JPS604940B2 - カテコールアミンの分析方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ェピネフリン型およびノルェピネフリン型カ
テコールアミン類を測定するための免疫分析（ｉｍｍｕ
ｍａｓｓａｙ）、ならびにそのような分析を行なうのに
有用な抗原および抗体に関する。

該免疫分析は、ェピネフリン型または／ルェピネフリン
型カテコールアミンに共通する側鎖に対して向けられ、
そして該分析はこれら化合物の１種もしくはそれ以上を
、該抗体によって結合されない他の化合物に選択転化さ
せるような酸化工程を使用する。ヱピネフリン型もしく
は／ルェピネフリン型カテコールアミンの総含有量と、
各酸化工程後におけるそれとの差を測定することにより
、原試料中に存在するいずれかの型の個々のカテコ−ル
アミンを定量することが可能である。カテコールアミン
を検出するために放射線免疫分析（ｒａｄｉｏｉｍｍ皿
ｏａｓｓａｙ）を用いることは、米国特許第３７０４２
８２号に記載されている。

この方法は極めて鋭敏な分析法であるが、そこで使用さ
れる抗体は極めて近緑なカテコールアミンを容易には区
別することができず、したがって試料中の総力テコ一ル
アミン含量が示されるに過ぎない。したがって、たとえ
ばエピネフリン、メタネフリン、シネフリンもしくはフ
エニレフリンのようなェピネフリン型カテコ−ルアミン
またはたとえばノルヱピネフリン、ノルメタネフリン、
オクトパミンもしくはノルフエネフリンのようなノルエ
ピネフリン型カテコールアミンの試料中における個々の
濃度を特定的に決定するために、そのような方法を使用
することはできないであろう。カテコールアミンの改良
蟹光分析法が文献〔仏ｖｅれｙａ的Ｔａｙｌｏｒ、Ａｎ
ａｌＸｉｃａＩＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔひ２２、２６９（
１９斑）〕に記載されている。

この技術においては、試料中のカテコールアミンを沃素
で酸化して、蟹光を有するインドール誘導体となし、次
いでこれを蟹光分析計で検出する。或る限度において、
この方法は他の関連化合物の存在下でも個々のカテコー
ルアミンを測定することができる。これには、異なる酸
化ｐＨ、異なる最終溶液処理および異なる波長極大値を
必要とする。しかしながら、そのうな条件を用いてもな
お交叉干渉（ｃｒｏｓｓ−ｉｎｔｅｒ企ｒｅｎｃｅ）が
起こりうるので、検出に先立って化学的分離を行なわな
いならば、混合物中で極めて僅かの数のカテコールアミ
ンしか実際に検出することができない。本発明は「ェピ
ネフリン型カテコールアミン（すなわち、ェピネフリン
、メタネフリン、シネフリンおよびフエニレフリン）ま
たはノルエピネフリン型カテコールアミン（すなわち、
ノルェピネフリン、ノルメタネフリン、オクトパミンお
よびノルフェネフリン）の個々の定量的検出を、これら
が試料中に混在するときでも可能にするような改良され
た分析方法に関するものである。

特に、本発明の方法は、酸化を受け易い順序で存在する
１種以上の選択されたェピネフリン型もしくはノルェピ
ネフリン型カテコールアミンを、該カテコールアミン型
に特異的な抗体とは免疫反応しえないような形態に、異
なる解および温度の条件下で転化させるような酸化工程
を使用する。亜硫酸塩還元剤で処理した後、ェピネフリ
ンもしくはノルェピネフリンの側鎖に対して特異的な抗
体を用いて免疫分析することにより、原試料と酸化工程
からの各々の反応生成物とを分析する。分析に使用する
抗体は選択的酸化工程で生成される生成物に対して親和
性を有しないので、転化される特定のヱピネフリン型も
しくはノルェピネフリン型カテコールアミンの濃度は、
或る条件下で酸化した試料に見出された力テコ‐ルァミ
ン含量を、酸化ないこ別の試料で或いはより緩和な条件
下で酸化した別の試料で測定されたカテコールアミン舎
量から、差引くことによって決定できる。さらに特定す
れば、本発明は試験試料中におけるエピネフリン、メタ
ネフリン、シネフリンおよびフェニレフリンから選ばれ
る個々のェピネフリン型カテコールアミン、ならびに／
ルェピネフリン、ノルメタネフリン、オクトパミンおよ
びノルフェネフリンから選ばれる個々のノルェピネフリ
ンを分析する方法に関するものであり、該方法は風 ェ
ピネフリン型もしくはノルェピネフリン型カテコールア
ミンに対する特異性を持った抗体を使用して該試験試料
につき免疫分析を行なうことにより、ェピネフリン型も
しくはノルェピネフリン型カテコールアミンの総濃度を
決定すること；ｔＢ’ 該試験試料の一部分を沃素によ
りｐＨ７．４で処理して該試験試料中に存在する如何な
るェピネフリンもしくはノルェピネフリンをも該抗体で
結合されない形態に選択転化せしめ、該部分を過剰の亜
硫酸塩水溶液で処理して残存する如何なる沃素をも還元
せしめ、得られた溶液のｐＨを該免疫分析に必要とされ
るｐ刊こ調節し、次いで該得られた溶液について該免疫
分析を行なうことにより、ェピネフリン型カテコールア
ミンについては該試験試料中に存在するメタネフリン、
シネフリンおよびフエニレフリンの合計量、またはノル
ェピネフリン型カテコールアミンについては／ルメタネ
フリン、オクトパミンおよびノルフェネフリンの合計量
を表わすェピネフリン型もしくはノルェピネフリン型カ
テコールアミン濃度を決定すること；‘○ 該試験試料
の第二の部分を沃素により解８．６で処理して該試験試
料中に存在するヱピネフリンおよびメタネフリンまたは
ノルエピネフリンおよびノルメタネフリンをも該抗体で
結合されない形態に選択転化せしめ、該部分を過剰の亜
硫酸塩水溶液で処理し、該免疫分析に適するレベルに母
を調節し、次いで該試験溶液について該免疫分析を行な
うことにより、該試験試料中に存在するシネフリンおよ
びフェニレフリンの合計量またはオクトパミンおよびノ
ルフェネフリンの合計量を表わすェピネフリン型もしく
は／ルェピネフリン型カテコールアミン濃度を決定する
こと：および醐 該試験試料の第三の部分を沃素により
ｐＨ９．２で処理して該試験試料中に存在する如何なる
ェピネフリン、メタネフリンおよびシネフリンまたは／
ルエピネフリン、ノルメタネフリンおよびオクトパミン
をも該抗体で結合されない形態に選択転化せしめ、該部
分を過剰の亜硫酸塩水溶液で処理し、該免疫分析に適す
るレベルに餌を調節し、次いで該試験試料について該免
疫分析を行なうことにより、談議験試料中に存在するフ
ェニレフリンまたはノルフェネフリンを表わすェピネフ
リン型もしくはノルェピネフリン型カテコールアミン濃
度を決定すること；の組合せから成り、そして上記工程
｛Ｂに見出される濃度を工程■のそれから差引くことに
よりヱピネフリンまたはノルェピネフリンの濃度を決定
し、上記工程にに見出される濃度を工程脚のそれから差
引くことによりメタネフリンまたはノルメタネフリンの
濃度を決定し、かつ上記工程皿に見出される濃度を工程
｛Ｃ｝のそれから菱引くことによりシネフリンまたはオ
クトパミンの濃度を決定することを特徴とする。

