JPS60365A - 妊娠特異蛋白測定用試薬 - Google Patents
妊娠特異蛋白測定用試薬Info
- Publication number
- JPS60365A JPS60365A JP58108391A JP10839183A JPS60365A JP S60365 A JPS60365 A JP S60365A JP 58108391 A JP58108391 A JP 58108391A JP 10839183 A JP10839183 A JP 10839183A JP S60365 A JPS60365 A JP S60365A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- spi
- human
- red blood
- blood cells
- antibody
- Prior art date
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- Pending
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、多数の被検液中の妊娠特異蛋白(以下SPI
)の抗体を迅速かつ正確に定量することが可能な抗ヒ
ト妊娠特異蛋白抗体測定試薬に関する。
)の抗体を迅速かつ正確に定量することが可能な抗ヒ
ト妊娠特異蛋白抗体測定試薬に関する。
SPIは、妊婦血清中に特異的に出現する糖蛋白として
、1971年西トイ゛八ベーへングヴエルケ(ヘキスト
社)のボーン(H,Bohnn )が発見した(^rc
h、 Gyn、ik、、 210.410.1971)
。
、1971年西トイ゛八ベーへングヴエルケ(ヘキスト
社)のボーン(H,Bohnn )が発見した(^rc
h、 Gyn、ik、、 210.410.1971)
。
このものは、その血清濃度が胎盤機能や胎児発育酸の指
標になりうるとして注目され、また抗ヒトSP1抗体は
不妊症の診断薬になるものとして注目されている。
標になりうるとして注目され、また抗ヒトSP1抗体は
不妊症の診断薬になるものとして注目されている。
本発明の目的は多数の被検体について迅速かつ正確に抗
SPI抗体を測定できる測定試薬を提供することである
。
SPI抗体を測定できる測定試薬を提供することである
。
本発明は、ヒ)SPIを動物赤血球に感作して得たヒ)
SPI感作赤血球を含む受身赤血球凝集反応用抗ヒトS
P1抗体測定試薬に関する。
SPI感作赤血球を含む受身赤血球凝集反応用抗ヒトS
P1抗体測定試薬に関する。
本発明に係る測定試薬は、各試薬をキット化しておくこ
とが便宜的であるので、以下キット化されたものを例と
して本発明を説明する。
とが便宜的であるので、以下キット化されたものを例と
して本発明を説明する。
本発明試薬をキット化した場合、次のごとき各試薬にて
構成される。即ち、(イ)SPIを動物赤血球に感作し
て得たヒ)SPI感作赤血球(以下、感作赤血球という
。)、(ロ)測定用緩衝液、(ハ)標準ヒト血漿陽性コ
ントロール(以下、陽性コントロールという)及び(ニ
)標準ヒト血漿陰性コントロール(以下、陰性コントロ
ールという。)の組合せにて当該キットは構成される。
構成される。即ち、(イ)SPIを動物赤血球に感作し
て得たヒ)SPI感作赤血球(以下、感作赤血球という
。)、(ロ)測定用緩衝液、(ハ)標準ヒト血漿陽性コ
ントロール(以下、陽性コントロールという)及び(ニ
)標準ヒト血漿陰性コントロール(以下、陰性コントロ
ールという。)の組合せにて当該キットは構成される。
感作赤血球は、ヒ)SPIを動物赤血球に感作さ廿た感
作赤血球がその本体をなす。ヒl−3PIは、たとえば
参考例のごとくして精製されたものが用いられる。
作赤血球がその本体をなす。ヒl−3PIは、たとえば
参考例のごとくして精製されたものが用いられる。
ヒトSP1を感作させる赤血球は、特に動物を選ぶ必要
ばないが、安定でしかも感度の高い試薬を作るためには
、ヒツジ、ニワトリ、ヒトの0型赤血球などが望ましい
。赤血球は生理食塩水で十分洗浄した後、グルクール・
アルデヒド、ホルマリンなどの処理で安定化させる。こ
のような赤血球としては5〜15μm程度のものがよい
。精製SPIでこれらの赤血球を感作するのは公知〔医
学のあゆみ、78.759 (1970))の方法で実
施することができる。それには、赤血球とSPlとを緩
衝液中で感作させるのがよく、一般には赤血球浮遊液と
SPI含有液を混合することによりおこなう。
ばないが、安定でしかも感度の高い試薬を作るためには
