JPH0780774B2

JPH0780774B2 - 薬剤組成物

Info

Publication number: JPH0780774B2
Application number: JP59500096A
Authority: JP
Inventors: スチユアートビーレビー
Original assignee: タフツユニバーシティ
Priority date: 1982-11-18
Filing date: 1983-11-17
Publication date: 1995-08-30
Anticipated expiration: 2010-08-30
Also published as: US4806529A; EP0126145B1; DE3382503D1; US5021407A; CA1225332A; EP0126145A4; AU2342284A; JPS60500257A; EP0126145A1; WO1984001895A1; ATE72116T1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、抗生物質の効力を増強する薬剤組成物、特
に、テトラサイクリン群抗生物質に対するバクテリアの
抵抗力を克服する薬剤組成物に関する。

発明の背景テトラサイクリン群は人間、動物および植物の広範囲な
微生物性疾患を治療するのに使用するバクテリア発育阻
止性抗生物質剤である。

多くのバクテリアは、抗生物質に抵抗力を持ち得るよう
になる方法で環境に順応可能となる。グループＡストレ
プトコッカスの株菌は、第２次大戦中にサルファダイア
ジンに対抗して開発された。ペニシリンの広範囲使用の
ために、抵抗力を持つスタヒロッカス感染症が公的研究
書および病院に拡がった。テトラサイクリン群を臨床的
に導入以来、多くの微生物がこれらの薬剤に対する抵抗
力を得てきた。ヤシの木のバクテリア感染を、根からの
テトラサイクリン溶液投与によって処置する方法は目立
って効果がとぼしくなってきた。Levy,“The Tetracycl
ines:Microbial Sensitivity and Resistance",New Tre
nds in Antibiotics；Research and Therapy,Eisevier/
North-Holland Biomedical Press,1981,27〜44頁;Chopr
a等，“The tetracyclines:prospects at the begining
of the 1980′s"Journal of Antimicrobial chemother
apy,8:5−21（1981）参照のこと。これらはここに文献
として採用している。

1948年に臨床面にテトラサイクリンが導入された時に
は、実に驚異的薬剤の１つだった。しかし、多くの微生
物がテトラサイクリンへの抵抗力を得てきた。更に驚く
ことは、より新しいテトラサイクリンの類似化合物に対
する抵抗力を持った生物の出現である。この薬剤を意識
的には摂取しなかった個体の中にも、抵抗性バクテリア
が出現しつつある。従って、抵抗の態様を知り、予防方
法を開発することが究めて重要となってきた。生命機構
がこの薬剤の力を弱めることはなく、自然界での分解も
少ないので、テトラサイクリンは環境内に残留し、抵抗
力のある生物の出現を促進し続ける。したがって、この
抵抗性に打ち勝つ方法を確立すれば、テトラサイクリン
群の効力を大いに増大させ、他方では現在多大に増加し
ているテトラサイクリン耐性微生物性疾患を減少させる
ことになろう。

Lehninger,Biochemistry-The Molecular Basis of Cell
Structure and Function，（２版,Worth Publishers,1
975）,941頁に記載してあるように、テトラサイクリン
群はリボソームの段階で感応性バクテリアの蛋白質合成
を阻止するという観察結果がテトラサイクリン群の作用
機序を研究することによって裏付けられている。上記文
献はここに参考として採用する。この阻止作用は、バク
テリアの呼吸系の全蛋白質合成および生合成を阻害す
る。

耐性生体においては、この抵抗力がテトラサイクリン分
子の微生物不活性化を助長しない。むしろ、この薬剤が
生物学的に効力を発揮しないような低濃度では、総放出
率が増大し、細胞による定常状態の蓄積が得られる。

バクテリアの殆んどの種でのテトラサイクリン群に対す
る抵抗力の特徴は、テトラサイクリン耐性を媒介する遺
伝子を伝達し、Ｒ因子と呼ばれる。過剰染色体的、独自
複製的でしばしば遺伝的であるプラスミドであることで
ある。いくつかのプラスミドの中から２種類のテトラサ
イクリン耐性決定子が今までに記録されている：すなわ
ち、テトラサイクリンだけに耐性を持つ決定子およびテ
トラサイクリン脂肪親和性的類似物に耐性を持つ決定子
である。少なくとも４種類の異なった遺伝的要素が、テ
トラサイクリン耐性表現型を記号化することが今まで示
されてきた。Mendez等，“Heterogeneity of Tetracycl
ine Resistance Determinants",Plasmid,3:99−108,198
0。この報文はここに参考として採用されている。

