JPS61176527A - 抗ウイルス感染剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、公知のアデノシン誘導体の用途、すなわちイ
ンビボ抗ウィルス剤、に関する。

先行技術 アデノシンの誘導体として、下記式ＣＩ〕で示されるも
のが知られている（以下において２’−５′Ａというこ
とがある）。

ＯＨ 〔式中、ｎは２ないし８の整数、ｍは工ないし４の整数
、ＸはＯＨまたは■をあられす〕上記式ＣＩ〕で示され
るアデノシン誘導体は、例えばｎ　＝　ｍ　＝　２およ
びＸ　＝　ＯＨのときの２’−５′Ａは５′−トリホス
ホリルアデニリルー（２’−５’）−アデニリルー（２
’−５’）−アデノシンであるが、この２’−５′Ａは
、インターフェロン作用機構の研究途上で発見された、
リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を活性化する作用を有
するオリ♂ヌクレオチドである（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、べ岨。

２５６　（１９７８）　、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１
０５　、４７　（１９７９）　）−すなわち、−例をあ
げれば、インターフェロンで処理した細胞の抽出液とア
デノシン三リン酸（ＡＴＰ）および二重鎖ＲＮＡを数分
間反応させると、抽出液中に存在する酵票の作用によっ
てＡＴＰから低分子物質の２’−５′Ａ　（ｎ　＝ｍ＝
　２、Ｘ＝ＯＨ）が合成される。合成された２’−５′
ＡはａＮａｓｅを活性化するため、ポリソームを形成し
ているｍＲＮＡが分解されて、その結果として蛋白買合
成が阻害されるものと考えられている。また、ｎ＝３．
ｎ＝４．などの２’−５′Ａも同様に生体内に見出され
ており、やはり同様の作用を有するものとして知られて
いる（前記文献）。

一方、一般にウィルス感染疾患忙対する有効な薬剤の開
発が望まれているのは言うまでもなく、例えば特に大き
な社会問題となっているヘルペス感染症については、こ
れに有効な薬剤はまだ十分に開発されていないのが現状
であり、就中全身的に投与できる薬剤あるいは有効な外
用剤の開発が望まれている。

ところで、前記２’−５′Ａ（ｎ＝ｍ＝２、Ｘ＝ＯＨ）
の抗ウィルス作用については、１ＭＣウィルス（脳心筋
炎ウィルス）を感染させたＢＨＫ細胞に２’−５′Ａを
取り込ませると、ウィルス増殖が抑制されたという報告
（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、−１０５、４７（１９７９）
　）　、リン酸カル７ウムの存在下で２’−５′Ａをマ
ウスＬ９２９細胞に取り込ませた場合、１１０１ｎの濃
度で水痘性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）の増殖が顕著に抑
制されたとい５報告（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

１０１　、８１　（１９８０）　）がある。しかしなが
ら、これらの報告はいずれもインビトロにおける実験で
あり、いまだ２’−５′Ａの抗ウィルス作用をインビボ
において確認した例はない。また、これらの報告に用い
たウィルスは、感染細胞の細胞質において増殖すること
、およびウィルスを構成する核酸の種類がＲＮＡである
という点で、例えばヘルペスウィルス（感染細胞の核に
おいて増殖、ウィルスを構成する核酸の種類はＤＮＡ　
）などとは相違しており、さらに前述のインターフェロ
ンによる抗ウィルス作用のメカニズムにおける２’−５
′Ａの果たす役割がいまだ明確に解明されていない現状
では、必ずしも事前に、特にインビボにおいて、２’−
５’人が細胞に感染したウィルスの増殖を阻止ないし抑
制するという作用を推定できるものではない。

本発明は、現代の重大な疾患の一つであるウィルス感染
症の治療ないし抑制する医薬を提供することを目的とし
、２’−５′Ａが％にインビボの実験、すなわちウィル
スに感染した動物に対する投与、においてその症状の発
現を抑制したとい５事実の発見に基づ（ものである したがって１本発明によるインビボ抗ウィルス感染剤は
、下式で示される化合物またはその塩を有効成分として
含有すること、を特徴とするものである。

ＯＨ 〔式中、ｎは２ないし８の整数、ｍは工ないし４の整数
、ＸはＯＨまたはＨをあられす〕効果 後記実験例から明らかなように、本発明で用いる２’−
５′Ａ’は、インビトロにおける活性はＨ８Ｖ感染ＢＨ
Ｋ細胞にて、インビボにおける活性もモルモット膣にて
、それぞれその効果が実証された。さらに、ＢＨＫを常
細胞に対する毒性がないこと、およびモルモット膣にお
ける実験でも創作用が観察されなかったことにより、本
発明の抗ウィルス感染剤の有用性は明らかである。