上記免疫分析に使用される抗体はそれ自体公知の方法で
得ることができる。

たとえば、式〔式中、Ｒ，は水素またはヒドロキシであ
り、Ｒ２は水素または低級アルキルであり、Ｒ′２は水
素または慣用のアミン保護基であり、そしてＲ３は水素
、ヒドロキシまたは低級アルコキシであり、そしてｎは
１〜３の整数である〕のハプテン（ｈａｐｔｅｎｉｃ）
化合物が抗原の製造に用いられる。

本発明の実施に使用される好適なハプテン化合物は、ェ
ピネフリン型カテコールアミンについてはシネフリンか
らそしてノルェピネフリン型カテコールアミンについて
はオクトバミンから誘導される。

必要とされる抗原を製造する際、後の変化中に自己縮合
反応が起こるのを防ぐ役をさせるため、式１の化合物に
おける保護基としてｔーブトキシカルボニル基を使用す
る。

本発明に必要とされる抗原を製造するためには、カルボ
キシル基を介して式１のハプテン（ｈａｐｔｅｎ）を慣
用の免疫原担体物質に共有結合せしめることが必要であ
る。

本明細書中で使用する「免疫原担体物質（ｉｍｍｕｎｏ
ｇｅｎｌｃ ｃａｎｌｅｒｍａｔｅｒｉａｌ）」という
語は、宿主動物における免疫原応答を独立的に譲発する
性質を有しかつ上記ハプテンに共有結合させうるような
物質を意味する。適する担体物質はたとえば蛋白質；天
然もしくは合成の高分子化合物たとえばポリベプチド（
たとえばポリリジンまたはアミノ酸の共重合体）、ポリ
サッカラィドなどを包含する。特に好適な担体物質は蛋
白質およびポリベプチド、殊に蛋白質である。本発明に
有用な抗原を調製する際に使用される蛋白物質の本体（
ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は臨界的でない。

本発明を実施する際使用しうる適当な蛋白質の例は俺乳
動物の血清蛋白質たとえばひとガンマーグロブリン、ひ
と血清アルブミン、子牛血清アルプミン、メチル化され
た子牛血清ァルブミン、兎血清アルブミンおよび子牛ガ
ンマーグロブリンを包含する。その他の適する蛋白質は
当業者に判るであろう。宿主動物（得られる抗原はこの
宿主動物に使用することになる）に対して異質である蛋
白質を使用することが一般に好ましいが、必らずしも必
要でない。免疫源坦体物質に対するハプテンの共有カッ
プリングは、アミド結合を達成するための当分野で周知
の方法によって行なうことができる。

しかしながら、担体物質に対するどんな悪影響をもでき
るだけ最少にするように、できるだけ緩和な条件下で十
分な程度のカップリングを確保するためには、カップリ
ングに先立って式１のハプテンを活性化された単離しう
る形態に変えることが望ましいであろう。特に好適な活
性化された単離しうる一形態は、式ロ〔式中、Ｒ，、Ｒ
２、Ｒ′２、Ｒ３およびｎは上記した通りである〕によ
って示されるようなＮーヒドロキシスクシンイミドエス
テルである。

その他の適する活性化された単離しうる誘導体はｐーニ
トロフヱニルヱステル、アシルイミダゾールなどを包含
する。

活性化された中間体を単機する必要がないようなその他
のカップリング方法も使用することができる。そのよう
な方法には、混合無水物法、カップリング剤としてのＥ
ＥＤＱ（Ｎーエトキシカルボニル−２−エトキシー１・
２ージヒドロキノリン）の使用などが包含される。式１
の遊離酸またはより好ましくはたとえば式０の活性化誘
導体のいずれかとしてのハプテンを免疫原担体物質にカ
ップリングさせることは、アミド結合を得るために当分
野で今日周知されている技術を使用して容易に達成する
ことができる。

