JPS6069556A - 新規なエストロゲンレセプタ−分析法 - Google Patents
新規なエストロゲンレセプタ−分析法Info
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
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- Biotechnology (AREA)
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- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
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- Oncology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は組織試料からの細胞核を、好ましくは核にまだ
付随していない少なくとも若干のニストロダン レセプ
ターを核に付随させた後に、分離シ、次いで核に付随し
ているニストロダン レセプターに結合した標識した抗
体の量を測定することにより組織試料中のニストロダン
レセプターの址を測定する方法およびキットに関する
。本発明は乳癌の患者にしばしば適当であるホルモン療
法を言む場合の適当な処置の決定に有用である。
付随していない少なくとも若干のニストロダン レセプ
ターを核に付随させた後に、分離シ、次いで核に付随し
ているニストロダン レセプターに結合した標識した抗
体の量を測定することにより組織試料中のニストロダン
レセプターの址を測定する方法およびキットに関する
。本発明は乳癌の患者にしばしば適当であるホルモン療
法を言む場合の適当な処置の決定に有用である。
手術後の化学療法は乳癌の治療方式で広〈実施されてい
る。1厘瘍が初期に検出された場合には、手術の範囲を
最小にでき、化学療法により癌細胞のそれ以上の生育お
よび拡大を多くの場合に止めることができる。医師の化
学療法剤の赳択はいくつかの因子Kilづいている。こ
のような因子o) 1つに、悪性細胞中のニストロダン
レセプター(K2R)のレベルがある。E2Rレベル
が高匹場合には、ホルモン療法が抗腫瘍剤として、また
は抗)庄瘍剤による処置の補助として使用できる。しか
しながら、E2Rレベルが低いと、ホルモン療法は効果
が無い。
る。1厘瘍が初期に検出された場合には、手術の範囲を
最小にでき、化学療法により癌細胞のそれ以上の生育お
よび拡大を多くの場合に止めることができる。医師の化
学療法剤の赳択はいくつかの因子Kilづいている。こ
のような因子o) 1つに、悪性細胞中のニストロダン
レセプター(K2R)のレベルがある。E2Rレベル
が高匹場合には、ホルモン療法が抗腫瘍剤として、また
は抗)庄瘍剤による処置の補助として使用できる。しか
しながら、E2Rレベルが低いと、ホルモン療法は効果
が無い。
ニストロダン レセプターは最近、腸および皮膚の発癌
性物質で同定された。これらはニストロダンについての
代表的対象組織ではないが、腫瘍生育におけるこのホル
モンの可能な役割は仮定できるものである。このような
場合に、腫瘍組織中のニストロダン レセプター レベ
ルの1liJ定は乳癌について良く研究されている状況
とほとんど同じように、術後療法の指針として価値があ
る。
性物質で同定された。これらはニストロダンについての
代表的対象組織ではないが、腫瘍生育におけるこのホル
モンの可能な役割は仮定できるものである。このような
場合に、腫瘍組織中のニストロダン レセプター レベ
ルの1liJ定は乳癌について良く研究されている状況
とほとんど同じように、術後療法の指針として価値があ
る。
医師がJili2Rレベルが低いという認識を持ている
場合には、患者は費用や、さらにM効な処置の開始の遅
れ、およびホルモン療法の副作用を回避できることにな
る。近年、有用なE2R分析法が開発され、広域の病院
訃よび医療センターで利用されている。これらの分析法
は複雑であって、時間がかかり、他方、比較的費用がか
かり、また時には悟頼できなり0さらにまた、これらの
分析法はサイトツル フラクション中のE2Rレベルを
測定スるだけであるので、ニストロダン レセプターの
さらに完全な測定にはこれらの測定値を核ニストロrン
レセプターの知誠でおぎなわなくてはならない。
場合には、患者は費用や、さらにM効な処置の開始の遅
れ、およびホルモン療法の副作用を回避できることにな
る。近年、有用なE2R分析法が開発され、広域の病院
訃よび医療センターで利用されている。これらの分析法
は複雑であって、時間がかかり、他方、比較的費用がか
かり、また時には悟頼できなり0さらにまた、これらの
分析法はサイトツル フラクション中のE2Rレベルを
測定スるだけであるので、ニストロダン レセプターの
さらに完全な測定にはこれらの測定値を核ニストロrン
レセプターの知誠でおぎなわなくてはならない。
ニストロダン レセプターはそれらのステロイド系ホル
モン特異結合活性を用いて研究され、同定された[:
Jenqen、 Hi、V、および、racobson
、 H,工、。
モン特異結合活性を用いて研究され、同定された[:
Jenqen、 Hi、V、および、racobson
、 H,工、。
のuecent prog、 norm、 nes、、
18 m 387〜414(1962年)および’l
”oft、 p、およびCorski、 J、のPro
c、 Natl、Acad、 soi、 U、S、A、
。
18 m 387〜414(1962年)および’l
”oft、 p、およびCorski、 J、のPro
c、 Natl、Acad、 soi、 U、S、A、
。
j5 、1574〜15’81(1966年)参照〕。
放射性物賀−標識したホルモン、たとえばエストラジオ
ールはこのレセプターの開度に特異性で機能的な同定を
可能にするが、その結合活性は成る柚の笑験条件(たと
えは、熱、洗剤等)Kよシ変り易い。さらvc、また、
多くの場合に、レセプターのステロイド結合性塩が内分
泌性のまたは薬理学的起源の非放射性物質−標識したホ
ルモンより占領されろ。この問題を解消するために、高
温な使用するか(Anaerson、 J、、 01a
rk、 、T、H,およびyeCk、 :rr、、 B
、J、 o)Biochem、 LH126、516〜
567(1972年)〕またはカオトロピック(cha
otropic )塩を使用して[: 5tca、 v
、、 pLica。
ールはこのレセプターの開度に特異性で機能的な同定を
可能にするが、その結合活性は成る柚の笑験条件(たと
えは、熱、洗剤等)Kよシ変り易い。さらvc、また、
多くの場合に、レセプターのステロイド結合性塩が内分