本発明で用いる有効成分は前記した通りであり、前述の
よ５にその一部は生体内にも存在するものであるｂｔ、
合成による取得方法もいくつか提案されている。例えば
、２’−５′Ａを合成する場合、アデノ７ンの３′水酸
基をメトキクテトラヒドロピラニル基で保護し【リン酸
トリエステル法で取得する方法（Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ、、７
３９９　（１９７９）　）、同様にテトラヒドロフラニ
ル基で保護して合成・取得する方法（特開昭５８−６２
１９８号公報）などである。また、化合物の安定性とい
う観点からすると２’−５′Ａのリボース部分の３′位
をデオキシ体にすると好ましい場合があり（ＦＥＢＳ　
Ｌｅｔｔ−、０５１９（１９８３）　）。

この化合物（すなわちＸ＝Ｈ）についても本発明者は後
記実施例と同様の効果を確認しており、本発明で用いる
有効成分として好適に用いられる。

しかし、好ましい化合物はＸ＝ＯＨのものであり、就中
ｎ　＝　ｍ　＝　２のものが代表的である。

これらの化合物の塩とは、前記式ＣＩＩのリン酸部分の
水酸基のＨが任意の陽イオンと置換した構造のもの、す
なわちＮａ、に、　Ｃａ％Ｍｇなどのアルカリ金属ない
しアルカリ土類金属、アンモニウム塩およびアミン塩な
ど、または他の化合物との複合塩、すなわちリン酸カル
シウムなどとの複合塩であることを意味する。これらの
塩は言うまでもなく、公知の置換反応、などｋより容易
に取得することができる。

本発明による抗ウィルス感染剤、−例として抗ヘルペス
ウィルス感染剤、としては、遊離の酸またはリン酸カル
シウムとの複塩が好ましい。

抗ウィルス感染剤 本発明に用いる抗ウィルス感染剤は、前記式ＣＩ］で示
される化合物またはその塩を有効成分とするものである
。そしてこの医薬は、これらの化合物のいずれか単独ま
たは相互の混合物からなるか、これと液体または固体の
製剤上の補助成分たとえば賦形剤、結合剤、希釈剤とか
らなるか、のいずれかであることができる。

そして投与の剤形としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセ
ル剤、トローチ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、眼軟膏剤、
点眼剤、ローション剤など投与可能な任意のものがあり
得て、経口的または非経口的に投与することができる。

投与量は年令、体重、症状により適宜増減するが、例え
ば２’−５′Ａ（ｎ＝ｍ＝２．Ｘ＝ＯＨ）の場合、非経
口的たとえば外用剤としては０．０１１ｎ９〜１００ダ
、好ましくは０．１１１１〜１０ダ、を−同量として含
有するものを適用できる。

また、本発明による抗ウィルス感染剤は、ヒト以外の動
物例えばウマ、イヌ、鳥類、にワトリ、シチメンチョウ
など）、魚類など罠も適用できる。

本発明による抗ウィルス感染剤の一具体例は、抗ヘルペ
スウィルス感染剤である。その場合の剤型は外用剤とし
てのそれであることがふつうであり、また外用剤のとき
の基剤はその全部または一部がポリエチレングリコール
からなるものが代表的である。

なお、後記実験例においては対象のウィルスとしてすべ
てヘルペスウィルスを用いているが、インターフェロン
はウィルスの種類によらず一般に抗ウィルス活性を示す
ので、その作用における中間作用物質であるところの２
’−５′Ａもウィルス特異性のない一般の抗ウィルス剤
と考えることができ、したがって本発明による抗ウィル
ス感染剤の適応症はヘルペス感染症に限られるものでは
ない。

実験例 実験例１ ＢＨＫ（ｂａｂｙ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｋｉｄｎｅｙ）細
胞を５％ＦＣ８（ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ）
を含むＩＭのＭＥＭ（Ｅａｇｌａ’ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ
　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉａ）の入ったＵのウェ
ルに１ウエルあたり１０５細胞ずつプレートシた。細胞
を５％ＣＯ□を含む大気中、３７℃で冴時間インキュベ
ートした。インキユベーシヨンの後、これらのうち１２
ウエルな５％ＦＯ８を含む口に入った、１６０μｔのＨ
８ＶＩ懸濁液にて感染させり（ウィルスの力価：　７−
６　Ｘ　１０　　ｐｆｕ／ｍ　）。