たとえば、そのような一技術は坦体物質およびカップリ
ング剤を適当な不活性溶媒中に溶解し、次いで望ましい
式１のハプテンを加えることから成るであろう。反応は
約ｏｏ 〜約５０ｑｏの範囲の温度で行なうことができ
るが、反応体の性質に応じてそれより高いまたは低い温
度も使用することができるであろう。最も好適な温度は
ほぼ室温である。上記の反応に使用しうるカップリング
剤は、アミド結合形成を開始させるために有機化学にお
いて一般的に使用されるものから選択される。

カップリング剤の特に適する群はカルポジィミド、特に
好ましくはジシクロヘキシルカルボジィミドまたは１−
エチル−３一（３ージメチルアミノプロピル）ーカルボ
ジイミドである。ハプテン対担体物質のモル比は、もち
ろん、使用するハプテンの本体および反応用に選択する
蛋白質に依存する。カップリング反応に対しては慣用の
条件を使用することができる。たとえば、カップリング
剤としてカルボジイミドを使用するときは、この工程に
対し僅か酸性の反応媒体、たとえば約３〜６．ふ特に好
ましくは約４〜６．５の範囲の肘をもつ媒体、を使用す
ることが望ましい。反応が完了したら、過剰のハプテン
分子を透析によって除去することができる。上記したよ
うに、本発明の抗原を作るための好適な一技術は、先ず
活性化された誘導体すなわち式０の化合物を調製および
単離し、次いでこの化合物を担体物質と反応させて、ブ
ロックされた抗原を生成せしめることである。

そのような活性化された誘導体は、式１の化合物を不活
性溶媒中においてたとえばＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドのような望ましい活性化用化合物およびたとえばジシ
クロヘキシルカルボジイミドのようなカップリング剤と
反応させることにより、便利に製造される。反応は、通
常、低温（０〜５００）にて１６〜６０時間進行させる
。次いで副生物、すなわちジシクロヘキシル尿素、を炉
過除去しそして溶媒を留去することにより、活性化され
た譲導体を単離することができる。次いで、選択した担
体物質と活性化された誘導体とを接触させることにより
、ハプテンを担体物質にカップリングさせることができ
る。

活性化された誘導体がＮーヒドロキシスクシンィミドェ
ステルでありかつ損体物質が子牛血清アルブミンである
ときは、水混和性溶媒の中の活性化誘導体を、たとえば
重炭酸ナトリウムのような塩基を含む担体物質の水溶液
に加えてカップリングを達成することができる。担体蛋
白質をハプテン（式１）にカップリングさせるもう１つ
の方法は、中間体を単離することなくハプテンのカルボ
キシル基を活性化せしめそしてこの活性化されたハプテ
ンを担体蛋白質に加えることである。

そのような反応の例は、イソプチルクロロホルメートと
の反応で得られる混合無水物である。ハプテンを無水の
水混和性有機溶媒、通常ジオキサン、の中に溶解させそ
してこの溶液を等モル量のトリェチルアミンで中和する
。室温で燈拝した後、混合物の温度をｏｏ〜８℃に低め
る。次いで等モル量プラス１０％過剰のィソブチルクロ
ロホルメートを加えそして蝿梓を続ける。その間、担体
蛋白質たとえば子牛血清アルブミンを水中に溶解させそ
してＮａＯＨでｐＨ９に調節する。担体の使用量は、坦
体上の反応性基の理論数によってハプテンのモル量を割
った値に等しい。有機溶媒を担体溶液に加えそして溶液
を００〜８℃に冷却する。次いで、この溶液を活性化さ
れたハプテンに加えそしてカップリングを３０分間乃至
一夜進行させる。有機溶媒対水の最終割合は１：１であ
る。次いで、混合物を中性となし、水性−有機溶媒を除
去して水溶液を得る。

透析および凍結乾燥の後、アミン保護基を除去する。式
１または式０のいずれかの化合物を担体物質にカップリ
ングさせた後、遊離の第一級もしくは第二級ァミノ機能
を回復させるために保護基（式１および川こおけるＲ′
２）を除去することが必要である。

ｔ−ブトキシカルボニル保護基の場合、これは該物質を
ジクロルメタン中において室温にてトリフルオロ酢酸で
処理することにより便利に達成される。トリフルオロ酢
酸とジク。ルメタンとの相対量および処理の持続時間は
、それぞれの場３合に応じて変化させることができる。
通常、トリフルオロ酢酸１容量当り１〜３容量のジクロ
ルメタンを使用しそして３０分〜６０分の反応時間を用
い＊＊ると、良好な結果が得られることが判った。上記
の抗原は、好ましくはアジュバントを用いて、宿主動物
に注射することにより、該宿主動物においてェピネフリ
ン型もしくはノルェピネフリン型カテコールアミンに特
異的な抗体の生成を誘起させるために使用することがで
きる。或る時間にわたり反復注射して、改良タィター（
ｔｉｔｅ岱）を得ることができる。この目的に適する宿
主動物はたとえば兎、馬、山羊、モルモット、ねずみ、
牛、羊などのような蹄乳動物を包含する。生じる抗血清
は、宿主接種に使用する抗原を調製する目的で使用した
ハプテンに応じて、ェピネフリン型もしくはノルェピネ
フリン型カテコールアミンと選択的に結合するような抗
体を含有するであるつ。本方法の各工程においてェピネ
フリン型もしくはノルェピネフリン型カテコールアミン
を検出するために用いる免疫分析法は、当分野で周知さ
れている免疫分析法から選ぶことができる。