プラスミドが伝達する耐性は、多くのバクテリアにおい
て誘導可能である。耐性レベルは細胞を抑止的濃度以下
のテトラサイクリンで前培養することによって実験的に
増強できる。誘導される耐性に伴うものは、「TET」蛋
白質と命名されるところの、プラスミドが記号化した内
膜蛋白質の誘導的合成であることが発見された。Levyお
よびMcMurry,“Detection of an Inducible Membrane P
rotein Associated with R-Factor-Mediated Tetracycl
ine Resistance"（Ｒ因子が仲介するテトラサイクリン
耐性を伴う誘導性膜蛋白質の発見），Biochemical and
Biophysical Research Communications,56（４）:1060
−68,（1974）。この報文はここに参考として採用され
ている。更に、耐性細胞による薬剤の蓄積は、感応性細
胞中への蓄積とは極めて異なる。LevyおよびMcMurry,
“Plasmid-determined Tetracycline Resistance invol
es new transport system for tetracycline"（プラス
ミドが決定するテトラサイクリン耐性は、テトラサイク
リンの新たな輸送系をもたらす），Natnre,275（568
3）:90−92（1978）。この報告は本出願で参考として採
用されている。一方では、テトラサイクリンは、感応性
細胞によって活発に蓄積されたか（McMurryおよびLevy,
“Two transport systems for Tetracycline in Sensit
ive Escherichia coli:Critical role for an Initial
Repid Uptake System Insentive to Energy Inhibitor
s"（感応性大腸菌におけるテトラサイクリンの２つの輸
送系：エネルギー抑制因子に非感応的な初期迅速吸収系
への重要な役割り）,Antimicrobial Agents and Chemot
herapy14（２）;201−09（1978），この報文は本出願の
参考に採用されている），これらの吸収系は、テトラサ
イクリン耐性プラスミドの少なくとも１つ、すなわちR2
22によっても変化させられるものと判明した。Nature27
5（5683），上記の91頁。LevyおよびMcMurryは、４つの
全てのプラスミドに由来するテトラサイクリン耐性決定
子がテトラサイクリンの活発な放出系を特定する事をそ
の後実証した。（McMurry等，“Active Efflux of Tetr
acycline Encoded by Four Genetically Different Tet
racycline Resistance Determinants in Escherichia c
oli"（大腸菌の４つの遺伝的に異なるテトラサイクリン
耐性決定子が信号を与えたテトラサイクリンの脂動的放
出），Pro.Nat.Acad.of Sci.USA77（７）:3974−77（19
80），この報文は本出願に参考として採用してある）。
最近になって、TETの構造区に属するテトラサイクリン
感応性変異株を用いて、TET AおよびTET Bと命名した２
つの遺伝的補体グループをこの研究者達は実証した。こ
れらの遺伝子座の何れか１つが存在しないと、テトラサ
イクリン耐性の特徴であるところのテトラサイクリンの
エネルギー依存性放出に欠損を生じさせる。（Curiale
and Levy.“Two Complementation Croup Mediate Tetra
cycline Resistance Determined by Tn10"（２つの相補
性グループがTn10で決定されたテトラサイクリン耐性を
仲介する），Journal of Bacteriology,151（１）:209
−15（1982），この報文は本出願の参考に採用されてい
る。）テトラサイクリン群の細菌発育阻止性および殺菌性効果
を増強する組成物を提供するのが本発明の目的に含まれ
る。耐性バクテリア細胞のテトラサイクリン放出メカニ
ズム（機構）を妨害する組成物を提供するのもまた１つ
の目的である。バクテリア細胞内に最小阻止濃度のテト
ラサイクリン群の蓄積を促進する組成物を提供すること
もまた目的の１つである。テトラサイクリン耐性細胞
を、テトラサイクリン感受性細胞に変換する組成物を提
供するのもまた１つの目的である。その他の追加的目的
および本発明の諸利点は、後続の記述中に部分的に記載
され、またその記述から部分的に明白であり、または本
発明の実施によって体得されるだろう。本発明の目的お
よび利点は、付記する特許請求の範囲にて特に指摘して
いる手段および組合せによって実現され、また取得でき
るだろう。

