JPS61109798A - ペプチドの製造及び精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、カルシトニン類、ソマトスタチン、バソプレ
ッシン及びオキシトシンを含め穴生物学的に活性なペプ
チドの製造方法ｌこ関する。本発明には新規な製造条件
、及び製造溶液から単離された中間体が包含される。

く本発明の背景〉 本発明は広くはペプチドの環化に関する。より特には本
発明は偶数個のシスティン基を含んでいるペプチドを処
理し、か＼る基対間にジスルフィド結合をつくシ出し、
そして環構造を形成する方法に関する。本発明の方法は
、生物学的活性を有し且つ動物及びヒトのめる種の疾病
の処置で治療的価値を有するペプチドの合成で有用であ
る。

ジスルフィド環を持つ多くのペプチドは、生物学的活性
を有し且つ疾病の治療で有効なことが知られている。ソ
マトスタチン、これは米国特許第３．９０４．５９４号
（Ｇｓ４Ｊｊ−値ｓｓ　ａｔ　ａｊ、）に記載されてお
り、下垂体による成長ホルモンの阻害に有効であること
が示されている・ソマトスタチンは先端巨大症及び糖尿
病の治療での使用が提案されていた。ソマトスタチンは
そのアミノ酸配列順序の３及び１４の位置のシスティン
残基の間にジスルフィド結合を持っている。バソプレッ
シン及びその類似体リプレツシンはヒトの抗利尿系とし
て使用されている。これらのペプチドはそのアミノ酸配
列順序の１及び６の位置のシスティン基の間にジスルフ
ィド架橋構造を持っている。オキシトシンは竺］、動物
の分娩誘発又は刺戟の目的及び分娩後の子宮出血の制御
にも使用されている。オキシトシンはそのアミノ酸配列
順序の１及び６の位置のシスティン基の間６ごジスルフ
ィド架橋構造がある。カルシトニン類はそのアミノ酸配
列１暇序の第１及び第７の位置のシスティア基金含む環
構造を有している。カルシトニンはベージェット病の治
療で有効である。

環構造のジスルフィド結合によって結合したシスティン
基を持っている上述の生物学的に活性なペプチドのアミ
ノ酸配列順序は次の表１に示されている。

鰻のカルシトニンは２６の位置にＡｓｐ、２７の位置に
Ｖａｌ、及び２９の位置にＡｌａｋ持つ以外は鮭カルシ
トニンの構造である。

本発明は、生物学的活性を保持又は増大させる様な、天
然産の配列順序の１個又は２個以上のアミノ酸をに性又
は欠失させるか、又は１個又は２（１１以上のアミノ酸
を付加し几当業界で知られている数多くのカルシトニン
類似体にも適用出来る。

米国特許第３．９２６．９３８．４，０６２．８１５．
３．９２９・７５８．４，０３３．９４０．４，３３６
．１８７．４３８＆２３５及び４，３９１．７４７号は
上で言及した鮭カルシトニンを含めたカルシトニンの改
良された合成法を開示している。

〈従来の技術〉 如何ｌこして閉じたジスルフィド環構造を持ったペプチ
ドを合成的につくるか、即ち所望のアミノ散配列順序を
持つた未環化ペプチドを形成して、次に酸化剤を用いる
酸化工程をペプチドに施して、２個のシスティン残基の
間にジスルフィド結合を形成させるかは公知である。２
個のシスティン残基の間にジスルフィド結合を持つ九ペ
プチド金つくシ出す友めの酸化的方法は文献：　Ｈｏｐ
ｅ　ｅ　＃Ｄ、＊　Ｍｓｒｔイ。

Ｅ、Ｘ、＊　６ｓｄ　ｄｓ　Ｖｉｇｓｍａｓｄ＊　Ｖ、
ｅ　Ｊ、　ｆ１４ｏ１　、　Ｃｈｍｍ、ｅＶ、２３）、
７．１５６３（１９６２）、に記載されている。

この方法は通常、ｄ％Ｖ匂ｒｎａａ％ｄ法と呼ばれてい
る。

ｄｓ　Ｗｉｇ引Ｉ％ｄ法では少なくとも１対のシスティ
ン基を持っている線状ペプチドの緩衝溶液を、一定のｐ
Ｈでペプチド溶液に７エリシアナイド塩〔ヘキサシアノ
鉄（ＩＩ）塩〕の緩衝溶液を添加する方法で、酸化する
。

ｄｓ　Ｗｉｇ％＃ａ％ｄ法及びその他の酸化的方法の主
な欠点は、極めて反応性のペプチドを酸化剤に曝すこと
で、ｌ。

これはペプチド分子の橋かけ結合及び重合を惹起させる
危険がある。閉じたジスルフィド環構造形成用の既知の
酸化的方法はペプチドの不活性化を惹起する可ｈｔ性が
あり、そして生物学的に活性なペプチド生成物の収率を
低下させる。

