JPS60500257A - テトラサイクリン活性増強方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 テトラサイクリン活性増・強力法 皮−里−−−−何一一分一一野 本発明は、抗生物質の効力増強方法および効力増強製品、特に、テトラサイタリ フ群抗生物質に対するバクテリアの抵抗力克服方法および克服製品に関するもテ トラサイクリン群は人間、動物および植物の広範囲な微生物性疾患を治療するの に使用する／ヘクテリア発育阻止性抗生物質剤である。

多くのバクテリアは、抗生物質に抵抗力を持ち得るようになる方法で環境に順応 可能となる。グループＡストレプトコンカスの株菌は、第２次犬戦中にサルファ ダイアシンに対抗して開発された。ペニシリンの広範囲使用のために、抵抗力を 持つスタヒロツヵス感染症が公的研究書および病院に拡がった。テトラサイクリ ン群を臨床的に導入以来、多くの微生物がこれらの薬剤に対する抵抗力を得てき た。ヤシの木のバクテリア感染を、根からのテトラサイクリン溶液投榮によって 処置する方法は目立って効果がとぼしくなってきた。Ｌｅｖｙ　、“Ｔｈｅ　Ｔ ｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ　：　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　５ｅｎ−ｓｉｔｉｖｉｔ ｙ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｉｓｔａｎｃｅ”、　Ｎｅｗ　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ａｎｔ ｉ−ｂｉｏｔｉｃｓ　；　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　Ｅｌ ｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−）ｔａｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅ ｓｓ、　１９８１．２７〜４４頁：　Ｃｈａｐｒａ等、“Ｔｈｅ　ｔｅｔｒａｃ ｙｃｌｉｎｅｓ　：　ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｂｅｇｉｎ−ｉｎｇ 　ｏｆ　ｔｈｅ　１８８０　′　ｓ　”　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｍｉ ｃｒｏｂｉａｌｃｈｅｍｏｔｈｅｒａ　ｙ、８：５−２１（ＩＨＩ　）参照のこ と。これらはここに文献として採用している。

１９４８年に臨床面にテトラサイクリンが導入された時には、実に驚異的薬剤の １つだった。しかし、多くの微生物がテトラサイクリンへの抵抗力を得てきた。

更に驚くことは、より新しいテトラサイクリンの類似化合物に対する抵抗力を持 った生物の出現である。この薬剤を意識的には摂取しなかった固体の中にも、抵 抗性バクテリアが出現しつつある。従って、抵抗の態様を知り、予防方法を開発 することが究めて重要となってきた。生命機構がこの薬剤の力を弱めることはな く、自然界での分解も少ないので、テトラサイクリンは環境内に残留し、抵抗力 のある生物の出現を促進し続ける。したがって、この抵抗性に打ち勝つ方法を確 立すれば、テトラサイクリン群の効力を大いに増大させ、他方では現在多大に増 加しているテトラサイクリン耐性微生物性疾患を減少させることになろう。

Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｂａ５ｉｓｏｆ　Ｃｅ１ｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉ ｏｎ、　（２版、　ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　＋９７５　）、　９４ １頁に記載しであるように、テトラサイクリン群はリポソームの段階で感応性バ クテリアの蛋白質合成を阻止するという観察結果がテトラサイクリン群の作用桟 序を研究することによって裏付けられている。上記文献はここに参考として採用 する。この阻Ｉ−作用は、バクテリアの呼吸系の全蛋白質合成および生合成を阻 害する。

耐性生態においては、この抵抗力がテトラサイクリン分子の微生物不活性化を助 長しない。むしろ、この薬剤が生物学的に効力を発揮しないような低儂度では、 全外向きフラックス速度が増大１２、細胞の定常状態蓄積が達成される。

バクテリアの殆んどの種でのテトラサイクリン群に対する抵抗力の特徴は、テト ラサイクリン耐性を媒介する遺伝子を伝達し、Ｒ因子と呼ばれる、過剰染色体的 、独自複製的でしばしば遺伝的であるプラスミドであることである。いくつかの プラスミドの中から２種類のテトラサイクリン耐性決定子が今までに記録されて いる：すなわち、デトラサイクリンだけに耐性を持つ決定子およびテトラサイク リン脂肪親和性的類似物に耐性を持つ決定子である。少なくとも４種類の異なっ た遺伝的要素が、テトラサイクリン耐性決定子を記号化することか今まで示され てきた。Ｍｅｎｄｅｚ等。

”Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ　Ｒｅ５ｉｓ ｔａｎｃ［ＩＤｅｔｅｒ−ｍｉｎａｎｔｓ　”　、　Ｐｌａｓｍｉｄ　、　３： ９９−１０８．１９８０゜この報文はここに参考として採用されている。