この目的に特に好適な免疫分析法は、たとえば米国特許
第３７０４２８２号または第３７０９６６５号に記載さ
れているような放射線免疫分析法であり、ェピネフリン
型もしくはノルェピネフリン型カテコールアミンに特異
的な上記の抗体を使用する。また、たとえば米国特許第
３８１７８３７号に記載されている酵素拡大法または米
国特許第３６９０８私号に記載されている如くスピンラ
ベルした化合物を用いる遊離基分析法のような他の免疫
分析法を使用することもできる。本方法の実施に使用す
るに適したヱピネフリン型カテコールアミン抗体の特異
性を下記第１表に示す。

抗体特異性 Ａｂ‐１山５ｄ乙‐ＭＥＴ＝１１２５でラベルされたｄ
と‐メタネフリンとの抗体コンプレックス本発明方法を
行なうのに適する手順は、下記のように要約することが
できる。

■ 試料の一部を免疫分析で試験して、ェピネフリン型
カテコールアミンの総含量（ェピネフリン十メタネフリ
ン十シネフリン十フエニレフリン）を決定する；【Ｂ｝
試料の他の一部を燐酸塩緩衝液でｐＨ７．４に調節し
、そして０．１Ｎ沃素（沃化ナトリウムと混ぜた水溶液
）で４℃にて５分間処理して、ヱピネフリンをアドレノ
クローム形に選択転化せしめ；反応混合物を過剰の亜硫
酸ナトリウム水溶液（１０％溶液として）で処理して禾
反応沃素を還元し；必要に応じて緩衝液により免疫分析
に必要な範囲のｐＨ‘こ調節し；そして反応混合物につ
いて免疫分析を行なって、残存するェピネフリン型力テ
コ‐ルアミン含量（メタネフリン＋シネフリン＋フェニ
レフリン）を決定する；‘Ｃ’ 試料の他の一部を燐酸
塩緩衝液でｐＨ８．６に調節しそして上記のような沃素
で４℃にて５分間処理して、ェピネフリンとメタネフリ
ンの両者をアドレノクローム形に選択転化せしめ；反応
混合物を前と同様の過剰の亜硫酸塩水溶液で処理し；免
疫分析に望ましい範囲にｐＨを調節し（上記抗体につい
てはｐＨ７．４）；次いで反応混合物について免疫分析
を行なって、残存するェピネフリン型カテコールアミン
濃度（シネフリン十フェニレフリン）を決定する：皿
試料の別の一部を炭酸塩一重炭酸塩緩衝液でｐＨ９．２
に調節しそして上記した沃素で窒素で室温にて５分間処
理して、ェピネフリン、メタネフリンおよびシネフリン
を環化形に選択転化せしめ；反応混合物を前と同様の過
剰の亜硫酸塩水溶液で処理し；免疫分析に望ましい範囲
にｐＨを調節し；次いで反応混合物について免疫分析を
行なって、残存するェピネフリン型カテコールアミン濃
度（フェニレフリン）を決定する。

試料のフェニレフリン含量は、かくして工程■における
免疫分析結果によって直接に決定される。エビネフリン
含量は、工程Ａでの試料の直接免疫分析によって見出さ
れるェピネフリン型カテコールアミン総合量から、工程
Ｂで見出されるェピネフリン型力テコ一ルアミン含量を
差引くことによって決定される。同様に、メタネフリン
含量は、工程Ｃで見出される濃度レベルを工程Ｂのそれ
から差引くことによって決定される。最後に、シネフリ
ン含量は、工程Ｄの結果を工程Ｃのそれから差引〈こと
によって得られる。上記した免疫分析は、ノノレェピネ
フリン型側鎖に対する特異性をもった抗体を使用すれば
、個々のノルェピネフリン型カテコールアミンについて
分析するのにも有用である。

すなわち、上記工程凶においては、試料の一部を試験し
て、ノルェピネフリン型カテコールアミン総合有量（ノ
ルェピネフリン十ノルメタネフリン十オクトパミン＋／
ルフェネフリン）を決定する。同り条件下で同じように
して工程｛Ｂ）を行ない、残存するノルェピネフリン型
カテコールアミン含量（ノルメタネフリン十オクトパミ
ン＋ノルフェネフリン）を与える。同様に、上記と同じ
ようにして工程にーを行ない、オクトパミン＋ノルフェ
ネフリンの濃度を与える。最後に、同じようにして工程
■を行ない、ノルフェネフリン濃度を与える。次に、ェ
ピネフリン型カテコールアミン系列の各場合について上
記したと同様に、個々のノルェピネフリン型カテコール
アミン濃度を算出する。すなわち、ノルフェネフリンは
工程皿から決定され、ノルェピネフリンは工程【Ｂーの
含量を工程■のそれから差引いて決定され、ノルメタネ
フリン含量は工程｛ｑのレベルを工程｛Ｂ｝のそれから
差引し、て決定され、そして最後にオクトパミン舎量は
工程肋の結果を工程に｝のそれから差引し、て得られる
。各種試験試料の個々のェピネフリン型もしくはノルェ
ピネフリン型力テコ‐ルアミン含量は本発明の方法によ
って決定することができる。

そのような試験試料の例は、たとえば尿、血液、組織抽
出液などのような生物学的流体を包含する。或る場合に
は、使用する免疫分析の特別な必要性に合致させるため
、試験試料の予備処理が必要とされることもある。たと
えば、分析を始めるに先立って、それ自体公知の方法で
除蛋白を行なうことが必要とされることもある。本明細
書中において使用する「低級アルキル」という語は、炭
素原子１〜７個、好ましくは１〜４個を有する直鎖もし
くは分枝鎖の炭化水素基、たとえばメチル、エチル、ｎ
−プロピル、ｎーフチルなどを意味する。