発明の要約本発明は、テトラサイクリン型抗生物質を、テトラサイ
クリン放出系抑止剤またはテトラサイクリン放出系ブロ
ック剤と共用して投与する場合において、バクテリア細
胞中のテトラサイクリン型抗生物質に対するプラスミド
媒介性の能動放出系の機能の抑止のための組成物から構
成される。耐性細胞中の能動放出系はこのようにして抑
止され、テトラサイクリン型抗生物質は比較的濃度にお
いても、今までのテトラサイクリン耐性微生物における
細胞性蛋白質合成を中断させるのに有効である。このよ
うな組合せを採用することによって、テトラサイクリン
群の殺菌性効果および細胞成長抑止的効果を増強する組
成物を提供する。耐性細胞の放出系が阻止されると、耐
性細胞は感応性細胞の特徴に変化する。

発明の詳細な説明本発明によるテトラサイクリン耐性細胞のテトラサイク
リン放出系を阻止する組成物は、放出遮断剤（ブロック
剤）、即ちTET Aおよび／またはTET B蛋白もしくは蛋白
領域の活動を妨害しこれにより細胞からのテトラサイク
リン放出を減少させるテトラサイクリン類似物質又は他
の薬剤を含んでいる。この組成物それまでテトラサイク
リンに対して耐性を有していた細胞を非耐性化、即ち、
テトラサイクリンに感応するようにする。テトラサイク
リン放出系が抑制されているかどうかは、感じやすい細
胞および耐性細胞に輸送されるテトラサイクリンの量
を、放出遮断剤を用いた場合と用いない場合とで比較す
ればよい。

本論文中でいる“テトラサイクリン型抗生物質”とか、
テトラサイクリン類とか、テトラサイクリン族等の語
は、テトラサイクリンとその類似物質を意味し、これら
は次のような構造式で表わされる：この中のR₁からR₅は水素であったり、水酸基、アルキル
であったり、置換、アルコキシ、アルキレン、ハロゲン
であってもよい。これについては、Korolkovas等、Esse
ntials of Medicinal Chemistry（John Wiley ＆ Son,I
nc.,1976）,512−17を参照されたい。その内容は参考文
献として本出願に採用されている。R₁とR₂は水素ないし
水酸基、R₃は水素ないしルチメ、R₄は水素ないしハロゲ
ン（好ましくは塩素）ないしアミノ（好ましくはジメチ
ルアミノ）、R₅は水素ないしＮ−メチル・ピロール（ロ
リテトラサイクリンにおけるように）ないし（リメサイクリンにおけるように）であることが好まし
い。メタサイクリンのように、R₂，R₃共にメチレンであ
つてもよい。

テトラサイクリン感応細胞の中では、テトラサイクリン
が蓄積されるため、細胞内のテトラサイクリン濃度は細
胞外の濃度より高くなる。Antimicrobial Agents14
（２），前出201に詳しく述べられているとおり、抗生
物質の一部は、初期のエネルギー非依存段階で吸収され
る。しかしながら、少なくとも半分は、代謝抑制物質に
感応したエネルギー依存系を通して吸収されている。

耐性生体には、耐性決定因子遺伝物質が存在することに
よって、プラスミドにより記号化されたTET耐性遺伝子
の如き、エネルギー要求型ならびに担体仲介型の能動放
出系が更に組み込まれている。耐性は、テトラサイクリ
ン分子の不活性化により生じるものではない。むしろ総
放出率は増大し、これにより定常状態において、耐性生
体は低い細胞内レベルのテトラサイクリンを有してい
る。この耐性メカニズムは、細胞から薬剤を引き出す能
動系である。

細胞からテトラサイクリンを活発に放出する担体蛋白
（類）と、結合、会合、さもなくばこれを不活性化する
働きのある遮断剤を用いて、テトラサイクリン型抗生物
質の流出を阻止し得ることがわかった。理論的に確認す
ることはしないが、蛋白ないし、TET A,TET Bとして知
られる蛋白域、ないし、他のテトラサイクリン耐性決定
因子等によるこれ以外の同様な担体蛋白は、テトラサイ
クリン型抗生物質と結合さもなくば会合することによ
り、そして、細胞から抗生物質を輸送することにより、
活発に微生物に耐性を少しずつ獲得させていくものと考
えられる。更にまた、TET A TET Bの蛋白類ないしその
蛋白域は、いずれも放出に影響を及ぼすうえで、決定的
かつ支持的な役割を果すものと思われるので、TET A,TE
T B蛋白の双方あるいはいずれかと結合ないし会合する
遮断剤を用いれば、放出系を阻止し、耐性微生物を感応
性微生物へと転換させることが可能である。