プラスミドが伝達する耐性は、多くのバクテリアにおいて誘導可能である。耐性 １／ペルは細胞を抑１１−的儂度以下のテトラサイクリンで前培養することによ って実験的に増強できる。誘導される耐性に伴うものは、ｒＴＥＴＪ蛋白質と命 名されるところの、プラスミドが記号化した内膜蛋白質の誘導的合成であること が発見された。ＬｅｖｙおよびＭｃＭｕｒｒｙ、“ｌ１ｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ 　ａｎ　Ｔｎｄｕ−ｃｉｂｌｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ｏ ｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｒ−Ｆａｃｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｅｔｒａｃ ｙｃｌｉｎｅ　Ｒｅ５ｉｓｔａｎｃｅ”　（Ｒ因子が仲介するテトラサイクリン 耐性を伴う誘導性膜蛋白質の発に参考として採用されている。更に、耐性細胞に よる薬剤の蓄積は、感応性細胞中への蓄積とは極めて異なる。ＬｅｖｙおよびＭ ｃＭｕｒｒｙ、　”Ｐｌａｓｍｉｄ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　Ｔｅｔｒａ−ｃｙ ｃｌｉｎｅ　Ｒｅ５ｉｓｔａｎｃｅ　１ｎｖｏｌｅｓ　ｎｅｗ　ｔｒａｎｓｐｏ ｒｔ　ｓｙｓｔｅｍｆｏｒ　ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ”　（プラスミドが決定 するテトラサイクリン耐性は、テトラサイクリンの新たな輸送系をもたらす）、 　Ｎａｔｕｒｅ、　２７５（５６８３）：！３Ｏ−９２（１！３７８）　、この 報告は本出願で参考として採用されている。一方゛では、テトラサイクリンは、 感応性細胞によって活発に蓄積されたか（ＭｃＭｕｒｒｙおよびＬｅｖｙ、”Ｔ ｗｏ　ｔｒａｎｓ−ｐｏｒｔ　ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉ ｎｅ　ｉｎ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｅｓｃｈｅ−ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ：　Ｃ ｒ１ｔｉｃａｌ　ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　ａｎ　Ｉｎ１ｔｉａｌ　ＲａｐｉｄＵｐｔ ａｋｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｉｎ５ｅｎｔｉｖｅ　ｔｏ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ｉｎｈｉｂ ｉｔｏｒｓ　”（感応性に脹１におけるテトラサイクリンの２つの輸送系：エネ ルギー抑制因子に非感応的な初期迅速吸収系への重要な役割り　）、Ａｎｔｉｍ ｉｃｒｏｂｉａ１７リドＡ見Ｉヱエ幻１Ｙ　１４（２）；２０１−０９（１！３ ７８　）、この報文は本出願の参考に採用されている　）、これらの吸収系は、 テトラサイクリン耐性プラスミドの少なくとも１つ、すなわちＲ２２２によって も変化させられるものと判明した。Ｎａｔｕｒｅ　２７５（５６８３）、上記の ９１頁。ＬｅｖｙおよびＭｃＭｕｒｒｙは、４つの全てのプラスミドに由来する テトラサイクリン耐性決定子がテトラサイクリンの活発な放出系を特定する事を その後実証した。（ＭｃＭｕｒｒｙ等。

“ＡｃｔｉｖｅＥｆｆｌｕｘ　ｏｆ　Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ　Ｅｎｃｏｄｅ ｄ　ｂｙ　ＦｏｕｒＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｔｅｔｒａ ｃｙｃｌｉｎｅ　ＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｉｎ　Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ”（Ｋ膿１の４つの遺伝的に異なるテトラサイク リン耐性決定子が信号を与えたテトラサイクリンの能動的放出）、　Ｐｒｏ−Ｎ ａｔ。

Ａｃａｄ、　ｏｆ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　？？（７）：３９７４−７？　（１８８ ０）、この報文は本出願に参考として採用しである　）。最近になって、ＴＥＴ の構造区に属するテトラサイクリン感応性変異株を用いて、ＴＥＴ　ＡおよびＴ ＥＴ　Ｂと命名した２つの遺伝的補体グループをこの研究者達は実証した。これ らの遺伝子座の何れか１つが存在しないと、テトラサイクリン耐性の特徴である ところのテトラサイクリンのエネルギー依存性放出に欠損を生じさせる。（Ｃｕ ｒｉ−ａｌｅ　ａｎｄ　Ｌｅｖｙ、”Ｔｗｏ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ 　Ｇｒｏｕｐ　Ｍｅｄｉ−ａｔｅ　Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ　Ｒｅ５ｉｓｔａ ｎｃｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＴｎｌＯ”（２つの相補性グループがＴ ｎｌＯで決定されたテトラサイクリン耐性を仲介する）、−月すュ１１−且ｆ　 Ｂａｃ↓すｊｏ↓ηＵ。

！５１（１，）：２０９−１５　（１９８２）、この報文は本出願の参考に採用 されている。） テトラサイクリン群・の細菌発育阻止性および殺菌性効果を増強する方法を提供 するのが本発明の・目的、に含まれる。耐性バクテリア細胞のテトラサイクリン 放出メカニズム（ｊａ構）を妨害する方法を提供するのもまた１つの目的である 。バクテリア細胞内に最小阻止濃度のテトラサイクリン群の蓄積を促進する方法 を提供することもまた目的の１つである。テトラサイクリン耐性細胞を、テトラ サイクリン感受性細胞に変換する方法を提供するのもまた１つの目的である。そ の他の追加的目的および本発明の諸利点は、後続の記述中に部分的に記載され、 またその記述から部分的に明白であり、または本発明の実施によって体得される だろう。本発明の目的および利点は、付記する特許請求の範囲にて特に指摘して いる手段および組合せによって実現され、また取得できるだろう。