米国特許第３，９２９．７５８号（Ｈｓｇｈａｓ＋　ａ
ｔ　ａｌ、　）はジスルフィド環状ペプチドの別の合成
方法を記載している。

この特許の方法では、その１つが５−フルキルチオ基に
よって保護され几少なくとも２個のシスティン部分を持
っているペプチドを先づつくることによって、ジスルフ
ィド環状ペプチドをつくるのである。その後、保護した
ペプチドを、５乃至Ｎｏのｐｅｌｔこ実質よ＠累の無い
溶液で、転位が起って環状ジスルフィドペプチドが得ら
ｎる迄、保護するという処理をペプチドに行なう。転位
中に５−アルキルチオ基はアミノ酸連鎖から置換される
。この開示は本発明の特定の反応条件の組合わせを示唆
していない。この方法は従来使用されて来次簡単な酸化
的方法よりも時間もか＼るし、そしてペプチドは比較的
高度に稀釈することが要求されている。

米国特許第４．２１６．１４１号によれに１ジスルフィ
ド結合の形成に先２つて中間体全形成する必要の無い方
法で、２個のシスティン残基間にジスルフィド結合を持
ったペプチドが形成される。この方法は少なくとも２個
のシスティン部分のあるペプチドの単純酸化を伴う。こ
の酸化工程は、反応時瘉こ、反応混会物中のスルフヒド
リル濃度を実質上ゼロに保つ条件下で達成される。この
方法は少なくとも１対のシスティン部分を持っているペ
プチドの酸性番こした水溶液の形成を伴う。次に酸性ペ
プチド溶成を少し宛、酸化剤を含む緩衝溶液番ζ添加す
る。酸性ペプチド溶液の少量を添加するＷＡはジスルフ
ィド結合を形成させる友めの酸化反応が実質上瞬間的に
起る様にし、七して毎添加量はスルフヒドリル濃度が反
応の間、笑質上−足で無限大稀釈に等しい実質上ゼロの
範囲であるものとする。

米国特許第４．２１２．７９５号は、保護基との外部ジ
スルフィド結合に参加している２個のシスティン残基金
持つペプチドを（それがとけるならば如何なる溶液でも
良いのだが）溶液に、好ましくは水又はアルコール性溶
液に、約５乃至１０の好ましいｐＨで、酸素又は酸化剤
の不存在下で、外部ジスルフィド結合が自発的転位を受
けて所望の内部ジスルフィド・ペプチドと非ペプチド・
ジスルフィド副生物の置換を生ずる迄保持できることを
開示している。転位反応の速度は遊離チオール化合物例
えば脂肪族又は芳香族チオール、アミノ酸システィン又
はチオグリコール酸又はその誘導体の（ペプチド１モル
当、１ｊｌｌ　Ｏ，０１モル当量の量の）共存によって
促進されると言われている。この特許は転位の速度は溶
液のｐｇを５．０乃至８．５、好ましくは６．０乃至８
．５４こ調節することζこよっても促進され、そして溶
液に水酸化アンモニウム又はアルカリを添加して約７．
５ｉこすると良いと述べている。この特許によると、６
・Ｏ以下のｐＨも使用出来るが、所望されるより転位が
ゆっくりと進行し、そして約１０．０又はｌ　Ｏ，５迄
のｐＨも使用出来るが約９．０以上のｐＨを使用した場
合には収率を損う危険があるという。

〈発明の構成〉 本発明は少なくとも１対のシスティン部分を持っている
ペプチドｌこジスルフィド架橋を形成する几めの方法か
ら成る。その未環化の形態のペプチドの溶液のｐＨ’ｊ
ｉ−８，５乃至９．０の値に、溶ｇ、１−当夛約０．４
乃至１．８ＩＲＱのペプチド濃度に調節し、且つ架橋が
形成さｎる迄溶液をこｎらの条件奢こ保持することを伴
う。

く態様の詳細〉 本発明の方法はジスルフィド結合がアミノ酸連鎖中の少
なくとも１対のシスティン残基の間にある如何なる環状
ジスルフィド・ペプチドの合成にも利用し得る。ペプチ
ドの橋かけ結合及び重合を避け、そしてその他の点でも
ペプチド構造を傷めない条件下でジスルフィド結合が形
成されるので、本発明の方法は不安定な、生物学的に活
性なペプチドの合成に特に適している。

本発明の方法は、少なくとも２個のシスティン残基のあ
る任意のペプチドのアミノ酸連鎖配列順序を構築するこ
とにより、未環化ペプチド金製作することから始まる。

アミノ酸連鎖の配列順序は古典的な合成法又は固相法を
用いることによって組立てることが田米る。

好ましくは、ペプチドは固相合成法を用いて組立てられ
る。ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ樹脂）と呼ばれ
る樹脂を用いて始めることが出来る。この樹脂はスチレ
ンとジビニルベンゼンの共Ｍ會によって製造され九橋か
け結合したポリスチレン・ビーズ樹脂から誘導される。

このタイプの樹脂は公知であシ、その製造方法はＰｉａ
ｔｔａ＊　ａｔ　ａｌ。

（Ｐｉｇｔｔａ＊　Ｐ、Ｓ、ａｓｄ　Ｍａｒａｈａｌｌ
　＊　Ｇ、Ｅ、＊　Ｃｈ−ｒｎ。

Ｃｏ雪■１．ｅ　　６５０（１９７０））、及び０ｒｌ
ｏｓｕｓｋｉａｔ　　ａｌ、、　〔Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃ
ｈｕｒｎ、、　　４１．３７０１（１９７６））によっ
て示されている。橋かけ結合し次ポリスチレンＢＨＡ樹
脂は薬品供給業者から入手できる。記号はＥＲＡ樹脂（
但し■は樹脂のポリスチレン部分である）を表わしてい
る。

