JPS6087226A - プラスミノーゲン・アクチベーター前駆体組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、安定な線維素溶解酵素前駆体（以下チモゲン
と言う）組成物に関する。

〈技術水準〉 本発明におけるチモゲンは人腎細胞の無血清培地より回
収しうる蛋白質であって、分子量が約５万ダルトンであ
り、還元剤処理によっても低分子化が起こらず、またプ
ラスミンなどの蛋白分解酵　１− １／Ｉｃ 素処理によりＩｎｎ素性性プラスミノーゲン・アクチベ
ーター活性）を発現する等の特徴を持つ。

しかも、既知ウロキナーゼに比べてフィブリンへの高い
親和性を有する。このため、本チモゲンは医薬として血
栓溶解療法に対する臨床効果に大いに期待がかけられる
。

しかし、本チモゲンはガラス壁に吸着する性質を有し、
熱に対して不安定であった。また、本チモグンはｍ液中
１の保存安定性に欠けるので、医薬品とした場合、凍結
乾燥品とすることが望ましい。しかし、凍結乾燥時にも
その活性が失わなれることが判明した。従って本チモゲ
ンは何らかの形で安定化させておくことが要求される。

〈発明の開示〉 本発明者らは、本チモゲンの安定化について鋭意研究を
重ねてきたところ、一定量のアルブミンを共存させてお
（と水溶液中の本チモゲンが安定化されること、凍結乾
燥時に本チモゲンが不活性化しないこと、凍結乾燥製剤
としての保存安定性が高まることを見いだして本発明を
完成した。

　２− 即ち本発明は安定化剤としてアルブミンを含むチモゲン
組成物であり、チモゲンとアルブミンの配合比率が本チ
モゲン１万一１００万ＴＯに対してアルブミンが少なく
とも３０ｔｎｇ以上となるに相当する比率であることを
特徴とする安定なチモゲン組成物に関する。

本発明におけるチモゲンとしては人腎細胞を無血清培地
で培養し培地中に産生された本チモゲンを回収し、遠心
分離、塩析、クロマトグラフィーを適宜組み合わせた操
作により精製したものが使用されるが、その他遺伝子工
学で大賜菌、枯草菌、酵母等によって生産されたものな
どその由来を問わず広く使用可能である。

本チモグンの回収は、以下の方法によって可能である。

［原料の調製１ 原料としては人腎細胞が用いられるが、この人腎細胞は
、例えば人胎児腎より得たＰｒｉｍａｒｙ　ｃｕ！ｔ−
１１ｒｅ又はｄｉｐｌｏｌｄ　ｃｅｌｌｓを人手し、こ
れを継代培養し、本チモゲン産生ｍ胞を分離したものが
利用　３− される。例えば細胞を２〜２０Ｘ　１０４ｃｅｌｌｓ／
ｍの数で植え込み、３日間はど培養を続け、細胞数が植
え込み数の約３倍になった詩点てトリプシン−ＥＤＴＡ
混液を添加し、単層の幼若な細胞を回収して得たものが
使われる。

［培養条件］ 培地としては、例えば−ｙｍｏｕｔｈの培地、Ｄｕ　ｌ
　ｂｅｃ−ｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＨＥＭ培地な
どが用いられ、前培養時には、前該培地中に熱不活化生
胎児血清を５％添加し、本チモゲン産生時には０．１％
ヒト血清アルブミンを添加した無血清培地を用いて越養
する。

無血清培地にはヒトまたはウシアルブミン、ラクトアル
ブミン氷解物、トランスフェリン、各種脂肪酸、インシ
ュリン等のホルモンなどを添加してもよい。培養時間は
２〜３日程度であり、培養培地を交換・回収する。この
培地中に本発明のヂモゲンが産生されている。

［本発明チモゲンの回収］ 培地からの本チモゲンの回収は、例えば、当該培地を遠
心分離、減圧濃縮、塩析分画、ゲル濾過、　４− 濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマ］・グラフィー等を、適宜組み合わせることによ
って行なわれる。

より具体的には、例えば次のごとき方法によって回収さ
れる。すなわち、まず培地を遠心分離し、上清を回収す
る。この回収液をイオン交換クロマトグラフィーにより
部分精製する。担体としては、弱酸性陽イオン交換体が
最適であり、例えばＣＭ−交換体、あるいはＤｕｏｌｉ
ｔｅ等が例示される。担体をｐＨ４，５〜６．５、より
好ましくはｐＨ５〜６に調整した後、回収液を展開して
担体に吸着させる。上記の緩衝液で洗浄した後に、ｐＨ
７，５〜９．５、Ｊ：り好ましくはｐＨ８〜９の緩衝液
で本酵素を溶出する。緩衝液としては、リンＭ緩衝液等
が例示される。さらに、この溶出液をアフィニティーク
ロマトグラフィーにより高度精製する。担体としては、
ポリクローナル抗体カラム、モノクローナル抗体カラム
のどうらを用いてもよい。