泌性のまたは薬理学的起源の非放射性物質−標識したホ
ルモンより占領されろ。この問題を解消するために、高
温な使用するか(Anaerson、 J、、 01a
rk、 、T、H,およびyeCk、 :rr、、 B
、J、 o)Biochem、 LH126、516〜
567(1972年)〕またはカオトロピック(cha
otropic )塩を使用して[: 5tca、 v
、、 pLica。
0、A、、 Mo1inari、 A、M、 、 Bu
onaguro、 F、M、およびBresaiani
、 F、のB10cllθm1θtry # 19 #
83〜88(1980年ン〕、レセプター結合した内
分泌性ホルモンを放射性物質−標識したホルモンと交換
させる多くの分析法が開発された。近年、ニストロダン
レセプターに対するモノクロナール抗体が利用できる
ようになった( )+40ncharmont。
onaguro、 F、M、およびBresaiani
、 F、のB10cllθm1θtry # 19 #
83〜88(1980年ン〕、レセプター結合した内
分泌性ホルモンを放射性物質−標識したホルモンと交換
させる多くの分析法が開発された。近年、ニストロダン
レセプターに対するモノクロナール抗体が利用できる
ようになった( )+40ncharmont。
B、、 Su、 J、L、およびParlikh、工、
のBl ochemistry。
のBl ochemistry。
21.6916〜6921 (1982年)〕。それら
のレセプターとの相互反応はエストラジオール結合部位
の占領に関係がない。また、米国特許第4232001
号およびPro、c、Nat、 Acad、 Sci。
のレセプターとの相互反応はエストラジオール結合部位
の占領に関係がない。また、米国特許第4232001
号およびPro、c、Nat、 Acad、 Sci。
U、S、A、、 77 、5115〜5119(198
0年)を参照できる。
0年)を参照できる。
さらにまた、本発明の方法はまたその他の従来技術の方
法に比較して、さらに敏感であって、筐たさらvc、精
確である。これは本発明の分析方法が低温で動作し、カ
オトロピック塩の使用を必要としないとともに、細胞核
内のE2Rレベルの測定手段を提供するからである。
法に比較して、さらに敏感であって、筐たさらvc、精
確である。これは本発明の分析方法が低温で動作し、カ
オトロピック塩の使用を必要としないとともに、細胞核
内のE2Rレベルの測定手段を提供するからである。
本発明はエストロデン対象組織の細胞核フラクションの
ニストロダン レセプターの測定力Hヲ提供する。たと
えば、すでに癌であることが診断され、手術によシ切除
された乳房から採取した腫瘍組織の1部分を適当な水性
緩衝液中に均一に分散させる。
ニストロダン レセプターの測定力Hヲ提供する。たと
えば、すでに癌であることが診断され、手術によシ切除
された乳房から採取した腫瘍組織の1部分を適当な水性
緩衝液中に均一に分散させる。
この均質懸濁液を遠心分離して、液相と固体ペレットと
に分離する。ペレットを洗浄し、細胞核を当技術で既知
の方法により単離する。緩衝剤溶液中の、ニストロダン
特異性モノクロナール抗体で標識した、単#4にシた核
をインキュベートして、核および標識した抗体と結合し
ているニストロダン レセフ0ターの複合体を形成する
。崩:濁液を次いで遠心分離して、固体ペレットと液体
上澄液とを生成する。ペレットを緩衝液で洗浄し、標識
した物質の量を標準試wLにより分析し、その存在量を
当技術で良く知られている方法に上り測定する。
に分離する。ペレットを洗浄し、細胞核を当技術で既知
の方法により単離する。緩衝剤溶液中の、ニストロダン
特異性モノクロナール抗体で標識した、単#4にシた核
をインキュベートして、核および標識した抗体と結合し
ているニストロダン レセフ0ターの複合体を形成する
。崩:濁液を次いで遠心分離して、固体ペレットと液体
上澄液とを生成する。ペレットを緩衝液で洗浄し、標識
した物質の量を標準試wLにより分析し、その存在量を
当技術で良く知られている方法に上り測定する。
本発明はまた、インビトロ移転後の核に付随しているニ
ストロダン レセプター分子の測定に有用である。たと
えば、腫瘍乳房組織を適当な水性緩衝剤中に均一に分散
させ、10−7〜1o−9モルのエストラジオールとと
もにインキュベートする。
ストロダン レセプター分子の測定に有用である。たと
えば、腫瘍乳房組織を適当な水性緩衝剤中に均一に分散
させ、10−7〜1o−9モルのエストラジオールとと
もにインキュベートする。
ニストロダン レセグターーエストラジオール複合体を
次いで当技術で既知の条件を使用して核に移動させる。
次いで当技術で既知の条件を使用して核に移動させる。
核を単離し、標識したエストロゲンレセプター特異性抗
体とともにインキュベートする。この懸濁液を遠心分離
により、中でもエストラジオールおよび標識した抗体と
複合化した全レセプターを含有する固形ペレットを分離
する。
体とともにインキュベートする。この懸濁液を遠心分離
により、中でもエストラジオールおよび標識した抗体と
複合化した全レセプターを含有する固形ペレットを分離
する。
]IC2Rはこのペレット中の標識した抗体の量を測定
することにより直接に決定できる。
することにより直接に決定できる。
木兄uAはまた組織試料の]1C2R言有址測定用の置
き換えタイプの標識した抗体を使用する放射免疫検定法
(RIAJまたはその他の検定法を提供1−る。
き換えタイプの標識した抗体を使用する放射免疫検定法
(RIAJまたはその他の検定法を提供1−る。
高い特別の]12B包有社を有する核を、tことえはエ
ストラジオールで処置した雌牛の子宮から、’、t:a
mする。インビトロ移転を使用して、核のxznfW量
を増加できる。尚レベルのB2Rを含有する核はまた、
ヒトの乳癌セルライン、たとえばMOF −7からエス
トラジオールによる処理および適当な時間での眉1j胞
の採取による標準組織培養技法を使用して、得ることも
できる。
ストラジオールで処置した雌牛の子宮から、’、t:a
mする。インビトロ移転を使用して、核のxznfW量
を増加できる。尚レベルのB2Rを含有する核はまた、
ヒトの乳癌セルライン、たとえばMOF −7からエス
トラジオールによる処理および適当な時間での眉1j胞
の採取による標準組織培養技法を使用して、得ることも
できる。
標識したニストロダン特異性モノクロナール抗体をE2
R廿有核と、既知量の可溶性ニストロrンレセゾターの
可溶性製剤(これはいずれがの哺乳′#J物ニストロr
ン対象組織から製造されたサイトツル フラクションか
ら、並びにヒトの乳癌セルラインから得ることができ、
当技術で良く知られているとおりに、放射性物質−標識
したエストラジオールを使用して定量できる)の連続稀