「低級アルコキシ」という語は、低級アルキル部分が上
記の通りである低級アルコキシを意味する。特に好適な
低級アルキル基はメチルでありそして特に好適な低級ア
ルコキシ基はメトキシである。実施例 １ ラセミ型シネフリン４１．８夕、（０．２８モル）およ
びｔ−ブトキシカルボニルアジド５３．６夕（０．３７
５モル）を一緒に、酸化マグネシウム４夕の存在下に５
０％本性ジオキサン１その中で４０〜４５午０にて２翻
時間蝿拝した。

ジオキサンを淡こはく色の溶液から蒸留しそしてこの残
留物に水５００叫を加えた。冷却すると、固体５８．７
夕が分離した、融点１４１．５〜１４３．５ｑｏ（１０
ぴ０で３時間乾燥の後）。この物質の試料を再結晶させ
て、ラセミ型Ｎ−（４Ｑージヒドロキシフェネチル）−
Ｎ−メチルカルバミン酸のｔーブチルェステルの白色結
晶（融点１４１〜１４１．５午○）を得た。実施例 ２ ラセミ型Ｎ一（４Ｑージヒドロキシフェネチル）−Ｎ−
メチルカルバミン酸のｔ−プチルヱステル２６．７夕（
０．１モル）をへキサメチル燐酸トリアミド２５０のＺ
中に溶解しそしてこの鷹拝されている溶液に窒素下で水
素化ナトリウム２．４夕（０．１モル）を少しずつ加え
た。

混合物を、水素発生が止むまで（約３時間）瀦拝した。
この縄拝されている溶液に、ベンゼン２５の【中のエチ
ルブロモアセテート１７．０夕（０．１モル）を一度に
加えた。外部温度は７℃から１９℃まで上昇した。混合
物を１０分間かけてほぼ中性にした。水と氷（５００の
Ｚ）を混合物に加え、僅かに濁った混合物をエーテル１
５０必ずつで５回抽出し、合したエーテル抽出液を少量
ずつの水で二三回洗浄しそして硫酸マグネシウムで脱水
した。脱水剤を除去した後、溶媒をロータリー・ェバポ
レーターで蒸留した。ラセミ型４−〔２−（Ｎ一ｔーブ
トキシカルボニル−Ｎ−メチルアミノ）−１−ヒドロキ
シエチル〕ーフエノキシ酢酸のエチルェステルである粘
鋼シラツブ３９夕の残留物は結晶化させようと努力した
が結晶化せず、そのまま加水分解に使用して下記のよう
に遊離酸にした。実施例 ３ 実施例２の対応するエチルェステルを８０〜８５ｑ０の
水中に懸濁させ、そして永続的斑９〜１０が得られるま
で１０％水酸化ナトリウム溶液を添加することにより、
該エチルェステルを加水分解させた。

２０％クエン酸溶液でｐＨ３に酸性化させた後、混合物
をクロロホルムで数回抽出した。

クロロホルム抽出液を脱水し、脱水剤を炉去しそして溶
媒をロータリー・ェバポレーターで蒸留した。結晶化し
そうにないシラップ状のラセミ型４一〔２−（Ｎ−ｔ−
ブトキシカルポニルーＮ−メチルアミノ）−１−ヒドロ
キシェチル〕−フェノキシ酢酸を得た。したがって、こ
のものを下記のようにして結晶Ｓ−ペンジルチウロニウ
ム塩に変えた。シラップ状の酸の秤量した試料を十分量
の水酸化ナトリウムで処理してナトリウム塩を生成せし
めた（ｐＨ７．５〜８．０）。この溶液に、Ｓーベンジ
ルチウロニウムクロラィドの濃厚溶液を加えると、沈殿
が生成した。固体を回収し、冷水で洗浄し、次いで水か
ら再結晶させて、融点１６３〜１６５ｑｏの白色結晶を
得た。分析により、この結晶が上記の酸のＳ−ペンジル
チウロニウム塩であることが示された。実施例 ４実施
例３に記載したシラップ状の酸３．２５夕（０．０１モ
ル）をジメトキシェタン４０の【中にＮーヒドロキシス
クシンイミド１．１５夕（０．０１モル）と一緒に溶解
させ、そしてこの溶液にジシクロヘキシルカルボジイミ
ド２．０６夕（０．０１モル）を加えると、溶液は温ま
るのが感じられた。

次いで混合物を５℃にて２１時間貯蔵した。分離したジ
シクロヘキシル尿素を炉過除去し、炉過ケーキを少量の
ジメトキシェタンで洗浄し、そして合した炉液をロータ
リー・ェバポレーターで蒸留した。濁ったシラップ３．
７０夕が残り、これをトルェン７５叫中に溶解し、そし
て分離した未溶解のジシクヘキシル尿素を炉過除去した
。溶媒を蒸留するとシラップが残り、これを２ーブロパ
ノール５０舷中に溶解し、６０〜９０ｏ画分の石油エー
テルを濁りが生ずるまで加え、そしてこの溶液を５℃で
５日間貯蔵した。分離した結晶を回収した。収量：２．
鰍のラセミ型４−〔２−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル
−Ｎーメチルアミノ）一１ーヒドロキシエチル〕ーフェ
ノキシ酢酸のＮーヒドロキシスクシンィミドェステル（
融点１０６〜１０８．５ｑ０）。実施例 ５ ラセミ型オクトパミンヒドロクロラィド４７．５夕（０
．２５モル）およびｔ−ブトキシカルボニルアジド５３
．６夕（０．３７５モル）を一緒に、５０％水性ジオキ
サン１〆と酸化マグネシウム１２夕との混合物の中で、
窒素下３７〜４５ｑｏにて２１時間燈拝した。