−の　、・ 本発明は、テトラサイクリン型抗生物質を、テトラサイクリン放出系抑止剤また はテトラサイクリン放出系ブロック剤と共用して投与する場合において、バクテ リア細胞中のテトラサイクリン型抗生物質に対するプラスミド媒介性の能動放出 系の機能の抑止のための方法および製品から構成される。耐性細胞中の能動放出 系はこのようにして抑止され、テトラサイクリン型抗生物質は比較的低濃度にお いても、今までのテトラサイクリン耐性微生物における細胞性蛋白質合成を中断 させるのに有効である。このような組合せを採用することによって、テトラサイ クリン群の殺菌性効果および細胞成長抑止的効果を増強する方法を提供する。

耐性細胞の放出系が阻止されると、耐性細胞は感応性細胞の特徴に変化する。

の　詳　細　な　説　四 本発明によるテトラサイクリン耐性細胞のテトラサイクリン放出系を阻止する方 法は、これらの細胞を例えばテトラサイクリン類似物質ないし別タイプの薬剤の ような、ＴＥＴ　Ａ蛋白および／またはＴＥＴ　Ｂ蛋白あるいは蛋白域の活動を 妨害し、従って、細胞からのテトラサイクリン放出を減少させる放出遮断剤で処 理することを特徴とする。この方法は、それまでテトラサイクリンに対して耐性 を有していた細胞を非耐性化、即ち、テトラサイクリンに感応するようにする。

テトラサイクリン放出系が抑制されているかどうかは、感じやすい細胞および耐 性細胞に輸送されるテトラサイクリンの量を、放出遮断剤を用いた場合と用いな い場合とで比較すればよい。好ましくは、放出遮断剤による処理と同時に、ある いは少したってから、テトラサイクリン型抗生物質を投与する。

本論文中でいる°“テトラサイクリン型抗生物質”と等の語は、テトラサイクリ ンとその類似物質を意味し、これらは次のような構造式で表わされる：アルキル であったり、置換、アルコキシ、アルキレン、ハロゲンであってもよい。これに ついては、Ｋｏ−ｒｏｌｋｏｖａｓ等、　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌｓ　ｏｆ　Ｍｅｄ ｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎ、　Ｉ ｎｃ、、　ｋｇ７６　）、　５１２−１７を参照されたい。その内容は参考文献 として本出願に採用されている。Ｒ，とＲ２は水素ないし水酸基、Ｒ３は水素な いしメチル、Ｒ４は水素ないしハロゲン（好ましくは塩素　）ないしアミン（好 ましくはジメチルアミノ　）、Ｒ５は水素ないしＮ−メチル・ビロール（ロリテ トラサイクリンにおけるように）ないし−ＣＨ２ＮＨＣＨ（ＣＨ２）４　ＮＨ２ （リメサイクリＯＯＨ ンにおけるように）であることが好ましい。メタサイクリンのように、Ｒ２、Ｒ ３共にメチレンであってもよい。

テトラサイクリン感応細胞の中では、テトラサイクリンかＳ積されるため、細胞 内のテトラサイクリン濃度は細胞外の濃度より高くなる。　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ ｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ１４（２）、前出生に詳しく述べられているとおり、抗 生物質の一部は、初期のエネルギー依存段階で吸収される。しかしながら、少な くとも半分は、仇討抑制物質に感応したエネルギー依存系を通して吸収されてい る。

耐性生態には、耐性決定因子産生物質が存在することによって、プラスミドによ り記号化されたＴＥＴ耐性遺伝子の如き、エネルギー要求型ならびに担体仲介型 の活性放出系が更に組み込まれている。耐性は、テトラサイクリン分子の不活性 化により生じるものではない。むしろ、総放出率は増加し、従って、安定状態で は、耐性生態におけるテトラサイクリンの細胞内濃度は低くなっている。この耐 性のメカニズムは、細胞から薬品を吸いあげ、細胞から切り捨てるための活性系 である。

細胞からテトラサイクリンを活発に放出する担体蛋白（類）と、結合、会合、さ もなくばこれを不活性化する働きのある遮断剤を用いて、テトラサイクリン型抗 生物質の流出を阻止し得ることがわかった。理論的に確認することはしないが、 蛋白ないし、ＴＥＴ　Ａ、ＴＥＴ　Ｂとして知られる蛋白域、ないし、他のテト ラサイクリン耐性決定因子等によるこれ以外の同様な担体蛋白は、テトラサイク リン型抗生物質と結合さもなくば会合することにより、そして、細胞から抗生物 質を輸送することにより、活発に微生物に耐性を少しずつ獲得させていくものと 考えられる。更にまた、ＴＥＴ＾　・ＴＥＴ　Ｈの蛋白類ないしその蛋白域は、 いずれも放出に影響を及ぼすうえで、決定的かつ支持的な役割を果すものと思わ れるので、ＴＥＴ　Ａ　、　ＴＥＴ　Ｂ蛋白の双方あるいはいずれかと結合ない し会合する遮断剤を用いれば、放出系を阻止し、耐性微生物を感応性微生物へと 転換させることが可能である。