ポリクローナル法の場合、抗水チモゲン抗体は、高度に
精製した本チモゲンを動物に免疫し、得ら　５− れた血清から回収・精製することによって得られる。

当該抗血清の製造は公知の方法にて行なえばよく、例え
ば高度精製水チモゲンとフロインドの完全アジュバント
の混合乳液を作り、動物の皮肉に２〜３回注射し、最終
免疫の数日後採血を行ない室温で凝固せしめた後、４℃
で一夜放置し、３，０００ｒｐｍ＋、　２０分間の遠心
分離により当該抗血清が得られる。

免疫に用いる動物としては、特に動物種を選ぶ必要はな
く、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等が
挙げられる。当該抗血清の精製は、例えば、Ｊ、Ａｌｌ
１．ＣｈｅｉＪｏｃ、、　６２．３３８θ（１９４０）
、　Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃ、、１７．１１６１　（１９５８）に記載の方
法ニテ行なわれる。

モノクローナル法の場合、細胞融合法により折本チモゲ
ン抗体を得る。細胞融合法は自体既知の手段にて行なわ
れ、その−例は増殖性を持った細胞と目的とする抗体を
産生しているリンパ球とをポリエチレングリコールの存
在下で反応せしめる　６− ことにより、増殖性と抗体産生能とを同時に兼ねそなえ
た細胞を製するもので、この細胞の産生ずる抗体は一個
の抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体である。

本発明では増殖性を持つ細胞としてマウスミエローマ細
胞を、抗体産生リンパ球として本チモゲンで免疫された
マウス牌臓細胞（Ｂ細胞）を用いて融合させ、さらに目
的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニングして
、本チモゲンのモノクローナル抗体を得る。

また、このＪ：うにして得られた抗ヂモゲン抗体を、そ
の活性を失うことなく固定化する方法としては、以下の
不溶性マトリックスを応用することができる。アミノ酸
のコポリマー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ２３６．１９７
０　（１９６１））　、セルロース（Ｎａｔｕｒｅ、　
１８９゜５７６　（１９６１））　、アガロースあるい
はセファデックス（Ｎａｔｕｒｅ、　２１５．＋４９１
　（＋９６７）　、　Ｎａｔｕｒｅ、２４５．３０５９
　（１９７０））　、ポリアクリルアミド（Ｂｉｏｃｈ
ｅｉｌ、、８．４０７４　（１９８６））。これらの方
法により抗チモゲン抗体を効率良く固定化しうる。また
、このように　７− して得られた吸着剤を用いることにより、収率良く、し
かも高純度の本チモゲンを得ることができる。

本発明に係るチモゲンのアフィニティークロマトグラフ
ィーは以下の通りである。陽イオン交換体により部分精
製した本ヂモゲンを、１）Ｈ６−８の緩衝液で平衡化し
た抗チモゲン抗体カラムと接触・吸着させる。カラムを
洗浄後、ｐＨ２−４の水溶液で溶出する。

なお、上記の回収法は本発明チモゲン回収法の一例を示
したにすぎず、もちろん他の方法によって回収してもよ
い。

ｃ本発明チモゲンの特性］ ■分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｎａｔｕ
ｒｅ、２２７，６８０−６８５（１９７０））を用いて
、本発明からなるチモゲンの分子量を測定したところ、
約５万ダルトンであった。なお分子量は分子量既知の標
準蛋白との比較によって決定し、また前処理として、３
７℃、２時間または１００℃、２分間　８− １％ＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノールによる還元
処理を各々行なった。

■酵素感受性 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７．３２７６−３２８
３　（１９８０）に準じて、プラスミンに対する感受性
実験を行なった。その結果、本発明からなるチモゲンは
それ自身はプラスミノーゲンアクチベーター活性を示さ
なかった。

しかし、プラスミン処理をすることにより活性が発現し
、その活性発現の程度はプラスミン処理の濃度（表１）
、およびその処理時間（表２）に依存していた。活性測
定法は後記の通りである。

前者の実験は、本チモゲン蛋白量として、１３μｇ／Ｉ
＋ｌｉ！を調製し、これに各濃度のプラスミンによって
約６０分間の前処理を行なった後に発現される＃５素活
性を測定した。

