JPS6069556A - 新規なエストロゲンレセプタ−分析法 - Google Patents
新規なエストロゲンレセプタ−分析法Info
- Publication number
- JPS6069556A JPS6069556A JP8508884A JP8508884A JPS6069556A JP S6069556 A JPS6069556 A JP S6069556A JP 8508884 A JP8508884 A JP 8508884A JP 8508884 A JP8508884 A JP 8508884A JP S6069556 A JPS6069556 A JP S6069556A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- estrogen receptor
- measuring
- estrogen
- amount
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は組織試料からの細胞核を、好ましくは核にまだ
付随していない少なくとも若干のニストロダン レセプ
ターを核に付随させた後に、分離シ、次いで核に付随し
ているニストロダン レセプターに結合した標識した抗
体の量を測定することにより組織試料中のニストロダン
レセプターの址を測定する方法およびキットに関する
。本発明は乳癌の患者にしばしば適当であるホルモン療
法を言む場合の適当な処置の決定に有用である。
付随していない少なくとも若干のニストロダン レセプ
ターを核に付随させた後に、分離シ、次いで核に付随し
ているニストロダン レセプターに結合した標識した抗
体の量を測定することにより組織試料中のニストロダン
レセプターの址を測定する方法およびキットに関する
。本発明は乳癌の患者にしばしば適当であるホルモン療
法を言む場合の適当な処置の決定に有用である。
手術後の化学療法は乳癌の治療方式で広〈実施されてい
る。１厘瘍が初期に検出された場合には、手術の範囲を
最小にでき、化学療法により癌細胞のそれ以上の生育お
よび拡大を多くの場合に止めることができる。医師の化
学療法剤の赳択はいくつかの因子Ｋｉｌづいている。こ
のような因子ｏ） １つに、悪性細胞中のニストロダン
レセプター（Ｋ２Ｒ）のレベルがある。Ｅ２Ｒレベル
が高匹場合には、ホルモン療法が抗腫瘍剤として、また
は抗）庄瘍剤による処置の補助として使用できる。しか
しながら、Ｅ２Ｒレベルが低いと、ホルモン療法は効果
が無い。
る。１厘瘍が初期に検出された場合には、手術の範囲を
最小にでき、化学療法により癌細胞のそれ以上の生育お
よび拡大を多くの場合に止めることができる。医師の化
学療法剤の赳択はいくつかの因子Ｋｉｌづいている。こ
のような因子ｏ） １つに、悪性細胞中のニストロダン
レセプター（Ｋ２Ｒ）のレベルがある。Ｅ２Ｒレベル
が高匹場合には、ホルモン療法が抗腫瘍剤として、また
は抗）庄瘍剤による処置の補助として使用できる。しか
しながら、Ｅ２Ｒレベルが低いと、ホルモン療法は効果
が無い。
ニストロダン レセプターは最近、腸および皮膚の発癌
性物質で同定された。これらはニストロダンについての
代表的対象組織ではないが、腫瘍生育におけるこのホル
モンの可能な役割は仮定できるものである。このような
場合に、腫瘍組織中のニストロダン レセプター レベ
ルの１ｌｉＪ定は乳癌について良く研究されている状況
とほとんど同じように、術後療法の指針として価値があ
る。
性物質で同定された。これらはニストロダンについての
代表的対象組織ではないが、腫瘍生育におけるこのホル
モンの可能な役割は仮定できるものである。このような
場合に、腫瘍組織中のニストロダン レセプター レベ
ルの１ｌｉＪ定は乳癌について良く研究されている状況
とほとんど同じように、術後療法の指針として価値があ
る。
医師がＪｉｌｉ２Ｒレベルが低いという認識を持ている
場合には、患者は費用や、さらにＭ効な処置の開始の遅
れ、およびホルモン療法の副作用を回避できることにな
る。近年、有用なＥ２Ｒ分析法が開発され、広域の病院
訃よび医療センターで利用されている。これらの分析法
は複雑であって、時間がかかり、他方、比較的費用がか
かり、また時には悟頼できなり０さらにまた、これらの
分析法はサイトツル フラクション中のＥ２Ｒレベルを
測定スるだけであるので、ニストロダン レセプターの
さらに完全な測定にはこれらの測定値を核ニストロｒン
レセプターの知誠でおぎなわなくてはならない。
場合には、患者は費用や、さらにＭ効な処置の開始の遅
れ、およびホルモン療法の副作用を回避できることにな
る。近年、有用なＥ２Ｒ分析法が開発され、広域の病院
訃よび医療センターで利用されている。これらの分析法
は複雑であって、時間がかかり、他方、比較的費用がか
かり、また時には悟頼できなり０さらにまた、これらの
分析法はサイトツル フラクション中のＥ２Ｒレベルを
測定スるだけであるので、ニストロダン レセプターの
さらに完全な測定にはこれらの測定値を核ニストロｒン
レセプターの知誠でおぎなわなくてはならない。
ニストロダン レセプターはそれらのステロイド系ホル
モン特異結合活性を用いて研究され、同定された［：
Ｊｅｎｑｅｎ、 Ｈｉ、Ｖ、および、ｒａｃｏｂｓｏｎ
、 Ｈ，工、。
モン特異結合活性を用いて研究され、同定された［：
Ｊｅｎｑｅｎ、 Ｈｉ、Ｖ、および、ｒａｃｏｂｓｏｎ
、 Ｈ，工、。
のｕｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇ、 ｎｏｒｍ、 ｎｅｓ、、
１８ ｍ ３８７〜４１４（１９６２年）および’ｌ
”ｏｆｔ、 ｐ、およびＣｏｒｓｋｉ、 Ｊ、のＰｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 ｓｏｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、
。
１８ ｍ ３８７〜４１４（１９６２年）および’ｌ
”ｏｆｔ、 ｐ、およびＣｏｒｓｋｉ、 Ｊ、のＰｒｏ
ｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 ｓｏｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、
。
ｊ５ 、１５７４〜１５’８１（１９６６年）参照〕。
放射性物賀−標識したホルモン、たとえばエストラジオ
ールはこのレセプターの開度に特異性で機能的な同定を
可能にするが、その結合活性は成る柚の笑験条件（たと
えは、熱、洗剤等）Ｋよシ変り易い。さらｖｃ、また、
多くの場合に、レセプターのステロイド結合性塩が内分
泌性のまたは薬理学的起源の非放射性物質−標識したホ
ルモンより占領されろ。この問題を解消するために、高
温な使用するか（Ａｎａｅｒｓｏｎ、 Ｊ、、 ０１ａ
ｒｋ、 、Ｔ、Ｈ，およびｙｅＣｋ、 ：ｒｒ、、 Ｂ
、Ｊ、 ｏ）Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ＬＨ１２６、５１６〜
５６７（１９７２年）〕またはカオトロピック（ｃｈａ
ｏｔｒｏｐｉｃ ）塩を使用して［： ５ｔｃａ、 ｖ
、、 ｐＬｉｃａ。
ールはこのレセプターの開度に特異性で機能的な同定を
可能にするが、その結合活性は成る柚の笑験条件（たと
えは、熱、洗剤等）Ｋよシ変り易い。さらｖｃ、また、
多くの場合に、レセプターのステロイド結合性塩が内分
泌性のまたは薬理学的起源の非放射性物質−標識したホ
ルモンより占領されろ。この問題を解消するために、高
温な使用するか（Ａｎａｅｒｓｏｎ、 Ｊ、、 ０１ａ
ｒｋ、 、Ｔ、Ｈ，およびｙｅＣｋ、 ：ｒｒ、、 Ｂ