釈の存在下にインキュベートすることに上り、標準曲線
が作成できる。
R廿有核と、既知量の可溶性ニストロrンレセゾターの
可溶性製剤(これはいずれがの哺乳′#J物ニストロr
ン対象組織から製造されたサイトツル フラクションか
ら、並びにヒトの乳癌セルラインから得ることができ、
当技術で良く知られているとおりに、放射性物質−標識
したエストラジオールを使用して定量できる)の連続稀
釈の存在下にインキュベートすることに上り、標準曲線
が作成できる。
この検に法は標準曲線の作成に使用したものと同献のE
2R含有核、適当な既知量の対象組織の可溶化試料およ
び標準曲線の作成に使用したものと同数の標識したニス
トロダン特異性モノクロナール抗体をインキュベートす
ることにより実施する。
2R含有核、適当な既知量の対象組織の可溶化試料およ
び標準曲線の作成に使用したものと同数の標識したニス
トロダン特異性モノクロナール抗体をインキュベートす
ることにより実施する。
抗体は核E2Rとおよび可溶化組織のlIC2Rと競合
的に結合し、それぞれ不溶性複合体および可溶性複合体
を形成する。混合物を適当なインキュベーション時間の
後に、遠心分離して、不溶性複合体をペレットにする。
的に結合し、それぞれ不溶性複合体および可溶性複合体
を形成する。混合物を適当なインキュベーション時間の
後に、遠心分離して、不溶性複合体をペレットにする。
このペレットの放射能な測足し、標準曲線と比較して、
対象組織のに2R含有址な決定する。
対象組織のに2R含有址な決定する。
例1
抗体標本
A)ニストロダン レセプターの精製
子牛子宮からのエストラジオール レセプター複合体を
次の方法に従い精製する。畜殺場で!!!I物から子宮
を切除し、結合組織および卵巣を迅速に除去し、輸送用
にドライアイスに詰め、処理に使用するまで一120℃
で貯蔵する。1肢に、約5QOgの組織を処理する。子
宮を解凍し、市販肉粉砕+1kに通して粉砕し、釉々の
爆発力のポリトロy (I’o’1ytron )ホモ
ジナイず−で、0〜4°Cにおいて完全組織の断片がも
はや見られなくなるまで緩衝液A (EDTA 2mM
およびDTTimMを官有するトリス−H(J 20
mM、 pH7,4) 2.5容量と均質化する。この
均質生成物を次いで150.000Iで1時間遠心分離
し、上澄液(サイトツル)を採取する。アがロースに共
有的に結合したヘパリン〔ヘパリン−セファロース;公
開されている方法により製造; Mo1inarijA
、M、等のPr0C,Natl。
次の方法に従い精製する。畜殺場で!!!I物から子宮
を切除し、結合組織および卵巣を迅速に除去し、輸送用
にドライアイスに詰め、処理に使用するまで一120℃
で貯蔵する。1肢に、約5QOgの組織を処理する。子
宮を解凍し、市販肉粉砕+1kに通して粉砕し、釉々の
爆発力のポリトロy (I’o’1ytron )ホモ
ジナイず−で、0〜4°Cにおいて完全組織の断片がも
はや見られなくなるまで緩衝液A (EDTA 2mM
およびDTTimMを官有するトリス−H(J 20
mM、 pH7,4) 2.5容量と均質化する。この
均質生成物を次いで150.000Iで1時間遠心分離
し、上澄液(サイトツル)を採取する。アがロースに共
有的に結合したヘパリン〔ヘパリン−セファロース;公
開されている方法により製造; Mo1inarijA
、M、等のPr0C,Natl。
Aead、sci、 USA、 74 、4886〜4
89゜(1977年)8照〕を緩衝液B (MgCf2
41nMおよびDTTlmMを官有するトリス−HCJ
2 Q mu。
89゜(1977年)8照〕を緩衝液B (MgCf2
41nMおよびDTTlmMを官有するトリス−HCJ
2 Q mu。
…7.4 ) 中−r”l 化する。ヘパリン−セファ
ロース(1’20Jl水血敞)を上記サイトツルと4°
Cで連続振盪しながら2時間、パッチ式でインキュベ−
1・する。この樹脂を次いでブックナーロト上に採取し
、緩衝液B約21!で洗浄し、広口カラム(直径約5c
m、)に詰め、次いで洗浄液中の280nmにおける光
学濃度が0.005に減じられるまで、同一緩衝ン良で
洗浄する。エスト2ジオールレセフ0ターをヘパリン4
〜/−言M緩衝液Bで溶出する。エストラジオール結合
活性のピークを採取し、100 mMKC4K L、次
いで緩衝液A十〇、IMKCJ中で平衡化したエストラ
ジオール−セファロースの6−カラムに、約10〜2o
−7時の流速で適用する。エストラジオール−セファロ
ースはジアミノジゾロビルアミン(DADPA )をシ
アノブy 7” oミド活性化したセファロース4BC
fKカツプリングすることにより製造する〔公開方法に
ょるH s’ica、 y、等のJ、 Biol、 O
hem、、 243 。
ロース(1’20Jl水血敞)を上記サイトツルと4°
Cで連続振盪しながら2時間、パッチ式でインキュベ−
1・する。この樹脂を次いでブックナーロト上に採取し
、緩衝液B約21!で洗浄し、広口カラム(直径約5c
m、)に詰め、次いで洗浄液中の280nmにおける光
学濃度が0.005に減じられるまで、同一緩衝ン良で
洗浄する。エスト2ジオールレセフ0ターをヘパリン4
〜/−言M緩衝液Bで溶出する。エストラジオール結合
活性のピークを採取し、100 mMKC4K L、次
いで緩衝液A十〇、IMKCJ中で平衡化したエストラ
ジオール−セファロースの6−カラムに、約10〜2o
−7時の流速で適用する。エストラジオール−セファロ
ースはジアミノジゾロビルアミン(DADPA )をシ
アノブy 7” oミド活性化したセファロース4BC
fKカツプリングすることにより製造する〔公開方法に
ょるH s’ica、 y、等のJ、 Biol、 O
hem、、 243 。
6546〜6558(1973年)〕。〕セファロース
ーDADFを次いで17β−エストラジオール17−ヘ
ミサクシネートとカル4ぐジイミVの存在でカップリン
グする。レセプターが負性されてbるエストラジオール
−セファロース カラム(樹脂約2−を含有する)を緩
衝液Al00m1!、緩衝液A+2MHCf、次いで再
び緩衝液A30−で注意して洗浄する。この洗浄サイク
ルを2回、繰返す。レセプターの溶出は9.5 M N
a5ON 。
ーDADFを次いで17β−エストラジオール17−ヘ
ミサクシネートとカル4ぐジイミVの存在でカップリン
グする。レセプターが負性されてbるエストラジオール
−セファロース カラム(樹脂約2−を含有する)を緩
衝液Al00m1!、緩衝液A+2MHCf、次いで再
び緩衝液A30−で注意して洗浄する。この洗浄サイク
ルを2回、繰返す。レセプターの溶出は9.5 M N
a5ON 。
5 X 10−’ M (6,7’H) 17β−エス
トラジオールおよび10チゾメテルホルムアミ1を含イ
1する緩衝液A5−を使用して行なう。巨大分子結合エ