この細胞を上と同条件で３時間再びインキュベートし、
培地を除去して３００μｔの新しい培地を加えた。ｐ’
３２２ｚ−５１Ａ溶液を加え（２５μｔ、２００μｔ）
（２’−５′Ａの比活性は２５８０　ｃ　ｉ　／ｍ　ｍ
ｏ　ｌ　、実際のｃｐｍは３２３９／１　ｐｇ　）、細
胞を上と同条件で１２時間インキュベートした。培地を
除去後、それぞれのウェルを１−のＰＢＳで洗浄した。

それぞれのウェルに２００μｔのＩ　Ｍ　ＮＨ４ＯＨを
加えて細胞を溶解し、さらにくり返しピペッティングに
より破壊した。

この溶液の部分標本（１６０１）をＷｈａｔｍａｎ　３
　ＭＭフィルターディスク上にとり、乾燥後、シンチレ
ーンヨンカウンター（ｐａｃｋａｒｄ社）にて計数した
。

結果は、次表に示す通りであった（細胞数はいずれも３
Ｘ１０５／ウエル）。

（イ）非感染細胞を用いた場合 （ロ）感染細胞を用いた場合 ＊７例の平均値 これらの結果から、わかるように、本実験の条件下にお
いて添加したｐ３２２′−５′人の大部分が細胞に取り
込まれた。したがって、Ｂ［ＪＩ胞の取り退入のための
容量は、与えられた量を越えるものであることがわかる
。言うまでもなく、細胞に取り込まれるか否かは抗ウィ
ルス感染剤としての条件の一つと考えられる。

また、同様の実験系において３Ｔ３細胞および８Ｖ３Ｔ
３細胞を用いた場合も、同様の結果を示した。

１０’のＢＨＫ細胞を５１ＦＣ８を含む１ｍのＭＥＭの
入ったウェルにプレートしも細胞を５％ＣＯ□を含む大
気中でｎ＝で冴時間インキエペートした。Ｈ８Ｖ（ヘル
ペス単純　　゛ウィルス）工を５４ＦＣ８を含む加μｔ
のＭＥＭＫ加えた。

ウィルスの力価（ｔｉｔｒｅ　）は７．６　ＸＩＯ’　
ｐｆｕ／ｍであった。ａａをさらに３７℃で３時間イン
キュベートし、培地を除去後３ｏｏ　ｐｔの新しい培地
を加えた。それぞれのウェルに各種濃度のＣａＰｉ−２
’−５′Ａ（ｎ＝２）を含むＨＥＰＥＳ緩衝液５μｔを
加えた。細胞をさらに１２時間インキュベート後、培地
を除去して１−の新しい培地を加えた。細胞をさらに１
５、時間インキュベートし、培地を除去して後、ＰＢＳ
　１１４で洗浄し、ディ７コクイツク（Ｄｉｆｃｏ　Ｑ
ｕｉｃｋ）で染色した。

太き（かつ可視の細胞シンンチアを計数し、集計した。

結果は、次表に示す通りであった。

この表かられかるように、　ＣａＰｉ−２’−５′Ａの
濃［５００ｎＭ　においてシンジチア形成に対するほと
んど完全な阻害活性をみることができる。２’−５′Ａ
投与量を減少させると活性も減少する。

なお実験例１および本実験において用いた試薬等の詳細
は以下の通りであり、後述の実験例においても特にこと
わらない限り同一のものを用いている。

ＰＢＳ：（組成）　　ＮａＣ１０，８％ＫＣ１０、０２
％ Ｎａ２ＨＰＯ４０，１１５％ ＫＨ２ＰＯ４０，０２％ ｃａｃ１２０−０１　％ ＭｇＣ１□　　　０．０１　％ ）ＩＥＰＥＳ緩衝液：　５００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（Ｐ
）１７．１　）、５２ｍＭＮＪＩＣＩおよび１−５　ｍ
ＭＮａ　２ＨＰＯ４＠１２Ｈ２０を含む。

ＣａＰｉ−２’−５′Ａ：　（調製法）ｏ、ｏ４ｍＭ２
１−５′Ａ水溶液４ｔｘｔ、Ｏａ４ｍＭ２’−５′Ａ水
溶液２ｔｔ１゜０　、４　ｍＭ　２’−５′Ａ水溶液４
ｔｘｔおよび４．０ｍＭ２’−５′Ａ水溶液２μｔをそ
れぞれ用意し、それぞれＫＴＥ緩衝液（１ｍＭ）リス塩
酸、　０．１ｍＭＥＤＴＡ％ｐＨ７，９）を加え【最終
容量５３０μＬとした。