別の方法として、ＢＨＡ樹脂の代りにアミノ−メチル樹
脂である樹脂から始めることが出来る。

アミノ−メチル樹脂からの樹脂−ペプチドの組立は好ま
しくは、Ｇａｍｈｄａ　ａｓｄ　Ｍａｔａ襲ａｄａ　（
１ｓｔ、　Ｊ。

Ｐｅｐｔｉｄｅ　　Ｐｒｏｔａｉｓ　Ｒａａ、＊　ｌ　
８．４５１−４５８（１９８１））によって記載されて
いる種類の１ハンドル”を樹脂とポリペプチドの末端ア
ミノ酸との間に包含させる工程を含む。より好筐しくに
アルギニン又はノルロイシンを樹脂と１ハンドル”との
間に、円部参照標準として包含させる。

従って、ＥＯＣ−Ｔｏａｙｌ−Ａｒｇはジシクロへキシ
ルカルボニルジイミドＣＤＣＣＩ）及びヒドロキシベン
ゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）の存在下で樹脂と反応させ
らｎて、を生ずる。この生成物へ酸（例えばジオキサン
中のＨＣ１又バドルエン中又はメチレンクロライド中の
トリフルオロ酢酸）の添加及び続いての、例えばジイン
プロピルアミンでの中和憂こよりてＢＯＣ基が除去され
る。次にＢＯＣ−保護した１ハンドル”、 ＤＣＣＩ及びＥＯＢＴｆ加えて、脱保護したアルギニン
残基にＢＯＣ−ハンドルを結合させる。酸性化及び中相
によってノツドルからＢＯＣ基を外して後、サイクル３
２を開始し、そこではＢＯＣ−グロリン力１ハンドル”
の脱保護した窒素と結合する。

一般に、各アミノ酸は樹脂ペプチドと、適切な溶媒例え
ばトルエン、クロロホルム、メチレンクロライド、又は
ジメチルホルムアミド中で、カップリング剤の存在下で
反応させられて、そして引続いて酸を用い次に中和工程
によって脱保護される；次に次のアミノ酸が付加されて
次々と続く。

全ペプチド配列順序が樹脂上に構築される迄、アミノ酸
は一時に１ｌｌｉｌ宛不浴性の樹脂に付加される。アミ
ノ酸の官能性基はブロッキング基によって保護される。

アミノ酸のα−アミノ基は第三級ブチルオキシカルボニ
ル基又は七の等価物によって保護される。このα−第三
級ブナルオキシｆＪｋボニｈ基＠ｓｏｃとして表わす。

セリン及びトレオニンのヒドロキシル官能はベンジル又
はベンジル誘導体基例えば４−メトキシベンジル、４−
メチルベンシル、３．４−ジメチルベンジル、４−クロ
ロベンジル、ｚ、６−ジｙロロペンジル、４−ニトロベ
ンジル、ベンズヒドリル又ハその等価物に依って保護さ
れる。用語ＢｓＬ金ベンジル又はベンジル誘導体基を表
わすために使用する。

チロシンのヒドロキシル官能は未保護の１までも良いし
、ＢｍＬ基として上で示したベンジル又はベンジル誘導
体基で保護しても良いし、又はベンジルオキシカルボニ
ル又はべンジルオキシカルボニル誘導体例工ば２−クロ
ロベンジルオキシカルボニル又は２−ブロモベンジルオ
キシカルボニル基又はその等何物で保護しても良い。用
語Ｗｆ非保護状態のＭ、ＢｇＬ＆ベンジルオキシカルボ
ニル基及び、ベンジルオキシカルボニル酵導体基の両万
全示すためζこ使用する。

システィンのチオール官能は上述し九ｈｌで示され友ベ
ンジル又はベンジル誘導体保護基、及び好ましくはｐ−
メチルベンジル又はｐ−メトキシベンジルで；又なアル
キルチオ基例えはメチルチオ、エチルチオ、２−プロピ
ルチオ、外−ブチルチオ、をブチルチオ又はその等何物
で保護できる。文字Ｒ１をアルキルチオ基又はＪｇＬｆ
表わすために、そして文字Ｒｓ　ｔ　Ｒ２がアルキルチ
オの場合にＥｇＬを１そしてＲ２がＢｓｌでろる場合に
アルキルチオを懺わす友めに使用する。二者択一的に、
Ｒ８は別のシスティン基であっても良く、そしてこれは
Ｒ１がＢｍｌである場合である。アルギニンのグアニジ
ン官記はニトロ基、トシル基又はその等何物暑こよって
保護可能である。文字Ｔ’ｆｆニトロ基とトシル基とｔ
ｉわすために使用する。リシンの６−アミノ官能は好１
しくＦｉＦＭＯＣＣ９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル）で又ハペンジルオキシ力ルボニル基又はベンジ
ルオキシカルボニル肪導体例工ば２−クロロベンジルオ
キシカルボニル％３．４−ジメチルベンジルオキシカル
ボ二ル、又はその等何物で保護しても良い。文字Ｖをこ
れらの基を表わす九め（こ使用する。ヒスチジンのイミ
ダゾール窒素に用いられる保護基はトシル、ベンジルオ
キシメチル、又はベンジルオキシカルボニルでｈＤ、Ｖ
と呼ばれる。γ−カルボン酸基又はグルタミン酸はベン
ジル又はベンジル誘導体基例、ｔばセリン及びトレオニ
ンのヒドロキシ”６Ｍ保護用に記載されたもので保護さ
れる。これらの保護基は文字Ｂｚｌで示さ江る。