木′発明に従えば、遮断剤としては、テトラサイクリンの類似物質ないし誘導体 が望まれる。または、テトラサイクリンの構造と同じ部分をかなり有しており、 テトラサイクリン型抗生物質の放出を惹き起こす担体蛋白分子もしくは蛋白域と 認められる、さもなくば、これらの少なくとも１つと結合し得る化合物、従って 、問題の微生物における放出系を崩壊し得る化合物であることが望ましい。良好 なブロッキング剤として知られているのはオキシテトラサイクリン、クロロテト ラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、　Ｂ　−ｃｈｅｌｏｃ ａｒｄｉｎ、ミノサイクリン、ロリテトラザイクリン、リメサイクリン、サンサ イタリン、メタサイクリン等のテトラサイクリン型抗生物質、および、アビサイ クリン、クロモサイクリン、　ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅ。

ｍｅｇｌｕｃｙｃｌｉｎｅ；　ｍｅｐｙｃｙｃｌｉｎｅ、　ｐｅｎｉｍｅｐｉｃ ｙｃｌｉｎｅ、　ｐｉｐａ−ｃｙｃｌｉｎｅ、　ｅｔａｌｌｏｃｙｃｌｉｎｅ、 　ｐｅｎｉｍｏｃｙｃｌｉｎｅ等のテトラサイクリン潜在型を含む化合物である が、これだけに限られているわけではない。また、テトラサイクリン類としては 、テトラサイクリン乳酸塩、ｔ、ラウリル硫酸塩、ｔ、燐酸錯体、ｔ、クロロヘ キシル・スルファメートのような塩の型をしたものや、　この他薬学的に塩と認 められるものを用いることもある。

遮断剤の使用量は、遮断活性の有効性、処理対称生体における吸収性、ならびに 、微生物の耐性の程度によって異なる。処理対象のヒト、動物、植物における薬 学的に許容可能なレベルのテトラサイクリンで、微生物がこれに感応するだけの 量を用いる。投与する遮断剤とテトラサイクリンないしテトラサイクリン類抗生 物質のダラム分子比は杵通０．０１から１００、好ましくは０．０５カラ２．０ ．更に好ましくは０　、０５　カら１．０　とする。

ｉｎ　ｖｉｒｏ処理においては、患者に悪い影響をケーえず、しかも遮断効果を 表わし得るψが投ｔされる。このことは、この発明でｉｎマ１ｔｒｏに化学反応 を見るような場合には適用されない。一般的に１゛って、哺乳動物の病弊治療に おける１日の遮断剤投与量は、通常体重１’ｋｇあたり０．１から１００　ｍｇ 、好ましくは約（ｋｌから５０ｍｇ）範囲とする。テトラサイクリン型抗生物質 とは別に遮断剤を投与することもあるが、好ましくは、テトラサイクリン型抗生 物質と同時に投与−する。典型的には、テトラサイクリン型抗生物質は、血液、 体液内のテトラサイクリン濃度が処理すべき微生物を抑制する濃度に達し、これ を維持するように、毎日の処理過程の中で投与されることになろう。また、遮断 剤はテトラサイクリン型抗生物質に対する微生物の耐性を弱めるがら、抗生物質 療法の効果を高めるには、遮断剤もまた連続的に使用しなくてはならない。

テトラサイクリンをベースとしない化合物でも、抗生物質の流出をひき起こす担 体と相互に作用して、放出を阻止ないし減少させ得る構造を持つという条件で、 遮断剤に使用されることがある。遮断剤のテトラサイクリン型抗生物質放出減少 効果は、テトラサイクリン耐性バクテリアを用いて測定できる。これに使用する バクテリアは、テトラサイクリンに対する耐性を自然的に有しているものである ことも、また、テトラサイクリン耐性情報をすり込んだプラスミドを他のバクテ リア宿主に組み込むことによって作る場合もある。

好ましくは、遮断剤ならびにテトラサイクリン型抗生物質を、薬学的に許容でき る担体と化合させて医薬混合物を作る。有効成分の投与は、治療すべき状態に応 じてどの経路でもよいが、経口的、経鼻的（スプレー等）、非経口的（皮下、筋 肉内、静脈内）投与が良好である。治療を要する状況に応じて投与経路を変える のが望ましいであろう。