、ヒツジ、ニワトリ、ヒトの0型赤血球などが望ましい
。赤血球は生理食塩水で十分洗浄した後、グルクール・
アルデヒド、ホルマリンなどの処理で安定化させる。こ
のような赤血球としては5〜15μm程度のものがよい
。精製SPIでこれらの赤血球を感作するのは公知〔医
学のあゆみ、78.759 (1970))の方法で実
施することができる。それには、赤血球とSPlとを緩
衝液中で感作させるのがよく、一般には赤血球浮遊液と
SPI含有液を混合することによりおこなう。
本操作は1. p l−16,8〜B、5 、温度20
〜60℃で行なうのがよい。感作赤血球は凍結乾燥して
、たとえばバイアル中に好ましくはナトリウムアジドな
どのごとき保存剤を添加して、封入しておくことが好ま
しい。
〜60℃で行なうのがよい。感作赤血球は凍結乾燥して
、たとえばバイアル中に好ましくはナトリウムアジドな
どのごとき保存剤を添加して、封入しておくことが好ま
しい。
本発明に関する陽性コントロールは、標準検量線を作成
するために用いられるものであり、通雷は抗S l)
1抗体含有の凍結乾燥品よりなるものである。かかる抗
SPI抗体としては、高度に精製された免疫用5I)1
(参考例1参照)を動物に免疫し、得られる抗血清より
Ii製することによって製造される。当該抗血清の製造
は公知の方法にて行えばよく、例えばよく、高度精製ヒ
トSPIとソロインドの完全アジュバントの混合乳液を
作り、動物の皮肉に5〜6回注射し、数週間後採血を行
い室温で凝固せしめた後、4℃で一夜放置後、3000
rpm 20分間の遠心分離により当該抗血清が得られ
る。免疫に用いる動物によっC、ヒトSP1に対する抗
体産生能力が異なることから、感受性の高い動物群、例
えば、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ウマ等
を選ぶことが経済的に有利である。当該抗血清の精製は
、たとえば、文献J、八m、Chem、 Soc、、
62.3386 (1940) ; Fed。
するために用いられるものであり、通雷は抗S l)
1抗体含有の凍結乾燥品よりなるものである。かかる抗
SPI抗体としては、高度に精製された免疫用5I)1
(参考例1参照)を動物に免疫し、得られる抗血清より
Ii製することによって製造される。当該抗血清の製造
は公知の方法にて行えばよく、例えばよく、高度精製ヒ
トSPIとソロインドの完全アジュバントの混合乳液を
作り、動物の皮肉に5〜6回注射し、数週間後採血を行
い室温で凝固せしめた後、4℃で一夜放置後、3000
rpm 20分間の遠心分離により当該抗血清が得られ
る。免疫に用いる動物によっC、ヒトSP1に対する抗
体産生能力が異なることから、感受性の高い動物群、例
えば、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ウマ等
を選ぶことが経済的に有利である。当該抗血清の精製は
、たとえば、文献J、八m、Chem、 Soc、、
62.3386 (1940) ; Fed。
Rroc、、17.1110 (195B)に記載の方
法にて行われる。抗SPI抗体は緩衝液に熔解して使用
され、この際、例えば5〜50 ng/m lとなるよ
うに4〜6濃度段階まで小分けして標準検量線の作成に
使用される。
法にて行われる。抗SPI抗体は緩衝液に熔解して使用
され、この際、例えば5〜50 ng/m lとなるよ
うに4〜6濃度段階まで小分けして標準検量線の作成に
使用される。
陽性コントロールは、例えばバイアル中に、好ましくは
、ナトリウムアジドなどの保存剤を添加して封入てしお
く。
、ナトリウムアジドなどの保存剤を添加して封入てしお
く。
陰性コントロールは、ヒト抗SPI抗体及びヒ1−3P
Iが共に陰性の液体(例えば男子血清、生理食塩など)
よりなり、例えばバイアル中にミ好ましくは、ナトリウ
ムアジドなどの保存剤を添加して、封入しておくことが
好ましい。
Iが共に陰性の液体(例えば男子血清、生理食塩など)
よりなり、例えばバイアル中にミ好ましくは、ナトリウ
ムアジドなどの保存剤を添加して、封入しておくことが
好ましい。
酵素活性測定用緩衝液は、感作赤血球、陽性コントロー
ル、陰性コントロールを希釈するために用いられるもの
であり、例えばリン酸m街液よりなり、非特異的反応の
生じるのを防止するために、例えばストローマ、動物血
清などを添加してもよい。また、例えばナトリウムアジ
ドなどの保存剤を添加しておくことが好ましい。
ル、陰性コントロールを希釈するために用いられるもの
