JPS609485A - プロテア−ゼの製造法 - Google Patents
プロテア−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS609485A JPS609485A JP11566883A JP11566883A JPS609485A JP S609485 A JPS609485 A JP S609485A JP 11566883 A JP11566883 A JP 11566883A JP 11566883 A JP11566883 A JP 11566883A JP S609485 A JPS609485 A JP S609485A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protease
- immobilized
- microorganisms
- bacterium
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプロテアーゼ生産能を有する固定化微生物を用
いる改良されたプロテアーゼの製造法に関する。
いる改良されたプロテアーゼの製造法に関する。
プロテアーゼｒよ皮革工業、醸造１秦１食品・水産物加
工業、洗剤工業等に広く使用されておシ、最近家庭用洗
剤の洗浄方向上剤として急速に需要が増大してきた。し
かし、従来のプロテアーゼの製造法はタンク培養法が１
１とんどであり、効率が悪く、しかも微生物菌体を使い
捨てにするという問題がある。
工業、洗剤工業等に広く使用されておシ、最近家庭用洗
剤の洗浄方向上剤として急速に需要が増大してきた。し
かし、従来のプロテアーゼの製造法はタンク培養法が１
１とんどであり、効率が悪く、しかも微生物菌体を使い
捨てにするという問題がある。
近年、微生物又は酵素を高分子ゲル中に閉じ込め、ある
いは高分子ゲルに化学的に結合させて固定化し、種々の
有用物質を生産させる方法が広く研究されるようになり
、その実用化が期待されるようになってきた。
いは高分子ゲルに化学的に結合させて固定化し、種々の
有用物質を生産させる方法が広く研究されるようになり
、その実用化が期待されるようになってきた。
本発明者等は微生物を用いたプロテアーゼの製造法を改
良するにあたり、固定化微生物を応用することに着目し
鋭意研究した結果、固定化微生物は意外にも固定化しな
い微生物に比してプロテアーゼの生産量が増加すること
を、見出し、本発明を完成した。
良するにあたり、固定化微生物を応用することに着目し
鋭意研究した結果、固定化微生物は意外にも固定化しな
い微生物に比してプロテアーゼの生産量が増加すること
を、見出し、本発明を完成した。
本発明はプロテアーゼ生産能を有する微生物を含有する
水性媒体中において、水溶性ビニルモノマーと多官能性
ビニルモノマーを重合させて微生物を固定化し、得られ
た固定化微生物を培養してプロテアーゼを生産させ、次
いで該プロテアーゼを分離取得することを特徴とする特 本発明に使用する微生物はプロプアーゼ生産能を有する
微生物（以下プロテアーゼ生産菌と略称する。）であれ
ば特に制限されるものではなく、任意に使用することが
できる。本発明に使用できる微生物の例として、バチル
ス・ザブチリス、バチルス・ザーモプロテメリテイクス
、バチルス・ポリミキサ、バチルス・リケニホルミス、
バチルスφアミロリクファシエンス、クロストリジウム
・ヒストリティクム、ストレプトマイセス・コリ。
水性媒体中において、水溶性ビニルモノマーと多官能性
ビニルモノマーを重合させて微生物を固定化し、得られ
た固定化微生物を培養してプロテアーゼを生産させ、次
いで該プロテアーゼを分離取得することを特徴とする特 本発明に使用する微生物はプロプアーゼ生産能を有する
微生物（以下プロテアーゼ生産菌と略称する。）であれ
ば特に制限されるものではなく、任意に使用することが
できる。本発明に使用できる微生物の例として、バチル