、Ｊ、 ｏ）Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ＬＨ１２６、５１６〜
５６７（１９７２年）〕またはカオトロピック（ｃｈａ
ｏｔｒｏｐｉｃ ）塩を使用して［： ５ｔｃａ、 ｖ
、、 ｐＬｉｃａ。
０、Ａ、、 Ｍｏ１ｉｎａｒｉ、 Ａ、Ｍ、 、 Ｂｕ
ｏｎａｇｕｒｏ、 Ｆ、Ｍ、およびＢｒｅｓａｉａｎｉ
、 Ｆ、のＢ１０ｃｌｌθｍ１θｔｒｙ ＃ １９ ＃
８３〜８８（１９８０年ン〕、レセプター結合した内
分泌性ホルモンを放射性物質−標識したホルモンと交換
させる多くの分析法が開発された。近年、ニストロダン
レセプターに対するモノクロナール抗体が利用できる
ようになった（ ）＋４０ｎｃｈａｒｍｏｎｔ。
ｏｎａｇｕｒｏ、 Ｆ、Ｍ、およびＢｒｅｓａｉａｎｉ
、 Ｆ、のＢ１０ｃｌｌθｍ１θｔｒｙ ＃ １９ ＃
８３〜８８（１９８０年ン〕、レセプター結合した内
分泌性ホルモンを放射性物質−標識したホルモンと交換
させる多くの分析法が開発された。近年、ニストロダン
レセプターに対するモノクロナール抗体が利用できる
ようになった（ ）＋４０ｎｃｈａｒｍｏｎｔ。
Ｂ、、 Ｓｕ、 Ｊ、Ｌ、およびＰａｒｌｉｋｈ、工、
のＢｌ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
のＢｌ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。
２１．６９１６〜６９２１ （１９８２年）〕。それら
のレセプターとの相互反応はエストラジオール結合部位
の占領に関係がない。また、米国特許第４２３２００１
号およびＰｒｏ、ｃ、Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
のレセプターとの相互反応はエストラジオール結合部位
の占領に関係がない。また、米国特許第４２３２００１
号およびＰｒｏ、ｃ、Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
Ｕ、Ｓ、Ａ、、 ７７ 、５１１５〜５１１９（１９８
０年）を参照できる。
０年）を参照できる。
さらにまた、本発明の方法はまたその他の従来技術の方
法に比較して、さらに敏感であって、筐たさらｖｃ、精
確である。これは本発明の分析方法が低温で動作し、カ
オトロピック塩の使用を必要としないとともに、細胞核
内のＥ２Ｒレベルの測定手段を提供するからである。
法に比較して、さらに敏感であって、筐たさらｖｃ、精
確である。これは本発明の分析方法が低温で動作し、カ
オトロピック塩の使用を必要としないとともに、細胞核
内のＥ２Ｒレベルの測定手段を提供するからである。
本発明はエストロデン対象組織の細胞核フラクションの
ニストロダン レセプターの測定力Ｈヲ提供する。たと
えば、すでに癌であることが診断され、手術によシ切除
された乳房から採取した腫瘍組織の１部分を適当な水性
緩衝液中に均一に分散させる。
ニストロダン レセプターの測定力Ｈヲ提供する。たと
えば、すでに癌であることが診断され、手術によシ切除
された乳房から採取した腫瘍組織の１部分を適当な水性
緩衝液中に均一に分散させる。
この均質懸濁液を遠心分離して、液相と固体ペレットと
に分離する。ペレットを洗浄し、細胞核を当技術で既知
の方法により単離する。緩衝剤溶液中の、ニストロダン
特異性モノクロナール抗体で標識した、単＃４にシた核
をインキュベートして、核および標識した抗体と結合し
ているニストロダン レセフ０ターの複合体を形成する
。崩：濁液を次いで遠心分離して、固体ペレットと液体
上澄液とを生成する。ペレットを緩衝液で洗浄し、標識
した物質の量を標準試ｗＬにより分析し、その存在量を
当技術で良く知られている方法に上り測定する。
に分離する。ペレットを洗浄し、細胞核を当技術で既知
の方法により単離する。緩衝剤溶液中の、ニストロダン
特異性モノクロナール抗体で標識した、単＃４にシた核
をインキュベートして、核および標識した抗体と結合し
ているニストロダン レセフ０ターの複合体を形成する
。崩：濁液を次いで遠心分離して、固体ペレットと液体
上澄液とを生成する。ペレットを緩衝液で洗浄し、標識
した物質の量を標準試ｗＬにより分析し、その存在量を
当技術で良く知られている方法に上り測定する。
本発明はまた、インビトロ移転後の核に付随しているニ
ストロダン レセプター分子の測定に有用である。たと
えば、腫瘍乳房組織を適当な水性緩衝剤中に均一に分散
させ、１０−７〜１ｏ−９モルのエストラジオールとと
もにインキュベートする。
ストロダン レセプター分子の測定に有用である。たと
えば、腫瘍乳房組織を適当な水性緩衝剤中に均一に分散
させ、１０−７〜１ｏ−９モルのエストラジオールとと
もにインキュベートする。
ニストロダン レセグターーエストラジオール複合体を
次いで当技術で既知の条件を使用して核に移動させる。
次いで当技術で既知の条件を使用して核に移動させる。
核を単離し、標識したエストロゲンレセプター特異性抗
体とともにインキュベートする。この懸濁液を遠心分離
により、中でもエストラジオールおよび標識した抗体と
複合化した全レセプターを含有する固形ペレットを分離
する。
体とともにインキュベートする。この懸濁液を遠心分離
により、中でもエストラジオールおよび標識した抗体と
複合化した全レセプターを含有する固形ペレットを分離
する。
］ＩＣ２Ｒはこのペレット中の標識した抗体の量を測定
することにより直接に決定できる。
することにより直接に決定できる。
木兄ｕＡはまた組織試料の］１Ｃ２Ｒ言有址測定用の置
き換えタイプの標識した抗体を使用する放射免疫検定法
（ＲＩＡＪまたはその他の検定法を提供１−る。
き換えタイプの標識した抗体を使用する放射免疫検定法
（ＲＩＡＪまたはその他の検定法を提供１−る。
高い特別の］１２Ｂ包有社を有する核を、ｔことえはエ
ストラジオールで処置した雌牛の子宮から、’、ｔ：ａ
ｍする。インビトロ移転を使用して、核のｘｚｎｆＷ量
を増加できる。尚レベルのＢ２Ｒを含有する核はまた、
ヒトの乳癌セルライン、たとえばＭＯＦ −７からエス
トラジオールによる処理および適当な時間での眉１ｊ胞
の採取による標準組織培養技法を使用して、得ることも
できる。
ストラジオールで処置した雌牛の子宮から、’、ｔ：ａ
ｍする。インビトロ移転を使用して、核のｘｚｎｆＷ量
を増加できる。尚レベルのＢ２Ｒを含有する核はまた、
ヒトの乳癌セルライン、たとえばＭＯＦ −７からエス
トラジオールによる処理および適当な時間での眉１ｊ胞
の採取による標準組織培養技法を使用して、得ることも
できる。
標識したニストロダン特異性モノクロナール抗体をＥ２
Ｒ廿有核と、既知量の可溶性ニストロｒンレセゾターの
可溶性製剤（これはいずれがの哺乳′＃Ｊ物ニストロｒ
ン対象組織から製造されたサイトツル フラクションか
ら、並びにヒトの乳癌セルラインから得ることができ、
当技術で良く知られているとおりに、放射性物質−標識
したエストラジオールを使用して定量できる）の連続稀
釈の存在下にインキュベートすることに上り、標準曲線
が作成できる。
Ｒ廿有核と、既知量の可溶性ニストロｒンレセゾターの
可溶性製剤（これはいずれがの哺乳′＃Ｊ物ニストロｒ
ン対象組織から製造されたサイトツル フラクションか
ら、並びにヒトの乳癌セルラインから得ることができ、
当技術で良く知られているとおりに、放射性物質−標識
したエストラジオールを使用して定量できる）の連続稀
釈の存在下にインキュベートすることに上り、標準曲線
が作成できる。
この検に法は標準曲線の作成に使用したものと同献のＥ
２Ｒ含有核、適当な既知量の対象組織の可溶化試料およ