ストラジオールのピークを採取し、緩衝液Aid対して
透析し、次いで濃縮する。ポリアクリルアミド デル電
気泳動により試験して、約り0%純度をイ1するレセフ
0ター160μgがイ+られる。
トラジオールおよび10チゾメテルホルムアミ1を含イ
1する緩衝液A5−を使用して行なう。巨大分子結合エ
ストラジオールのピークを採取し、緩衝液Aid対して
透析し、次いで濃縮する。ポリアクリルアミド デル電
気泳動により試験して、約り0%純度をイ1するレセフ
0ター160μgがイ+られる。
B)抗体の調製
6匹g) Eal b/c −qウス(6週間令)[、
等量のフロイントの兄全アジュバントで乳化〔7た’4
1u ’Jlレセプター10μgを皮下注射する。2週
間後の間隔で、さらに1ケ月後の間隔で、等量の不完全
フロインドアジュバントを注射する。最後の注射をした
ffl+4)1[J日日に、各マウスにエストロケゞン
レセフ”ターの注射を尾から毎日6日間、静脈投与−4
−ろ。4日日に、1匹のマウスを犠牲に17、その肺臓
を無菌条件下に切除する。20デージの針を5〜6回通
すことにより、5m1H:assメジウム中の細胞懸濁
液を作る。赤血球をQ、Q 1M KHOO。
等量のフロイントの兄全アジュバントで乳化〔7た’4
1u ’Jlレセプター10μgを皮下注射する。2週
間後の間隔で、さらに1ケ月後の間隔で、等量の不完全
フロインドアジュバントを注射する。最後の注射をした
ffl+4)1[J日日に、各マウスにエストロケゞン
レセフ”ターの注射を尾から毎日6日間、静脈投与−4
−ろ。4日日に、1匹のマウスを犠牲に17、その肺臓
を無菌条件下に切除する。20デージの針を5〜6回通
すことにより、5m1H:assメジウム中の細胞懸濁
液を作る。赤血球をQ、Q 1M KHOO。
言Mする0、15 M IIIH4CJ、(pH7,2
) ’)容量により室温で5分間で分離する。
) ’)容量により室温で5分間で分離する。
肺臓細胞(約108)を5 X 107悪性細胞sp2
/υ/Ag14と混合し、1900rpmT5分間遠心
分離する。細胞を50%ポリエチレングリコール(PI
!i0−1000 ) 中VC再懸f’lJ(、、血清
ヲ含有しなめダルベツコ(1)ulbθcco )のM
EMメジウムにより、67℃で8分1fjj ノ1fj
J K 、PEO(1)ノー終5%濃度に稀釈する。細
胞を再贋、遠心分離し、DMEM +20 % 姐娠雌
牛血清(FC!S )中に2.5 X 10’細胞/−
の最終濃度で再懸濁する。細胞を96凹t’Aを有する
微滴定器の250個の四部中九分配する。翌日に、メジ
ウムをハイゾリド選択用のメジウムを含有するヒボキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン(HAT )に変え
る。細胞にHATメジウムを10日間、−日おきに与え
る。メジウムを次イテDMEM +2 Q%lII′c
8ニ変、+6;180イ固の凹部がバイブリドを注1す
ることが判った。さらに2日後に、各四部からのメジウ
ムをエストロデンレセプターに対する抗体について分析
する。抗体の存在は、ヘパリンを予め塗布した96凹部
を有するプレート上に固定した精製ニストロダン レセ
プターと四部上度数とをインキュベートすることにより
検定する。四部の洗浄後に、レセゾター−ヘパリン複合
体に結合した抗体の存在を酵素−標識した山羊xg、a
の製造業者(BθthesdaResearch La
boratoriθS)により提供された指示に従い、
β−がラクトシダーゼに結合した山羊抗マウスエgGと
の反応により検出する。これらの凹部でエストロゲン
レセプターと反応する抗体の存在をまた、ショ糖勾配検
定により確認する。
/υ/Ag14と混合し、1900rpmT5分間遠心
分離する。細胞を50%ポリエチレングリコール(PI
!i0−1000 ) 中VC再懸f’lJ(、、血清
ヲ含有しなめダルベツコ(1)ulbθcco )のM
EMメジウムにより、67℃で8分1fjj ノ1fj
J K 、PEO(1)ノー終5%濃度に稀釈する。細
胞を再贋、遠心分離し、DMEM +20 % 姐娠雌
牛血清(FC!S )中に2.5 X 10’細胞/−
の最終濃度で再懸濁する。細胞を96凹t’Aを有する
微滴定器の250個の四部中九分配する。翌日に、メジ
ウムをハイゾリド選択用のメジウムを含有するヒボキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン(HAT )に変え
る。細胞にHATメジウムを10日間、−日おきに与え
る。メジウムを次イテDMEM +2 Q%lII′c
8ニ変、+6;180イ固の凹部がバイブリドを注1す
ることが判った。さらに2日後に、各四部からのメジウ
ムをエストロデンレセプターに対する抗体について分析
する。抗体の存在は、ヘパリンを予め塗布した96凹部
を有するプレート上に固定した精製ニストロダン レセ
プターと四部上度数とをインキュベートすることにより
検定する。四部の洗浄後に、レセゾター−ヘパリン複合
体に結合した抗体の存在を酵素−標識した山羊xg、a
の製造業者(BθthesdaResearch La
boratoriθS)により提供された指示に従い、
β−がラクトシダーゼに結合した山羊抗マウスエgGと
の反応により検出する。これらの凹部でエストロゲン
レセプターと反応する抗体の存在をまた、ショ糖勾配検
定により確認する。
陽性の四部のかなシからの細胞を軟質寒天でクローン化
する。目に見えるクローンを採取し、96個の凹部を4
fするプレートに移す。これらのクローンの上澄液を[
125工〕−エストラジオール標識したサイトンル系レ
セプターを使用する二車抗体免疫沈殿検定法で区別する
。陽性のクローンの細胞をグリスタン(3,6,10,
14−テトラメチルペンタデカン)でプライムしたBa
1b/cマウス(107細胞/マウスンに腹腔内注射す
る。
する。目に見えるクローンを採取し、96個の凹部を4
fするプレートに移す。これらのクローンの上澄液を[
125工〕−エストラジオール標識したサイトンル系レ
セプターを使用する二車抗体免疫沈殿検定法で区別する
。陽性のクローンの細胞をグリスタン(3,6,10,
14−テトラメチルペンタデカン)でプライムしたBa
1b/cマウス(107細胞/マウスンに腹腔内注射す
る。
7〜10日後に、マウスを犠牲にし、腹水を腹腔側から
採取する。抗体は硫酸アンモニウム沈殿およヒLIKA
Eセルロース クロマトグラフィにより精製jる。
採取する。抗体は硫酸アンモニウム沈殿およヒLIKA
Eセルロース クロマトグラフィにより精製jる。
血清を含有しないメジウム中での別の方法では、少量、
の高純度抗体の製造が可能である。これは融合用に使用
する親の悪性セルラインsp 210/Ag −14が