ジオキサンをロータリー・ェバポレーターで溶液から蒸
留した。酢酸でｐＨ６に調節した後、溶液をクロロホル
ム２００の‘ずつで５回抽出した。合したクロロホルム
抽出液を少量の水で洗浄し、溶液を脱水し、次いで溶媒
を蟹去すると、融点１４６〜１４８℃の結晶固体５９．
０夕が残った。酢酸エチルと６０〜９０ｏ画分の石油エ
ーテルとの鷹液から再結晶させて、生成物すなわちラセ
ミ型Ｎ−（４Ｑ−ジヒドロキシフェネチル）ーカルバミ
ン酸のｔーブチルェステル（融点１４７〜１４蟹０）を
得た。実施例 ６ ラセミ型Ｎ−（４Ｑ−ジヒドロキシフェネチル）ーヵル
バミン酸のｔ−ブチルェステル２５．３夕（０．１モル
）をへキサメチル燐酸トリアミド３５０の‘中に溶解し
、そして窒素下で鍵拝されている溶液に水素化ナトリウ
ム２．４夕（０．１モル）を少しずつ加えた。

この混合物を、水素発生が止むまで鷹拝した。次いで、
この蝿拝されている溶液に、ベンゼン２５の上中のエチ
ルブロモアセテート１７．０夕（０．１モル）を一度に
加えた。外部温度は７℃から１９ｏｏまで上昇した。混
合物は１０分間でほぼ中性になった。この混合物に水お
よび氷（５００の‘）を加え、僅かに濁った混合物をエ
ーテル１５０の【ずつで５回抽出し、合したエーテル抽
出液を少量ずつの水で二三回洗浄し、そして硫酸マグネ
シウムで脱水した。脱水剤を除去した後、溶媒をロータ
リー・ェバポレーターで蒸留した。残留物、すなわちこ
はく色のシラップ、３１．７夕を熱四塩化炭素中に溶解
し、そして冷却するとラセミ型４−〔２一（Ｎ−ｔーブ
トキシカルボニルアミノ）−１ーヒドロキシェチル〕−
フェノキシ酢酸のエチルェステルの結晶が析出した。こ
の結晶は５６〜５９ｑｏで溶融する。４ず０にて高真空
下で乾燥すると、この結晶は無色ガラス状物に変った。

実施例 ７ 実施例６の生成物を８０〜８ｙ０の水中に懸濁させそし
て永続的母９〜１０が得られるまで１０％水酸化ナトリ
ウム溶液を加えることによって、該生成物を加水分解し
た。

２０％クエン酸溶液で対３に酸性化させた後、溶液をク
ロロホルム１００の‘ずつで２回抽出した。

合したクロロホルム抽出液を脱水し、脱水剤を炉過除去
しそして溶媒をロータリー・ヱバポレーターで蒸留した
。淡こはく色のシラツプが生じた。このシラツプを６０
〜９００画分のあたたかい石油エーテルに溶解させ、そ
して冷却すると結晶が分離した。この色の悪い結晶２２
．５５夕をアセトニトリル１００の‘中に溶解し、脱色
炭で処理し、炉遇しそして冷却した炉液から固体８．９
夕を得た（融点聡〜１０１００）。脱色炭を用いてもう
１度アセトニトリルから再結晶させると、ラセミ型４一
（２一ｔ−ブトキシカルボンアミドー１−ヒドロキシェ
チル）−フェノキシ酢酸の僅か灰色の結晶６．６５夕が
得られた（融点１０９〜１１１℃）。実施例 ８以下に
示す手順にしたがい、ラセミ型４一〔２一（Ｎ一ｔーブ
トキシカルポニル一Ｎーメチルアミノ）−１−ヒドロキ
シェチル〕ーフェノキシ酢酸のＮーヒドロキシスクシン
イミドヱステルを子牛血清アルブミン（ＢＳＡ）にカッ
プリングさせた。

水１２の‘中の全部で３００の９（０．００４４７ミリ
モル）の子牛血清アルプミン（ＢＳＡ）を重炭酸ナトリ
ウムの０．９Ｍ溶液６叫で処理し、次いでラセミ型４一
〔２一（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルーＮーメチルアミ
ノ）一１ーヒドロキシエチル〕−フエノキシ酢酸のＮー
ヒドロキシスクシンィミドェステル６０の９（０．０７
５ミリモル）を含有するジメトキシェタン８の‘で処理
した。

混合物を室温で３時間蝿拝し、エタノール９６の‘を加
えそして溶液を蒸発させて少容量にした。次いで、残留
物を水２０Ｍ昔容量で１日２回交換しながら透析し、次
いで保護された抗原を凍結乾燥した。上記と同じ条件下
で第２回目の実験を行なったが、この場合は活性化され
たェステル１６２雌を使用した。保護された抗原５０ｍ
ｇを塩化メチレン５０必中において５０％トリフルオロ
酢酸と一緒に室温で１時間蝿拝することにより、ｔープ
トキシカルポニル保護基の除去を達成した。

次いでトリフルオロ酢酸をフラッシュ蒸発によって除去
した。残留物を水洗し、次いで蒸発させた。次いで、残
留物を水中に溶解し、凍結乾燥させて所望の抗原を得た
。両実験から作られた抗原を蛋白質分析およびＵ．Ｖ．
スペクトル示差分析によって検査すると、実験１の抗原
はＢＳＡＩモル当り１４モルのハプテンを含有（理論的
に可能な８９固のアミノ基に基づいて１７％の置換）す
るが、実験２の抗原はＢＳＡＩモル当り２５モルのハプ
テンを含有した（２９％の置換）。この抗原を、ェピネ
フリン、メタネフリン、シネフリンおよびフェニレフリ
ンに特異的な抗体を誘発するために使用した。実施例
９ 下記の混合アンヒドラィド法を用いて、ラセミ型４一（
２一ｔ−ブトキシカルポンアミド−１ーヒドロキシェチ
ル）‐フェノキシ酢酸を斑Ａにカップリングさせた。