後者の実験は、プラスミンを０１μ９７ｄ及び本ヂモゲ
ン蛋白扮として１３μｇ／−を調製し、プラスミンによ
る処理時間による効果を経時的に測定した。

　９− 表１　プラスミン前処理によるプラスミノーゲンアクチ
ベーター活性（１１／ｍり 表２　プラスミン前処理によるプラスミノーゲンアクチ
ベーター活　１０− ■還元剤処理 １％ＳＤ８．１％２−メルカプトエタノール、３７℃・
２時間、もしくは、１００’Ｃ・２分間の処理に対する
本発明からなるチモゲンの抵抗性を分子量測定法に準じ
て調べた。その結果、未処理水チモゲンと処理後水チモ
ゲンは同じ電気泳動パターンを示し、この酵素が一本鎖
であることを確認した。

■活性測定法 合成基質法（クリーソンら　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、
、７．７６　（１９７８１）　、もしくは平板法（アス
トラップらＡｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、、４０，３４６−３５１ｊ１９５２）　）によって活
性を測定できた。フィブリノーゲンはＭｔｌｅｓ社のｂ
ＯＶ＋ｎｅ、ｒｉｂｒｌｎｏｏｅｎ、Ｉ’ｒ、ｒ　（微
量のプラスミンを含む）を使用した。

■その他の性状について 活性中心；ウロキナーゼのセリン活性部位に結合するρ
−７ミノベンズアミジンを固定したセファローズゲルに
本発明からなるチモゲンを接触させたが、吸着しなかっ
た。このことがら、本発明が−１１− らなるチモゲンのセリン活性部位は分子内部にはいって
おり、従来のつ０キナーゼとＣよ高次構造が異なってい
るものと推定される。

フィブリン親和性；本発明からなるチモゲンはフィブリ
ンへの親和性が強く、組織プラスミノーゲン・アクチベ
ーター類似の性質を有する。

［アルブミンの調製］ 本発明に使用されるアルブミンは抗原性の問題からヒト
由来のアルブミンであることが好ましく、それらは医療
用に精製されたものであれば特に制限はない。その純度
は、電気泳動で分析して８０％以上がアルブミンである
ものが好ましい。ヒト由来アルブミンを得る方法てして
は、エタノール分画法（特公昭４７−２８６９、特公昭
３５−５２９７）、有機酸の存在下で加熱する方法（特
公昭４３−１６０４、特公昭５ｌ−４０１３２１）等が
例示される。特に好ましくはアルブミンを加熱処理（好
ましくは、６０’Ｃ１１０時間程度）して肝炎ウィルス
等不活化処理を行なったものが使用される。

　１２− ［アル１ミン含聞］ 本チモゲンとアルブミンとの配合比は本チモゲン１万一
１００万１１１に対して少なくともアルブミン３０ｍｇ
以上となるに相当する比率であり、好ましくは本チモゲ
ン１万一１００万１ｕに対してアルブミン３０η〜５（
ＣＩとなるに相当する比率である。

なお、本チモゲン含有水溶液の凍結乾燥にあたっては、
本チモゲンの含有酸にかかわりなく水溶液中に少なくと
も３ａｙ／−以上好ましくは５＃／ｄ以上の濃度にアル
ブミンを添加しておけば本チモゲンの安定化が達成され
る。

なお、本発明においてアルブミンに加えてその他の安定
剤を加えることも当然可能である。例えば、無Ｉｌ！塩
や有機塩の添加は好適である。

［凍結乾燥処理］ アルブミンにＪ：る凍結乾燥処理の場合例えば次のよう
にして行われる。即ち、精製水チモゲンを含有する水溶
液を１１１１５〜９に調整し、これにアルブミンを前記
安定化量を添加し、この水溶液の除　１３− 菌濾過を行なったあと、分注し常法によって凍結乾燥に
付すことによって行われる。

［効果］ かくして提供された本発明組成物は、製剤化工程中のチ
モゲンの損失がなく、しかも保存中の安定化にすぐれた
医薬品として好適のものである。

以下に実施例、実験例、参考例を挙げて本発明を具体的
に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。

〈実施例〉 培養人腎細胞を無内情培地に数日間培養した後、培養液
を遠心分離した。得られた上溝を各種クロマトグラフィ
ーで精製して比活性５６．０００１１以上の本チモゲン
を得た。その後、この本チモゲンを含む溶１１１ｉ２４
，０００１υ／ｄをリン酸緩衝液でｐ）１７に調整した
後、ヒト内情アルブミンを３５ａｙ／ｄ！Ｍ加えた。