さて、ここでは本発明を！」のカルシトニンの合成ｌこ
焦点をあてて説明しよう。ヒトのカルシトニンｌこつい
て先に示した式から明らかな＊ｉこ、３２個のアミノ酸
が関与し、この式中では連鎖の一端のＣｙｓｌこついて
の位置１で始まシ、七して連鎖の他端の位置３２のＰｒ
ｏで終る広く認められている方法によ広番号が位置に付
されている。説明の簡潔にするために、同一の付番号法
金合成のサイクルについても利用する。ヒトのカルシト
ニンの組立てはプロリンの結合を伴うサイクル３２で始
まシ、そしてアラニンの結付を伴うサイクル３１．・・
・・・・へと続いてゆく。

吐のカルシトニン合成の３２のサイクルのそれぞれで用
いられる好ましいアミノ酸反応剤を（例示のためにだけ
用いらｎるものとして）次の表２に示す。

３２　　　　　ＢＯＣ−Ｌ−プロリン ３１　　　　ＢＯＣ−Ｌ−アラニン ３０　　　　ＢＯＣ−グリシン ２９　　　ＢＯＣ−Ｌ−バリン ２８　　　　ＢＯＣ−グリシン ２７　　　　ＢＯＣ−Ｌ−インロイシン２６　　　　Ｂ
ＯＣ−Ｌ−アラニン ２５　　　　ＢＯＣ−０−ベンジン−Ｌ−）レオニン２
４　　　　ＢＯＣ−Ｌ−グルタミン ２３　　　　　ＢＯＣ−Ｌ−プロリン ２２　　　　ＢＯＣ−Ｌ−７エニルアラニン２１　　　
　ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−）レオニン２Ｕ　　　　
ＥＯＣ−Ｎ（ｉｓ）−ＣＢＪＩ−Ｌ−ヒスチジン１９　
　　　ＢＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン１８　　　　ＢＯ
Ｃ−６−２−クロロベンジルオキシカルボレニルメチル
オキシカルボニル−Ｌ−リシン１７　　　　ＢＯＣ−Ｌ
−アスパラギン１６　　　　ＢＯＣ−Ｌ−フェニルアラ
ニン１５　　　　ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン酸β−ベン
ジルエステル １４　　　　ＥＯＣ−Ｌ−グルタミン １３　　　　ＢＯＣ−０−べ／ジルーＡ−）レオニン１
２　　　　ＢＯＣ−０−プロモーベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−チロシン １１　　　　ＢＯＣ−０−ベンジン−Ｌ−）レオニ／１
０　　　　ＢＯＣ−グリシン ９　　　　ＢＯＣ−Ｌ−ロイシン ８　　　　ＥＯＣ−Ｌ−メチオニン ジル−Ｌ−システィン ６　　　　ＢＯＣ−０−ベンジル−ｂ−トレオニン５　
　　　ＢＯＣ−０−ベンジル−Ｌ−セリン４　　　　Ｂ
ＯＣ−Ｌ−ロイシン ３　　　　ＢＯＣ−Ｌ−アスパラギン ２　　　　ＢＯＣ−グリシン サイクル１及び７で添加されるシスティンは別の方法と
して６個以下の炭素原子を持つ別の５−ｎ−アルキルチ
オ誘導体となり得る。

懺２で示したアミノ酸誘導体のそれぞれは供給業者から
購入出来る。他のカルシトニン、オキシトシン、ンマト
スタチン、及びバンブレツシン用の典型的な満足のゆく
反応剤は米国特許第４，２１２，７９５号に開示されて
いる。

次のものは、本発明に従って次に環化出来るヒトのカル
シトニンペプチドの製造方法例である。この例は限定的
にとるべきではない；当業者は等価の結果を得られる条
件、溶媒及び方法を使用できることを知っていよう。

２．０ｒ１ｖｒＬＯｌ＃アミノ基に相当する（即ち、樹
脂１ｇ当り０．９７３ミリ当量のアミノ基置換を持つ）
アミノメチル樹脂ハイドロクロライドの２０．６ｇ試料
をベガ・モ、デル５０ペプチド合成装置〔Ｖｅｇａ　Ｍ
ｏｄｇＬ５０　ＰｅｐｔｉｄｅＳＢｔｈｔｔｓｉｚａｒ
　　（Ｖａｇａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅａｌｓ、Ｄｉｖｉ
ｓｉｏｎｏｆ　Ｖｅｇａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｇｓ　
　Ｉｎｃ、、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｚ　　１１６４ＪＬＴｗｃｓ
ｏｎ、Ａｒｔｚｏｎａ　ｇ５？３４）］の反応容器に入
れた。