本発明における遮断剤としては、テトラサイクリンの類
似物質又は誘導体であるミノサイクリン又はチアテトラ
サイクリンが用いられる。遮断剤としては、テトラサイ
クリンの構造と同じ部分をかなり有しており、テトラサ
イクリン型抗生物質の放出を惹き起こす担体蛋白分子も
しくは蛋白域と認められる、さもなくば、これらの少な
くとも１つと結合し得る化合物、従って、問題の微生物
における放出系を崩壊し得る化合物がある。この他に良
好な遮断剤として知られているのは、オキシテトラサイ
クリン，クロロテトラサイクリン，デメクロサイクリ
ン，ドキシサイクリン,B−chelocardin,ミノサイクリ
ン，ロリテトラサイクリン，リメサイクリン，サンサイ
クリン，メタサイクリン等のテトラサイクリン型抗生物
質，および、アピサイクリン，クロモサイクリン,guame
cycline,meglcycline;mepycycline,penimepicycline,pi
pacycline,etamocycline,Penimocycline等のテトラサイ
クリン潜在型を含む化合物であるが、これだけに限られ
ているわけではない。また、テトラサイクリン類として
は、テトラサイクリン乳酸塩、t.ラウリル硫酸塩、t.燐
酸錯体、t.クロロヘキシル・スルファメートのような塩
の型をしたものや、この他薬学的に塩と認められるもの
を用いることもある。

遮断剤の使用量は、遮断活性の有効性、処理対称生体に
おける吸収性、ならびに、微生物の耐性の程度によって
異なる。処理対象のヒト、動物、植物における薬学的に
許容可能なレベルのテトラサイクリンで、微生物がこれ
に感応するだけの量を用いる。投与する遮断剤とテトラ
サイクリンないしテトラサイクリン類抗生物質のグラム
分子比は普通0.01から100、好ましくは0.05から2.0,更
に好ましくは0.05から1.0とする。in viro処理において
は、患者に悪い影響を与えず、しかも遮断効果を表わし
得る量が投与される。このことは、この発明でin vitro
に化学反応を見るような場合には適用されない。一般的
に言って、哺乳動物の病弊治療における１日の遮断剤投
与量は、通常体重1kgあたり0.1から100mg,好ましくは約
0.1から50mgの範囲とする。テトラサイクリン型抗生物
質とは別に遮断剤を投与することもあるが、好ましく
は、テトラサイクリン型抗生物質と同時に投与する。典
型的には、テトラサイクリン型抗生物質は、血液、体液
内のテトラサイクリン濃度が処理すべき微生物を抑制す
る濃度に達し、これを維持するように、毎日の処理過程
の中で投与されることになろう。また、遮断剤はテトラ
サイクリン型抗生物質に対する微生物の耐性を弱めるか
ら、抗生物質療法の効果を高めるには、遮断剤もまた連
続的に使用しなくてはならない。

テトラサイクリンをベースとしない化合物でも、抗生物
質の流出をひき起こす担体と相互に作用して、放出を阻
止ないし減少させ得る構造を持つという条件で、遮断剤
に使用されることがある。遮断剤のテトラサイクリン型
抗生物質放出減少効果は、テトラサイクリン耐性バクテ
リアを用いて測定できる。これに使用するバクテリア
は、テトラサイクリンに対する耐性を自然的に有してい
るものであることも、また、テトラサイクリン耐性情報
をすり込んだプラスミドを他のバクテリア宿主に組み込
むことによって作る場合もある。

好ましくは、遮断剤ならびにテトラサイクリン型抗生物
質を、薬学的に許容できる担体と化合させて医薬混合物
を作る、有効成分の投与は、治療すべき状態に応じてど
の経路でもよいが、経口的、経鼻的（スプレー等）、非
経口的（皮下、筋肉内、静脈内）投与が良好である。治
療を要する状況に応じて投与経路を変えるのが望ましい
であろう。

