JPS62211556A - ノルメタネフリンの免疫学的測定方法およびそれに用いる試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血中あるいは尿中のノルメタネフリンを免疫学
的方法により測定する方法およびそれに用いる試薬に関
する。さらに詳しくはノルメタネフリンに対する特異抗
体及び標識剤により標識されている標識オクトパミンを
用いることを特徴とするノルメタネフリンの測定方法及
びそれに用いる測定用試薬に関するものである。

交感神経および副腎髄質系の細胞は血中からチロシンを
取り込み、ドーパ、ドーパミン、ノルアドレナリン、ア
ドレナリンの順に合成する。ドーパミン、ノルアドレナ
リン、アドレナリンはカテコールアミンと総称され、ヒ
トでは主に脳、交感神経ならびに副腎髄質などに分布し
、ノルアドレナリンは神経刺激伝達物質として、アドレ
ナリンは副腎髄質ホルモンとして重要な役割を演じてい
る。カテコールアミンの測定は主に交感神経・副腎髄質
由来の腫瘍、すなわち褐色細胞腫や交感神経芽細胞腫の
診断、治療効果の判定、さらには高血圧の病因解明に有
用と考えられるが、その分泌量は必ずしも多くはなく、
代謝が速やかで、変動中も大であるため、また、測定法
の問題もあシ、実用的な測定法は確立されていない。す
なわち、螢光測定法、高速液体クロマトグラフィー法、
酵素アイソトープ法あるいはラジオレセプターアッセイ
などが試みられているが、その操作の煩雑さ、感度の低
さなどから実用化には至っていない。

また一般に微量物質の測定法としてラジオイムノアッセ
イなどの免疫学的測定法が繁用され、臨床面においても
広く利用されているが、ノルアドレナリンおよびアドレ
ナリンに対する特異抗体が得られず、これらのカテコー
ルアミンの免疫学的測定法は確立されていない。

近年、これらカテコールアミンの代謝産物であるノルメ
タネフリン、メタネ７リンを測定することは生体内、特
に血中内でのカテコールアミンの代謝等を知る上に有用
でおると考えられ、ノルメタネフリン、メタネフリンの
６１１定によシ交感神経・副腎髄質の機能を判定しよう
とする試みがなされている。脳・交感神経、副腎髄質で
生合成、分泌されたノルアドレナリン、アドレナリンは
、神経終末や標的細胞内でカテコール−０−メチル転換
酵素（ＣＯＭＴ）によってメチル化さね１．中間代謝産
物であるノルメタネフリン、メタネ７リンとなり、さら
にモノアミン酸化酵素（ＭＡＯ）による酸化的膜アミン
反応によってバニルマンデル酸になる。血中に分泌され
九ノルアドレナリン、アドレナリンのうち約１％はその
ままの形で、約８％−Ｉ）ｉ　ＣＯＭＴの作用のみを受
けたノルメタネフリン、メタネフリンの形で、そして残
シの約９１％がバニルマンデル酸の形で尿中に排泄され
る。血中、および、尿中のノルメタネフリン、メタネフ
リンの測定法としては比色法、螢光法、ガスクロマトグ
ラフィー・マススペクトロメトリー法、および、高速液
体クロマトグラフィー法などが挙げられるが、いずれの
方法も検体の前処理が煩雑で測定に長時間を要するなど
の問題があシ、臨床応用上広く普及することが困難であ
った。さらに、ラジオイムノアッセイについても報告さ
れているがノルメタネフリン、メタネフリンが酸化剤に
対して不安定でアシ、そのヨウ素による標識が不可能で
あるため標識剤としてトリチウムを用いている。トリチ
ウムによる標識は手技が煩雑であシ、さらにその放射能
量を測定するためにはシンチレーションカウンターによ
らなければならない等の欠点があり、実用的なラジオイ
ムノアッセイとは言い鐵く研究者レベルでの実施に限ら
れている。そのため、臨床的に用いることができる前処
理を必要としない、操作の簡便な特異性、感度に優れた
測定法の開発が望まれていた。

本発明者等はオクトパミンが抗−ノルメタネフリン抗体
に対して、３〜７−程度の交叉反応性を示すに過ぎない
のに対し、オクトパミンを標識剤により標識して得た標
識オクトパミンは、抗−ノルメタネフリン抗体に対して
ほぼ１００チの交叉性を示すという知見を得、本発明を
完成するに至ったものである。

すなわち、本発明は特異性の高い抗−ノルメタネフリン
抗体および標識オクトパミンを用いることにより、血清
、血漿、尿等の中のノルメタネフリンを直接測定するこ
とのできる免疫学的測定方法を提供するものである１、 本発明は従来の測定法のよりな煩雑な前処理を必要とせ
ず、簡便性、多数検体を同時に処理できる点で優れてい
ると共に、％異性、感度の点においても優れている。