樹脂はメタノール（３０ｏｄ）中で５分間振鼓して膨潤
させ、次にメチレンクロライド（３Ｘ１５０ａｄ、　１
ｒｎｉｎ宛）で洗浄した。５％ジインプロピルアミン（
ＤＩＡ）のメチレンクロライド溶液（２’ＯＭ宛、１回
目１ｒｎｉｎ、ｍ’Ａ回目２ｍｔｎ、）を用いて２回処
理した。メチレンクロライド（１５０ｍ、１ｎｉｒＬ、
）で１回洗い、次に５％ＤＩＡのメチレンクロライド溶
液（２００ａｕ、１Ｆ７Ｌｊｙｃ、）で揶処理し、メチ
レンクロライド（１５０ｙｎｌ　、　ｌ　ｒｎｉｎ、宛
）で３回、そしてジメチルホルムアミド（１５０ｄ、１
ｍｆ、宛）で３回洗浄した。

２０　ｒｒａｎｏ　１６のアミノ基を含む中和した樹脂
に５０？？Ｌｒｎｏ１ｇのＮ（α）Ｂｏｃ、ｕ（ａ）−
トシル−Ｌ−アルギニンを含むアシル化溶液を加えた。

このアシル化溶液はジメチルホルムアｉ　）”（２，０
０ｎｌ）ＩＩＣＥＯＣ（Ｔｏｓ）Ａｒｇ（２５−７１１
６０ｍＷＬｏ１ｇ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール水和物（１０，７１１？　Ｏｍｒｎｏｌｅ　）を溶
かしてつくった。生成した溶液を００−５℃に冷却し、
２Ｍ　Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドのト
ルエン溶液（３０１，６０ｒｒＬｒｎｏｌｅ）を加えた
。室温で３０分間撹拌後、ジシクロヘキシル尿素の沈殿
をＦ別して、Ｐ液を樹脂に加えた。

カップリング時間は１時間と短かくても充分であるが、
便宜上混合物を一晩振盪した。樹脂を水切りし、各１分
間宛、ＤＭＦ（０１５０一部で３回、メｌ／−ルの１５
０ｍ部で３回、メチレンクロライドの１５０ｍ部で６回
洗浄した。

二／ヒドリン試験（Ｋａｉｓｅｒ　ａｔ　ａｌ、Ａｎａ
ｌ、ＢｉｏＣｈｅｍ。

３４．５９５−８（１９６９））を実施し、すべての場
合、陰性であることを確かめた。僅かな陽性でも内結合
を実施すべきである。

これは次のａ）、６）の２方法のりずれかで実施した：
ａ）好ましぐは２％ｖ７ｖ２−メルカプトエタノールを
共存させた、＋ｙｉｃＢｙ’）ジオキサン溶液を使用。

上からの樹脂を次の様に処理するニ ジオキサン＋２％Ｔｉ’／Ｖ ２−メルカプトエタノール　　３Ｘ１５０ｍｊ　　１ｒ
ｎｉｎ、宛３．５−４．０ＯＮＨＣｌジオ ｌＸ３０ｍ１ｎ。

ジオキサン＋２％ｖ７ｖ ２−メルカプトエタノール　　３Ｘ１５０１ｊ　　１ｒ
ｎｉｎ、宛メタノール　　　　　　　　３Ｘ１５０１１
ｊ　　１輌ｊ、宛メチレンクロライド　　　　３ｘ１５
０ｍ　　１ｍ５ｘ、宛ジーイソプロピルアミド ｌＸ２ｍ＜Ｆ＆。

メチレンクロライド　　　　３　Ｘ　１５０ｍｌ　　ｌ
　＠ｊ　７Ｂ　、宛ＤＩＡ（５％ｖ７ｖ）　メ’ｙ− レンクロライド溶液　　　　ＩＸＺＯＯｌｌｔ　１ｍ５
３゜メチレンクロライド　　　　３　ｘ　１５０ｍ　　
ｌ　ｘｉ　３　、宛ＤＭＦ　　　　　　　　　３Ｘ１５
０ｓｕ　　１ｒｎｉｎ、宛ｂ）好ましくは２％ｖ７ｖ２
−メルカプトエタノールを共存ざぜた、５０％ｖｉｖ　
トリフルオロ酢酸のメチレンクロライド溶液を使用。

ＢＯＣ−保護した樹脂を次の様に処理する：ノール　　
　　　　　　　　　３Ｘ１５０ＲＪ　　１ｍ１ｎ。

５０％Ｖ／Ｖ　　ＴＦＡ（Ｄメ ｌＸ３０ｍ５ｘ。

ノール　　　　　　　　　　　３Ｘ１５０ＪＥｌ？　　
１ｒｒＬイル。

メタノール（１５％！７ｙ） のメチレンクロライド溶液　　３Ｘ１５０１１ｔ　１ｍ
１ｎ。

メチレンクロライド　　　　　ｌＸ１５０ＩＲ１１ｍ１
ｎ。

メチレンクロライド　　　　　Ｉ　Ｘ　１５０Ｒｔｌ　
ｒｎｉル。

ンクロライρ溶液　　　　　　ｌＸ２００ｍ　　１ｒｎ
ｉｎ。

）１ｆＬ／７クロライ１’　　　　　　３Ｘ１５０Ｉ１
１ｔ１ｍｉｎ。

ＤＭＦ　　　　　　　　　　　　３Ｘ１５０ａｆｆ　　
１ｍ１ｘ。

これは、２倍過剰、４０ｍｍｏｌｅ、のアシル化剤を便
用した以外は、アルギニンＩＡＡＩＩＣついて述べたの
と同様にして実施した。ＢＯＣ基の除去はＡｒｇ　ＩＲ
ＡＫっ埴てと全く同様に実施した。