ス・ザブチリス、バチルス・ザーモプロテメリテイクス
、バチルス・ポリミキサ、バチルス・リケニホルミス、
バチルスφアミロリクファシエンス、クロストリジウム
・ヒストリティクム、ストレプトマイセス・コリ。
ストレフトマイセス・フラデイ、シュードモナス・フル
オレセンス、セラチア属等の細菌類及びアスパルギルス
争ニガー、アルバルギルス・オリザエ。
オレセンス、セラチア属等の細菌類及びアスパルギルス
争ニガー、アルバルギルス・オリザエ。
ペニシリウム・クルクロピリラム等のカビ類が挙げられ
る。アルカリプロテアーゼ生産菌としてはバチルス・サ
ブチリス、バチルス・リケニホルミスが好ましく、中性
プロテアーゼ生産菌としてはクロストリジウム・ヒスト
リティクム及びシュードモナス・フルオレセンスが好ま
しい。特に、バチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ−１４
５８０、バー／−Ａ／ス・サブチリスＩＦＯ−３０１３
、バチルス・アミロリフファシェンスＡＴＣＣ−２３８
４２，バチルス・８００５及びサーマス・サーモフィラ
スＡＴＯＯ−２７６３４が適している。これらの微生物
は一般によく知られた微生物でＩＪ）、所望により公的
機関などより容易に入手できる。
る。アルカリプロテアーゼ生産菌としてはバチルス・サ
ブチリス、バチルス・リケニホルミスが好ましく、中性
プロテアーゼ生産菌としてはクロストリジウム・ヒスト
リティクム及びシュードモナス・フルオレセンスが好ま
しい。特に、バチルス・リケニホルミスＡＴＣＣ−１４
５８０、バー／−Ａ／ス・サブチリスＩＦＯ−３０１３
、バチルス・アミロリフファシェンスＡＴＣＣ−２３８
４２，バチルス・８００５及びサーマス・サーモフィラ
スＡＴＯＯ−２７６３４が適している。これらの微生物
は一般によく知られた微生物でＩＪ）、所望により公的
機関などより容易に入手できる。
本発明においてプロテアーゼ生産菌を固定化するために
用いる水溶性ビニルモノマーとして、アクリル酸、メタ
クリル酸、スチレンスルポン酸。
用いる水溶性ビニルモノマーとして、アクリル酸、メタ
クリル酸、スチレンスルポン酸。
アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸などの不飽和
酸、アクリルアミド、メタクリルアミド。
酸、アクリルアミド、メタクリルアミド。
Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミドなどの不飽和ア
ミド及びヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプ
ロピルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート
、ヒドロキシプロピルメタクリレ−）、Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルアミノエチルメタクリレートなどの不飽和エステルが
挙げられ、特にアクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリ
ルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ヒドロキ
シエチルアクリレート及びこれらの混合物が好ましい。
リルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミドなどの不飽和ア
ミド及びヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシプ
ロピルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート
、ヒドロキシプロピルメタクリレ−）、Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルアミノエチルメタクリレートなどの不飽和エステルが