遮断剤については、原料化学品を与えることも可能であ
るが、薬学的に公式化された試料の方が望ましい。

家畜、農作物、ヒトに用いる本発明の調整品は、遮断剤
や前に定義した通りのテトラサイクリン型薬品と共に、
１種類ないしそれ以上の担体、また場合によってはその
他の治療薬剤等の有効成分を含んでいる。“許容可能”
な担体（複数）とは、処方中の他の成分と適合し、受容
体に有害影響を与えない、と言う意味である。これらの
抗生物質およびその誘導体ならびに遮断剤と適合しない
とされる酸化剤その他の物質は含めない方がよい。調整
品には経口投与が適したものや非経口投与（皮下、筋肉
内、静脈内）に適したものも含まれているが、有効成分
や治療すべき状態等に応じて、それぞれのケースに最も
適した投与経路が決まってくるであろう。調整品は、便
宜上、単位投薬量形式で表わされているが、現今の製薬
技術分野では、様々に製造方法がとられている。どの方
法も、１種類ないしそれ以上の副成分としての担体と有
効成分を会合させる段階を踏む。一般に、調整品は、有
効成分を液状担体ないし正確に分割した固形担体と均質
かつ親密に会合させて製造し、しかる後に必要とあら
ば、適当に整形する。本発明の調整品は経口投与に適し
ており、所定量の有効成分を入れたカプセル、カシェ
ー、錠剤であるとか、粉末、顆粒であるとか、水あるい
は水以外の液剤ないし、懸濁液であるとか、水中油型乳
剤あるいは油中水型乳剤であるとか、それぞれ別の単位
で表示される。また、有効成分が、大丸剤、鼻スプレ
ー、坐薬、舐剤、泥膏の形で表わされることもある。

錠剤は、場合によって、１種類あるいはそれ以上の副成
分と共に圧縮または型に入れて作る。圧縮錠剤の製造に
は適当な機械が用いられ、この中で粉末状なり顆粒状の
サラサラした有効成分を、適宜、結合剤、潤滑剤、薬効
のない希釈剤、ならびに。潤滑性の表面活性ないし分散
剤と混合した上で圧縮する。成型錠剤は、薬効のない希
釈液で湿めらせた粉末化合物の混合物を、適当な機械で
成型する。

非経口投与用調整品は、便宜上、有効成分の無菌水溶液
で作られるが、好ましくは、この水溶液を患者の血液の
等張液とする。この場合、便宜上、有効成分を水に溶か
して水溶液を作り、これを無菌化して製造することもあ
る。こうした調整品は、密封アンプルないし水薬瓶等
の、単次あるいは複次投与量単位で表示される。

本発明の調整品は前述の成分の他に、希釈剤、緩衝剤、
香味剤、結合剤、表面活性剤、濃縮剤、潤滑剤、防腐剤
（酸化防止剤）その他の付加成分が含まれることに類意
すべきである。

ヒトもしくは家畜用の調整品が、前に特筆した如き単位
服用量形式で表示されている場合、その各単位の有効成
分（上で定義した）は、便宜上、約1mgから1000mgの範
囲である。

繰り返すが、感応細胞は能動吸収系と受動拡散メカニズ
ムによって、テトラサイクリンをコンスタントに蓄積し
ていく。耐性細胞では、薬品の能動・受動吸収のほか
に、能動放出が起こっている。本発明は、テトラサイク
リン類似物と一緒に、放出を遮断するための抑制物質を
投与することによって、プラスミドにより媒介されるテ
トラサイクリン耐性の問題を解決するものである。能動
放出を阻止することにより、耐性細胞もまた、感応細胞
と全く同量のテトラサイクリン類似物を蓄積するように
なることが発見されている。

本発明は、耐性細胞においてその放出系が遮断される
と、耐性細胞は感応細胞へとその特性を変換することを
教えている。TET蛋白は、プラスミドにより媒介される
耐性の表われであるから、TET Aおよび／またはTET B蛋
白ないしその蛋白域（複数）の作用を阻止すれば、耐性
細胞は再びテトラサイクリン類似物に対する感応細胞に
戻り、これによって、放出系の活動を遮断することにな
るだろう。

個々の遮断剤の有効性は、テトラサイクリン型抗生物質
からひとつを選んでその最小抑制濃度（MIC）を調べ、
この抗生物質のみのMICと、遮断剤を一緒に用いた時のM
ICを比較することにより、簡単に決定できる。抗生物質
のMIC、また抗生物質・遮断剤併用のMICは、例えば、An
timicrobial Agents,14（２），前出202,に概説された
手法で調べることができる。この技術分野では、これ以
外の多くのMIC測定法が知られている。

テトラサイクリン型抗生物質やその他の薬剤の吸収およ
び／または放出は、細胞全体の薬品に放射線標識をつ
け、これをカウントすることにより、直接測定すること
もある。この細胞全体の量による方法は、輸送系統が飽
和状態になるとすぐに判るという利点を持っている。こ
の状態になるとテトラサイクリンの流入量が単純拡散な
いし能動放出によるテトラサイクリンの損失量を上回
る。