遮断剤については、原料化学品を与えることも可能であるが、薬学的に公式化さ れた試料の方が望ましい。

家畜、農作物、ヒトに用いる本発明の調整品は、遮断剤や前に定義した通りのテ トラサイクリン型薬品と共に、１種類ないしそれ以上の担体、また場合によって はその他の治療薬剤等の有効成分を含んでいる。′許容可能”な担体（複数）と は、処方中の他の成分と適合し、受容体に有害影響を与えない、と言う意味であ る。これらの抗生物質およびその誘導体ならびに遮断剤と適合しないとされる酸 化剤その他の物質は含めない方がよい。調整品には経口投与が適したものや非経 口投与（皮下、筋肉内、静脈内）に適したものも含まれているが、有効成分や治 療すべき状態等に応じて、それぞれのケースに最も適した投与経路が決まってく るであろう。調整品は、便宜上、単位投薬量形式で表わされているが、現今の製 薬技術分野では、様々な製造方法がとられている。どの方法も、１種類ないしそ れ以上の副成分としての担体と有効成分を会合させる段階を踏む。一般に、調整 品は、有効成分を液状担体ないし正確に分割した固形相体と均質かつ親密に会合 させて製造し、しかる後に必要とあらば、適当に整形する。本発明の調整品は経 口投与に適しており、所定量の有効成分を入れたカプセル。

カシェ−１錠剤であるとか、粉末、顆粒であるとか、水あるいは水以外の液剤な いし、懸濁液であるとか、水中油型乳剤あるいは油中木型乳剤であるとか、それ ぞれ別の単位で表示される。また、有効成分が、大丸削、鼻スプレー、生薬、舐 剤、泥膏の形で表わされることもある。

錠剤は、場合によって、１種類あるいはそれ以上の副成分と共に圧縮または型に 入れて作る。圧縮錠剤の製造には適当な機械が用いられ、この中で粉末状なり顆 粒状のサラサラした有効成分を、適宜、結合剤、潤滑剤、薬効のない希釈剤、な らびに、潤滑性の表面活性剤ないし分散剤と混合した上で圧縮する。成型錠剤は 、薬′効のない希釈液で湿めらせた粉末化合物の混合物を、適当な機械で成型す る。

非経口投与用調整品は、便宜上、有効成分の無菌水溶液で作られるが、好ましく は、この水溶液を患者の血液の等張液とする。この場合、便宜上、有効成分を水 に溶かして水溶液を作り、これを無菌化して製造することもある。こうした調整 品は、密封アンプルないし水薬瓶等の、半成あるいは複次投与量単位で表示され る。

本発明の調整品は前述の成分の他に、希釈剤、緩衝剤、香味剤、結合剤、表面活 性剤、Ｓ縮開、潤滑剤、防腐剤（酸化防止剤）その他の付加成分が含まれること に留意すべきである。

ヒトもしくは家畜用の調整品が、前に特筆した如き単位服用量形式で表示されて いる場合、その各単位の有効成分（上で定義した）は、便宜上、約１ｎｇから１ ０００ｍｇの範囲である。

（以下余白） ５ 繰り返すが、感応細胞は能動吸収系と受動拡散メカニズムによって、テトラサイ クリンをコンスタントに蓄積していく。耐性細胞では、薬品の能動・受動吸収の ほかに、能動放出が起こっている。本発明は、テトラサイクリン類似物と一緒に 、放出を遮断するための抑制物質を投与することによって、プラスミドにより媒 介されるテトラサイクリン耐性の問題を解決するものである。能動放出を阻止す ることにより、耐性細胞もまた、感応細胞と全く同量のテトラサイクリン類似物 を蓄積するようになることが発見されている。

本発明は、耐性細胞においてその放出系が遮断されると、耐性細胞は感応細胞へ とその特性を変換することを教えている。ＴＥＴ蛋白は、プラスミドにより媒介 される耐性の表われであるから、ＴＥＴ　Ａおよび／またはＴＥＴ　Ｂ蛋白ない しその蛋白域（複数）の作用を阻止すれば、耐性細胞は再びテトラサイクリン類 似物に対する感応細胞に戻り、これによって、放出系の活動を遮断することにな るだろう。

個々の遮断剤の有効性は、テトラサイクリン型抗生物質からひとつを選んでその 最小抑制濃度（ＭＩＣ）を調べ、この抗生物質のみのＭＩＣと、遮断剤を一緒に 用いた時のＭＩＣを比較することにより、簡単に決定できる。抗生物質のＭＩＣ ｌまた抗生物質・遮断剤併用のＭＩＣは、例えば、植旦肚■並圏旦ｊ旦υ、１４ （２）　、　ｔｌｊ２ｏ２　、に概説された手法で調べることができる。この技 術分野では、これ以外の多くのＭＩＣ測定法が知られている。

テトラサイクリン型抗生物質やその他の薬剤の吸収および／または放出は、細胞 全体の薬品に放射線標識をつけ、これをカウントすることにより、直接測定する こともある。この細胞全体の量による方法は、輸送系統が飽和状態になるとすぐ に判るという利点を持っている。この状態になるとテトラサイクリンの流入量が 単純拡散ないし能動放出によるテトラサイクリンの損失量を−Ｌ回る。

遮断剤の有効性を分析するもうひとつの方法は　小胞法で、小胞内膜を反転して 用いる。Ｐｒｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、？？（７）、１ｉ７ｉ３！９７４−５；　ＭｃＭｕｒｒｙ等 、　”ＡｃｔｉｖｅＵｐｔａｋｅ　ｏｆ　Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ　ｂｙ　Ｍ ｅｍｂｒａｎｅ　Ｖｅｓｉｃｌｅｓｆｒｏｍ　５ｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ　Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、　［感応大腸菌における膜小責による積極的テト ラサイクリン吸収］パ。

Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ ｙ　２０（３）　＋３０７−１３（１９８１）。これらの内容は本出願中に参考 として採用している。反転した小胞を用いると、正常な状態での流出系を流入系 として観察できる。小胞による方法には、テトラサイクリン類似物やその他の薬 剤を僧都じて使用する際に、競合あるいは流出系との結合を測定できるという長 所がある。

次に挙げる実施例では、本発明を更に詳しく説明する。

夫−＠Ｘ テトラサイクリンの１′合成類似物であるミノサイクリンを用いて、本発明は耐 性細胞の放出系を妨害し、これによって、それまでテトラサイクリンへの耐性を 有していた細胞が、活発にテトラサイクリンを蓄積するようになることが証明さ れた。この実施例は、両方の類似物が同じ担体によって耐性細胞から輸送される こと、また、放出系を類似物ミノサイクリンで飽和させると、デトラサイクリン そのものの耐性細胞からの流出はストップすることギ証明している。この観察の 意味するところは、放出遮断剤を加えても、テトラサイクリン吸収系は影響を受 けない、という観察と一致する。従って、テトラサイクリンは耐性細胞内に蓄積 され続ける。遮断剤を加えると、細胞外のテトラサイクリン濃度は低くてもＭＩ Ｃに到達するようになる。

ミノサイクリンはテトラサイクリンの半合成類似物質であり、テトラサイクリン より脂肪親和性である。

テトラサイクリンへの耐性を決定するプラスミドは、この更に脂肪親和性の強い 類似物であるミノサイクリンには、はるかに弱い耐性を示す。ミノサイクリンへ の耐性レベルは、普通、テトラサイクリンへのそれの１％から１０％である。

プラスミドＲ２２２はＴｎｌＯ上にＢクラスのテトラサイタリン耐性決定因子を 有している。Ｒ２２２のミノサイクリン耐性レベルは、テトラサイクリンへの耐 性の６％に過ぎない。もう１種類のＲプラスミド　ｐｌＰ７はＡクラスのテトラ サイタリン耐性決定因子を有しているが、ミノサイクリンへの耐性は、テトラサ イクリンに対するレベルの１％に過ぎない。これらのプラスミドを使って、ζ種 類のテトラサイクリンが、感応細胞ならびに２つの異なる耐性細胞により輸送さ れる量を比較した。

薬品のレベルが低い場合、感応細胞内に協動的に蓄積されるミノサイクリンの純 粋量は、細胞外の濃度の約６０倍であった。テトラサイクリンについては、この 値が細胞外濃度の７〜８倍である。

ジニトロフェノールの有無による細胞外薬品濃度の変化につれて安定状態の耐性 細胞中に蓄積される標識をつけたテトラサイクリンの量を測定した（標識をつけ てから３０分後）。この実験結果は、ＭｃＭｕｒｒｙ　＆　Ｌｅｖｙ。

旌ｊｊ’＋、　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅ＋ ｍｏｔｈｅｒａｐｙ　１４（２）、が感応細胞について報告している結果と一致 した。エネルギー抑制ＤＮＰが存在する場合の細胞全体における安定状態吸収量 が、ＤＮＰの存在しなｌ、）場合より大であれば、活性流出の純粋量が得られる 。

通常、ＤＮＰとか青酸化合物のようなエネルギー抑制剤を耐性細胞に加えると、 静止状態におけるテトラサイクリン・レベルは−Ｌ昇する；　Ｎａｔｕｒｅ、前 出　９０・これらエネルギーを抑制された細胞では、能動放出が抑えられるから である。　Ｐｒｏｃ、、前出　３９７４゜ルかし、この放出が飽和に達すれば、 エネルギーを与えられた細胞内への蓄積がそれ以−Ｌに低くなることはなかった 。実際、もし耐性細胞が未飽和で、まだ宿主細胞の能動吸収系が残っていれば、 放出系が飽和した時の細胞外薬品濃度において、能動吸収系が検出可能となろう 。

プラスミドＲ２２２を持つ細胞におけるテトラサイクリン放出の純量は、細胞外 テトラ→」−イクリンが１０００用舅レヘルの際にも減少しなかった。ごの点で はミノサイクリンと異なっている。６．−７．’Ａ以下の濃度でミノサイクリン の放出が見られたのに対１７、能動吸収が明らかになるレベルはこれより上であ った。２０ＪＬＭ以−［二での能動吸収は外部儂１隻の１．　Ｏ０倍で、これは 感応細胞における吸収率のほぼ２００倍に相当した。