挙げられ、特にアクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリ
ルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ヒドロキ
シエチルアクリレート及びこれらの混合物が好ましい。
またこれらの水溶性ビニルモノマーの重合体が好ましい
機械的強度を有するために、本発明においては架橋剤と
して、多官能性ビニルモノテ チレンビスアクリルアミド、≠トラエチレンクリコール
ジアクリレートなどが使用される。この架橋剤の使用量
は水溶性とニルモノマー１００重量部当夛、０．５〜３
０重量部、好ましくは２〜１５崩黛Ｓである。
機械的強度を有するために、本発明においては架橋剤と
して、多官能性ビニルモノテ チレンビスアクリルアミド、≠トラエチレンクリコール
ジアクリレートなどが使用される。この架橋剤の使用量
は水溶性とニルモノマー１００重量部当夛、０．５〜３
０重量部、好ましくは２〜１５崩黛Ｓである。
本発明において微生物を固定化するために用いる重合開
始剤は、水溶性過酸化物及び水溶性アゾ化合物が過当で
ｔりシ、例え社過硫酸アンモニウム。
始剤は、水溶性過酸化物及び水溶性アゾ化合物が過当で
ｔりシ、例え社過硫酸アンモニウム。
過硫酸カリウムなどが挙げられる。また重合促進剤とし
て、例えは亜硫酸ナトリウム、Ｎ、Ｎ、Ｎ’。
て、例えは亜硫酸ナトリウム、Ｎ、Ｎ、Ｎ’。
Ｎｏ−ナト２メチルエチレンジアミン、Ｎ、Ｎ−ジオ
メチルアミノプロビキニトリルなどが挙げられる。
１１合開始剤の使用を社通常０．１〜１０重拭チであシ
、重合促進剤の使用ｊｔｔｔｏ〜１０重Ｊｉ％程度であ
る。
、重合促進剤の使用ｊｔｔｔｏ〜１０重Ｊｉ％程度であ
る。
プロテアーゼ生産菌を分散させた水性媒体中の水溶性ビ
ニルモノマー及び多官能性ビニルモノマーの使用量は、
モノマー濃度が５〜４０Ｊ員チとなる量である。重合温
度は微生物が死滅しないように、０〜６０℃、好ましく
はθ〜４０”Ｃの範囲が選択される。重合によシ生成し
たゲル中の微生物の量は含水状態で２０重量−以下が適
当である。
ニルモノマー及び多官能性ビニルモノマーの使用量は、
モノマー濃度が５〜４０Ｊ員チとなる量である。重合温
度は微生物が死滅しないように、０〜６０℃、好ましく
はθ〜４０”Ｃの範囲が選択される。重合によシ生成し
たゲル中の微生物の量は含水状態で２０重量−以下が適
当である。
本発明においてはラジカル重合開始剤を用いる代シに、
光照射によりラジカル重合させるととも可能である。
光照射によりラジカル重合させるととも可能である。
本発明において固定化された微生物にプロテアーゼを生
産させるにあたり、培養液中に添加する栄養源は炭素源
としてブドウ糖、果糖、乳糖などの糖類、デンプン、セ
ルロース、ペクチンナトノ多ｍ ’ＪＡ 、ソルビトー
ルなどのアルコール類、クエン酸、コハク酸などの有機
ｒ９ル１等が適宜使用され、窒素源として尿素、アミノ
酸、ペプトン、コーンステープリカー、酵母エキス等が
使用され、また無機塩類としてリン酸モノカリウム、リ
ン酸ジカリウム、硫酸マグネシウム等がリン、カリウム
及びイオウの供給源として使用される。これらの栄養分
は例示のものに限定されることなく、他の物質も任意に
使用することができる。培養液中におけるこれら栄養源
の濃度は微生物の種類、培養条件などによ）異なシ、そ
の都度適宜選択される。
産させるにあたり、培養液中に添加する栄養源は炭素源
としてブドウ糖、果糖、乳糖などの糖類、デンプン、セ
ルロース、ペクチンナトノ多ｍ ’ＪＡ 、ソルビトー
ルなどのアルコール類、クエン酸、コハク酸などの有機
ｒ９ル１等が適宜使用され、窒素源として尿素、アミノ
酸、ペプトン、コーンステープリカー、酵母エキス等が
使用され、また無機塩類としてリン酸モノカリウム、リ