免疫グロブリンを合成しなしことから可能[なろ[Sh
uiman等のNature 、 276 、269〜
270、(1978年)参照〕。ハイプリドーマ細胞は
初期に、0.5〜I X 106細胞/−の濃度まで2
0%FO8を含有するDMEM中で生育させ、次いで血
清を含有しないメジウムに移す。16〜18時間後に、
メジウムを採取し、プロティンA−セファロース カラ
ムでクロマトグラフィ処理する。PBSで十分に洗浄し
た後に、吸着している免疫グロブリンを0.I N酢酸
で浴出し、トリスですぐに中和する。このような方法で
生成された抗体の純度は98%より大であるが、生成さ
れた抗体の肚は腹水で生成された量より少ない。
の高純度抗体の製造が可能である。これは融合用に使用
する親の悪性セルラインsp 210/Ag −14が
免疫グロブリンを合成しなしことから可能[なろ[Sh
uiman等のNature 、 276 、269〜
270、(1978年)参照〕。ハイプリドーマ細胞は
初期に、0.5〜I X 106細胞/−の濃度まで2
0%FO8を含有するDMEM中で生育させ、次いで血
清を含有しないメジウムに移す。16〜18時間後に、
メジウムを採取し、プロティンA−セファロース カラ
ムでクロマトグラフィ処理する。PBSで十分に洗浄し
た後に、吸着している免疫グロブリンを0.I N酢酸
で浴出し、トリスですぐに中和する。このような方法で
生成された抗体の純度は98%より大であるが、生成さ
れた抗体の肚は腹水で生成された量より少ない。
これらの生成物を5DS−PACE上で分析すると、工
gGの存在および工gMの不存在を示す。1匹のマウス
から得られる精製工gGの址は1.5i+y〜20■で
変わる。
gGの存在および工gMの不存在を示す。1匹のマウス
から得られる精製工gGの址は1.5i+y〜20■で
変わる。
2
抗体の放射性ヨーV化
一定適献の精製したモノクロナール抗体をラクトパーオ
キシダーゼ法[Marchalonis、 JJ、+
17)f31ochein、 J、 1 1 3 m
2 9 9 〜6 0 5 (1969年〕〕により放
射性物質で標識する。抗体50pg。
キシダーゼ法[Marchalonis、 JJ、+
17)f31ochein、 J、 1 1 3 m
2 9 9 〜6 0 5 (1969年〕〕により放
射性物質で標識する。抗体50pg。
N、[125工] 2mcz、ラクトパー:#*ジター
(!’50μg オ! ヒ0.3 M 酢酸ナトリウム
中のO,[102%H2O2(tl 5.6 )を宮肩
する反応混合物(総容積150μl)を作る。反応は過
酸化氷菓のvJ≦加により開始され、室温で2分後にチ
ラミン塩酸塩(2rng/m7り 100 plを加え
、1分VvcNa工(2■/ mq ) 100μlを
加えて止める。放射性物質−標識した抗体を、仔牛血清
アルゾミン(4*/ml)をfMする5 9 mhIリ
ン酸塩緩Vj W (pH7,5)で平衡化したセファ
デックスG−100力2ム(10y)で精製し、空容鼠
(Void volume )の留分を集め7)。放射
性物質−標識した抗体の比活性は10〜50μC1/u
gの範囲である。同様に、フレイドで標識できる。(”
5S )メチオニンにより標識した抗体の生成も可能で
ある。この目的には、ハイプリドーマ細胞を細胞培養メ
ジウム1tnl。
(!’50μg オ! ヒ0.3 M 酢酸ナトリウム
中のO,[102%H2O2(tl 5.6 )を宮肩
する反応混合物(総容積150μl)を作る。反応は過
酸化氷菓のvJ≦加により開始され、室温で2分後にチ
ラミン塩酸塩(2rng/m7り 100 plを加え
、1分VvcNa工(2■/ mq ) 100μlを
加えて止める。放射性物質−標識した抗体を、仔牛血清
アルゾミン(4*/ml)をfMする5 9 mhIリ
ン酸塩緩Vj W (pH7,5)で平衡化したセファ
デックスG−100力2ム(10y)で精製し、空容鼠
(Void volume )の留分を集め7)。放射
性物質−標識した抗体の比活性は10〜50μC1/u
gの範囲である。同様に、フレイドで標識できる。(”
5S )メチオニンにより標識した抗体の生成も可能で
ある。この目的には、ハイプリドーマ細胞を細胞培養メ
ジウム1tnl。
当り、(35s )メチオニン(600〜1400a1
/モリモル)50μ(Jを官有するメチオニンを含まな
いメジウム中に再懸濁する。[35s)−標識した抗1
本はプロティンA−セファロース カラムで前記のとお
りに精製する。
/モリモル)50μ(Jを官有するメチオニンを含まな
いメジウム中に再懸濁する。[35s)−標識した抗1
本はプロティンA−セファロース カラムで前記のとお
りに精製する。
列3
非アイソトープ系標識を有する抗体の調製放射性物質標
識の代りに、抗体はまた、酵素、フルオロホーレまたは
クロモホーレ(発色団)VC。
識の代りに、抗体はまた、酵素、フルオロホーレまたは
クロモホーレ(発色団)VC。
より、標識化用の既知の技法により標識付けすることも
できる。酵素に対する生物学的基質の結合ノPi fi
、タトえばSteinberger、 L、A、の工m
munocytochemistry 、 Prent
ice Hall、 NθWYork (1974年)
に記載されている。
できる。酵素に対する生物学的基質の結合ノPi fi
、タトえばSteinberger、 L、A、の工m
munocytochemistry 、 Prent
ice Hall、 NθWYork (1974年)
に記載されている。
:4HW ry−)1−− パー**シaゝ−ゼ5+n
gを0.3MNaHCO2(pH8−1’) 1−Ir
、/g解し、無水メタ/−ル中のフルオロジニトロベン
ゼンの1%iio、irMを加える。室温で1時間イン
キュベートした後に、水中のQ 、5 M NaIO4
1−Ornl! ヲ)Ju fc−1m 合物全室温で
60分子MJ攪拌する。エチレングリコール(1,0−
;蒸留水中0.15 ’M ) ヲ)tllL、室温7
1時間攪拌した後に、溶液を4℃で10 mM Na2
003(pH9,5)に対して透析する。透析した溶液
に、抗体5■を加え、混合物を室温でさらに攪拌し、次
いでNaBH45mgを加える。混合物を4°で一夜に
わたり放置する。反応混合物を法論で透析し、セファデ
ックスC!−100カラムに通してクロマトグラフィ処
理する。酵素−抗体複合体を含有する留分を集める〔こ
の方法のさらに詳#Iな説明はNakanejP、に、
等によりJ、Hletochem、 0ytochθm
、。
gを0.3MNaHCO2(pH8−1’) 1−Ir
、/g解し、無水メタ/−ル中のフルオロジニトロベン
ゼンの1%iio、irMを加える。室温で1時間イン
キュベートした後に、水中のQ 、5 M NaIO4
1−Ornl! ヲ)Ju fc−1m 合物全室温で