Ｒ２２２に関する結果は以上の通りであるが、これに対し、テトラサイクリンに 対する耐性は３倍弱く、ミノサイクリンに対する耐性は２倍弱い　ＰＩＰ７を右 する細胞は、約５ｐＭのテトラサイクリンで細胞内の能動放出が止まることを示 した。外部１／ベルが上Ａすると、テトラサイクリンの能動吸収が現われた。し かしながら、細胞内のテトラサイクリン−（ＩＹは、同じ細胞外濃度における感 応細胞内のテトラサイクリン早−を常に下回り゛（テトラサイクリン論比がまだ 飽和していないことを示す）、２５０から４００１ｉにの間で急上昇することに なる。これらの細胞においては、ミノサイクリン能動放出は６．８　ｇ　Ｍ以下 の時にのみ起こった。このレベルより上では、ミノサイクリンの能動吸収が見ら れた。

これらの結果からは、どちらのタイプの耐性決定因子を有していようと、耐性細 胞はその中に、テトラサイクリンに対する宿主媒介の能動吸収系を保持している ことがわかる。

各テトラサイクリンが他のテトラサイクリンの放出系を阻止するものかどうかを 確かめるため、標識をつけないミノサイクリンの存在における標識をつけたテト ラサイクリンの安定状態蓄積量を測定した。また、この逆についても測定を行な った。Ｒ２２２を有する細胞を用い、まず、様々な濃度の未標識ミノサイクリン に、　３．４　ｇ　Ｍの［３Ｈ１テトラサイクリンを加えた。

約１０ｇＭの未標識ミノサイクリンレベルでテトラサイクリン放出が旧まり、こ れ以上のレベルでは艦ｉ■事ｆ見２ｈ犬。検査に用いた最高濃度の２００ルＮ未 標識ミノサイクリンレベルでは、エネルギー増強細胞の内／昇化（細胞内濃度／ 細胞外濃度の比）は５０で、エネルギー抑制細胞では５となった。これは、ミノ サイクリンがテトラサイクリンの放出系を妨害していることを示すものであった 。

約１００　ｐ、　Ｈの未標識テトラサイクリンで、［１４Ｃ］ミノサイタリン（ １，８ｐＬＭ　）の放出がなくなり、能動的吸収が始まった。未標識のテトラサ イクリンもまたミノサイクリンの能動放出を遮断し得るということである。実験 した最高濃度４００　ｐＬＭテトラサイクリンでは、エネルギー増強細胞および エネルギー抑制細胞における［１４Ｃ］　ミノサイクリンの内／昇化はそれぞれ ３０と５０で、つまりミノサイクリン放出系は飽和しかかっていた。

このように、各類似物がそれぞれ他方の放出を阻止する方向に作用するというこ とは、両類似物の放出がおそらく同じ飽和可能が担体によって行なわれるからで あろう。この実験結果は、Ｒ２２２上に温度感応テトラサイクリン耐性決定因子 を持った細胞における両薬品の温度感応放出によって、更に実証された。

この実施例は、テトラサイクリンおよびミノサイクリンがエネルギー非依存型な らびにエネルギー依存型吸収系の双方よって、感受性細胞中に蓄積されることを 証明した。これら類似物の宿主媒介エネルギー依存型吸収は、テトラサイクリン 耐性細胞でも依然観察された。テトラサイクリンについて前述した、プラスミド 媒介放出系もまた、耐性細胞内のミノサイクリン（より脂肪親和性の類似物）を 放出させる。

実−二旅一」九−」■ 同様の方法による競合実験が行なわれ、もう１種類のテトラサイクリン類似物で あるクロルテトラサイクリンも、感応ＩＬ！細胞で最近発見された潜伏放出経由 のミノサイクリン放出を効果的に遮断することが証明された。

支−ム−１−ｊ この実験は、亜抑制レベルのテトラサイクリン類似物を加えることにより、テト ラサイクリンの最小抑制濃度はかなり′低下することを示している。

この実験では、ミノサイクリン塩酸塩にューヨーク、　Ｌｅｄｅｒｌｅ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓより受領し、上述の）およびテトラサイクリン類似物である チアテトラサイクリン（ドイツ、ダルムシュタ・ント、　Ｅ、Ｍｅｒｃｋより受 領）が使用された。耐性細胞内のチアテトラサイクリンレベルは、テトラサイク リンの１％程度である。

ｍ族旧−２０９（Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７７（？）に 記載、旌遇　３９７４　）がこの実施例に用いられた。実験用の細胞は、前出し た通り、　０．５％グリセロールを加えた３７６ＣのＡ培養基中で、Ａ３３ｏ＝ 　０．１から”；ｑｏ＝０．８まで増殖させた。培養中、４４Ｍテトラサイクリ ンでプラスミドを持った細胞が誘発された。前出した通りの方法で細胞を洗浄し た。この後、培養基を希釈して光学密度を１Ｏ−５まで落とした。

次に様々なｍＫの様々な類似物を入れた試験管に、希釈細胞保存溶液１１を加え る。Ａ、、、、＝１０’の接種細菌から始めた時の混濁を抑える最小抗生物質濃 度を最小抑制濃度（ＭＩＣ）とする。最初の概算ＭＩＣの約１５％増加までの範 囲の抗生物質濃度を選んで用いた。