遮断剤の有効性を分析するもうひとつの方法は小胞法
で、小胞内膜を反転して用いる。Pro.Nat.Acad.Sci.US
A,77（７），前出3974−5;McMurry等，“Active Uptake
of Tetracycline by Membrane Vesicles from Suscept
ible Escherichia coli,［感応大腸菌における膜小嚢に
よる積極的テトラサイクリン吸収］",Antimicrobial Ag
ents and Chemotherapy20（３）:307−13（1981）。こ
れらの内容は本出願中に参考として採用している。反転
した小胞を用いると、正常な状態での流出系を流入系と
して観察できる。小胞による方法には、テトラサイクリ
ン類似物やその他の薬剤を増量して使用する際に、競合
あるいは流出系との結合を測定できるという長所があ
る。

次に挙げる実施例では、本発明を更に詳しく説明する。

実施例Ｉ感受性大腸菌ならびに耐性大腸菌におけるミノサイクリ
ン輸送。

テトラサイクリンの半合成類似物であるミノサイクリン
を用いて、本発明は耐性細胞の放出系を妨害し、これに
よって、それまでテトラサイクリンへの耐性を有してい
た細胞が、活発にテトラサイクリンを蓄積するようにな
ることが証明された。この実施例は、両方の類似物が同
じ担体によって耐性細胞から輸送されること、また、放
出系を類似物ミノサイクリンで飽和させると、テトラサ
イクリンそのものの耐性細胞からの流出はストップする
ことを証明している。この観察の意味するところは、放
出遮断剤を加えても、テトラサイクリン吸収系は影響を
受けない、という観察と一致する。従って、テトラサイ
クリンは耐性細胞内に蓄積され続ける。遮断剤を加える
と、細胞外のテトラサイクリン濃度は低くてもMICに到
達するようになる。

ミノサイクリンはテトラサイクリンの半合成類似物質で
あり、テトラサイクリンより脂肪親和性である。テトラ
サイクリンへの耐性を決定するプラスミドは、この更に
脂肪親和性の強い類似物であるミノサイクリンには、は
るかに弱い耐性を示す。ミノサイクリンへの耐性レベル
は、普通、テトラサイクリンへのそれの１％から10％で
ある。

プラスミドR222はTn10上にＢクラスのテトラサイクリン
耐性決定因子を有している。R222のミノサイクリン耐性
レベルは、テトラサイクリンへの耐性の６％に過ぎな
い。もう１種類のＲプラスミドpIP7はＡクラスのテトラ
サイクリン耐性決定因子を有しているが、ミノサイクリ
ンへの耐性は、テトラサイクリンに対するレベルの１％
に過ぎない。これらのプラスミドを使って、２種類のテ
トラサイクリンが、感応細胞ならびに２つの異なる耐性
細胞により輸送される量を比較した。

薬品のレベルが低い場合、感応細胞内に能動的に蓄積さ
れるミノサイクリンの純粋量は、細胞外の濃度の約60倍
であった。テトラサイクリンについては、この値が細胞
外濃度の７〜８倍である。

ジニトロフェノールの有無による細胞外薬品濃度の変化
につれて安定状態の耐性細胞中に蓄積される標識をつけ
たテトラサイクリンの量を測定した（標識をつけてから
30分後）。この実験結果は、McMurry ＆ Levy,前出，An
timicrobial Agents and Chemotherapy14（２），が感
応細胞について報告している結果と一致した。エネルギ
ー抑制DNPが存在する場合の細胞全体における安定状態
吸収量が、DNPの存在しない場合より大であれば、活性
流出の純粋量が得られる。

通常、DNPとか青酸化合物のようなエネルギー抑制剤を
耐性細胞に加えると、静止状態におけるテトラサイクリ
ン・レベルは上昇する；Nature，前出90。これらエネル
ギーを抑制された細胞では、能動放出が抑えられるから
である，Proc.,前出3974。しかし、この放出が飽和に達
すれば、エネルギーを与えられた細胞内への蓄積がそれ
以上に低くなることはなかった。実際、もし耐性細胞が
未飽和で、まだ宿主細胞の能動吸収系が残っていれば、
放出系が飽和した時の細胞外薬品濃度において、能動吸
収系が検出可能となろう。

プラスミドR222を持つ細胞におけるテトラサイクリン放
出の純量は、細胞外テトラサイクリンが1000μＭレベル
の際にも減少しなかった。この点ではミノサイクリンと
異なっている。６〜７μＭ以下の濃度でミノサイクリン
の放出が見られたのに対し、能動吸収が明らかになるレ
ベルはこれより上であった。20μＭ以上での能動吸収は
外部濃度の100倍で、これは感応細胞におけるほぼ200倍
に等しい。