であり、例えばリン酸m街液よりなり、非特異的反応の
生じるのを防止するために、例えばストローマ、動物血
清などを添加してもよい。また、例えばナトリウムアジ
ドなどの保存剤を添加しておくことが好ましい。
実施例 1
ヒツジ赤血球をリン酸B街液で充分に洗浄後、ゲルター
ルアルデヒドを終濃度0.5%w / vに添加し゛C
約1時間室温処理し、0.0175Mリン酸緩衝液(p
t16.3 )でゲルタールアルデヒドを除い°ζ固定
化赤血球を(りた。5%w/v固定化赤血球の懸濁液と
等量の参考例の精製ヒトS P 1 (E2UOnmで
0.OL程度)を混合し、pJI7.2でタンニン酸5
〜300tcg/diを添加、攪拌後、4℃で一夜放置
して感作しヒトSPI感作赤血球を11また。そし゛ζ
充分に同上リン酸緩衝液で洗浄した。この感作血球を分
注してから凍結乾燥して試薬を得た。
ルアルデヒドを終濃度0.5%w / vに添加し゛C
約1時間室温処理し、0.0175Mリン酸緩衝液(p
t16.3 )でゲルタールアルデヒドを除い°ζ固定
化赤血球を(りた。5%w/v固定化赤血球の懸濁液と
等量の参考例の精製ヒトS P 1 (E2UOnmで
0.OL程度)を混合し、pJI7.2でタンニン酸5
〜300tcg/diを添加、攪拌後、4℃で一夜放置
して感作しヒトSPI感作赤血球を11また。そし゛ζ
充分に同上リン酸緩衝液で洗浄した。この感作血球を分
注してから凍結乾燥して試薬を得た。
凍結乾燥後のヒ)SPI感作赤血球を動物血清を含有す
る塩化ナトリウム含有等張化リンrl!を緩衝液(pH
7,2)に2%以上のヒツジ赤血球ストローマを含むリ
ン酸緩衝液で0.5%に開整熔tts L、抗ヒ) S
J) 1抗体に対する凝集反応をマイクロプレート法
で測定した。検体中に含有せる抗ヒ) S l’ 1抗
体量の5ng/mlまでの測定が可能であった。
る塩化ナトリウム含有等張化リンrl!を緩衝液(pH
7,2)に2%以上のヒツジ赤血球ストローマを含むリ
ン酸緩衝液で0.5%に開整熔tts L、抗ヒ) S
J) 1抗体に対する凝集反応をマイクロプレート法
で測定した。検体中に含有せる抗ヒ) S l’ 1抗
体量の5ng/mlまでの測定が可能であった。
実施例 2 キットの構成
抗ヒトS )) l抗体測定用キットに含まれている試
薬類は、次の5種である。
薬類は、次の5種である。
■ ヒトSPI感作ヒツジ赤血球:
1バイアルの内容物は、乾燥感作ヒツジ赤血球および保
存剤で■のリン酸緩衝液(P B S)の5mlをこれ
に加えて懸濁させるとき、0.5%(w/ν)赤血球浮
遊液が得られる。保存剤としてすトリウムアジドIIT
1gが添加されている。
存剤で■のリン酸緩衝液(P B S)の5mlをこれ
に加えて懸濁させるとき、0.5%(w/ν)赤血球浮
遊液が得られる。保存剤としてすトリウムアジドIIT
1gが添加されている。
■ 抗ヒl−S P 1抗体陽性コントロール:1バイ
アル中、除菌濾過した抗ヒ)SPI抗体抗体1壱l有す
る。本溶液のPHA法による抗ヒトSPI抗体量は1:
64以上である。保存剤としてナトリウムアジド1■(
0,1%)が添加されている。
アル中、除菌濾過した抗ヒ)SPI抗体抗体1壱l有す
る。本溶液のPHA法による抗ヒトSPI抗体量は1:
64以上である。保存剤としてナトリウムアジド1■(
0,1%)が添加されている。
■ 陰性コントロール
1バイアル中、除菌濾過した抗ヒ)SPI抗体ならびに
ヒトSPIが共に陰性のヒト(男子)血清または生理食
塩液1mlを含有する。保存剤としてすトリウムアジ1
−1■(0,1%)が添加されている。
ヒトSPIが共に陰性のヒト(男子)血清または生理食
塩液1mlを含有する。保存剤としてすトリウムアジ1
−1■(0,1%)が添加されている。
■ リン酸緩衝液:
1バイアル中、除菌濾過した塩化すトリウム加等張リン
酸緩衝?&、pH7,2(P B S) 50 mlを
含有する。、PBSには、試験に際して非特異反応の生
じるのを防止するため、可溶化ストローマおよび動物血
清を配合している。
酸緩衝?&、pH7,2(P B S) 50 mlを
含有する。、PBSには、試験に際して非特異反応の生
じるのを防止するため、可溶化ストローマおよび動物血
清を配合している。
組成(50m+r)中
リン酸二すI・リウム(無水) 395nwリン酸−カ
リウム 155曙 塩化ナトリウム 225+T1g ストローマ 3 % 動物血清 1 % ナトリウムアジド 501町 pH7,2 リン酸緩衝液の10m1はヒトSPI感作ヒッソ赤血球