び標準曲線の作成に使用したものと同数の標識したニス
トロダン特異性モノクロナール抗体をインキュベートす
ることにより実施する。
２Ｒ含有核、適当な既知量の対象組織の可溶化試料およ
び標準曲線の作成に使用したものと同数の標識したニス
トロダン特異性モノクロナール抗体をインキュベートす
ることにより実施する。
抗体は核Ｅ２Ｒとおよび可溶化組織のｌＩＣ２Ｒと競合
的に結合し、それぞれ不溶性複合体および可溶性複合体
を形成する。混合物を適当なインキュベーション時間の
後に、遠心分離して、不溶性複合体をペレットにする。
的に結合し、それぞれ不溶性複合体および可溶性複合体
を形成する。混合物を適当なインキュベーション時間の
後に、遠心分離して、不溶性複合体をペレットにする。
このペレットの放射能な測足し、標準曲線と比較して、
対象組織のに２Ｒ含有址な決定する。
対象組織のに２Ｒ含有址な決定する。
例１
抗体標本
Ａ）ニストロダン レセプターの精製
子牛子宮からのエストラジオール レセプター複合体を
次の方法に従い精製する。畜殺場で！！！Ｉ物から子宮
を切除し、結合組織および卵巣を迅速に除去し、輸送用
にドライアイスに詰め、処理に使用するまで一１２０℃
で貯蔵する。１肢に、約５ＱＯｇの組織を処理する。子
宮を解凍し、市販肉粉砕＋１ｋに通して粉砕し、釉々の
爆発力のポリトロｙ （Ｉ’ｏ’１ｙｔｒｏｎ ）ホモ
ジナイず−で、０〜４°Ｃにおいて完全組織の断片がも
はや見られなくなるまで緩衝液Ａ （ＥＤＴＡ ２ｍＭ
およびＤＴＴｉｍＭを官有するトリス−Ｈ（Ｊ ２０
ｍＭ、 ｐＨ７，４） ２．５容量と均質化する。この
均質生成物を次いで１５０．０００Ｉで１時間遠心分離
し、上澄液（サイトツル）を採取する。アがロースに共
有的に結合したヘパリン〔ヘパリン−セファロース；公
開されている方法により製造； Ｍｏ１ｉｎａｒｉｊＡ
、Ｍ、等のＰｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ。
次の方法に従い精製する。畜殺場で！！！Ｉ物から子宮
を切除し、結合組織および卵巣を迅速に除去し、輸送用
にドライアイスに詰め、処理に使用するまで一１２０℃
で貯蔵する。１肢に、約５ＱＯｇの組織を処理する。子
宮を解凍し、市販肉粉砕＋１ｋに通して粉砕し、釉々の
爆発力のポリトロｙ （Ｉ’ｏ’１ｙｔｒｏｎ ）ホモ
ジナイず−で、０〜４°Ｃにおいて完全組織の断片がも
はや見られなくなるまで緩衝液Ａ （ＥＤＴＡ ２ｍＭ
およびＤＴＴｉｍＭを官有するトリス−Ｈ（Ｊ ２０
ｍＭ、 ｐＨ７，４） ２．５容量と均質化する。この
均質生成物を次いで１５０．０００Ｉで１時間遠心分離
し、上澄液（サイトツル）を採取する。アがロースに共
有的に結合したヘパリン〔ヘパリン−セファロース；公
開されている方法により製造； Ｍｏ１ｉｎａｒｉｊＡ
、Ｍ、等のＰｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ。
Ａｅａｄ、ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７４ 、４８８６〜４
８９゜（１９７７年）８照〕を緩衝液Ｂ （ＭｇＣｆ２
４１ｎＭおよびＤＴＴｌｍＭを官有するトリス−ＨＣＪ
２ Ｑ ｍｕ。
８９゜（１９７７年）８照〕を緩衝液Ｂ （ＭｇＣｆ２
４１ｎＭおよびＤＴＴｌｍＭを官有するトリス−ＨＣＪ
２ Ｑ ｍｕ。
…７．４ ） 中−ｒ”ｌ 化する。ヘパリン−セファ
ロース（１’２０Ｊｌ水血敞）を上記サイトツルと４°
Ｃで連続振盪しながら２時間、パッチ式でインキュベ−
１・する。この樹脂を次いでブックナーロト上に採取し
、緩衝液Ｂ約２１！で洗浄し、広口カラム（直径約５ｃ
ｍ、）に詰め、次いで洗浄液中の２８０ｎｍにおける光
学濃度が０．００５に減じられるまで、同一緩衝ン良で
洗浄する。エスト２ジオールレセフ０ターをヘパリン４
〜／−言Ｍ緩衝液Ｂで溶出する。エストラジオール結合
活性のピークを採取し、１００ ｍＭＫＣ４Ｋ Ｌ、次
いで緩衝液Ａ十〇、ＩＭＫＣＪ中で平衡化したエストラ
ジオール−セファロースの６−カラムに、約１０〜２ｏ
−７時の流速で適用する。エストラジオール−セファロ
ースはジアミノジゾロビルアミン（ＤＡＤＰＡ ）をシ
アノブｙ ７” ｏミド活性化したセファロース４ＢＣ
ｆＫカツプリングすることにより製造する〔公開方法に
ょるＨ ｓ’ｉｃａ、 ｙ、等のＪ、 Ｂｉｏｌ、 Ｏ
ｈｅｍ、、 ２４３ 。
ロース（１’２０Ｊｌ水血敞）を上記サイトツルと４°
Ｃで連続振盪しながら２時間、パッチ式でインキュベ−
１・する。この樹脂を次いでブックナーロト上に採取し
、緩衝液Ｂ約２１！で洗浄し、広口カラム（直径約５ｃ
ｍ、）に詰め、次いで洗浄液中の２８０ｎｍにおける光
学濃度が０．００５に減じられるまで、同一緩衝ン良で
洗浄する。エスト２ジオールレセフ０ターをヘパリン４
〜／−言Ｍ緩衝液Ｂで溶出する。エストラジオール結合
活性のピークを採取し、１００ ｍＭＫＣ４Ｋ Ｌ、次
いで緩衝液Ａ十〇、ＩＭＫＣＪ中で平衡化したエストラ
ジオール−セファロースの６−カラムに、約１０〜２ｏ
−７時の流速で適用する。エストラジオール−セファロ
ースはジアミノジゾロビルアミン（ＤＡＤＰＡ ）をシ
アノブｙ ７” ｏミド活性化したセファロース４ＢＣ
ｆＫカツプリングすることにより製造する〔公開方法に
ょるＨ ｓ’ｉｃａ、 ｙ、等のＪ、 Ｂｉｏｌ、 Ｏ
ｈｅｍ、、 ２４３ 。
６５４６〜６５５８（１９７３年）〕。〕セファロース
ーＤＡＤＦを次いで１７β−エストラジオール１７−ヘ
ミサクシネートとカル４ぐジイミＶの存在でカップリン
グする。レセプターが負性されてｂるエストラジオール
−セファロース カラム（樹脂約２−を含有する）を緩
衝液Ａｌ００ｍ１！、緩衝液Ａ＋２ＭＨＣｆ、次いで再
び緩衝液Ａ３０−で注意して洗浄する。この洗浄サイク
ルを２回、繰返す。レセプターの溶出は９．５ Ｍ Ｎ
ａ５ＯＮ 。
ーＤＡＤＦを次いで１７β−エストラジオール１７−ヘ
ミサクシネートとカル４ぐジイミＶの存在でカップリン
グする。レセプターが負性されてｂるエストラジオール
−セファロース カラム（樹脂約２−を含有する）を緩
衝液Ａｌ００ｍ１！、緩衝液Ａ＋２ＭＨＣｆ、次いで再
び緩衝液Ａ３０−で注意して洗浄する。この洗浄サイク
ルを２回、繰返す。レセプターの溶出は９．５ Ｍ Ｎ
ａ５ＯＮ 。
５ Ｘ １０−’ Ｍ （６，７’Ｈ） １７β−エス
トラジオールおよび１０チゾメテルホルムアミ１を含イ
１する緩衝液Ａ５−を使用して行なう。巨大分子結合エ
ストラジオールのピークを採取し、緩衝液Ａｉｄ対して
透析し、次いで濃縮する。ポリアクリルアミド デル電
気泳動により試験して、約り０％純度をイ１するレセフ
０ター１６０μｇがイ＋られる。
トラジオールおよび１０チゾメテルホルムアミ１を含イ
１する緩衝液Ａ５−を使用して行なう。巨大分子結合エ
ストラジオールのピークを採取し、緩衝液Ａｉｄ対して
透析し、次いで濃縮する。ポリアクリルアミド デル電
気泳動により試験して、約り０％純度をイ１するレセフ
０ター１６０μｇがイ＋られる。
Ｂ）抗体の調製
６匹ｇ） Ｅａｌ ｂ／ｃ −ｑウス（６週間令）［、
等量のフロイントの兄全アジュバントで乳化〔７た’４
１ｕ ’Ｊｌレセプター１０μｇを皮下注射する。２週
間後の間隔で、さらに１ケ月後の間隔で、等量の不完全
フロインドアジュバントを注射する。最後の注射をした
ｆｆｌ＋４）１［Ｊ日日に、各マウスにエストロケゞン
レセフ”ターの注射を尾から毎日６日間、静脈投与−４
−ろ。４日日に、１匹のマウスを犠牲に１７、その肺臓
を無菌条件下に切除する。２０デージの針を５〜６回通
すことにより、５ｍ１Ｈ：ａｓｓメジウム中の細胞懸濁