この溶液を除菌濾過し、２Ｉｄずっ１ｏｄ容の管瓶に分
注し、最終到達温度２５℃の乾燥条件で凍結乾燥した。

　１４− 得られた乾燥品の含湿度を生物学的製剤基準、一般試験
法に準じて試験したところ、約０２％であった。いずれ
の乾燥品についも２ｍｉ！の法則用蒸留水を加えると直
ちに溶解し、溶解液は無色透明であった。これらの溶解
液について本チモゲン残存率をめたところ、いずれも凍
結乾燥前と何ら変化なかった。また、製剤化工程中にお
いて、本チモゲンのガラス壁への吸着による損失はなか
った。

〈実験例〉 本発明による安定化効果を確認するための実験を行なっ
た。

精製した本チモゲン含有溶液（１ｘ１０４ｒｔｌ／ｍｅ
、５ｘ１０　１１／ｄ、５ｘ１０５１１１／岨に各種濃
度のヒト血清アルブミン（１−１００＃Ｉｇ／ａｔりを
添加し、次いで凍結乾燥を行なった。凍結乾燥品の〕２
価は凍結乾燥直後および５０℃にて３力月保存後に測定
し、ヒト血清アルブミン添加直後の力価に対する活性残
存率を表３に示した。

以下余白 　１５− 表３ く参考例：製造例〉 培養人腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をｐｉ（５，
５に調整した後、ＣＭ　−Ｓ　ｅｌ）ｔｌａｄｆ！−Ｘ
　Ｃ−５０に接触した。０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
５，５＞でカラムを洗浄した後、０．１６Ｍリン酸緩衝
液（ｐ）−１８，５）で吸着していた本チモゲ　１６− ンを溶出させた。

一方、本チモゲンで予め免疫しておいたマウスＢＡＬＢ
／Ｃの牌臓細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレン
グリコールにより融合させたハイブリドーマのうち、本
チモゲンに対する抗体産生の高いクローンを選択した。

この融合細胞の培養液から、抗チモゲンモノクローナル
抗体を回収した。このモノクローナル抗体をＢｒ０Ｎ活
性化５−ｅｐｈａｒｏｓｅ４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社）に固定した。

このモノクローナル抗体カラムを０．４８ＮａＣ１含有
０．１８リン酸緩衝液（１）Ｈ７，０）で平衡化し、こ
れに前記の本チモゲンを含有する溶出液を接触した。０
．４ＭＮａＣｌ含有０．１Ｈリン酸緩衝液（Ｄ）−１７
，０）でカラムを洗浄した後、吸着していた本チモゲン
を０．５ＨＮａＣ１含有０．２Ｈグリシン−ＨＣｌ水溶
液（ｐＨ２，５）で溶出させた。

溶出液を除菌濾過した後、凍結乾燥し高度精製水チモゲ
ンを得た。

回収率は、約９０％であり、又この精製品は５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法により　１７− 分子ｉ１５万の１本の帯を示した。

特許出願人　株式会社　ミドリ十字 代　理　人　弁理士　圧用　隆 　１８　− 手続補正書（自発） 昭和５９年９月ｌ？日 特許庁長官殿 １、事件の表示 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）１株式会社　ミドリ十字 ４、代理人 住所　〒５４１　大阪市東区今橋１丁目１５番地の１株
式会社ミドリ十字内 電話（０６）　２２８−０７００ （１）明細書第４頁、第９行の「前該培地」を「前記該
培地」に訂正する。

（２）　同書第４頁、第１０行の「０．１％」を［無血
清培地、好ましくは」に訂正する。

（３）同書第４頁、第１３行の［トランスフェリン、」
の後に「各種アミノ酸、」を挿入する。

（４）　同書第４頁、第１５行〜第１６行の［培養時間
は２〜８日程度であり、培養培地を交換・回収する。」
を１培養培地は２〜３日程度ごとに交換する。」に訂正
する。

（５）同書第１６頁、表３を別紙の通りに訂正する。

（６）　同書第１７頁、下から第４行の「凍結乾燥し」
の後に「比活性が少なくとも８０，０００　Ｕ／＋＋ｌ
、の」を挿入する。

（７）同書第１７頁、下から第２行の［回収率は、約９
０％であり、又」を「な右、」に訂正する。

以　上 （別服） 表３ 手続補正書（ｎ１ 昭和５９年／７月９Ｐ日 特許庁長官殿 昭和５８年特許願第１９５０５１号 ２、発明の名称 線維素溶解酵素前駆体組成物 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人 住所　〒５４１　大阪市東区今橋１丁目１５番地の１株
式会社ミドリ十字内 電話Ｔ０６）　２２８−０７００ ６、補正により増加する発明の数　なし７、補正の対象 願書の発明の名称の欄、明ＩＤＩＩの全文８、補正の内
容 別紙の通り 明　細　書　（訂正） １、発明の名称 プラスミノーゲン・アクヂベーター前駆体組成物 ２、特許請求の範囲 人腎細胞の培養培地より回収しうる蛋白質であり、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分
子量が約５万ダルトンであり、還元剤処理によって低分
子化が起こらず、またプラスミン処理により酵素活性を
発現するチモゲンの一種であるプラスミノーゲン・アク
チベーター前駆体を主成分とし、安定剤として少なくと
もアルブミンを含有することを特徴とするプラスミノー
ゲン・アクチベーター前駆体組成物。