これに５８．５μ／、の２．５　Ｍ　Ｃａ　Ｃｌ　２を
加え、さらに６５４μｔのＨＥＰＥＳ緩衝液を加えた。

実験例３ ＢＨＫ細胞に対する２’−５′Ａの無毒性ＣａＰｉ　−
２’　−５′Ａを含むＨＥＰＥＳ緩衝液をウェルに添加
する操作までは実験例２と同じである。細胞をさらに３
７℃で１２時間インキエペートし、培地を除去し、それ
ぞれのウェルを４００μｔのＰＢＳで洗浄シタ。０．２
５％のトリプシン１５０μｔによりトリプンナイズして
、１分間室温にて放置した。トリプシンを吸引戸去し、
さらに３７℃で１５分間インキュベートした。その後、
５％ＦＣ８を−含むＭＥＭ　５００μｔをそれぞれのウ
ェルに加え、細胞懸濁液を１．５ｒＩＬｔのエツ’ｙド
ーフ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブにピイソテイング
して採取した。この操作は、チューブの細胞懸濁液の全
量が０．９１になるまで４００μｔのＭＥＭを用いて（
り返した。それぞれのチューブに０．４％トリノ４ンブ
ルー含有のＰＢＳ　１００μｔを加え、５分間室温に放
置した。そして細胞を血球計算盤にて計数し、集計した
。結果は、次表に示す通りであった。

すなわち、Ｈ８ｖ感染後の細胞および感染していない細
胞ともに染色された細胞（死細胞）数がＯであること、
そして染色されなかった細胞（生細胞）数が同濃度の２
’−５′Ａの正常ＢＨＫ細胞に対する毒性は本実験で用
いた投与量においてはないものと結論できる。

体重的５００９の雌のノ１−トレーモルモット１０匹を
チャールズリノ々−社から入手し、メトキクフルラン麻
酔下に、Ｈ８Ｖ　ｎを３．３　Ｘ　１０’　ｐｆｕ膣内
に注射器にて接種した。

１群５匹とし、一方はウィルスコントロール群。

一方ハ２５　Ｖ／Ｖ％ポリエチレングリコール水溶液０
−４１３μを中に２’−５′Ａ　１５Ｑｎｍｏｌｅを混
合した製剤を１日１回、６日間膣内に注入した。

結果は、下記の通りであった。すなわち、ウィルスコン
トロール群は、接種４日後に膣口に最初の小胞の集団が
現われ、この集団は、５〜７日の間に膿胞化ないしは潰
瘍化し、幾皿かのモルモットは後肢に麻痺症状を示した
。そして１４日目立でにこの群のすべてのモルモットが
死亡した。一方、２’−５′Ａ投与群においては完全な
抑制効果を示したのみならず、モルモットの行動異常、
患部のただれ、毛なみの異常など一切の副作用は観察さ
れなかった。

実験例５ 実験側番と同様の操作にて２’−５′Ａ投与量をＯ１５
，１０，２０，４０，７５およびｌ　５Ｑ　ｎ　ｍｏｌ
ｅｏと変化させ、効果に及ぼす影響をみた。

結果は、下記の通りであった。すなわち、２′−５′Ａ
濃度を増加させる忙したがって顕著な抑制効果がみられ
た。抑制効果は膣口に認められる膿胞ないし潰瘍の程度
によって容易に知ることができた。なお、７５ｎｍｏｌ
ｅを投与したモルモットまで（群Ｃ−Ｈ）は最終的にす
べ【死亡し、１５０μｍｏｌｅ投与モルモットのみ生存
した。

また、同様にウィルス感染後４日後に２’−５′Ａを１
５０μｍｏｌｅ投与した場合は、膣口くは膿胞ないし潰
瘍は認められず、従ってウィルス感染後の治療、抑制剤
としても２’−５′Ａは有効に作用することが判る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般に２′−５′Ａと総称され、下式で示される化
   合物またはその塩を有効成分として含有することを特徴
   とするインビボ抗ウィルス感染剤。 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは２ないし８の整数、ｍは１ないし４の整数
   、ＸはＯＨまたはＨをあらわす〕 ２、抗ヘルペスウィルス感染剤である特許請求の範囲第
   １項記載の抗ウィルス感染剤。 ３、外用剤である特許請求の範囲第２項記載の抗ウィル
   ス感染剤。 ４、ポリエチレングリコールを基剤の全部または一部と
   して含有する特許請求の範囲第３項記載の抗ウィルス感
   染剤。 ５、化合物の塩がリン酸カルシウムとの複合塩である特
   許請求の範囲第１項記載の抗ウィルス感染剤。 ６、ＸがＯＨであり、ｎが２、ｍが２である特許請求の
   範囲第１〜５項のいずれかに記載の抗ウィルス感染剤。