液を作る。赤血球をＱ、Ｑ １Ｍ ＫＨＯＯ。
等量のフロイントの兄全アジュバントで乳化〔７た’４
１ｕ ’Ｊｌレセプター１０μｇを皮下注射する。２週
間後の間隔で、さらに１ケ月後の間隔で、等量の不完全
フロインドアジュバントを注射する。最後の注射をした
ｆｆｌ＋４）１［Ｊ日日に、各マウスにエストロケゞン
レセフ”ターの注射を尾から毎日６日間、静脈投与−４
−ろ。４日日に、１匹のマウスを犠牲に１７、その肺臓
を無菌条件下に切除する。２０デージの針を５〜６回通
すことにより、５ｍ１Ｈ：ａｓｓメジウム中の細胞懸濁
液を作る。赤血球をＱ、Ｑ １Ｍ ＫＨＯＯ。
言Ｍする０、１５ Ｍ ＩＩＩＨ４ＣＪ、（ｐＨ７，２
） ’）容量により室温で５分間で分離する。
） ’）容量により室温で５分間で分離する。
肺臓細胞（約１０８）を５ Ｘ １０７悪性細胞ｓｐ２
／υ／Ａｇ１４と混合し、１９００ｒｐｍＴ５分間遠心
分離する。細胞を５０％ポリエチレングリコール（ＰＩ
！ｉ０−１０００ ） 中ＶＣ再懸ｆ’ｌＪ（、、血清
ヲ含有しなめダルベツコ（１）ｕｌｂθｃｃｏ ）のＭ
ＥＭメジウムにより、６７℃で８分１ｆｊｊ ノ１ｆｊ
Ｊ Ｋ 、ＰＥＯ（１）ノー終５％濃度に稀釈する。細
胞を再贋、遠心分離し、ＤＭＥＭ ＋２０ ％ 姐娠雌
牛血清（ＦＣ！Ｓ ）中に２．５ Ｘ １０’細胞／−
の最終濃度で再懸濁する。細胞を９６凹ｔ’Ａを有する
微滴定器の２５０個の四部中九分配する。翌日に、メジ
ウムをハイゾリド選択用のメジウムを含有するヒボキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ ）に変え
る。細胞にＨＡＴメジウムを１０日間、−日おきに与え
る。メジウムを次イテＤＭＥＭ ＋２ Ｑ％ｌＩＩ′ｃ
８ニ変、＋６；１８０イ固の凹部がバイブリドを注１す
ることが判った。さらに２日後に、各四部からのメジウ
ムをエストロデンレセプターに対する抗体について分析
する。抗体の存在は、ヘパリンを予め塗布した９６凹部
を有するプレート上に固定した精製ニストロダン レセ
プターと四部上度数とをインキュベートすることにより
検定する。四部の洗浄後に、レセゾター−ヘパリン複合
体に結合した抗体の存在を酵素−標識した山羊ｘｇ、ａ
の製造業者（ＢθｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉθＳ）により提供された指示に従い、
β−がラクトシダーゼに結合した山羊抗マウスエｇＧと
の反応により検出する。これらの凹部でエストロゲン
レセプターと反応する抗体の存在をまた、ショ糖勾配検
定により確認する。
／υ／Ａｇ１４と混合し、１９００ｒｐｍＴ５分間遠心
分離する。細胞を５０％ポリエチレングリコール（ＰＩ
！ｉ０−１０００ ） 中ＶＣ再懸ｆ’ｌＪ（、、血清
ヲ含有しなめダルベツコ（１）ｕｌｂθｃｃｏ ）のＭ
ＥＭメジウムにより、６７℃で８分１ｆｊｊ ノ１ｆｊ
Ｊ Ｋ 、ＰＥＯ（１）ノー終５％濃度に稀釈する。細
胞を再贋、遠心分離し、ＤＭＥＭ ＋２０ ％ 姐娠雌
牛血清（ＦＣ！Ｓ ）中に２．５ Ｘ １０’細胞／−
の最終濃度で再懸濁する。細胞を９６凹ｔ’Ａを有する
微滴定器の２５０個の四部中九分配する。翌日に、メジ
ウムをハイゾリド選択用のメジウムを含有するヒボキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ ）に変え
る。細胞にＨＡＴメジウムを１０日間、−日おきに与え
る。メジウムを次イテＤＭＥＭ ＋２ Ｑ％ｌＩＩ′ｃ
８ニ変、＋６；１８０イ固の凹部がバイブリドを注１す
ることが判った。さらに２日後に、各四部からのメジウ
ムをエストロデンレセプターに対する抗体について分析
する。抗体の存在は、ヘパリンを予め塗布した９６凹部
を有するプレート上に固定した精製ニストロダン レセ
プターと四部上度数とをインキュベートすることにより
検定する。四部の洗浄後に、レセゾター−ヘパリン複合
体に結合した抗体の存在を酵素−標識した山羊ｘｇ、ａ
の製造業者（ＢθｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉθＳ）により提供された指示に従い、
β−がラクトシダーゼに結合した山羊抗マウスエｇＧと
の反応により検出する。これらの凹部でエストロゲン
レセプターと反応する抗体の存在をまた、ショ糖勾配検
定により確認する。
陽性の四部のかなシからの細胞を軟質寒天でクローン化
する。目に見えるクローンを採取し、９６個の凹部を４
ｆするプレートに移す。これらのクローンの上澄液を［
１２５工〕−エストラジオール標識したサイトンル系レ
セプターを使用する二車抗体免疫沈殿検定法で区別する
。陽性のクローンの細胞をグリスタン（３，６，１０，
１４−テトラメチルペンタデカン）でプライムしたＢａ
１ｂ／ｃマウス（１０７細胞／マウスンに腹腔内注射す
る。
する。目に見えるクローンを採取し、９６個の凹部を４
ｆするプレートに移す。これらのクローンの上澄液を［
１２５工〕−エストラジオール標識したサイトンル系レ
セプターを使用する二車抗体免疫沈殿検定法で区別する
。陽性のクローンの細胞をグリスタン（３，６，１０，
１４−テトラメチルペンタデカン）でプライムしたＢａ
１ｂ／ｃマウス（１０７細胞／マウスンに腹腔内注射す
る。
７〜１０日後に、マウスを犠牲にし、腹水を腹腔側から
採取する。抗体は硫酸アンモニウム沈殿およヒＬＩＫＡ
Ｅセルロース クロマトグラフィにより精製ｊる。
採取する。抗体は硫酸アンモニウム沈殿およヒＬＩＫＡ
Ｅセルロース クロマトグラフィにより精製ｊる。
血清を含有しないメジウム中での別の方法では、少量、
の高純度抗体の製造が可能である。これは融合用に使用
する親の悪性セルラインｓｐ ２１０／Ａｇ −１４が
免疫グロブリンを合成しなしことから可能［なろ［Ｓｈ
ｕｉｍａｎ等のＮａｔｕｒｅ 、 ２７６ 、２６９〜
２７０、（１９７８年）参照〕。ハイプリドーマ細胞は
初期に、０．５〜Ｉ Ｘ １０６細胞／−の濃度まで２
０％ＦＯ８を含有するＤＭＥＭ中で生育させ、次いで血
清を含有しないメジウムに移す。１６〜１８時間後に、
メジウムを採取し、プロティンＡ−セファロース カラ
ムでクロマトグラフィ処理する。ＰＢＳで十分に洗浄し
た後に、吸着している免疫グロブリンを０．Ｉ Ｎ酢酸
で浴出し、トリスですぐに中和する。このような方法で
生成された抗体の純度は９８％より大であるが、生成さ
れた抗体の肚は腹水で生成された量より少ない。
の高純度抗体の製造が可能である。これは融合用に使用
する親の悪性セルラインｓｐ ２１０／Ａｇ −１４が
免疫グロブリンを合成しなしことから可能［なろ［Ｓｈ
ｕｉｍａｎ等のＮａｔｕｒｅ 、 ２７６ 、２６９〜
２７０、（１９７８年）参照〕。ハイプリドーマ細胞は
初期に、０．５〜Ｉ Ｘ １０６細胞／−の濃度まで２
０％ＦＯ８を含有するＤＭＥＭ中で生育させ、次いで血
清を含有しないメジウムに移す。１６〜１８時間後に、
メジウムを採取し、プロティンＡ−セファロース カラ
ムでクロマトグラフィ処理する。ＰＢＳで十分に洗浄し
た後に、吸着している免疫グロブリンを０．Ｉ Ｎ酢酸
で浴出し、トリスですぐに中和する。このような方法で
生成された抗体の純度は９８％より大であるが、生成さ
れた抗体の肚は腹水で生成された量より少ない。
これらの生成物を５ＤＳ−ＰＡＣＥ上で分析すると、工
ｇＧの存在および工ｇＭの不存在を示す。１匹のマウス
から得られる精製工ｇＧの址は１．５ｉ＋ｙ〜２０■で
変わる。
ｇＧの存在および工ｇＭの不存在を示す。１匹のマウス
から得られる精製工ｇＧの址は１．５ｉ＋ｙ〜２０■で
変わる。
２
抗体の放射性ヨーＶ化
一定適献の精製したモノクロナール抗体をラクトパーオ