３、発明の詳細な説明 本発明は、安定なプラスミノーゲン・アクチベーター前
駆体（以下チモゲンと言う）組成物に関する。

く技術水準〉 本発明におけるチモゲンは人腎細胞の無血清培地より回
収しうる蛋白質であって、分子量が約５万ダルトンであ
り、還元剤処理によっても低分子化が起こらず、またプ
ラスミンなどの蛋白分解酵素処理により酵素活性（プラ
スミノーゲン・アクチベーター活性）を発現する等の特
徴を持つ。

しかも、既知ウロキナーゼに比べてフィブリンへの高い
親和性を有する。このため、本チモゲンは医薬として血
栓溶解療法に対する臨床効果に大いに期待がかけられる
。

しかし、本チモグンはガラス壁に吸着する性質を有し、
熱に対して不安定であった。また、本チモゲンは溶液中
での保存安定性に欠けるので、医薬品とした場合、凍結
乾燥品とすることが望ましい。しかし、凍結乾燥時にも
その活性が失ねなれることが判明した。従って本チモゲ
ンは何らかの形で安定化させておくことが要求される。

〈発明の開示〉 本発明者らは、本チモゲンの安定化について鋭意研究を
重ねてきたところ、一定量のアルブミンを共存させてお
くと水溶液中の本チモゲンが安定化されること、凍結乾
燥時に本ヂモゲンが不活性化しないこと、凍結乾燥製剤
としての保存安定性が高まることを見いだして本発明を
完成した。

即ち本発明は安定化剤としてアルブミンを含むチモゲン
組成物であり、チモゲンとアルブミンの配合比率が本チ
モゲン１万一１００万Ｕに対してアルブミンが少なくと
も３０ｍｇ以上となるに相当する比率であることを特徴
とする安定なチモゲン組成物に関する。

本発明におけるチモグンとしては人腎細胞を無血清培地
で培養し培地中に産生された本チモゲンを回収し、遠心
分離、塩析、クロマトグラフィーを適宜組み合わせた操
作により精製したものが使用されるが、その他遺伝子工
学で大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞等によって生産さ
れたものなどその由来を問わず広く使用可能である。

本チモゲンの回収は、以下の方法によって可能である。

［原料の調製］ 原料としては人腎細胞が用いられるが、この人　３− 腎細胞は、例えば人胎児腎より得たＰｒｉｍａｒｙ　ｃ
ｕｌｔｕｒｅ又はｄｉｐｌｏｉｄ　ｃｅｌｌｓを入手し
、これを継代培養し、本チモゲン産生細胞を分離したも
のが利用さｔ’Ｌル。例えば細胞ヲ２〜２０ｘ１０４ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｅの数で植え込み、３日間はど培養を続け
、細胞数が植え込み数の約３倍になった時点でトリプシ
ン−ＥＤＴＡ混液を添加し、単層、の幼若な細胞を回収
して得たものが使われる。

［培養条件］ 培地としては、例えば−ａｙｍｏｕｔｈの培地、ＤＩ　
Ｉ　ｂｅｃＣＯ’Ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＨＥＭ培地な
どが用いられ、前培養時には、前記該培地中に熱不活化
牛胎児血清を５％添加し、本チモゲン産生時には無血清
培地、好ましくは、ヒト血清アルブミンを添加した無血
清培地を用いて培養する。無血清培地にはヒトまたはウ
シアルブミン、ラクトアルブミン水解物、トランスフェ
リン、各種アミノ酸、各種脂肪酸、インシュリン等のホ
ルモンなどを添加してもよい。

２〜３日程度ごとに、培養培地は交換する。この培地中
に本発明のヂモゲンが産生されている。

　４− ［本発明チモグンの回収］ 培地からの本ヂモゲンの回収は、例えば、当該培地を遠
心分離、減圧濃縮、塩析分画、ゲル濾過、濃縮、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等を、適宜組み合わせることによって行なわれる
。