の懸濁用に用いられ、残りは被験液の希釈に用いる。保
存剤としてナトリウムアジドI■(0,1%)を加えて
おくことが好ましい。
リウム 155曙 塩化ナトリウム 225+T1g ストローマ 3 % 動物血清 1 % ナトリウムアジド 501町 pH7,2 リン酸緩衝液の10m1はヒトSPI感作ヒッソ赤血球
の懸濁用に用いられ、残りは被験液の希釈に用いる。保
存剤としてナトリウムアジドI■(0,1%)を加えて
おくことが好ましい。
■ 特異性判定のための確認試薬:
lバイアル中、除菌濾過した精製しト5))l(P L
i A価で1:512以上)を含む凍結乾燥品である。
i A価で1:512以上)を含む凍結乾燥品である。
これを生理食塩水の5mlで溶解する。
実施例 3
実施例2に示した試薬を用いて定量試験を次の通り実施
した。
した。
■ l: トSPI感作ヒツジ赤血球を、lバイアルあ
たりリン酸緩衝液5mlに懸濁する。
たりリン酸緩衝液5mlに懸濁する。
■ U−フレートの各穴に、dropperでリン酸緩
衝液をそれぞれ25μmずっ入れる。
衝液をそれぞれ25μmずっ入れる。
■ dropperにより、4夕IJの穴に被験液各2
5μmずつをいれる。A列の混液をdiluterでB
列へ移し、更にB列よりC列へ移し、次々と順次移して
3列までこれを行なう。これにより被験液は、2倍段階
希釈されており、3列の希釈倍数は1024倍となって
いる。
5μmずつをいれる。A列の混液をdiluterでB
列へ移し、更にB列よりC列へ移し、次々と順次移して
3列までこれを行なう。これにより被験液は、2倍段階
希釈されており、3列の希釈倍数は1024倍となって
いる。
■ 別に被験液の代わりに、陽性コントロールについて
も、同様にして希釈系列をつくる。
も、同様にして希釈系列をつくる。
■ dropperを用い、すべての穴にヒ)SPIg
作ヒツジ赤血球のリン酸緩衝液懸濁液を25μlずつ加
える。
作ヒツジ赤血球のリン酸緩衝液懸濁液を25μlずつ加
える。
■ プレートは% mlcromlXerで約10秒間
振盪後、室温で2時間インキュベートする。
振盪後、室温で2時間インキュベートする。
■ コントロールの観察:
陽性コントロールについては、通* 64倍希釈以上で
凝集を認める。陰性コントロールは、A−Jのすべてに
おいて穴の底に赤血球の沈降物を認める(測定が良好な
場合、陰性象は小さく明瞭である)。
凝集を認める。陰性コントロールは、A−Jのすべてに
おいて穴の底に赤血球の沈降物を認める(測定が良好な
場合、陰性象は小さく明瞭である)。
■ 試験結果
被験液につき、陰性コントロールと比較して凝集像をみ
とめる最高希釈倍数をもって抗ヒl−S I) 1抗体
とした。
とめる最高希釈倍数をもって抗ヒl−S I) 1抗体
とした。
実験例
実験例1により得られた抗SPI抗体検出用PHA試薬
を用いて以下の被験サンプルを検査するとき高感度で抗
SPI抗体が検出されることが判った。
を用いて以下の被験サンプルを検査するとき高感度で抗
SPI抗体が検出されることが判った。
男性由来の血清/血漿(1540体)
・・・抗SPI抗体(検出されず)
上記+抗S l) 1抗体の各濃度のもの・・・抗SP
I抗体(5ng/ ml)以上にて検出可能 参考例 SPIの製法 ヒI・胎盤抽出液400ρ〔ヒト胎盤(平均重量600
g/個)、約420個のミンチを生理食塩液で懸濁し
たもの〕を、IN塩酸でpH4,8に調整し、3〜4日
間静置させた後、不要なムコイド画分、ヘム画分を遠心
分離(3000rpm X 15分)で除去した。その
上清に硫酸アンモニウムを加えて(pH7,0で)5%
飽和にし、生じる沈殿を遠心分離で分離除去し、得られ
た上滑に更に硫酸アンモニウムを加えることにより硫酸
アンモニウム飽和60%とした。得られた沈殿を0.0
2Mリン酸緩衝液(p)16.8 )に熔解し、同緩衝
液で透析した後、その透析内液をセファデックスG−1
50(ファルマシア社製)カラムにアプライし、分子量
マーカーをもちいて、分子量8〜12万ダルトンの両分
を分取した。更にこの両分を非妊娠性正常ヒト血漿抗体
(ウサギ)−セファロースのカラムにアプライして、S
Pl溶出させた。得られた未吸着画分を硫酸アンモニウ
ム40%飽和により濃縮し、次いで同上の緩衝液で透析
した後、凍結乾燥し乾燥粉末のSP180gをえた。こ
のSPIは、要すれば更に高速液体クロマトグラフィー
またはクロマトフオーカシングのような電気泳動法によ
って高度精製され動物への免疫用抗原とすることができ
る。