ン酸ジカリウム、硫酸マグネシウム等がリン、カリウム
及びイオウの供給源として使用される。これらの栄養分
は例示のものに限定されることなく、他の物質も任意に
使用することができる。培養液中におけるこれら栄養源
の濃度は微生物の種類、培養条件などによ）異なシ、そ
の都度適宜選択される。
固定化微生物の培′＃条件杜特に制限はないが、通常、
Ｐｌｌは４〜８好ましくは５〜７、温度ｉ１：１０〜７
５℃好ましくは２５〜５０°Ｃの範囲内である。
Ｐｌｌは４〜８好ましくは５〜７、温度ｉ１：１０〜７
５℃好ましくは２５〜５０°Ｃの範囲内である。
固定化微生物はその培養条件によシ、 ５０〜２３０時
間でプロテアーゼ生産量が最大となるため、パッチ形式
で培養する場合れ培養時間を ５０〜２３０時間に、連
続反応形式の場合は平均滞留時間を ５０〜２３０時間
にＦＩ１１節することが好ましい。培養装置はＪｌ檜型
培養槽、振とり培養機。
間でプロテアーゼ生産量が最大となるため、パッチ形式
で培養する場合れ培養時間を ５０〜２３０時間に、連
続反応形式の場合は平均滞留時間を ５０〜２３０時間
にＦＩ１１節することが好ましい。培養装置はＪｌ檜型
培養槽、振とり培養機。
ジャーファーメンタ−装置、充填カラムなど任意に使用
できる。
できる。
本発明のプロテアーゼの製造方法において固定化微生物
の生産したプロテアーゼは、塩析、ＰＩｉ調館９分離膜
による分離、樹脂による吸着分離などの方法によシ単離
、精製することができる。
の生産したプロテアーゼは、塩析、ＰＩｉ調館９分離膜
による分離、樹脂による吸着分離などの方法によシ単離
、精製することができる。
本発明り固定化しない微生物を用いる場合と同様に実施
することができ、さらに連続培養ができる利点を有する
。また、固定化微生物は固定化しない微生物よりもプロ
テアーゼの生産量が多いという特徴を有する。微生物が
固定化されているため、微生物と培養液の分離が容易で
あり、微生物の再使用が可能であシ、プロテアーゼの分
離精製も容易である。
することができ、さらに連続培養ができる利点を有する
。また、固定化微生物は固定化しない微生物よりもプロ
テアーゼの生産量が多いという特徴を有する。微生物が
固定化されているため、微生物と培養液の分離が容易で
あり、微生物の再使用が可能であシ、プロテアーゼの分
離精製も容易である。
次に実施例によシ本発明をさらに詳細に説明する。尚、
全ての試薬は滅菌処理した後使用し、操作は無菌室で行
なった。ｔた実験に用いた微生物及び培養液の組成は次
の通りである。
全ての試薬は滅菌処理した後使用し、操作は無菌室で行
なった。ｔた実験に用いた微生物及び培養液の組成は次
の通りである。
微生物の調製
微生物を４８時間スラント培養し、次いでス地ノ
ラント培ｎから１白金耳の微生物菌体を取シ出し、９６
時間前培養して得た前培養液１０−を遠心分離し、次い
で生理食塩水１０−に分散させて菌体希釈液を調製した
。
時間前培養して得た前培養液１０−を遠心分離し、次い
で生理食塩水１０−に分散させて菌体希釈液を調製した
。
培養液の組成
ラクトース６０ｇ、コーンステープリカー１０ｇ。
ペプトン１７９．リン酸ジカリウム１４ｇ、リン酸モノ
カリウム６９．クエン酸ナトリウム３り。
カリウム６９．クエン酸ナトリウム３り。
硫酸アンモニウム６９．炭酸カルシウム０．５ｇ及び硫
酸マグネシラノ・１ｇを水に溶解して全量を１７とした
。
酸マグネシラノ・１ｇを水に溶解して全量を１７とした
。
実施例エ
アクリルアミド７．２ｇとメチレンビスアクリルアミド
０．８９を水２７−に溶解し、予めｖＡ製したバチルス
・リケニホルミスＡＴＯＯ−１４５８０の菌体希釈液５
ｍｌを加え、温度を約１０℃にして過硫酸アンモニウ
ム５チ水溶液４−とテトラメチルエチレンジアミン５％
水溶液１−を加えて重合した。
０．８９を水２７−に溶解し、予めｖＡ製したバチルス
・リケニホルミスＡＴＯＯ−１４５８０の菌体希釈液５
ｍｌを加え、温度を約１０℃にして過硫酸アンモニウ