より具体的には、例えば次のごとき方法によって回収さ
れる。すなわち、まず培地を遠心分離し、上清を回収す
る。この回収液をイオン交換クロマ１〜グラフイーによ
り部分精製する。担体としては、弱酸性陽イオン交換体
が最適であり、例えばＣＭ−交換体、あるいはＤｕｏｌ
ｉｔｅ等が例示される。担体をｐＨ４，５〜６，５、よ
り好ましくはＩ）Ｈ５〜６に調整した後、回収液を展開
して担体に吸着させる。上記の緩衝液で洗浄した後に、
Ｉ）Ｈ７，５〜９．５、より好ましくはｐＨ８〜９の緩
衝液で本チモゲンを溶出する。緩衝液としては、リン酸
緩衝液等が例示される。さらに、この溶出液をアフィニ
ティークロマトグラフィーにより高度精製する。

担体としては、ポリクローナル抗体カラム、モノクロー
ナル抗体カラムのどちらを用いてもよい。

ポリクローナル法の場合、折本チモゲン抗体は、高度に
精製した本チモゲンを動物に免疫し、得られた血清から
回収・精製することによって得られる。

当該抗血清の製造は公知の方法にて行なえばよく、例え
ば高度精製水チモグンとフロイントの完全アジュバント
の混合乳液を作り、動物の皮肉に２〜３回注射し、最終
免疫の数日後採血を行ない室温で凝固せしめた後、４℃
で一夜放置し、３．００ｏｒｐｍ、２０分間の遠心分離
により当該抗血清が得られる。

免疫に用いる動物としては、特に動物種を選ぶ必要はな
く、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等が
挙げられる。当該抗血清の精製は、例えば、Ｊ、Ａｍ、
Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　６２．３３８６（１９４０）、
　Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃ、、１７．１１６１　（１９５８）に記載の方
法にて行なわれる。

モノクローナル法の場合、細胞融合法により折本チモゲ
ン抗体を得る。細胞融合法は自体既知の手段にて行なわ
れ、その−例は増殖性を持った細胞と目的とする抗体を
産生じているリンパ球とをポリエチレングリコールの存
在下で反応せしめることにより、増殖性と抗体産生能と
を同時に兼ねそなえた細胞を製するもので、この細胞の
産生ずる抗体は一個の抗原決定基に対してのみ反応する
単一の抗体である。

本発明では増殖性を持つ細胞としてマウスミエローマ細
胞を、抗体産生リンパ球として本チモゲンで免疫された
マウス牌臓細胞（Ｂ細胞）を用いて融合させ、さらに目
的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニングして
、本チモグンのモノクローナル抗体を得る。

また、このようにして得られた抗チモグン抗体を、その
活性を失うことなく固定化する方法としては、以下の不
溶性マトリックスを応用することができる。アミノ酸の
コポリマー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

、２３６．１９７０　（１９６１））　、セルロース（
Ｎａｔｕｒｅ、　１８９゜５７６　（１９６１））　、
アガロースあるいはセファデックス（Ｎａｔｕｒｅ、　
２１５．１４９１　（１９６７）　、　Ｎａｔｕｒｅ、
２４５．３７− ０５９　（１９７０））　、ポリアクリルアミド（Ｂｉ
ＯＣｈｅｍ、８．４０７４　（１９６Ｂ））。これらの
方法により抗チモゲン抗体を効率良く固定化しうる。ま
た、このようにして得られた吸着剤を用いることにより
、収率良く、しかも高純度の本チモゲンを得ることがで
きる。

本発明に係るチモゲンのアフィニティークロマトグラフ
ィーは以下の通りである。陽イオン交換触・吸着させる
。カラムを洗浄後、ｐＨ２−４の水溶液で溶出する。

なお、上記の回収法は本発明チモゲン回収法の一例を示
したにすぎず、もちろん他の方法によって回収してもよ
い。

［本発明チモゲンの特性］ ■分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２２７．６８０−６８５（１９７０）　）を用
いて、本発明からなるチモゲンの分子量を測定したとこ
ろ、約　８− ５万ダルトンであった。なお分子量は分子量既知の標準
蛋白との比較によって決定し、また前処理として、３７
°Ｃ，２時間または１００’Ｃ１２分間１％ＳＤＳ、１
％２−メルカプトエタノールによる還元処理を各々行な
った。

■酵素感受性 Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　ｃｈｅｍ、　、　２５７．３２７６
−３２８３　（１９８０）に準じて、プラスミンに対す
る感受性実験を行なった。その結果、本発明からなるヂ
モゲンはそれ自身はプラスミノーゲンアクチベーター活
性を示さなかった。