一般には、これらの残基の各々は、Ａｒｇ　ＩＲＡにっ
１て記載したのと同様に包含され、そしてＢＯＣ基はＨ
ＣＩ；／ジオキサン又はＴＦＡを用いて除去した。ＡＪ
ｃＬ（３１）のＰｒ。

（８２）への、及びｐｈａ（ｚ２＞のＰｒｏ（２３）ヘ
ノカップｌＪ７グの完了はイサチン試験（Ｋａｉｓａｒ
　Ｅ、　、ＢｏｓｓｉｎｇａｒＣ，Ｄ、、Ｃｏ１ｅｓｃ
ｏｔｔ、Ｒ，Ｌ、ａｔｓｄ　ＯＥｓｇｎ、Ｄ、Ｂ、。

Ａｎａｌｙｔｉｃａ　Ｃｈｉｒｎｉｃａ　Ａｃｔα、、
１１８．１４９（１９８０））によってモニターした。

またＧ１ＩＣ２８＞とＩＪｇ（２？）とはジペプチドＥ
ＯＣＨａ　Ｇｌ’ｌを用いるなどして、個々のアミノ酸
についてと同一の条件で一諸に包含させることが可能で
ある。これは合成時間の節約という利点だけがある。

更にジペプチドＢＯＣＰｈａ　Ｐｒｏを用い、個々のア
ミノ酸と同一の条件を用いて１．Ｐｒｏ（２３）とＰＡ
ｇ（２２）を包含させるのが好ましい。

Ｈｓａ（２０）の付加 アシル化溶液をＡｒｇ　ＩＲＡ　についてと同一の方法
で調製したが、ＤＣＣＩのトルエン溶液を添加して後、
即刻冷浴液を樹脂に加えた。

ＰＡｇ（１９）の付加 Ａｒｇ　ＩＥＡについてと同一。

Ａｒｇ　　ＩＡＡについて述べた様にアシル化溶液を調
製する。好ましい脱ブロッキング方法はＬｙｓ（１８）
から末端へはＭＣＩよりもＴＦＡを使用することである
。Ｎｅ　ｔ　（８）１１付加されて以後は、酸脱ブロッ
キング処理甲に２−メルカプトエタノールを存在はぜる
ことが必須である。

アシル化溶液をＡｒｇ　　ＩＲＡについて述べたのと同
様にして調製するが、溶媒としてはＤＭＦよりもジメチ
ルアセトアミドが好ましい。又すべてのＤＭＦ洗浄をジ
メチルアミン洗浄に置き換えた。

脱ブロッキングについての好ましい方法はＴＦＡを使用
することであり、中和にりいては、ジ−イソプロピルア
ミ７′ｏメチレンクロライド溶液処理をすべて５％Ｆ／
７）リエチルアミンのメチレンクロライド溶液処理で置
き換え、しかもこれらを１０秒だけそれぞれ行った。

Ｃｙｓ（１）の包含後は、ＥＯＣ基をＴＦＡを用いて除
去せずに残しておき、ＨＦ開裂時に除去する、Ｌ’１８
に２−クロロベンジルオキシカルボニルを用いた時は、
ＨＦ開裂は次の工程である。ＦＭＯＣを使用する場合に
は、次の方法でこれをＨＦ開裂前に除去する必要がある
。

樹脂を次の様にして洗浄する： ＤＭＦ　　　　　　　　　　　　３ｘ１ｒｎｉｎ、ｘ１
５０ｍ１１０％ピペリジン（ＤＭＦ溶液）　　ｌｘｌｍ
ｓｉ、、ｌＸ１５ｒｎｉｎ。

２００１ＥＪ宛 ＤＭＦ　　　　　　　　　　　　　　３ｘ１ｒｎｉｎ、
×１５ωＵＣＨ２ＣＩｔ　　　　　　　　　　　　６　
Ｘ　１　ｒｎ％　ｎ、　Ｘ　１５０８１サイクル１から
得られた樹脂ペプチドから液体弗化水素（ｘｙ）を用い
た処理によってペプチドは開裂させられる。

このＨＦ開裂反応は、樹脂ペプチド１１当り０．５乃至
５ｄの（１：１乃至１：２の比の）ｒｎ−クレゾールと
エタンジチオールの混合物中、又はアニソール中で、（
樹脂４プチド１ｇ当り２乃至２０１１７の）液体ＨＦを
用い、０．５乃至２０時間、−２０乃至＋１５℃、好ま
しくは０℃で実施することが出来る。反応時間後、過剰
のＨＦを蒸発によって除去することが出来、そして得ら
れたペプチドと樹脂ビーズとの混合物は、有機溶媒例え
ば酢酸エチル、ジエチルエーテル、トルエン等を用いて
抽出してｍ−クレゾール／エフ／ジチオール又はアニソ
ール及び残留ＨＦを除くことができる。酢酸水溶液中へ
の抽出によってペプチドを樹脂ビーズから分離しても良
いし、又は樹脂＋粗ペプチドの混合物として貯蔵しても
良い。この段階のペプチドは環状では無く、分子の位置
１と７のシスティ／の間にジスルフィド架橋の無い非環
状生成物である。