ム５チ水溶液４−とテトラメチルエチレンジアミン５％
水溶液１−を加えて重合した。
得られたゲルを６間角の立方体に細断し、生理食塩水で
洗浄後ゲル２０−を、予め調製した培養液５０ｇＬｌに
加えて坂ロフラスコ中で３７℃、１２０ｓｐｍの条件下
で振とう培養した。
洗浄後ゲル２０−を、予め調製した培養液５０ｇＬｌに
加えて坂ロフラスコ中で３７℃、１２０ｓｐｍの条件下
で振とう培養した。
培養時間２００時間後のアルカリグロチアーゼ生産量は
１１，７００Ｕ々ｔであり、中性プロテアーゼ生産ｔは
４．６００ Ｕ／−であった。
１１，７００Ｕ々ｔであり、中性プロテアーゼ生産ｔは
４．６００ Ｕ／−であった。
−力固定化しない微生物を用いた場合は、アルカリプロ
テアーゼ生産量が７．８００ Ｕ／ｄ、中性グロテアー
ゼ生産釦が３． ｏ ｏ ｏ Ｕ／ｎｔで固定化微生物
を用いた場合の約２／３と低い結果を示した。
テアーゼ生産量が７．８００ Ｕ／ｄ、中性グロテアー
ゼ生産釦が３． ｏ ｏ ｏ Ｕ／ｎｔで固定化微生物
を用いた場合の約２／３と低い結果を示した。
実施例２
実施例１と同様の方法で固定化微生物を７２時間培養し
た後、プロテアーゼ生産Ｊｉｔを測定した。
た後、プロテアーゼ生産Ｊｉｔを測定した。
次いで培養液からゲルを分際トし生理食塩水で洗浄後、
新しい培養液５０−を加えて上記と同じ条件で培養を繰
り返した。同様にして合唱１０回培養を繰り遇した。
新しい培養液５０−を加えて上記と同じ条件で培養を繰
り返した。同様にして合唱１０回培養を繰り遇した。
一方、対照として同条件で固定化しない歓生物を用いて
繰り返し培養を行なった。この時、培養後の微生物はｓ
、ｏ ｏ ｏ ｒｐｍで遠心分離して培養液から分離し
た。
繰り返し培養を行なった。この時、培養後の微生物はｓ
、ｏ ｏ ｏ ｒｐｍで遠心分離して培養液から分離し
た。
プロテアーゼの生産量の測定結果を次表に示す。
（単位 Ｕ／ ｍｌ ）
実施例３
Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド７．２９とメチレンビ
スアクリルアミド０．８ｇを水２７ｆＩｌに溶解し、予
め潤製したバチルス・リケニホルミスＡＴＯＯ−１４５
８０の菌体希釈液５−を加え、温度を約１０℃にして過
硫酸アンモニウム５％水溶液４−及びテトラメチルエチ
レンジアミン５％水溶液１−を加えて重合した。
スアクリルアミド０．８ｇを水２７ｆＩｌに溶解し、予
め潤製したバチルス・リケニホルミスＡＴＯＯ−１４５
８０の菌体希釈液５−を加え、温度を約１０℃にして過
硫酸アンモニウム５％水溶液４−及びテトラメチルエチ
レンジアミン５％水溶液１−を加えて重合した。
得られたゲルを６Ｂ角の立方体に細断し、生理食塩水で
洗浄後ゲル２ｏ−を予めＨｎｌＡした培養液５０−に加
えて、坂ロフラスコ中で３７℃、１２０ｓｐｍの条件下
で振とり培養した。
洗浄後ゲル２ｏ−を予めＨｎｌＡした培養液５０−に加
えて、坂ロフラスコ中で３７℃、１２０ｓｐｍの条件下
で振とり培養した。
培養時間２００時間後のアルカリプロテアーゼ生産量は
１３，５００Ｕ／ｇＰＬｔであり、中性グロテアーゼ生
産量は５．２００ Ｕ／−であった。
１３，５００Ｕ／ｇＰＬｔであり、中性グロテアーゼ生
産量は５．２００ Ｕ／−であった。
実施例４
アクリルアミドの代シにＮ−メチロールアクリルアミド
を用いて、実施例と同様の方法で固定化微生物の培養を
行なった。培養時間２００時間後のアルカリプロテアー
ゼ生産量は１１，７００Ｕ／”であり、中性プロテアー
ゼ生蕪量は４，６００Ｕ／ｎｔであった。
を用いて、実施例と同様の方法で固定化微生物の培養を
行なった。培養時間２００時間後のアルカリプロテアー
ゼ生産量は１１，７００Ｕ／”であり、中性プロテアー
ゼ生蕪量は４，６００Ｕ／ｎｔであった。
実施例５
アクリルアミドの代シにヒドロキシェチ／ｌ／アクリレ
ートを用いて、実施例１と同様の方法で固定化微生物の