しかし、プラスミン処理をすることにより活性が発現し
、その活性発現の程度はプラスミン処理の濃度（表１）
、およびその処理時間（表２）に依存していた。活性測
定法は後記の通りである。

前者の実験は、本チモゲン蛋白量として、１．３μｇ／
ｙｄを調製し、これに各濃度のプラスミンによって約６
０分間の前処理を行なった後に発現される酵素活性を測
定した。

後者の実験は、プラスミンを０．１μｇ／ｄ及び本チモ
ゲン蛋白量として１．３μ９／ｍｅを調製し、プラスミ
ンによる処理時間による効果を経時的に測定した。

以下余白 表１　プラスミン前処理による プラスミノーグンアクチベーター活性（Ｕ　／、ｒｒＬ
ｌ）表２　プラスミン前処理による プラスミノーゲンアクチヘーター活性の経時変化　１１
− ■還元剤処理 １％ＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノール３７℃・２
時間、もしくは、１００℃・２分間の処理に対する本発
明からなるチモグンの抵抗性を分子量測定法に準じて調
べた。その結果、未処理水チモグンと処理後水チモゲン
は同じ電気泳動パターンを示し、この酵素が一本鎖であ
ることを確認した。

■活性測定法 合成基質法（’ｙ’）　−’）ンら　Ｈａｅｍｏｓｔａ
ｓｉｓ．　、　７．　７６　（１９７８））　、もしく
は平板法（アストラップらＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．、４０，３４６−３５１，（１９５２
）　）によって活性を測定できた。フィブリノーゲンは
Ｍｉｌｅｓ社のｂｏｖｉｎｅ，　ｆ　ｉｂｒｉｎｏｇｅ
ｎ，　Ｆｒ．　Ｉ　（微量のプラスミンを含む）を使用
した。

■その他の性状について 活性中心：ウロキナーゼのセリン活性部位に結合するｐ
−アミノベンズアミジンを固定したセファローズゲルに
本発明からなるチモゲンを接触させたが、吸着しなかっ
た。このことから、本発明か　１２　− らなるヂモゲンのセリン活性部位は分子内部にはいって
おり、従来のウロキナーゼとは高次構造が異なっている
ものと推定される。

フィブリン親和性二本発明からなるチモゲンはフィブリ
ンへの親和性が強く、組織プラスミノーゲン・アクチベ
ーター類似の性質を有する。

抗ウロキナーゼ抗体および抗ヒトメラノーマ由来ＴＰＡ
抗体による酵素活性の中和：本発明からなるチモグンの
活性をプラスミンにより発現さけた。さらに、抗ウロキ
ナーゼ抗体、もしくは抗ヒトメラノーマ由来ＴＰＡ抗体
を添加し、３７°Ｃ１９０分間放置後、残存酵素活性を
前記合成基質法、もしくは平板法で測定したところ、プ
ラスミン処理によって発現する本発明からなるチモゲン
の酵素活性は、抗ウロキナーゼ抗体によって阻害された
が、抗ＴＰＡ抗体によっては阻害されなかった。

以上のことより、本発明からなるチモゲンは、ウロキナ
ーゼの前駆物質でありフィブリン親和性において、ＴＰ
Ａと類似の性質を示すが、ＴＰＡや、その前駆物質とは
異なる物質である。

［アルブミンの調製］ 本発明に使用されるアルブミンは抗原性の問題からヒト
由来のアルブミンであることが好ましく、それらは医療
用に精製されたものであれば特に制限はない。その純度
は、電気泳動で分析して８０％以上がアルブミンである
ものが好ましい。ヒト由来アルブミンを得る方法どして
は、エタノール分画法（特公昭４７−２８６９、特公昭
３５−５２９７＞、有機酸の存在下で加熱する方法（特
公昭４３−１６０４、特公昭５１−４０１３２１＞等が
例示される。特に好ましくはアルブミンを加熱処理（好
ましくは、６０℃、１０時間程度）して肝炎ウィルス等
不活化処理を行なったものが使用される。

［アルブミン含量］ 本チモゲンとアルブミンとの配合比は本チモゲン１万一
１００万０に対して少なくともアルブミン３０ｍ９以上
となるに徂当する比率であり、好ましくは本チモゲン１
万一１００万υに対してアルブミン３０ｍｇ〜５ｏｍｙ
となるに相当する比率である。

なお、本チモゲン含有水溶液の凍結乾燥にあたっては、
本ヂモゲンの含有量にかかわりなく水溶液中に少なくと
も３１ｎｌ／ｍ１以上好ましくは５１ｎｌ／ｄ以上の濃
度にアルブミンを添加しておけば本チモゲンの安定化が
達成される。