キシダーゼ法［Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ、 ＪＪ、＋
１７）ｆ３１ｏｃｈｅｉｎ、 Ｊ、 １ １ ３ ｍ
２ ９ ９ 〜６ ０ ５ （１９６９年〕〕により放
射性物質で標識する。抗体５０ｐｇ。
キシダーゼ法［Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ、 ＪＪ、＋
１７）ｆ３１ｏｃｈｅｉｎ、 Ｊ、 １ １ ３ ｍ
２ ９ ９ 〜６ ０ ５ （１９６９年〕〕により放
射性物質で標識する。抗体５０ｐｇ。
Ｎ、［１２５工］ ２ｍｃｚ、ラクトパー：＃＊ジター
（！’５０μｇ オ！ ヒ０．３ Ｍ 酢酸ナトリウム
中のＯ，［１０２％Ｈ２Ｏ２（ｔｌ ５．６ ）を宮肩
する反応混合物（総容積１５０μｌ）を作る。反応は過
酸化氷菓のｖＪ≦加により開始され、室温で２分後にチ
ラミン塩酸塩（２ｒｎｇ／ｍ７り １００ ｐｌを加え
、１分ＶｖｃＮａ工（２■／ ｍｑ ） １００μｌを
加えて止める。放射性物質−標識した抗体を、仔牛血清
アルゾミン（４＊／ｍｌ）をｆＭする５ ９ ｍｈＩリ
ン酸塩緩Ｖｊ Ｗ （ｐＨ７，５）で平衡化したセファ
デックスＧ−１００力２ム（１０ｙ）で精製し、空容鼠
（Ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ ）の留分を集め７）。放射
性物質−標識した抗体の比活性は１０〜５０μＣ１／ｕ
ｇの範囲である。同様に、フレイドで標識できる。（”
５Ｓ ）メチオニンにより標識した抗体の生成も可能で
ある。この目的には、ハイプリドーマ細胞を細胞培養メ
ジウム１ｔｎｌ。
（！’５０μｇ オ！ ヒ０．３ Ｍ 酢酸ナトリウム
中のＯ，［１０２％Ｈ２Ｏ２（ｔｌ ５．６ ）を宮肩
する反応混合物（総容積１５０μｌ）を作る。反応は過
酸化氷菓のｖＪ≦加により開始され、室温で２分後にチ
ラミン塩酸塩（２ｒｎｇ／ｍ７り １００ ｐｌを加え
、１分ＶｖｃＮａ工（２■／ ｍｑ ） １００μｌを
加えて止める。放射性物質−標識した抗体を、仔牛血清
アルゾミン（４＊／ｍｌ）をｆＭする５ ９ ｍｈＩリ
ン酸塩緩Ｖｊ Ｗ （ｐＨ７，５）で平衡化したセファ
デックスＧ−１００力２ム（１０ｙ）で精製し、空容鼠
（Ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ ）の留分を集め７）。放射
性物質−標識した抗体の比活性は１０〜５０μＣ１／ｕ
ｇの範囲である。同様に、フレイドで標識できる。（”
５Ｓ ）メチオニンにより標識した抗体の生成も可能で
ある。この目的には、ハイプリドーマ細胞を細胞培養メ
ジウム１ｔｎｌ。
当り、（３５ｓ ）メチオニン（６００〜１４００ａ１
／モリモル）５０μ（Ｊを官有するメチオニンを含まな
いメジウム中に再懸濁する。［３５ｓ）−標識した抗１
本はプロティンＡ−セファロース カラムで前記のとお
りに精製する。
／モリモル）５０μ（Ｊを官有するメチオニンを含まな
いメジウム中に再懸濁する。［３５ｓ）−標識した抗１
本はプロティンＡ−セファロース カラムで前記のとお
りに精製する。
列３
非アイソトープ系標識を有する抗体の調製放射性物質標
識の代りに、抗体はまた、酵素、フルオロホーレまたは
クロモホーレ（発色団）ＶＣ。
識の代りに、抗体はまた、酵素、フルオロホーレまたは
クロモホーレ（発色団）ＶＣ。
より、標識化用の既知の技法により標識付けすることも
できる。酵素に対する生物学的基質の結合ノＰｉ ｆｉ
、タトえばＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、 Ｌ、Ａ、の工ｍ
ｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 Ｐｒｅｎｔ
ｉｃｅ Ｈａｌｌ、 ＮθＷＹｏｒｋ （１９７４年）
に記載されている。
できる。酵素に対する生物学的基質の結合ノＰｉ ｆｉ
、タトえばＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、 Ｌ、Ａ、の工ｍ
ｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 Ｐｒｅｎｔ
ｉｃｅ Ｈａｌｌ、 ＮθＷＹｏｒｋ （１９７４年）
に記載されている。
：４ＨＷ ｒｙ−）１−− パー＊＊シａゝ−ゼ５＋ｎ
ｇを０．３ＭＮａＨＣＯ２（ｐＨ８−１’） １−Ｉｒ
、／ｇ解し、無水メタ／−ル中のフルオロジニトロベン
ゼンの１％ｉｉｏ、ｉｒＭを加える。室温で１時間イン
キュベートした後に、水中のＱ 、５ Ｍ ＮａＩＯ４
１−Ｏｒｎｌ！ ヲ）Ｊｕ ｆｃ−１ｍ 合物全室温で
６０分子ＭＪ攪拌する。エチレングリコール（１，０−
；蒸留水中０．１５ ’Ｍ ） ヲ）ｔｌｌＬ、室温７
１時間攪拌した後に、溶液を４℃で１０ ｍＭ Ｎａ２
００３（ｐＨ９，５）に対して透析する。透析した溶液
に、抗体５■を加え、混合物を室温でさらに攪拌し、次
いでＮａＢＨ４５ｍｇを加える。混合物を４°で一夜に
わたり放置する。反応混合物を法論で透析し、セファデ
ックスＣ！−１００カラムに通してクロマトグラフィ処
理する。酵素−抗体複合体を含有する留分を集める〔こ
の方法のさらに詳＃Ｉな説明はＮａｋａｎｅｊＰ、に、
等によりＪ、Ｈｌｅｔｏｃｈｅｍ、 ０ｙｔｏｃｈθｍ
、。
ｇを０．３ＭＮａＨＣＯ２（ｐＨ８−１’） １−Ｉｒ
、／ｇ解し、無水メタ／−ル中のフルオロジニトロベン
ゼンの１％ｉｉｏ、ｉｒＭを加える。室温で１時間イン
キュベートした後に、水中のＱ 、５ Ｍ ＮａＩＯ４
１−Ｏｒｎｌ！ ヲ）Ｊｕ ｆｃ−１ｍ 合物全室温で
６０分子ＭＪ攪拌する。エチレングリコール（１，０−
；蒸留水中０．１５ ’Ｍ ） ヲ）ｔｌｌＬ、室温７
１時間攪拌した後に、溶液を４℃で１０ ｍＭ Ｎａ２
００３（ｐＨ９，５）に対して透析する。透析した溶液
に、抗体５■を加え、混合物を室温でさらに攪拌し、次
いでＮａＢＨ４５ｍｇを加える。混合物を４°で一夜に
わたり放置する。反応混合物を法論で透析し、セファデ
ックスＣ！−１００カラムに通してクロマトグラフィ処
理する。酵素−抗体複合体を含有する留分を集める〔こ
の方法のさらに詳＃Ｉな説明はＮａｋａｎｅｊＰ、に、
等によりＪ、Ｈｌｅｔｏｃｈｅｍ、 ０ｙｔｏｃｈθｍ
、。
２２．１０８４〜１０９１（１９７４年）に示されてい
る〕。種々のその他の酵素を抗体に、当技術で既知の方
法により結合させることができる。
る〕。種々のその他の酵素を抗体に、当技術で既知の方
法により結合させることができる。
Ｂ）発螢光団接合抗体の製造
０、’ｉ Ｍ ＮａＨＣＯ２（ｐｌ（８−１） ２−に
溶解した精製モノクロナール抗体（５η）をジメチルス
ルホキシド（Ｉｒｎｙ／ｍｇ）中のテキザスレツＰの溶
液１５μでと暗所で４°にお因て一夜の間、混合する。
溶解した精製モノクロナール抗体（５η）をジメチルス
ルホキシド（Ｉｒｎｙ／ｍｇ）中のテキザスレツＰの溶
液１５μでと暗所で４°にお因て一夜の間、混合する。
この赤色浴液を次いで２０ｃＩＪＬ×１ｃｒｒＬセフア
デツクスＧ−２５カラムに通してクロマトグラフィ処理
し、空容積のピ′−りを集め、生化学分析に使用する。
デツクスＧ−２５カラムに通してクロマトグラフィ処理
し、空容積のピ′−りを集め、生化学分析に使用する。
種々のその他の発螢光団または発色団を抗体に、当技術
で既知の方法により結合させることができる（ Ｗａｎ
ｇ、 Ｋ１等のＭｅｔｈｏａ ｌｎ Ｆｉｎ２７ｍ０１
０ｇ７．８５ＥＬ５１４（１９８２年）参照〕。
で既知の方法により結合させることができる（ Ｗａｎ
ｇ、 Ｋ１等のＭｅｔｈｏａ ｌｎ Ｆｉｎ２７ｍ０１
０ｇ７．８５ＥＬ５１４（１９８２年）参照〕。