ＭＩＣの約２０％段階で増加が始まり約２００％で終了した。

５ｋＭのミノサイクリンおよびチアテトラサイクリン、４０ｐＭのテトラサイク リン溶液を毎週新しく作成し、−１５°Ｃで保存した。チアテトラサイクリンは エタノールに溶かした。ミノサイクリンおよびテトラサイクリンは、実施例工に 記した通りの方法で使用した。

様々な濃度のテトラサイクリンを入れた試験管に保存溶液１１を加え、最終濃度 にした。１７．５時間後の保存溶液のＭＩＣは、テトラサイクリンで４８０ｐＭ 　、ミノサイクリンで２０ｐＬＭ、チアテトラサイクリンで３．５ルにであった 。テトラサイクリン保存溶液に４ｐＬＭのミノサイクリンを加えると、テトラサ イクリンのＭＩＣが４００　ＪＬＭとなった。８ｐＬＭのミノサイクリンを加え ると、テトラサイクリンのＭＩＣは３２０」に落ちた。０．２１ＬＭのチアテト ラサイクリンをテトラサイクリン保存溶液に加えても、テトラサイクリンのＭＩ Ｃは変化しなかった。しかし、　０．８１７−　Ｈのチアテトラサイクリンを加 えた場合には、テトラサイクリンのＭＩＣが３００ｐＭまで減少した。つまり、 実施例■は、テトラサイクリンと共にもう１種類のテトラサイクリン類似物の亜 抑制濃度を用いて、実施例工の結果を追認したことになる。

このようにプラスミド媒介のテトラサイクリン耐性放出系は１種類以上のテトラ サイクリンを輸送することが証明された。実施例Ｉは様々なテトラサイクリン類 似物が様々な比率で輸送されることを示していた。

テトラナイフリンは感応性細胞内ないし耐性細胞内にもコンスタントに蓄積され ていくのだから、放出系を遮断するだけでよい。また同様に、ミノサイクリン、 チアテトラサイクリン等の遮断剤を加えると、それまでの耐性を有していた微生 物に対するテトラサイクリンの有効性が大いに高められる。

こうした結果は、テトラサイクリン型類似物質やその他の産物をテトラサイクリ ンと一緒にテトラサイクリン耐性細胞に投与すれば、類似物ならびにその他の物 質は確実にテトラサイクリンの放出を抑え、テトラサイクリンは正常に細胞内へ 蓄積されるようになる、という未発明と一致する。またテトラサイクリンをテト ラサイクリン型類似物と共に投与する場合には、耐性細胞を殺すために、テトラ サイクリン濃度を低くする必要があった。このように、もし細胞の放出系が遮断 されれば、耐性細胞は、感応細胞へと特性を変換する。

げ１　際　調　（・４・之　仇

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．抗生物質を放出するバクテリアの活動を阻止する遮断剤にこれらのバクテリ アを感染させることを特徴とする、テトラサイクリン型抗生物質に対するノくク チリアの耐性を克服する方法。 ２、遮断剤をテトラサイクリン型抗生物質と共にノ（クチリアに′投与すること を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、テトラサイクリン型抗生物質がテトラサイクリンであることを特徴とする特 許請求の範囲第２項記載の方法・ ４、当該の遮断剤を、耐性細胞の能動放出系を飽和させるに必要な濃度の溶液に して投与することを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、遮断剤としてミノサイクリンを用いることを特徴とする特許請求の範囲第２ 項記載の方法。 ６、遮断剤としてチアテトラサイクリンを用１．）ることを特徴とする特許請求 の範囲第１項記載の方法。 ７、当該の遮断剤に対する上述のテトラサイクリン型抗生物質の比が約０．０１ から　１００であることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８、当該の投与組み合せが、テトラサイクリンとミノサイクリンであることを特 徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、当該の投与組み合せがテトラサイクリンとチアテトラサイクリンであること を特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、テトラサイクリン型抗生物質を投与す、ること、ならびに、バクテリアの テトラサイクリン放出を抑制する遮断剤を少なくとも１種類投与することを特徴 とする、動物ないし植物のバクテリア感染を処置する方法。 １１、テトラサイクリン型抗生物質、バクテリアのテトラサイクリン放出を阻止 する遮断剤、ならびに、薬学的に許容可能な担体を成分とする薬剤調製。 １２、遮断剤をテトラサイクリン型抗生物質と共にバクテリアに投与することを 特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、テトラサイクリン型抗生物質をテトラサイクリンとすることを特徴とする 特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、当該の遮断剤を、耐性細胞の能動放出を飽和させ得る濃度の溶液にして投 与することを特徴とする特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １５、遮断剤にミノサイクリンを用いることを特徴とする特許請求の範囲第１２ 項記載の方法。 １６、遮断剤にチアテトラサイクリンを用いることを特徴とする特許請求の範囲 第１１項記載の方法。 １７、当該遮断剤に対する当該テトラサイクリン型抗生物質の比を約０．Ｏｌか ら　１００とすることを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １８．当該の投与組み合せをテトラサイクリンとミノサイクリンとすることを特 徴とする特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、当該の投与組み合せをテトラサイクリンとチアテトラサイクリンとするこ とを特徴とする特許請求の範囲第１７項記載の方法。