全部で３９．４６秘（０．１２６９ミリモル）の保護さ
れたハプテンを乾燥ジオキサン１の‘に加え、次いでジ
オキサン０．５の【中のトリエチルアミン０．１２６９
ミリモルを加えた。

混合物を室温で１０分間燈拝し、次いで８℃に冷却した
。ジオキサン０．５のと中のィソブチルクロロホルメー
ト０．１３９５ミリモルを加え、そして溶液を２び分間
損拝した。別のフラスコ中において、ＢＳＡＩＯＯ雌を
水１０ｗ‘に溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ９に調節
しそして縄拝しながらジオキサン８の‘をゆっくり加え
た。

溶液を８℃に冷却しそして上記からの保護されたハプテ
ン溶液を加えそして８℃で３０分間蝿拝し、次いでｐＨ
９にて４℃で一夜額拝した。次いで、溶液を酸で処理し
て中性となし、溶媒を除去し、そして残留物を水５の‘
中に入れた（ＮａＯＨを加えて溶解させた）。この溶液
５の‘を、それぞれ６０００肌の０．９ＮＮａＯＨ、０
．１ＮＮａＯＨおよび水（２回）に対して順次に透析し
た。アミンーフロックされた抗原の溶液を取出し、凍結
乾燥させた。実施例８に記載したようにして、ｔーブト
キシカルボニル基をトリフルオロ酢酸で除去した。得ら
れた抗原を蛋白質測定およびＵ．Ｖ．分析によって分析
すると、ＢＳＡＩモル当り６４モルのハプテンが存在す
ることが示された。

このようにして製造された抗原は、適当な動物に注射す
れば、ノルヱピネフリン、ノルメタネフリン、オクトパ
ミンおよびノルフェネフリンを認知する抗体を誘発する
のに有用である。実施例 １０ 免疫化および放血 兎を兎疫にするために、実施例８または実施例９の生成
物のそれぞれ１０の９を燐酸塩緩衝された食塩水１の‘
の中に溶解させ、そして完全フロインド補助液で乳化さ
せた。

第二回目の接種物を３週間後に与えたが、これはＰＢＳ
Ｉの‘中の免疫原１．５の９を完全フロィンド補助液１
泌で乳化させたものである。第一回目のものから５週間
後の第三回目の注射は同じ濃度の抗原を用いたが、ただ
し不完全なフロィンド補助液中のものであった。免疫化
は皮下ルートによって行なった。試験放血は５週間後お
よびその後１ケ月間隔で行なった。

血清３０叫を探り、そして血清を標準技術によって分離
した。分析方法 米国特許第３７０４２８２号に記載されたものと類似の
、競合的結合放射線免疫分析法を使用した。

ｏ．５の【または１．０の‘のいずれかのインキユベー
ション容量を用い、そして抗体ーラベル鏡体を飽和硫酸
アンモニウムでの沈殿により、ラベルされてないものか
ら分離した。分析の条件：（および添加の順序） １ーカテコールアミンｌｎ夕を含有する試料１００しそ
２−適切な斑の０．２Ｍ燐酸塩緩衝液もしくは炭酸塩一
重炭酸塩緩衝液１００〜２００仏夕３−０．１Ｎ沃素（
１２−Ｎａｌ）水溶液、次いで１０％ＮもＳＱ水溶液４
一全インキュベーション容量１泌、０．１Ｍ燐酸塩緩衝
液ｐＨ７．４で容量を定めた（この緩衝液は、酸化の後
に分析のため餌７．４に戻すのに使用した）。

５一０．１Ｍ燐酸塩緩衝液餌７．４中のラベル１００仏
そ（クロラミンＴ法で調製した１１２５ｄｌ−メタネフ
リン、比活性約３０にｉ′のｍｏｌ）６一燐酸塩緩衝さ
れた食塩水（ｐＨ７．４）中の正常兎血清１０％Ｗ′Ｖ
）溶液における抗体の１：４００希釈物１００ｒそ。

培養：４℃にて２時間乃至一夜 抗体ーラベル鍵体の沈殿：飽和硫酸アンモニウム・泌遠
心分離：３０びｐｍ、３０分間、４℃ 吸引：上燈液 計数：ガンマ一計数器により管中でべレツトを直接に計
数する。

ェピネフリン抗体を用いてＲＩＡ法に より測定したヵテコールァミンの量 試料の処理 なし、ＰＨ７．４ ５０〃〃０．１Ｎ１２，４℃，５′ 還元ｗ′／５０〃乙Ｎａ２Ｓ０３１０※ ２００〃ム燐酸塩緩衝液、ｐＨ８．８ （溶液試料を８．６に調節）、５０〃と １２，５′，４℃、還元ｗ′／５０〃とＮａ２Ｓ０３１
００〃乙炭酸塩‐重炭酸塩緩衝液０．１ＭｐＨ９．２，
５０〃ＺＩＮ１２ ，５′，２４℃、還元ｗ／５０〃Ｚ
Ｎａ２Ｓ０３ラベルされた化合物の調製 ヱピネフリン型カテコールアミンを放射線免疫分析する
のに有用な放射線ラベルされたェピネフリン型カテコー
ルアミンは市販されている（ェピネフリン３Ｈ）か、ま
たはたとえば沃素ラベルを導入するためのクロラミンＴ
法のような当分野で周知の方法を用いて調製することが
できる（シネフリンは５１；メタネフリン１２５１；お
よびフエニレフリン泣５１）。