なお、本発明においてアルブミンに加えてその他の安定
剤を加えることも当然可能である。例えば、無機塩や有
機塩の添加は好適である。

［凍結乾燥処理］ アルブミンによる凍結乾燥処理の場合例えば次のように
して行われる。即ち、精製水チモゲンを含有する水溶液
を１）Ｈ５〜９に調整し、これにアルブミンを前記安定
化量を添加し、この水溶液の除菌濾過を行なったあと、
分注し常法によって凍結乾燥に付すことによって行われ
る。

し効果コ かくして提供された本発明組成物は、製剤化工程中のチ
モグンの損失がなく、しかも保存中の安定化にすぐれた
医薬品として好適のものである。

　１５　− 以下に実施例、実験例、参考例を挙げて本発明を具体的
に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。

〈実施例〉 培養大賢細胞を無血清培地に数日間培養した後、培養液
を遠心分離した。得られた上清を各種クロマトグラフィ
ーで精製して比活性５６，０００１以上の本チモゲンを
得た。その後、この本チモゲンを含む溶液２４，０００
　Ｕ／Ｉｎｌ１をリン酸緩衝液でｐＩ−１７に調整した
後、ヒト血清アルブミンを３５ｍｌ１ｗｄｌ量加えた。

この溶液を除菌濾過し、２ｄずつ１０ｍ容の管瓶に分注
し、最終到達温度２５℃の乾燥条件で凍結乾燥した。

得られた乾燥品の含湿度を生物学的製剤基準、一般試験
法に準じて試験したところ、約０．２％であった。いず
れの乾燥品についも２ｄの注射用蒸留水を加えると直ち
に溶解し、溶解液は無色透明であった。これらの溶解液
について本チモゲン残存率をめたところ、いずれも凍結
乾燥前と何ら　１６　− 変化なかった。また、製剤化工程中において、本ヂモゲ
ンのガラス壁への吸着による損失はなかった。

〈実験例〉 本発明による安定化効果を確認するための実験を行なっ
た。

精製した本チモゲン含有溶液（ＩＸ１０４Ｕ／ｒｒｔ１
．５ｘ１０４Ｕ／ｄ、５ｘ１０５Ｕ／ｍｅ）ｋ［種濃度
のヒト血清アルブミン（１−１００ｍｇ、４＋＞を添加
し、次いで凍結乾燥を行なった。凍結乾燥品の力価は凍
結乾燥直後および５０’Ｃにて３力月保存後に測定し、
ヒト血清アルブミン添加直後の力価に対する活性残存率
を表３に示した。

以下余白 表３ 〈参考例：製造例〉 培養人腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をｐＨ５，５
に調整した後、ＣＭ−３ｅｐｈａｄｅＸＣ−５０に接触
した。０．１６Ｍリン酸緩衝液（１）８５．５）でカラ
ムを洗浄した後、０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ−１８
，５）で吸着していた本チモゲンを溶出させた。

一方、本チモゲンで予め免疫しておいたマウスＢＡＬＢ
／ｃの牌臓細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレン
グリ］−ルにより融合させたハイブリドーマのうち、本
チモゲンに対する抗体産生の高いクローンを選択した。

この融合細胞の培養液から、抗チモグンモノクローナル
抗体を回収した。このモノクローナル抗体をＢｒＣＮ活
性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社）に固定した。

このモノクローナル抗体カラムを０．４ＨＮａＣ１含有
０．１Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し、これ
に前記の本チモゲンを含有する溶出液を　１９− 接触した。０．４ＨＮａＣ１含有０．ＩＨリン酸緩衝液
（ｐＨ７、Ｏ）でカラムを洗浄した後、吸着していた本
チモゲンを０．５）ＩＮａｃ＋含有０．２Ｍグリシン−
ＨＣｌ水溶液（ＤＨ２，５＞で溶出させた。

溶出液を除菌濾過した後、凍結乾燥し比活性が少なくと
も８０．０ＯＯＵ　／ｍｌの高度精製水チモゲンを得た
。

なお、この精製品は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により分子量５万の１本の帯を示した。

特許出願人　株式会社　ミドリ十字 代　理　人　弁理士　圧用　隆 　２０−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 人腎細胞の培養培地より回収しうる蛋白質であり、５Ｏ
   ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分
   子量が約５万ダルトンであり、還元剤処理によって低分
   子化が起こらず、またプラスミン処理により酊素活性を
   発現するチモゲンの一種である線ＮＭ溶解酵素前駆体を
   主成分とし、安定剤として少なくともアルブミンを含有
   することを特徴とするｌ！ｉ！［素溶解酵素前駆体組成
   物。