ｖ／ｕ ４
細胞核の未知試料中のＥ２Ｒ含有量の検定哺乳動物の組
織の移植片の重置なはかり（たとえは５００η）、次い
でポリトン ホモジナイず−で水冷ＴＥＤ８緩衝液（Ｅ
ＤＴＡ ｉ ｍＭ 、ジテオスレイトールｉ ｍＭおよ
び１０饅（重ｂｉ−／谷蓋）ショＭｕ 金含有’１−６
トリ／’ −ＨＣＩ （ｐｌ４７．４ ） ２０ ｍ
Ｍ ）中に均質に分散させる。均質生成物をナイロンメ
ツシュ（２００μｍ ） ｖｃ通して濾過し、８００
ｘｇで２０分間遠心分離する。この核ペレットを同一緩
衝液で２回洗浄し、次いでＴＪＩＧＤＳ緩衝液に０．２
〜［１，５ｍｇ ＤＮＡ／ ｍ Ｉｃ再ｒａ濁する。
織の移植片の重置なはかり（たとえは５００η）、次い
でポリトン ホモジナイず−で水冷ＴＥＤ８緩衝液（Ｅ
ＤＴＡ ｉ ｍＭ 、ジテオスレイトールｉ ｍＭおよ
び１０饅（重ｂｉ−／谷蓋）ショＭｕ 金含有’１−６
トリ／’ −ＨＣＩ （ｐｌ４７．４ ） ２０ ｍ
Ｍ ）中に均質に分散させる。均質生成物をナイロンメ
ツシュ（２００μｍ ） ｖｃ通して濾過し、８００
ｘｇで２０分間遠心分離する。この核ペレットを同一緩
衝液で２回洗浄し、次いでＴＪＩＧＤＳ緩衝液に０．２
〜［１，５ｍｇ ＤＮＡ／ ｍ Ｉｃ再ｒａ濁する。
１００μｌ各定敢の核懸濁液を放射性ヨウ素化抗体の適
度の稀釈ｉ（２０■／１検定）と、標識していない抗体
（同一クローンからの）５μｇ／ｌ検定の存在または不
存在下に、最終容積２００ｐ／で、６時間、二重反復イ
ンキュベートする。抗体（標識したもの並びに標識して
しないものの両方）を仔牛ｒ−プロゾリン１９／−含有
ＴＥＤＳ緩衝液で稀釈する。インキュベーションの終了
時ニ、仔牛血清アルブミン１■／−を含有する水冷Ｔ
ＢＤＳ緩！Ｍｊ液４−を各音に加え、次いでａｏｏｘｇ
で２０分間遠心分離する。この核ペレットを前記緩衝液
で１回洗浄し、ガンマカウンターで放射能を測定する。
度の稀釈ｉ（２０■／１検定）と、標識していない抗体
（同一クローンからの）５μｇ／ｌ検定の存在または不
存在下に、最終容積２００ｐ／で、６時間、二重反復イ
ンキュベートする。抗体（標識したもの並びに標識して
しないものの両方）を仔牛ｒ−プロゾリン１９／−含有
ＴＥＤＳ緩衝液で稀釈する。インキュベーションの終了
時ニ、仔牛血清アルブミン１■／−を含有する水冷Ｔ
ＢＤＳ緩！Ｍｊ液４−を各音に加え、次いでａｏｏｘｇ
で２０分間遠心分離する。この核ペレットを前記緩衝液
で１回洗浄し、ガンマカウンターで放射能を測定する。
既知量のエストロゲン レセプター（５〜１ｏ。
ｆｍｏＪ ）を言Ｍする核の安定化した試料を使用踵標
準曲線を同一条件で同時に作成する。未知の試料中に存
在するニストロダン レセプターノ量ハ油ｊ（ｈｄｈＪ
ｄＡｆ−４）参ｊｒＪＪｌイＪ＋「１ｃ＝ｒ、・、・４
１゛−？ｔＭＨＨ’Ｊ重１＋＋＋−，，−−−科中に存
在するエストロゲン レセプターのこのｉｔｔす定値は
ＤＮＡ宮有駄について標準化せねばならない。試料のＤ
ＮＡ含有量は、０．５Ｍ過ジクロル酸中核懸濁液の１０
０μｌ定川、（最終容積５００ ｐｌ ）を７０℃で１
５分間、予備インキュベートし、次いでジフェニルアミ
ン試桑（ジフェニルアミン１．５ｇ、Ｈ２ＳＯ４１，５
ｄ、酢酸１００ ｐｉ オヨＵ １．６饅アセトアルデ
ヒｌ’０．５ｍ）１ｍを加え、次いで３０°Ｃで１８時
間インキュベートすることに上り１）ｌ！Ｉ定する〔詳
ａはＢｕｒｔｏｎ、 Ｋ、のＢｊ−ｏｃｈｅｍ、 Ｊ、
６２ 。
準曲線を同一条件で同時に作成する。未知の試料中に存
在するニストロダン レセプターノ量ハ油ｊ（ｈｄｈＪ
ｄＡｆ−４）参ｊｒＪＪｌイＪ＋「１ｃ＝ｒ、・、・４
１゛−？ｔＭＨＨ’Ｊ重１＋＋＋−，，−−−科中に存
在するエストロゲン レセプターのこのｉｔｔす定値は
ＤＮＡ宮有駄について標準化せねばならない。試料のＤ
ＮＡ含有量は、０．５Ｍ過ジクロル酸中核懸濁液の１０
０μｌ定川、（最終容積５００ ｐｌ ）を７０℃で１
５分間、予備インキュベートし、次いでジフェニルアミ
ン試桑（ジフェニルアミン１．５ｇ、Ｈ２ＳＯ４１，５
ｄ、酢酸１００ ｐｉ オヨＵ １．６饅アセトアルデ
ヒｌ’０．５ｍ）１ｍを加え、次いで３０°Ｃで１８時
間インキュベートすることに上り１）ｌ！Ｉ定する〔詳
ａはＢｕｒｔｏｎ、 Ｋ、のＢｊ−ｏｃｈｅｍ、 Ｊ、
６２ 。
６１５〜３２３（１９５６年〕を参照できる〕。
試料の６００ｎＩ］１ＶｃおけるブＣ学濃度を次いで既
知の１）ＮＡ言Ｍ址の試料により得られた標準曲線と比
較する。
知の１）ＮＡ言Ｍ址の試料により得られた標準曲線と比
較する。
例５
卵果摘出したラットに１７β−エストラジオールの投与
［１（たとえば１Ｕ〜５０ ｐｇ／体重ｋｙ ）を？Ｊ
ｉ４ｔ −１’−ム − ’ｌｌ’ｔ！出１落１ｆｆ
１１山’ｌ＋ｂ＋ ｆｘ ’ｌ：ｍ ル１： ｌｚ
ｌ エ・ｅｉ −切除し、型針をはかり、フェニルメチ
ルスルホニルフルオライドｏ、ｉ ｍＭを含有するＴＥ
ＤＥＩ緩衝液１０容量中に均質に分散する。この均質生
成物をナイロンメツシュ（２００μｍ）［通して濾過し
、８００ｘｇで２０分間遠心分離し、ペレットを同一緩
衝液で２回、洗浄する。ペレットを均質化に使用した緩
衝液２ｒｎｌ中に再懸濁し、次いで２．１Ｍショ糖ゴ有
ＴＥＤ緩衝液２ｍ−クッション上に層形成し、動揺パケ
ットローターにおいて４５０００×ｇで６０分１ｉ４ｊ
遠心分離する。ペレットを１回、洗浄し、ＴＥＤＥＩ緩
衝液２ｒｎＩに再懸濁する。このような生成試料の各固
定量中に存在するエストロゲンレセプターの址は次のと
おりにして測定する。各１００ ｐｉ定鍛を０．５ Ｍ
Ｎａ５ＯＮ 言＠ ＴＥＤＳ緩衝液中の１７β−〔３
Ｈ〕工ストラジオール１５１１１Ｍと、５００倍過來１
１量の標識していないホルモンの存在または不存在下に
、６００μＥの最終容量でインキュベー）ｆる。４°Ｃ
で１５〜１８時間インキュベートした後に、水冷木炭）
酢濁液（１％木炭、０，１チデキストロンＴ−７０およ
び０．１％ゼラチンのＴＥＤＳ緩衝液緩衝液中懸濁液管
に加え、さらに１５分後に、５０．ＯＯＯｒｌｌ）ｍＴ
３０分間遠心分離することにより、結合したエストラジ
オールを分離する。上澄液の各０．５一定駈中に存在す
る放射ｉヒを測定し、試料と放射能を有するホルモンと
の結合活性から過剰の標識していないホルモンを含有す
る試料の結合活性を引き算することにより、特異的結合
活性を計算する。存在するエストロゲンレセプターのモ
ル址は放射性物質−標識したエストラジオールの比活性
から計ｎ−′４−る。
［１（たとえば１Ｕ〜５０ ｐｇ／体重ｋｙ ）を？Ｊ
ｉ４ｔ −１’−ム − ’ｌｌ’ｔ！出１落１ｆｆ
１１山’ｌ＋ｂ＋ ｆｘ ’ｌ：ｍ ル１： ｌｚ
ｌ エ・ｅｉ −切除し、型針をはかり、フェニルメチ
ルスルホニルフルオライドｏ、ｉ ｍＭを含有するＴＥ
ＤＥＩ緩衝液１０容量中に均質に分散する。この均質生
成物をナイロンメツシュ（２００μｍ）［通して濾過し
、８００ｘｇで２０分間遠心分離し、ペレットを同一緩
衝液で２回、洗浄する。ペレットを均質化に使用した緩
衝液２ｒｎｌ中に再懸濁し、次いで２．１Ｍショ糖ゴ有
ＴＥＤ緩衝液２ｍ−クッション上に層形成し、動揺パケ
ットローターにおいて４５０００×ｇで６０分１ｉ４ｊ
遠心分離する。ペレットを１回、洗浄し、ＴＥＤＥＩ緩
衝液２ｒｎＩに再懸濁する。このような生成試料の各固
定量中に存在するエストロゲンレセプターの址は次のと
おりにして測定する。各１００ ｐｉ定鍛を０．５ Ｍ
Ｎａ５ＯＮ 言＠ ＴＥＤＳ緩衝液中の１７β−〔３
Ｈ〕工ストラジオール１５１１１Ｍと、５００倍過來１
１量の標識していないホルモンの存在または不存在下に
、６００μＥの最終容量でインキュベー）ｆる。４°Ｃ
で１５〜１８時間インキュベートした後に、水冷木炭）