このＨＪ’％埋は、位［１のシスティン残基のチオール
官能上のＳ−アルキルチオ・ブロッキング基以外の、す
べてのブロッキング基をペプチドから取り除く。Ｓ−ア
ルキルチオ−Ｌ−システィン残基はＨＥ’開裂法製法し
て安定であり、開裂及び抽出操作を通して無傷のままで
ある。Ｓ−バラメトキシベンジル（又はバラメチルベン
ジル）−Ｌ−システィ／残基はＨＦにより開裂させられ
てシスティン残基と遊離のチオール官能を生ずる。従っ
てＨＦ開裂後に得られるペプチドは次式で示されること
となろう：Ｓ−アルキル −Ｇ　ｌ　３ｌ−Ｌｌ　ｓ−Ｌ　ｇ　％−、Ｓげ七Ｉｎ
−Ｇ１５−Ｌεを丑ｉ　５−Ｌｌ　ｓ−Ｌ　ｇ　ｓ−Ｇ
　ｌ　ｒ＆Ｊｒんｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｙｇ−Ｔんｒ
−Ａａｎ−Ｔん？−Ｇｘｙ−８ａｒ−ＧＥｌ−Ｔｈｔ＝
Ｐｒｏ−ＮＨ＠好ましくは（ブチ−は１−８−チオエチ
ル置換体となっている。

本発明の一態様では、樹脂＋開裂させられた粗ペプチド
から出発した（プチドは、樹脂＋ペプチド混合物１ｇ当
り６００ｄの水、即ち水１ｄ消りＬ６クダの樹脂＋ペプ
チド、を用いる、１５−１５−６Ｏ＆、の、数値上の最
終濃度として溶液１―当り０．４乃至Ｌ３、そして好ま
しくは０．７乃至ＬＯＩＩｇのペプチドとなる、蒸留水
を用いる最初の撹拌で環化させられる。次にこの溶液の
ｐＨを８．５乃至９．０の範囲内で、そして好ましぐは
約９．０を越えない値に１例えば水酸化アンモニウム溶
液の添加によって調節する。この混合物を容器中で不活
性気体例えば窒素の流れの下で、又は空気下で約４乃至
２４時間撹拌する。ＨＰＬＣによるモニタリングでは４
時間が必要なすべてであるが、−晩装置するのがしばし
ば好都合であり、ＨＰｒ、Ｃではこれがペプチドにとっ
て無害であることが示されている。副反応例えばメチオ
ニン（８）でのスルホキシドの形成が起きる様に条件は
酸化的ではあるべきでは無い。流出ガス流がもはやアル
中ルメルカブタンを含有し無くなった時に反応を停止で
きる。

不溶性物質すべてを濾過又は遠心分離によって除去する
。

例えば５．８ｇの樹脂＋ペプチドを３５００１Ｒ１の蒸
留水に加え、１時間撹拌してテ過した。溶液のｐＨは８
．７８であった。ＮＨ４ＯＨ溶液の滴加によってｐＨを
８．８４に調節し、ｇＬ翼素下１晩環化を進めさせた。

翌日、混合物を遠心分離し、遠心分離液を凍結乾燥して
２．３５ｇの粗んＣＴを得た。

遠心分離によって実質量のペプチド副生物が除去された
。

ＨＰＬＣはこれらは主として高分子量不純物であり、ｈ
ＣＴは存在しないことを示していた。別の方法として遠
心分離後、遠心分離液のｐＨを、氷酢酸の添加によって
約８．５−５．５に下げても良い。

上記合成法からのｐＨ５，０の粗ペプチド溶液はイオン
交換法を用いて濃縮出来よう。濃縮物又は再溶解後の凍
結乾燥物は、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフ法
及び分配クロマトグラフの組合わせによって精製可能で
ある。最終の精製した生成物はふわふわした白色固体と
して凍結乾燥により溶液から得ることができる。この生
成物は所望のペプチドに関して正しいアミノ酸分析値を
示す。

以下は本発明の方法で環化させであるペプチドの精製の
実例である。

上記合成からの２．３５ｐの粗ｈＣＴを（大略２００刈
）０．２Ｍ酢酸に溶解す＜Ｗｈａｔｒｒｕｙｎ　　ＣＭ
−５Ｚカラムを用い酢酸グラディエン）　（０，２−１
，０１を使って溶離ざぞるイオン交換クロマトグラフ法
によって精製した。ｐＨは７以下でなければならず、好
ましくは１乃至３である。このカラム力ｉらのカルシト
ニン・分画を集め、冷結乾燥したところ５６６１ｎ９の
ペプチドが得られ、これはＨＰＬＣによると、３５０Ｉ
Ｉ９ｈＣＴを含んでいた、次にこれを更にｄｕｐｏ　Ｆ
Ｌ　ｔ　　ｌ１ｏｒｂａｚ　Ｃ１Ｂ　”逆相オクタデシ
ル・シリカゲル・カラム上で、その電気伝導度を水酸化
アンモニウム溶液を用いて１０ミリシーメンに調節しで
ある２Ｍ酢酸水溶液中の１０−４０％エタノールのグラ
ディエンドを用いて溶離させるＨＰＬＣによって精製し
た。ｈＣＴを含む分画を分析的ＨＰＬＣプロフィルに従
って集め、エタノールをロータリーエバポレータを除去
した。残留液体を凍結乾燥した。得られた粉末を０．５
Ｎ酢酸水溶液＋数滴の５０％酢酸に再溶解させて、完全
に溶解することを確認し、５ｅｐｈαｄｇｚＧ−２５（
ファイン）ゲルー濾過カラムを用い０．５Ｎ酢酸水溶液
で溶離させて脱塩した。