同様に、トリチウムで放射線ラベルしたノルェピネフリ
ン型カテコールアミンは市販されている（ノルエピネフ
リン３日およびノルメタネフリン３Ｈ）か、またはクロ
ラミンＴ法によって調製することができる（ノルメタネ
フリン１２５１；オクトバミン１２５１およびノルフエ
ネフリン１２５１）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ （Ａ） エピネフリン型もしくはノルエピネフリン
   型カテコールアミンに対する特異性を持った抗体を使用
   して試験試料につき免疫分析を行なうことにより、エピ
   ネフリン型もしくはノルエピネフリン型カテコールアミ
   ンの総濃度を決定すること；（Ｂ） 該試験試料の一部
   分を沃素によりｐＨ７．４で処理して該試験試料中に存
   在しうるエピネフリンもしくはノルエピネフリンを該抗
   体で結合されない形態に選択転化せしめ、該部分を過剰
   の亜硫酸塩水溶液で処理して残存しうる沃素を還元せし
   め、得られる溶液のｐＨを該免疫分析に必要とされるｐ
   Ｈに調節し、次いで該得られる溶液について該免疫分析
   を行なうことにより、エピネフリン型カテコールアミン
   については該試験試料中に存在するメタネフリン、シネ
   フリンおよびフエニレフリンの合計量、またはノルエピ
   ネフリン型カテコールアミンについてはノルメタネフリ
   ン、オクトパミンおよびノルフエネフリンの合計量を表
   わすエピネフリン型もしくはノルエピネフリン型カテコ
   ールアミン濃度を決定すること；（Ｃ） 該試験試料の
   第二の部分を沃素によりｐＨ８．６で処理して該試験試
   料中に存在しうるエピネフリンおよびメタネフリンまた
   はノルエピネフリンおよびノルメタネフリンを該抗体で
   結合されない形態に選択転化せしめ、該部分を過剰の亜
   硫酸塩水溶液で処理し、該免疫分析に適するレベルにｐ
   Ｈを調節し、次いで該試験溶液について該免疫分析を行
   なうことにより、該試験試料中に存在するシネフリンお
   よびフエニレフリンの合計量またはオクトパミンおよび
   ノルフエネフリンの合計量を表わすエピネフリン型もし
   くはノルエピネフリン型カテコールアミン濃度を決定す
   ること；および（Ｄ） 該試験試料の第三の部分を沃素
   によりｐＨ９．２で処理して該試験試料中に存在しうる
   エピネフリン、メタネフリンおよびシネフリンまたはノ
   ルエピネフリン、ノルメタネフリンおよびオクトパミン
   を該抗体で結合されない形態に選択転化せしめ、該部分
   を過剰の亜硫酸塩水溶液で処理し、該免疫分析に適する
   レベルにｐＨを調節し、次いで該試験試料について該免
   疫分析を行なうことにより、該試験試料中に存在しるフ
   エニレフリンまたはノルフエネフリンを表わすエピネフ
   リン型もしくはノルエピネフリン型カテコールアミン濃
   度を決定すること；の組合せから成り、上記工程（Ｂ）
   で見出される濃度を工程（Ａ）のそれから差引くことに
   よりエピネフリンまたはノルエピネフリンの濃度を決定
   し、上記工程（Ｃ）で見出される濃度を工程（Ｂ）のそ
   れから差引くことによりメタネフリンまたはノルメタネ
   フリンの濃度を決定し、かつ上記工程（Ｄ）で見出され
   る濃度を工程（Ｃ）のそれから差引くことによりシネフ
   リンまたはオクトパミンの濃度を決定することを特徴と
   する、試験試料中におけるエピネフリン、メタネフリン
   、シネフリンおよびフエニレフリンから選ばれる個々の
   エピネフリン型カテコールアミン、ならびにノルエピネ
   フリン、ノルメタネフリン、オクトパミンおよびノルフ
   エネフリンから選ばれる個々のノルエピネフリン型カテ
   コールアミンを分析する方法。 ２ 工程（Ｂ）および（Ｃ）における沃素化処理のｐＨ
   を燐酸塩緩衝液で維持し、工程（Ｄ）における沃素化処
   理のｐＨを炭酸塩−重炭酸塩緩衝液で維持する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３ 用いる該免疫分析が放射線免疫分析である特許請求
   の範囲第１または２項記載の方法。 ４ エピネフリン、メタネフリン、シネフリンおよびフ
   エニレフリンから選ばれるエピネフリン型カテコールア
   ミンを分析するための特許請求の範囲第１〜３項のいず
   れか１つに記載の方法。 ５ ノルエピネフリン、ノルメタネフリン、オクトパミ
   ンおよびノルフエネフリンから選ばれるノルエピネフリ
   ン型カテコールアミンを分析するための特許請求の範囲
   第１〜３項のいずれか１つに記載の方法。 ６ 非カテコールアミン含有物質、たとえば蛋白質およ
   び酸化反応を阻害しうるその他の化合物、を除去するよ
   うに試料を最初に処理する特許請求の範囲第１〜５項の
   いずれか１つに記載の方法。 ７ 免疫原担体物質に共有結合されたラセミ型４−（２
   −Ｎ−メチルアミノ−ヒドロキシエチル）フエノキシ酢
   酸から成る抗原によって誘発される、エピネフリン型カ
   テコールアミンに特異的な抗体。 ８ 該免疫原担体物質が子牛血清アルブミンである特許
   請求の範囲第７項記載の抗体。 ９ 免疫原担体物質に共有結合されたラセミ型４−（２
   −アミノ−１−ヒドロキシエチル）フエノキシ酢酸から
   成る抗原によって誘発される、ノルエピネフリン型カテ
   コールアミンに特異的な抗体。 １０ 該免疫原担体物質が子牛血清アルブミンである特
   許請求の範囲第９項記載の抗体。