酢濁液（１％木炭、０，１チデキストロンＴ−７０およ
び０．１％ゼラチンのＴＥＤＳ緩衝液緩衝液中懸濁液管
に加え、さらに１５分後に、５０．ＯＯＯｒｌｌ）ｍＴ
３０分間遠心分離することにより、結合したエストラジ
オールを分離する。上澄液の各０．５一定駈中に存在す
る放射ｉヒを測定し、試料と放射能を有するホルモンと
の結合活性から過剰の標識していないホルモンを含有す
る試料の結合活性を引き算することにより、特異的結合
活性を計算する。存在するエストロゲンレセプターのモ
ル址は放射性物質−標識したエストラジオールの比活性
から計ｎ−′４−る。
本明細■、において、下記の略語を使用する：ＣＮＢｒ
ニジアノｒン プロミド； ＤＡＤＰＡ ：ジアミノジ
プロピルアミン： ＤＭｆｆｉＭ ：ダルベツコの最低
基本メジウム； ＤＴＴ ニジチオスレイトール； Ｋ
２Ｒ：エストロゲン レセプター； ＥＤＴＡ ：エチ
レンジアミノテトラ自゛「酸； ＨＢＳＳ ：ハングの
平衡化塩溶液；工ｇ（） ： Ｇタイプのガンマ免疫グ
ロゾリン；工ｇＭ二Ｍタイプのガンマ免疫グロブリン；
ＭＥＭ ：最低基本メジウム； ＰＡＣＥ ：ポリア
クリルアミド ｒルミ気泳動； ＰＢＳ ： ｖン改塩
緩衝塩類浴液； ＳＤＳ ニドデシル硫酸ナトリウム；
およびＴＲ工Ｓニドリス（ヒＰロキシメチル）アミノメ
タン。
ニジアノｒン プロミド； ＤＡＤＰＡ ：ジアミノジ
プロピルアミン： ＤＭｆｆｉＭ ：ダルベツコの最低
基本メジウム； ＤＴＴ ニジチオスレイトール； Ｋ
２Ｒ：エストロゲン レセプター； ＥＤＴＡ ：エチ
レンジアミノテトラ自゛「酸； ＨＢＳＳ ：ハングの
平衡化塩溶液；工ｇ（） ： Ｇタイプのガンマ免疫グ
ロゾリン；工ｇＭ二Ｍタイプのガンマ免疫グロブリン；
ＭＥＭ ：最低基本メジウム； ＰＡＣＥ ：ポリア
クリルアミド ｒルミ気泳動； ＰＢＳ ： ｖン改塩
緩衝塩類浴液； ＳＤＳ ニドデシル硫酸ナトリウム；
およびＴＲ工Ｓニドリス（ヒＰロキシメチル）アミノメ
タン。
第１図は標準曲線および本発明に従い作成されたグラフ
を、標準曲線の使用方法とともに示すものである。
を、標準曲線の使用方法とともに示すものである。
標準曲線は異なる量で核中に存在するエストロゲン レ
セプターを固定量の放射性物質−標識した抗体とインキ
ュベートすることにより作成する。
セプターを固定量の放射性物質−標識した抗体とインキ
ュベートすることにより作成する。
抗体の特異的結合は総結合と過剰の標識していない抗体
の存在における結合との差である。未知試料中に存在す
るエストロゲン レセプターの量は〔１２５工〕抗体の
実験的に決定された特異的結合に相当する横坐標から標
準曲線を用いて決定される。
の存在における結合との差である。未知試料中に存在す
るエストロゲン レセプターの量は〔１２５工〕抗体の
実験的に決定された特異的結合に相当する横坐標から標
準曲線を用いて決定される。
第１図は標準曲線および本発明に従い作成され□たグラ
フを標準曲線の１史用力法とともに示すものである。 代理入浅村 ゛皓 手続補正書（１発） 昭和５９年９月２ｑ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 １１ｓ和５９１ｉｆｆＦＩｉＥＴ８５ Ｄ ８８ 号２
、発明の名称 新規なエストロゲンレセプター分析法 ３、補正をする者 ＋ＪＴｌ！Ｌトノ関６％ （！ｊ：ｌ’ｌ出願人４、代
理人 昭和 年 月 日 ６、補正により増加する発明の数 明細書の浄書（内容に変更なし） 手続補正書（方式） 昭和ｇ２年ケ月２７日 特許庁長官殿 り事件の表示 昭和、イー７年特許願第 ？ｊＯざｒ 号２、発明の名
称 」ｈ′４なニス１■す゛ンレｌづ゛ター分析法３、補正
をする者 Ｔｊｉ件との関係 特；ｊ′１出願人 住 所 ４、代理人 昭和４年２月Ｓ１日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象
フを標準曲線の１史用力法とともに示すものである。 代理入浅村 ゛皓 手続補正書（１発） 昭和５９年９月２ｑ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 １１ｓ和５９１ｉｆｆＦＩｉＥＴ８５ Ｄ ８８ 号２
、発明の名称 新規なエストロゲンレセプター分析法 ３、補正をする者 ＋ＪＴｌ！Ｌトノ関６％ （！ｊ：ｌ’ｌ出願人４、代
理人 昭和 年 月 日 ６、補正により増加する発明の数 明細書の浄書（内容に変更なし） 手続補正書（方式） 昭和ｇ２年ケ月２７日 特許庁長官殿 り事件の表示 昭和、イー７年特許願第 ？ｊＯざｒ 号２、発明の名
称 」ｈ′４なニス１■す゛ンレｌづ゛ター分析法３、補正
をする者 Ｔｊｉ件との関係 特；ｊ′１出願人 住 所 ４、代理人 昭和４年２月Ｓ１日 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）対象組織の細胞核に付随しているエストロゲンレ
セプターの量の測定方法であって、対象組織から細胞核
を分離し、細胞核に付随しているエストロゲン レセプ
ターの敞を標識した抗体を使用することにより測定する
ことを含む方法。 （２） エストｅＩｒン レセプターの量の測定方法で
あって、一定址のエストロゲン レセプターを含有する
細胞核、未知量のＯＪ′メ性ニストロｒン レセプター
および標識した抗体を一緒に混合し、次いで核に付随し
てｂるエストロゲン レセプターに結合している抗体の
結合を測定することを含む方法。 （３）細胞核を含有する組織試料中のエストロゲンレセ
プターの量の測定方法であって、組織試料を採取しよう
とする哺乳動物にエストラジオールを投与し、この哺乳
動物から組織試料を採取し、組織試料から完全細胞核を
単離し、分離した完全核に標識したエストロゲン特異性
抗体を加え、次いでエストロゲン レセプターに対する
標識した抗体の結合レベルを測定することを含む方法。 （４）対象組織から核を分離する前に、対象組織をエス
トラジオールと混合する特許請求の範囲第１項の方法。 （５）哺乳動物組織中のエストロゲン レセプター製剤
ルの測定に使用するキットであって、（ａ）エストロゲ
ン レセプターを組織の細胞核に移動させるに十分な散
のエストラジオール； （ｂ）検知できる神職で標識し
た抗体の成る量；および（Ｃ）既冨鮭のエストロゲン
レセプターを言句する安定化されている核製剤を含むキ
ット。 （６１１’ｆｌＴ乳動物組織中のエストロゲン レセプ
ターのレベルの測定に使用するキットであって、（ａ）
成る址の標識した抗体：（ｂ）一定危のエストロゲンレ
セプターを含有する成る社の核；および＜Ｃ）巧浴性エ
ストロデン レセプター製剤を含むキット。 （７）各成分の一定鼠をプラスチックまたはガラス製の
封鎖容器内に貯蔵しである特許請求の範囲第５項または
第６項のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48899083A | 1983-04-27 | 1983-04-27 | |
| US488990 | 1983-04-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6069556A true JPS6069556A (ja) | 1985-04-20 |
Family