本発明によるノルメタネフリンの測定はノルメタネフリ
ンに対する特異抗体に対して、被検検体中のノルメタネ
フリンと標識オクトパミンとを競合反応させた後、抗−
ノルメタネフリン抗体に結合１〜た標識オクトパミン（
Ｂ）と結合していない標識オクトパミン（Ｆ）とを適当
な方法で分離（Ｂ／Ｆ分離）シ、分画の一方または両者
の８！識剤の活性を測定し、あらかじめ被検検体の代わ
りに濃度既知の標準物質で同様にして求めた標準曲線よ
り被検検体中のノルメタネ７９ンの量を求めるものであ
る。

ノルメタネフリンに対する特異性の高い抗体は、ノルメ
タネフリンにマンニッヒ反応によシ牛血清アルブミン（
Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ　：　Ｂ　
Ｓ　Ａ　）を結合させたものを免疫原として用いること
によシ得ることができた。

免疫動物としてはヒト以外の動物、例えば、家兎、山羊
、馬、ニワトリ、羊、ラットなどを用いることができる
。

標識オクトパミンは通常用いられている既知の方法によ
シ得ることができ、オクトパミン、つ−１シ、式標識剤
が結合したものである。標識剤が３位または５位の一方
だけに結合したもの（モノ−標識型）と、３位および５
位の両方に結合したもの（ジー標識型）とで、抗−ノル
メタネフリン抗体に対する反応性において差は見られな
かったが、標識オクトパミンとしての安定性において、
モノー標識屋が優れているため、標識オクトパミンとし
てモノ−標識型を用いることが望ましい。しかしジー標
識型、あるいは、モノー標ａ型とジー標識屋との混合物
を標識オクトパミンとして用いることもできる。標識剤
としては放射性同位元素、酵素、螢光物質あるいは発光
物質など標識剤として通常用いられているものを使用す
ることができる。

Ｂ／Ｆ分離は、ＰＥＧ法、二抗体法、固相法など既知の
方法によシ行うことができる。

被検検体としては、血清、血漿、尿などを用いることが
できる。

尿中ノルメタネフリンの測定は、−日蓄尿したものを被
検検体として用いることが望ましいが、クレアチニンを
ノルメタネフリンと同時に測定することによシ、一時尿
からノルメタネフリンの一日の排泄量を算出することも
可能である。

本発明による尿中あるいは血中のノルメタネフリンの測
定は、褐色細胞腫の診断、さらには、高血圧の病因解明
に有用である。

次に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明
の本質は標識剤により標識したオクトパミンを用いる点
にあ石のであって、以下の実施例によシ限定されるもの
ではない。

実施例１ ノルメタネフリンに対する抗血清の作製１−（１）　　
ノルメタネフリンへの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の結
合 ノルメタネフリン溶液（５ｙ／ｍｊ）２−に、ＢＳＡ（
１７１Ｎ！／ｄ　）　３−を加え攪拌した。さらに、３
Ｍ酢酸ナトリウム２ｒｎｔ及び７．５％ホルマリン２１
１Ｉｔを加え、３Ｎ塩酸によＦ）ｐＨを６〜６．５に調
整した後、遮光しながら約２０時間攪拌した。反応液を
精製水に対して十分透析し、内液をノルメタネフリンー
ＢＳＡ結合物として免疫に使用した。

１−（２）　　ノルメタネフリンーＢＳＡ結合物による
家兎の免疫 ノルメタネフリンーＢＳＡ結合物溶液（ノルメタネフリ
ン１１１１！７相当）２ｍｌを生理食塩水２−と混合し
た後、フロイント・コンプリート・アジュバント４−を
加えエマルジョンとした。このエマルジョンを２週間間
隔て家兎に５回注射した。最後の注射の２週間後に全採
血した抗血清を得た。

実施例２ １２５■によるオクトパミンの標識 的１ｍＣ１のＮａ１２５１を反応用試験管に採取し、０
．５　Ｍリン酸緩衝液２５μｔとオクトパミン（１η／
ｍｌ　）　１０μｔを加え、ｐＨが７〜８であることを
確認した後、クロラミンＴ　（１’Ｑ／ａｔ　）　２５
μｔをさらに加えて反応を行った。

反応後ピロ亜硫酸す）　ＩＪウム溶液（１ｗ９／ｍｅ）
１００μｔを加え、反応を停止させた。キャリアとして
ヨウ化カリウムを加えた後、１Ｎ！Ｒを行った。

Ｍ製は、あらかじめ！Ｗ製水で平衡化した陽イオン交換
体ＣＭ−セルロースに反応液を導入し、精製水で未反応
のヨウ素（１２５工）を溶出させた。その後０．　Ｉ　
Ｎ塩酸によりヨウ化オクトパミン（１２５工）を溶出さ
せた。