60分子MJ攪拌する。エチレングリコール(1,0−
;蒸留水中0.15 ’M ) ヲ)tllL、室温7
1時間攪拌した後に、溶液を4℃で10 mM Na2
003(pH9,5)に対して透析する。透析した溶液
に、抗体5■を加え、混合物を室温でさらに攪拌し、次
いでNaBH45mgを加える。混合物を4°で一夜に
わたり放置する。反応混合物を法論で透析し、セファデ
ックスC!−100カラムに通してクロマトグラフィ処
理する。酵素−抗体複合体を含有する留分を集める〔こ
の方法のさらに詳#Iな説明はNakanejP、に、
等によりJ、Hletochem、 0ytochθm
、。
22.1084〜1091(1974年)に示されてい
る〕。種々のその他の酵素を抗体に、当技術で既知の方
法により結合させることができる。
る〕。種々のその他の酵素を抗体に、当技術で既知の方
法により結合させることができる。
B)発螢光団接合抗体の製造
0、’i M NaHCO2(pl(8−1) 2−に
溶解した精製モノクロナール抗体(5η)をジメチルス
ルホキシド(Irny/mg)中のテキザスレツPの溶
液15μでと暗所で4°にお因て一夜の間、混合する。
溶解した精製モノクロナール抗体(5η)をジメチルス
ルホキシド(Irny/mg)中のテキザスレツPの溶
液15μでと暗所で4°にお因て一夜の間、混合する。
この赤色浴液を次いで20cIJL×1crrLセフア
デツクスG−25カラムに通してクロマトグラフィ処理
し、空容積のピ′−りを集め、生化学分析に使用する。
デツクスG−25カラムに通してクロマトグラフィ処理
し、空容積のピ′−りを集め、生化学分析に使用する。
種々のその他の発螢光団または発色団を抗体に、当技術
で既知の方法により結合させることができる( Wan
g、 K1等のMethoa ln Fin27m01
0g7.85EL514(1982年)参照〕。
で既知の方法により結合させることができる( Wan
g、 K1等のMethoa ln Fin27m01
0g7.85EL514(1982年)参照〕。
v/u 4
細胞核の未知試料中のE2R含有量の検定哺乳動物の組
織の移植片の重置なはかり(たとえは500η)、次い
でポリトン ホモジナイず−で水冷TED8緩衝液(E
DTA i mM 、ジテオスレイトールi mMおよ
び10饅(重bi−/谷蓋)ショMu 金含有’1−6
トリ/’ −HCI (pl47.4 ) 20 m
M )中に均質に分散させる。均質生成物をナイロンメ
ツシュ(200μm ) vc通して濾過し、800
xgで20分間遠心分離する。この核ペレットを同一緩
衝液で2回洗浄し、次いでTJIGDS緩衝液に0.2
〜[1,5mg DNA/ m Ic再ra濁する。
織の移植片の重置なはかり(たとえは500η)、次い
でポリトン ホモジナイず−で水冷TED8緩衝液(E
DTA i mM 、ジテオスレイトールi mMおよ
び10饅(重bi−/谷蓋)ショMu 金含有’1−6
トリ/’ −HCI (pl47.4 ) 20 m
M )中に均質に分散させる。均質生成物をナイロンメ
ツシュ(200μm ) vc通して濾過し、800
xgで20分間遠心分離する。この核ペレットを同一緩
衝液で2回洗浄し、次いでTJIGDS緩衝液に0.2
〜[1,5mg DNA/ m Ic再ra濁する。
100μl各定敢の核懸濁液を放射性ヨウ素化抗体の適
度の稀釈i(20■/1検定)と、標識していない抗体
(同一クローンからの)5μg/l検定の存在または不
存在下に、最終容積200p/で、6時間、二重反復イ
ンキュベートする。抗体(標識したもの並びに標識して
しないものの両方)を仔牛r−プロゾリン19/−含有
TEDS緩衝液で稀釈する。インキュベーションの終了
時ニ、仔牛血清アルブミン1■/−を含有する水冷T
BDS緩!Mj液4−を各音に加え、次いでaooxg
で20分間遠心分離する。この核ペレットを前記緩衝液
で1回洗浄し、ガンマカウンターで放射能を測定する。
度の稀釈i(20■/1検定)と、標識していない抗体
(同一クローンからの)5μg/l検定の存在または不
存在下に、最終容積200p/で、6時間、二重反復イ
ンキュベートする。抗体(標識したもの並びに標識して
しないものの両方)を仔牛r−プロゾリン19/−含有
TEDS緩衝液で稀釈する。インキュベーションの終了
時ニ、仔牛血清アルブミン1■/−を含有する水冷T
BDS緩!Mj液4−を各音に加え、次いでaooxg
で20分間遠心分離する。この核ペレットを前記緩衝液
で1回洗浄し、ガンマカウンターで放射能を測定する。
既知量のエストロゲン レセプター(5〜1o。
fmoJ )を言Mする核の安定化した試料を使用踵標
準曲線を同一条件で同時に作成する。未知の試料中に存
在するニストロダン レセプターノ量ハ油j(hdhJ
dAf−4)参jrJJlイJ+「1c=r、・、・4
1゛−?tMHH’J重1+++−,,−−−科中に存
在するエストロゲン レセプターのこのittす定値は
DNA宮有駄について標準化せねばならない。試料のD
NA含有量は、0.5M過ジクロル酸中核懸濁液の10
0μl定川、(最終容積500 pl )を70℃で1
5分間、予備インキュベートし、次いでジフェニルアミ
ン試桑(ジフェニルアミン1.5g、H2SO41,5
d、酢酸100 pi オヨU 1.6饅アセトアルデ
ヒl’0.5m)1mを加え、次いで30°Cで18時
間インキュベートすることに上り1)l!I定する〔詳
aはBurton、 K、のBj−ochem、 J、
62 。
準曲線を同一条件で同時に作成する。未知の試料中に存
在するニストロダン レセプターノ量ハ油j(hdhJ
dAf−4)参jrJJlイJ+「1c=r、・、・4
1゛−?tMHH’J重1+++−,,−−−科中に存
在するエストロゲン レセプターのこのittす定値は
DNA宮有駄について標準化せねばならない。試料のD
NA含有量は、0.5M過ジクロル酸中核懸濁液の10
0μl定川、(最終容積500 pl )を70℃で1
5分間、予備インキュベートし、次いでジフェニルアミ
ン試桑(ジフェニルアミン1.5g、H2SO41,5
d、酢酸100 pi オヨU 1.6饅アセトアルデ
ヒl’0.5m)1mを加え、次いで30°Cで18時
間インキュベートすることに上り1)l!I定する〔詳
aはBurton、 K、のBj−ochem、 J、
62 。
615〜323(1956年〕を参照できる〕。
試料の600nI]1VcおけるブC学濃度を次いで既
知の1)NA言M址の試料により得られた標準曲線と比
較する。
知の1)NA言M址の試料により得られた標準曲線と比
較する。
例5
卵果摘出したラットに17β−エストラジオールの投与
[1(たとえば1U〜50 pg/体重ky )を?J
i4t −1’−ム − ’ll’t!出1落1ff