R222に関する結果は以上の通りであるが、これに対し、
テトラサイクリンに対する耐性は３倍弱く、ミノサイク
リンに対する耐性は20倍弱いpIP7を有する細胞は、約５
μＭのテトラサイクリンで細胞内の能動放出が止まるこ
とを示した。外部レベルが上昇すると、テトラサイクリ
ンの能動吸収が現われた、しかしながら、細胞内のテト
ラサイクリン量は、同じ細胞外濃度における感応細胞内
のテトラサイクリン量を常に下回り（テトラサイクリン
流出がまだ飽和していないことを示す）,250から400μ
Ｍの間で急上昇することになる。これらの細胞において
は、ミノサイクリン能動放出は、0.6μＭ以下の時にの
み起こった。このレベルより上では、ミノサイクリンの
能動吸収が見られた。

これらの結果からは、どちらのタイプの耐性決定因子を
有していようと、耐性細胞はその中に、テトラサイクリ
ンに対する宿主媒介の能動吸収系を保持していることが
わかる。

各テトラサイクリンが他のテトラサイクリンの放出系を
阻止するものかどうかを確かめるため、標識をつけない
ミノサイクリンの存在における標識をつけたテトラサイ
クリンの安定状態蓄積量を測定した。また、この逆につ
いても測定を行なった。R222を有する細胞を用い、ま
ず、様々な濃度の未標識ミノサイクリンに、3.4μＭの
［³H］テトラサイクリンを加えた。約10μＭの未標識ミ
ノサイクリンレベルでテトラサイクリン放出が止まり、
これ以上のレベルでは能動吸収が見られた。検査に用い
た最高濃度の200μＭ未標識ミノサイクリンレベルで
は、エネルギー増強細胞の内／外比（細胞内濃度／細胞
外濃度の比）は50で、エネルギー抑制細胞では５となっ
た。これは、ミノサイクリンがテトラサイクリンの放出
系を妨害していることを示すものであった。

約100μＭの未標識テトラサイクリンで、［¹⁴C］ミノサ
イクリン（1.8μＭ）の放出がなくなり、能動的吸収が
始まった。未標識のテトラサイクリンもまたミノサイク
リンの能動放出を遮断し得るということである。実験し
た最高濃度400μＭテトラサイクリンでは、エネルギー
増強細胞およびエネルギー抑制細胞における［14C］ミ
ノサイクリンの内／外比はそれぞれ30と50で、つまりミ
ノサイクリン放出系は飽和しかかっていた。

このように、各類似物がそれぞれ他方の放出を阻止する
方向に作用するということは、両類似物が放出がおそら
く同じ飽和可能が担体によって行なわれるからであろ
う。この実験結果は、R222上に温度感応テトラサイクリ
ン耐性決定因子を持った細胞における両薬品の温度感応
放出によって、更に実証された。

この実施例は、テトラサイクリンおよびミノサイクリン
がエネルギー非依存型ならびにエネルギー依存型吸収系
の双方よって、感受性細胞中に蓄積されることを証明し
た。これら類似物の宿主媒介エネルギー依存型吸収は、
テトラサイクリン耐性細胞でも依然観察された。テトラ
サイクリンについて前述した、プラスミド媒介放出系も
また、耐性細胞内のミノサイクリン（より脂肪親和性の
類似物）を放出させる。

参考例Ｉ同様の方法による競合実験が行なわれ、もう１種類のテ
トラサイクリン類似物であるクロルテトラサイクリン
も、感応大腸菌細胞で最近発見された潜伏放出経由のミ
ノサイクリン放出を効果的に遮断することが証明され
た。

実施例II この実験は、亜抑制レベルのテトラサイクリン類似物を
加えることにより、テトラサイクリンの最小抑制濃度は
かなり低下することを示している。

この実験では、ミノサイクリン塩酸塩（ニューヨーク,L
ederle Laboratoriesより受領し、上述の）およびテト
ラサイクリン類似物であるチアテトラサイクリン（ドイ
ツ，ダルムシュタット,E.Merckより受領）が使用され
た。耐性細胞内のチアテトラサイクリンレベルは、テト
ラサイクリンの１％程度である。

大腸菌族D1−209（Proc.Nat.Acad.Sci.77（７）に記
載，前出3974）がこの実施例に用いられた。実験用の細
胞は、前出した通り、0.5％グリセロールを加えた37℃
のＡ培養基中で、A₅₃₀＝0.1からA₅₃₀＝0.8まで増殖させ
た。培養中、４μＭテトラサイクリンでプラスミドを持
った細胞が誘発された。前出した通りの方法で細胞を洗
浄した。この後、培養基を希釈して光学密度を10^-5まで
落とした。

