６、ＤＳＭ５５７
、ＤＳＭ５６０、ＤＳＭ５６２、ＤＳＭ５６３、ＤＳＭ
５６４および特にＤＳＭ５５５株のうちの１種の微生物
株を使用する第１〜６項のいずれかに記載の方法。 ８、再生する補酵素１ｍｍｏｌ当たり溶解質タンパク質
が２〜５０ｍｇ、好ましくは２０〜４０ｍｇ（ブラッド
フォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法による測定値）存在す
るような量でクロストリジウム・クルイベリの溶解質を
使用する第１〜７項のいずれかに記載の方法。 ９、ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６．７５〜７．５の緩
衝溶液中で行なう第１〜８項のいずれかに記載の方法。 １０、追加の酵素として市販のアセトキナーゼを、再生
するＡＴＰまたはリン酸化する基質１ｍｍｏｌ当たり５
〜２０Ｕの量で使用する第１〜９項のいずれかに記載の
方法。 １１、補酵素ＡＴＰ、アセチル−ＣｏＡ、アセチルリン
酸、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰまたはそ
の混合物（ただしＮＡＤ（Ｐ）とＮＡＤ（Ｐ）Ｈの混合
物を除く）を、生理的条件下、これらの補酵素を消費す
る反応混合物内で連続的に調製する第１〜１０項のいず
れかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE3505397.6 | 1985-02-16 | ||
| DE19853505397 DE3505397A1 (de) | 1985-02-16 | 1985-02-16 | Verfahren zur coenzymregenerierung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61187798A true JPS61187798A (ja) | 1986-08-21 |
Family
ID=6262714
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61033676A Pending JPS61187798A (ja) | 1985-02-16 | 1986-02-17 | 補酵素の再生方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0195230A3 (ja) |
| JP (1) | JPS61187798A (ja) |
| DE (1) | DE3505397A1 (ja) |
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| JP2818695B2 (ja) * | 1991-01-25 | 1998-10-30 | 財団法人野田産業科学研究所 | Ｎａｄｈキナーゼ及びその製造法 |
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-
1985
- 1985-02-16 DE DE19853505397 patent/DE3505397A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-02-08 EP EP86101648A patent/EP0195230A3/de not_active Withdrawn
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- 1986-02-17 JP JP61033676A patent/JPS61187798A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| DE3505397A1 (de) | 1986-08-21 |
| EP0195230A3 (de) | 1987-10-14 |
| EP0195230A2 (de) | 1986-09-24 |
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