ID=23941956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8508884A Pending JPS6069556A (ja) | 1983-04-27 | 1984-04-26 | 新規なエストロゲンレセプタ−分析法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0129669A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6069556A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0264185A3 (en) * | 1986-09-29 | 1989-05-31 | Baylor College Of Medicine | Urea-induced dna-binding assay for quantitative determination of estrogen receptor proteins |
| US5312752A (en) * | 1989-07-31 | 1994-05-17 | Trustees Of Boston University | Specific antibodies against the DNA-binding domain of and immunoassays to determine the presence and functional status of estrogen receptor proteins |
| DE19516954C1 (de) * | 1995-05-12 | 1996-12-19 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zum ortsaufgelösten immunhistochemischen Nachweis von Steroidrezeptoren |
| DE19628298C2 (de) * | 1996-07-12 | 2002-04-11 | Max Delbrueck Centrum | Verfahren zum Nachweis einer Hormon- bzw. Antihormonresistenz bei Tumoren |
| EP3501519A4 (en) | 2016-08-18 | 2020-04-01 | National University Corporation Nara Institute of Science and Technology | IMMUNE MODULATOR |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4232001A (en) * | 1978-09-22 | 1980-11-04 | University Patents, Inc. | Methods and materials for detection of estrophilin |
-
1984
- 1984-04-26 EP EP84104721A patent/EP0129669A3/en not_active Withdrawn
- 1984-04-26 JP JP8508884A patent/JPS6069556A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0129669A3 (en) | 1987-09-16 |
| EP0129669A2 (en) | 1985-01-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Samuels et al. | Thyroid hormone action. Demonstration of similar receptors in isolated nuclei of rat liver and cultured GH1 cells. | |
| Williams et al. | Platelet-derived growth factor binds specifically to receptors on vascular smooth muscle cells and the binding becomes nondissociable. | |
| FI67760C (fi) | Foerfarande foer bestaemning av koncentrationen av en fri ligand fraon en biologisk vaetska | |
| US4232001A (en) | Methods and materials for detection of estrophilin | |
| JPH09291042A (ja) | 医薬組成物 | |
| Sato et al. | Scurvy-prone animals, including man, monkey, and guinea pig, do not express the gene for gulonolactone oxidase | |
| JP2011148821A (ja) | 還元型コルチゾール接合体 | |
| JP2001517427A (ja) | 造血幹細胞を結合するための方法および組成物 | |
| JPH05255390A (ja) | オリゴペプチド接合体 | |
| EP0020090A1 (en) | Radioimmunoassay of migration inhibitory factor | |
| Liebert et al. | Identification by monoclonal antibodies of an antigen shed by human bladder cancer cells | |
| JPS6069556A (ja) | 新規なエストロゲンレセプタ−分析法 | |
| KR910008637B1 (ko) | 심근 미오신 중사슬에 대한 단일클론항체 | |
| JP2517561B2 (ja) | カテコ−ルエストロゲンのイムノアツセイキツド | |
| Puder et al. | Glutathione conjugates recognize the Rossmann fold of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase | |
| Fukumoto et al. | The site of IgG2a catabolism in the rat | |
| JPS59500832A (ja) | 競合的免疫螢光検定法及び試験セット | |
| Gordon et al. | Metabolism and binding of androgens by mouse mammary tumour cells in culture | |
| McArdle et al. | The effect of monoclonal antibodies to the human transferrin receptor on transferrin and iron uptake by rat and rabbit reticulocytes. | |
| GB2111201A (en) | Immunoassay of human luteinising hormone | |
| US5312900A (en) | 23K protein with binding specificity for queuine | |
| JPH0611507A (ja) | ヒトポドカリキシンの測定方法 | |
| JP2688759B2 (ja) | シュードウリジン誘導体 | |
| JPH01163664A (ja) | 悪性腫瘍及び／又はビールス性疾患の診断薬 | |
| JP2521496B2 (ja) | 抗ヒト癌モノクロ―ナル抗体 |