別の態様では、樹脂からの開裂に続いて未環化のペプチ
ドを０，ＩＮ酢酸水溶液で抽出して、ＣＭ−３２カラム
を用いる上述のイオン交換クロマトグラフ法を実施した
。生成物はＳ−アルキル、例えば１−５−チオエチル、
ジヒドロ−竺」・カルシトニンに豊む溶液であり、冷却
乾燥によってカルシトニンを回収出来る。その固体の形
態の生成物は、従来の公知方法によっては環化せずに溶
液から回収出来なかったために新規であると考えられる
。ａｍ中間体は水又は０．Ｉ　Ｎ酢酸に再溶解させて１
０−３０分以内に本発明の教示の様に環化させて、見上
のカルシトニンを与えることが出来る。

開裂させたペプチドの本発明を構成しているｐｇ及び濃
度の範囲内での環化の特長を示すために、次表に、濃度
及び収率以外は同一の条件下で未環化の１−３−エチル
チオ・ｌ？）・カルシトニンの同一の出発原料について
実施した環化操作の収率を示す。環化は窒素下で’ＩＪ
Ｈ９，０で１晩（２０時間）行なわせた。

（ダ　樹脂＋ペプチド）／　ダ　ｈＣＴ（ν水） ａ　　　　９．０　　　　　　　０．１９　　　　　　
１０．７Ｂ　　　　９．０　　　　　　　０．５６　　
　　　　１２．８Ｃ９゜０　　　　　　　　１．６？　
　　　　　　　　２５．３Ｄ　　　　９．０　　　　　
　　５゜０２．４本発明の方法は特許請求の範囲には該
当しない条件の場合に比して、期待出来ない程、高い収
率を与える。更に、特許請求された条件下での環化は迅
速に、一般に約１０分以内に進行する。

本発明のある態様のみを特に詳細に説明したが、本発明
の精神及び特許請求の範囲すべて該当しつつ、当業者に
とってはそれ以外の多くの特定態様を実施することが出
来そして多くの変更を加えることが出来るのは自明のこ
とである。

次表は、同一の濃度条件（１−６７■樹脂＋ぜブチド／
ｍｅ水）下で、未環化の１−８−エチルチオジヒドロ−
ヒト・カルシトニンの同一出発試料について実施した環
化操作の収率を示している。但し原料試料は前表のもの
とは異なっていた。環化け１晩（２０時間）行なわせた
。

Ｅ　　　　　　　８．０　　　　　　　　　４．８０Ｆ
　　　　　　　９．０　　　　　　　　　６．５５Ｇ　
　　　１０．０　　　　　　４゜８０Ｈ１１，０２，８
４ ここでは収量の数字は相対的なもので、２０時間後のＥ
−Ｈの５０ｗ１についてＨＰＬＣを実施して得られるり
、ＣＴピークの面積を表わしている。それでもなお、ｐ
Ｈ＝９．０での環化によって得られた収量が、ｐＨ−８
，０又はｐＨ＝１０．０で得られた収量よりも３５％以
上高いことが明白である。

′＼−〉 手続補正書（方式） ％式％ １事件の表示 昭和６０年特許願第２４４２３７号 ２、発明の名称 ペプチドの製造及び精製方法 ＆補正をする者 事件との関係　　特許出願人 ４、代理人 ５、補正の対象 願書に添付の手書き明細書の浄書 ６、補正の内容 別紙のとおり、ただし内容の補正はない。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、未環化の少なくとも１対のシステイン部分を有する
   ペプチドにジスルフィド架橋を形成する方法に於て、環
   化が完了する迄、該ペプチドの溶液を８．５より大で、
   しかも９．０を越えないｐＨに保持することを特徴とす
   るペプチドのジスルフィド架橋の形成方法。 ２、未環化の当初のペプチドを環化を起こすに足る濃度
   で存在させる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、該濃度が溶液１ｍｌ当り０．４乃至１．８ｍｇのペ
   プチドである特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、該濃度が溶液１ｍｌ当り０．７乃至１．０ｍｇのペ
   プチドである特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、ペプチドが天然産カルシトニンの構造を有するカル
   シトニン、又はその欠失、置換又は付加類似体である特
   許請求の範囲第２項記載の方法。 ６、カルシトニンがヒトのカルシトニン又はその類似体
   である特許請求の範囲第２項記載の方法。 ７、未環化の当初ペプチドのＣｙｓ（１）残基を６個以
   下の炭素原子を有するアルキル基で置換する特許請求の
   範囲第６項記載の方法。 ８、アルキル基が直鎖又は枝分れの１乃至６個の炭素原
   子長を有する１−Ｓ−アルキルジヒドロ−￥ヒト￥カル
   シトニンから本質上成る乾燥した固体生成物。 ９、アルキル基がエチルである特許請求の範囲第８項記
   載の生成物。