11山’l+b+ fx ’l:m ル1: lz
l エ・ei −切除し、型針をはかり、フェニルメチ
ルスルホニルフルオライドo、i mMを含有するTE
DEI緩衝液10容量中に均質に分散する。この均質生
成物をナイロンメツシュ(200μm)[通して濾過し
、800xgで20分間遠心分離し、ペレットを同一緩
衝液で2回、洗浄する。ペレットを均質化に使用した緩
衝液2rnl中に再懸濁し、次いで2.1Mショ糖ゴ有
TED緩衝液2m−クッション上に層形成し、動揺パケ
ットローターにおいて45000×gで60分1i4j
遠心分離する。ペレットを1回、洗浄し、TEDEI緩
衝液2rnIに再懸濁する。このような生成試料の各固
定量中に存在するエストロゲンレセプターの址は次のと
おりにして測定する。各100 pi定鍛を0.5 M
Na5ON 言@ TEDS緩衝液中の17β−〔3
H〕工ストラジオール15111Mと、500倍過來1
1量の標識していないホルモンの存在または不存在下に
、600μEの最終容量でインキュベー)fる。4°C
で15〜18時間インキュベートした後に、水冷木炭)
酢濁液(1%木炭、0,1チデキストロンT−70およ
び0.1%ゼラチンのTEDS緩衝液緩衝液中懸濁液管
に加え、さらに15分後に、50.OOOrll)mT
30分間遠心分離することにより、結合したエストラジ
オールを分離する。上澄液の各0.5一定駈中に存在す
る放射iヒを測定し、試料と放射能を有するホルモンと
の結合活性から過剰の標識していないホルモンを含有す
る試料の結合活性を引き算することにより、特異的結合
活性を計算する。存在するエストロゲンレセプターのモ
ル址は放射性物質−標識したエストラジオールの比活性
から計n−′4−る。
[1(たとえば1U〜50 pg/体重ky )を?J
i4t −1’−ム − ’ll’t!出1落1ff
11山’l+b+ fx ’l:m ル1: lz
l エ・ei −切除し、型針をはかり、フェニルメチ
ルスルホニルフルオライドo、i mMを含有するTE
DEI緩衝液10容量中に均質に分散する。この均質生
成物をナイロンメツシュ(200μm)[通して濾過し
、800xgで20分間遠心分離し、ペレットを同一緩
衝液で2回、洗浄する。ペレットを均質化に使用した緩
衝液2rnl中に再懸濁し、次いで2.1Mショ糖ゴ有
TED緩衝液2m−クッション上に層形成し、動揺パケ
ットローターにおいて45000×gで60分1i4j
遠心分離する。ペレットを1回、洗浄し、TEDEI緩
衝液2rnIに再懸濁する。このような生成試料の各固
定量中に存在するエストロゲンレセプターの址は次のと
おりにして測定する。各100 pi定鍛を0.5 M
Na5ON 言@ TEDS緩衝液中の17β−〔3
H〕工ストラジオール15111Mと、500倍過來1
1量の標識していないホルモンの存在または不存在下に
、600μEの最終容量でインキュベー)fる。4°C
で15〜18時間インキュベートした後に、水冷木炭)
酢濁液(1%木炭、0,1チデキストロンT−70およ
び0.1%ゼラチンのTEDS緩衝液緩衝液中懸濁液管
に加え、さらに15分後に、50.OOOrll)mT
30分間遠心分離することにより、結合したエストラジ
オールを分離する。上澄液の各0.5一定駈中に存在す
る放射iヒを測定し、試料と放射能を有するホルモンと
の結合活性から過剰の標識していないホルモンを含有す
る試料の結合活性を引き算することにより、特異的結合
活性を計算する。存在するエストロゲンレセプターのモ
ル址は放射性物質−標識したエストラジオールの比活性
から計n−′4−る。
本明細■、において、下記の略語を使用する:CNBr
ニジアノrン プロミド; DADPA :ジアミノジ
プロピルアミン: DMffiM :ダルベツコの最低
基本メジウム; DTT ニジチオスレイトール; K
2R:エストロゲン レセプター; EDTA :エチ
レンジアミノテトラ自゛「酸; HBSS :ハングの
平衡化塩溶液;工g() : Gタイプのガンマ免疫グ
ロゾリン;工gM二Mタイプのガンマ免疫グロブリン;
MEM :最低基本メジウム; PACE :ポリア
クリルアミド rルミ気泳動; PBS : vン改塩
緩衝塩類浴液; SDS ニドデシル硫酸ナトリウム;
およびTR工Sニドリス(ヒPロキシメチル)アミノメ
タン。
ニジアノrン プロミド; DADPA :ジアミノジ
プロピルアミン: DMffiM :ダルベツコの最低
基本メジウム; DTT ニジチオスレイトール; K
2R:エストロゲン レセプター; EDTA :エチ
レンジアミノテトラ自゛「酸; HBSS :ハングの
平衡化塩溶液;工g() : Gタイプのガンマ免疫グ
ロゾリン;工gM二Mタイプのガンマ免疫グロブリン;
MEM :最低基本メジウム; PACE :ポリア
クリルアミド rルミ気泳動; PBS : vン改塩
緩衝塩類浴液; SDS ニドデシル硫酸ナトリウム;
およびTR工Sニドリス(ヒPロキシメチル)アミノメ
タン。
第1図は標準曲線および本発明に従い作成されたグラフ
を、標準曲線の使用方法とともに示すものである。
を、標準曲線の使用方法とともに示すものである。
標準曲線は異なる量で核中に存在するエストロゲン レ
セプターを固定量の放射性物質−標識した抗体とインキ
ュベートすることにより作成する。
セプターを固定量の放射性物質−標識した抗体とインキ
ュベートすることにより作成する。
抗体の特異的結合は総結合と過剰の標識していない抗体
の存在における結合との差である。未知試料中に存在す
るエストロゲン レセプターの量は〔125工〕抗体の
実験的に決定された特異的結合に相当する横坐標から標
準曲線を用いて決定される。
の存在における結合との差である。未知試料中に存在す
るエストロゲン レセプターの量は〔125工〕抗体の
実験的に決定された特異的結合に相当する横坐標から標
準曲線を用いて決定される。
第1図は標準曲線および本発明に従い作成され□たグラ
フを標準曲線の1史用力法とともに示すものである。 代理入浅村 ゛皓 手続補正書(1発) 昭和59年9月2q日 特許庁長官殿 1、事件の表示 11s和591iffFIiET85 D 88 号2
、発明の名称 新規なエストロゲンレセプター分析法 3、補正をする者 +JTl!Lトノ関6% (!j:l’l出願人4、代
理人 昭和 年 月 日 6、補正により増加する発明の数 明細書の浄書(内容に変更なし) 手続補正書(方式) 昭和g2年ケ月27日 特許庁長官殿 り事件の表示 昭和、イー7年特許願第 ?jOざr 号2、発明の名
称 」h′4なニス1■す゛ンレlづ゛ター分析法3、補正
をする者 Tji件との関係 特;j′1出願人 住 所 4、代理人 昭和4年2月S1日 6、補正により増加する発明の数 7、補正の対象