培養を行なった。培養時間２００時間後のアルカリプロ
テアーゼ生産量は１２，１００Ｕ／ｆｉｌであり、中性
グロテアーゼ生産μｍｉＪ：４，８００Ｕ／−であった
。
ートを用いて、実施例１と同様の方法で固定化微生物の
培養を行なった。培養時間２００時間後のアルカリプロ
テアーゼ生産量は１２，１００Ｕ／ｆｉｌであり、中性
グロテアーゼ生産μｍｉＪ：４，８００Ｕ／−であった
。
実施例６
バチルスΦリケニホルミスの代りにバチルス・アミロリ
フファシェンスＡＴＯＯ−２３８４２ｔ−用いて、実施
例１と同様の方法で固定化微生物の培養を行なった。培
養時間２００時間後のアルカリプロテアーゼ生産量は９
．５００ Ｕ／ｆＩｔであυ、中性プロテアーゼ生産量
は５．４００ Ｕ／ｆｎｌであり、固定化しない微生物
を用いて培養した場合のそれぞれ１．２倍及びｉ、ｓ倍
であった。
フファシェンスＡＴＯＯ−２３８４２ｔ−用いて、実施
例１と同様の方法で固定化微生物の培養を行なった。培
養時間２００時間後のアルカリプロテアーゼ生産量は９
．５００ Ｕ／ｆＩｔであυ、中性プロテアーゼ生産量
は５．４００ Ｕ／ｆｎｌであり、固定化しない微生物
を用いて培養した場合のそれぞれ１．２倍及びｉ、ｓ倍
であった。
特許出願人 ライオン株式会社
Claims (1)
- １、 プロテアーゼ生産能を有する微生物を含有する水
性媒体中において、水溶性ビニルモノマーと多官能性ビ
ニルモノマーを重合させて微生物を固定化し、得られた
固定化微生物を培養してプロテアーゼを生産させ、次い
で該プロテアーゼを分離取得することを／ｒｂ徴とする
プロテアーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11566883A JPS609485A (ja) | 1983-06-27 | 1983-06-27 | プロテア−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11566883A JPS609485A (ja) | 1983-06-27 | 1983-06-27 | プロテア−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS609485A true JPS609485A (ja) | 1985-01-18 |
Family
ID=14668336
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11566883A Pending JPS609485A (ja) | 1983-06-27 | 1983-06-27 | プロテア−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS609485A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5231898A (en) * | 1988-11-24 | 1993-08-03 | Kabushiki Kaisha Komatsu Seisakusho | Method and apparatus for controlling transmission system |
-
1983
- 1983-06-27 JP JP11566883A patent/JPS609485A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5231898A (en) * | 1988-11-24 | 1993-08-03 | Kabushiki Kaisha Komatsu Seisakusho | Method and apparatus for controlling transmission system |
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