実施例３ ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）によるオクトハミンの標識 オクトパミン漕液（５ｖ／ゴ）２ゴにＰＯＤ（１５■／
ｍｔ）：３１Ｗｔを加え攪拌を行い、さらに３Ｍ酢酸ナ
トリウム２−および７．５％ホルマリン２ｄを加え、３
Ｎ塩酸によりｐＨを６．０〜６，５に調整した後、遮光
しながら約２０時間攪拌した。反応液を精製水に対して
十分透析し、内液をセファデックスＧ−２５でゲル濾過
し、ノルメタネフリンーＰＯＤ結合物として希釈後、エ
ンザイムノムノアツセイ用のトレーサとして使用した。

゛実施例４ 抗−家兎ＩｇＧ抗血抗血束２抗体）の作製家兎ｒ−グロ
ブリン１１１１９を生理食塩水２ｍｌに溶かし７０イン
ド・コンプリート・アジュバント２ｍｌを加えエマルジ
ョンとした。このエマルジョンを２週間間隔でヤギに５
回注射した。最後の注射の２週間後に全採血し抗血清を
得た。

実施例５ ラジオイムノアッセイ（二抗体法）による尿中ノルメタ
ネフリンの測定 濃度既知のノルメタネフリン標準液１００７！ｔまたは
酸性蓄尿を加水分解後中和した尿検体１００μｔに１２
５Ｉ標識オクトパミン１００μを及び抗−ノルメタネフ
リン抗体１００μｔを加え２−８℃で１時間インキュベ
ーション後、抗−家兎１ｇＧ抗血清１００μｔを加え、
２−８℃で１時間インキュベーションした。インキュベ
ーション終了後２−８℃で３００Ｏｒｐｍ、３０分間遠
心分離した後、デカンテーションし、沈殿の放射能を測
定した。

実施例６ ラジオイムノアッセイ（二抗体法）による血中ノルメタ
ネフリンの測定 濃度既知のフルメタネ７リン標準液１００μｍＸまたは
血清１００μｔに１２５■標識オクトパミン１００μｔ
１抗−ノルメタネフリン抗体１００μを及び抗−家兎Ｉ
ｇＧ抗血清１００μｔを加え、２−８℃で４時間インキ
ュベーションシタ。インキュベーション終了後２−８℃
で３００゜ｒｐｍ、ｊＯ分間遠心分離した後、デカンテ
ーションし、沈殿の放射能を測定した。

笑施例７ フルオレツセによるオクトハミンの標識オクトパミン溶
液（５■／ｍｌ　）　２　ｍｌに、フルオレツセインア
ミン（０，５’１１７７ｍ１　）　３　ｍｌを加え攪拌
した。さらに、３Ｍ酢酸ナトリウム２−および７．５％
ホルマリン２ｍ１ｔ加え、３Ｎ塩酸によシｐＨを６．０
〜６．５に調整した後、遮光しながら約４０時間攪拌し
た。反応液を梢裂水に対して十分透析し、内液をセファ
デックスＧ−２５でゲル濾過し、フルオレツセインーオ
クトパミン結合物として適当な濃度に希釈後、螢光イム
ノアッセイあるいは螢光偏光イムノアッセイ用のトレー
サとして使用した。

【図面の簡単な説明】

第４図は濃度既知のノルメタネ７９ン標準液を用いて作
成した標準曲線の１例を示したものである。 第２図は３種類のノルメタネフリン含有血漿をそれぞれ
倍々希釈して求めた希釈曲線を示したものである。 第３図は本発明の方法により測定した尿中ノルメタネフ
リン濃度を示したものである。 第４図は本発明の方法により測定した血中ノルメタネフ
リン濃度を示したものである。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）被検試料中のノルメタネフリンを測定する方法に
   おいて、標識剤により標識されている標識オクトパミン
   及び抗−ノルメタネフリン抗体を用いることを特徴とす
   るノルメタネフリンの免疫学的測定方法。
2. （２）標識剤が放射性同位元素、酵素、螢光物質あるい
   は発光物質である特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）放射性同位元素が＾１＾２＾５Ｉである特許請求
   の範囲第２項に記載の方法。
4. （４）被検試料が血清、血漿、又は尿である特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。
5. （５）標識剤により標識されている標識オクトパミンお
   よび抗−ノルメタネフリン抗体を含むことを特徴とする
   ノルメタネフリンの免疫学的測定用試薬。
6. （６）標識剤が放射性同位元素、酵素、螢光物質あるい
   は発光物質である特許請求の範囲第５項に記載の試薬。
7. （７）放射性同位元素が＾１＾２＾５Ｉである特許請求
   の範囲第６項に記載の試薬。