フを標準曲線の1史用力法とともに示すものである。 代理入浅村 ゛皓 手続補正書(1発) 昭和59年9月2q日 特許庁長官殿 1、事件の表示 11s和591iffFIiET85 D 88 号2
、発明の名称 新規なエストロゲンレセプター分析法 3、補正をする者 +JTl!Lトノ関6% (!j:l’l出願人4、代
理人 昭和 年 月 日 6、補正により増加する発明の数 明細書の浄書(内容に変更なし) 手続補正書(方式) 昭和g2年ケ月27日 特許庁長官殿 り事件の表示 昭和、イー7年特許願第 ?jOざr 号2、発明の名
称 」h′4なニス1■す゛ンレlづ゛ター分析法3、補正
をする者 Tji件との関係 特;j′1出願人 住 所 4、代理人 昭和4年2月S1日 6、補正により増加する発明の数 7、補正の対象
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)対象組織の細胞核に付随しているエストロゲンレ
セプターの量の測定方法であって、対象組織から細胞核
を分離し、細胞核に付随しているエストロゲン レセプ
ターの敞を標識した抗体を使用することにより測定する
ことを含む方法。 (2) エストeIrン レセプターの量の測定方法で
あって、一定址のエストロゲン レセプターを含有する
細胞核、未知量のOJ′メ性ニストロrン レセプター
および標識した抗体を一緒に混合し、次いで核に付随し
てbるエストロゲン レセプターに結合している抗体の
結合を測定することを含む方法。 (3)細胞核を含有する組織試料中のエストロゲンレセ
プターの量の測定方法であって、組織試料を採取しよう
とする哺乳動物にエストラジオールを投与し、この哺乳
動物から組織試料を採取し、組織試料から完全細胞核を
単離し、分離した完全核に標識したエストロゲン特異性
抗体を加え、次いでエストロゲン レセプターに対する
標識した抗体の結合レベルを測定することを含む方法。 (4)対象組織から核を分離する前に、対象組織をエス
トラジオールと混合する特許請求の範囲第1項の方法。 (5)哺乳動物組織中のエストロゲン レセプター製剤
ルの測定に使用するキットであって、(a)エストロゲ
ン レセプターを組織の細胞核に移動させるに十分な散
のエストラジオール; (b)検知できる神職で標識し
た抗体の成る量;および(C)既冨鮭のエストロゲン
レセプターを言句する安定化されている核製剤を含むキ
ット。 (611’flT乳動物組織中のエストロゲン レセプ
ターのレベルの測定に使用するキットであって、(a)
成る址の標識した抗体:(b)一定危のエストロゲンレ
セプターを含有する成る社の核;および<C)巧浴性エ
ストロデン レセプター製剤を含むキット。 (7)各成分の一定鼠をプラスチックまたはガラス製の
封鎖容器内に貯蔵しである特許請求の範囲第5項または
第6項のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US48899083A | 1983-04-27 | 1983-04-27 | |
US488990 | 1983-04-27 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6069556A true JPS6069556A (ja) | 1985-04-20 |
Family
ID=23941956
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59085088A Pending JPS6069556A (ja) | 1983-04-27 | 1984-04-26 | 新規なエストロゲンレセプタ−分析法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0129669A3 (ja) |
JP (1) | JPS6069556A (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0264185A3 (en) * | 1986-09-29 | 1989-05-31 | Baylor College Of Medicine | Urea-induced dna-binding assay for quantitative determination of estrogen receptor proteins |
US5312752A (en) * | 1989-07-31 | 1994-05-17 | Trustees Of Boston University | Specific antibodies against the DNA-binding domain of and immunoassays to determine the presence and functional status of estrogen receptor proteins |
DE19516954C1 (de) * | 1995-05-12 | 1996-12-19 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zum ortsaufgelösten immunhistochemischen Nachweis von Steroidrezeptoren |
DE19628298C2 (de) * | 1996-07-12 | 2002-04-11 | Max Delbrueck Centrum | Verfahren zum Nachweis einer Hormon- bzw. Antihormonresistenz bei Tumoren |
CN109982695A (zh) | 2016-08-18 | 2019-07-05 | 国立大学法人奈良先端科学技术大学院大学 | 免疫调节剂 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4232001A (en) * | 1978-09-22 | 1980-11-04 | University Patents, Inc. | Methods and materials for detection of estrophilin |
-
1984
- 1984-04-26 JP JP59085088A patent/JPS6069556A/ja active Pending
- 1984-04-26 EP EP84104721A patent/EP0129669A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0129669A3 (en) | 1987-09-16 |
EP0129669A2 (en) | 1985-01-02 |
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