次に様々な濃度の様々な類似物を入れた試験管に、希釈
細胞保存溶液1mlを加える。A₅₃₀＝10^-5の接種細菌から
始めた時の混濁を抑える最小抗生物質濃度を最小抑制濃
度（MIC）とする。最初の概算MICの約15％増加までの範
囲の抗生物質濃度を選んで用いた。MICの約20％段階で
増加が始まり約200％で終了した。

５μＭのミノサイクリンおよびチアテトラサイクリン、
40μＭのテトラサイクリン溶液を毎週新しく作成し、−
15℃で保存した。チアテトラサイクリンはエタノールに
溶かした。ミノサイクリンおよびテトラサイクリンは、
実施例Ｉに記した通りの方法で使用した。

様々な濃度のテトラサイクリンを入れた試験管に保存溶
液1mlを加え、最終濃度にした。17.5時間後の保存溶液
のMICは、テトラサイクリンで480μＭ、ミノサイクリン
で20μＭ、チアテトラサイクリンで3.5μＭであった。
テトラサイクリン保存溶液に４μＭのミノサイクリンを
加えると、テトラサイクリンのMICが400μＭとなった。
８μＭのミノサイクリンを加えると、テトラサイクリン
のMICは320μＭに落ちた。0.2μＭのチアテトラサイク
リンをテトラサイクリン保存溶液に加えても、テトラサ
イクリンのMICは変化しなかった。しかし、0.8μＭのチ
アテトラサイクリンを加えた場合には、テトラサイクリ
ンのMICが300μＭまで減少した。つまり、実施例III
は、テトラサイクリンと共にもう１種類のテトラサイク
リン類似物の亜抑制濃度を用いて、実施例Ｉの結果を追
認したことになる。

このようにプラスミド媒介のテトラサイクリン耐性放出
系は１種類以上のテトラサイクリンを輸送することが証
明された。実施例Ｉは様々なテトラサイクリン類似物が
様々な比率で輸送されることを示していた。テトラサイ
クリンは感応性細胞内ないし耐性細胞内にもコンスタン
トに蓄積されていくのだから、放出系を遮断するたけで
よい。また同様に、ミノサイクリン、チアテトラサイク
リン等の遮断剤を加えると、それまでの耐性を有してい
た微生物に対するテトラサイクリンの有効性が大いに高
められる。

こうした結果は、テトラサイクリン型類似物質やその他
の産物をテトラサイクリンと一緒にテトラサイクリン耐
性細胞に投与すれば、類似物ならびにその他の物質は確
実にテトラサイクリンの放出を抑え、テトラサイクリン
は正常に細胞内へ蓄積されるようになる、という本発明
と一致する。またテトラサイクリンをテトラサイクリン
型類似物と共に投与する場合には、耐性細胞を殺すため
に、テトラサイクリン濃度を低くする必要があった。こ
のように、もし細胞の放出系が遮断されれば、耐性細胞
は、感応細胞へと特性を変換する。

フロントページの続き (56)参考文献米国特許3454697（ＵＳ，Ａ) Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ．89（1978）71494 ｕＣｈｅｍ．Ａｂｓｔ．90（1979）198211 ｕＣｈｅｍ．Ａｂｓｔ．83（1975）1393ｆＣｈｅｍ．Ａｂｓｔ．81（1974）115200 ｅＣｈｅｍ．Ａｂｓｔ．82（1975）26560 ａＣｈｅｍ．Ａｂｓｔ．74（1971）74941 ｇ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の構造式を有するテトラサイクリン型
抗生物質と、ブロック剤とを含む組成物であって、前記
ブロック剤は、前記テトラサイクリン型抗生物質に対す
るモル比が約0.01から100であるミノサイクリン又はチ
アテトラサイクリンからなることを特徴とする薬剤組成
物。（式中、R₁は水素又は水酸基、R₂は水素もしくは水酸基
又はR₃と共にメチレン、R₃は水素もしくはメチル又はR₂
と共にメチレン、R₄は水素、ハロゲン又はアミノ、R₅は
水素、Ｎ−メチル・ピロール又は
【請求項２】前記テトラサイクリン型抗生物質が、テト
ラサイクリンであることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載の薬剤組成物。
【請求項３】前記テトラサイクリン型抗生物質に対する
前記ブロック剤のモル比が約0.05から２であることを特
徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の薬剤
組成物。
【請求項４】前記テトラサイクリン型抗生物質に対する
前記ブロック剤のモル比が約0.05から１であることを特
徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の薬剤
組成物。