I抗体(5ng/ ml)以上にて検出可能 参考例 SPIの製法 ヒI・胎盤抽出液400ρ〔ヒト胎盤(平均重量600
g/個)、約420個のミンチを生理食塩液で懸濁し
たもの〕を、IN塩酸でpH4,8に調整し、3〜4日
間静置させた後、不要なムコイド画分、ヘム画分を遠心
分離(3000rpm X 15分)で除去した。その
上清に硫酸アンモニウムを加えて(pH7,0で)5%
飽和にし、生じる沈殿を遠心分離で分離除去し、得られ
た上滑に更に硫酸アンモニウムを加えることにより硫酸
アンモニウム飽和60%とした。得られた沈殿を0.0
2Mリン酸緩衝液(p)16.8 )に熔解し、同緩衝
液で透析した後、その透析内液をセファデックスG−1
50(ファルマシア社製)カラムにアプライし、分子量
マーカーをもちいて、分子量8〜12万ダルトンの両分
を分取した。更にこの両分を非妊娠性正常ヒト血漿抗体
(ウサギ)−セファロースのカラムにアプライして、S
Pl溶出させた。得られた未吸着画分を硫酸アンモニウ
ム40%飽和により濃縮し、次いで同上の緩衝液で透析
した後、凍結乾燥し乾燥粉末のSP180gをえた。こ
のSPIは、要すれば更に高速液体クロマトグラフィー
またはクロマトフオーカシングのような電気泳動法によ
って高度精製され動物への免疫用抗原とすることができ
る。
特許出願人 株式会社 ミドリ十字
手続補正書印釦
昭和58年8月S日
1、事件の表示
昭和58年特許願第108391号
2、発明の名称
妊娠特異蛋白測定用試薬
3、補正をする者
事件との関係 特許出願人
氏名(名称) 株式会社 ミドリ十字
4、代理人
■541
住 所 大阪市東区平野町4丁目53の3ニユ一ライフ
平野町406号 電話(06) 227−1156 7、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 (1)明細書第4頁、第9行の「例えば」の次の「よく
」を削除する。
平野町406号 電話(06) 227−1156 7、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 (1)明細書第4頁、第9行の「例えば」の次の「よく
」を削除する。
(2)同書第5頁、第7行の「封入てしおく」を「封入
しておく」に訂正する。
しておく」に訂正する。
(3)同書第5頁、第10頁の「生理食塩」の次に「液
」を加入する。
」を加入する。
(4)同書第9頁、第7行の「フレート」を「プレート
」に訂正する。
」に訂正する。
Claims (1)
- ヒト妊娠特異蛋白を動物赤血球に感作して得たヒト妊娠
特異蛋白感作赤血球を含むことを特徴とする受身赤血球
凝集反応用抗ヒト妊娠特異蛋白抗体測定用試薬
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58108391A JPS60365A (ja) | 1983-06-16 | 1983-06-16 | 妊娠特異蛋白測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58108391A JPS60365A (ja) | 1983-06-16 | 1983-06-16 | 妊娠特異蛋白測定用試薬 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60365A true JPS60365A (ja) | 1985-01-05 |
Family
ID=14483569
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58108391A Pending JPS60365A (ja) | 1983-06-16 | 1983-06-16 | 妊娠特異蛋白測定用試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60365A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010142953A1 (en) | 2009-06-09 | 2010-12-16 | Haydale Limited | Methods and apparatus for particle processing with plasma |
-
1983
- 1983-06-16 JP JP58108391A patent/JPS60365A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010142953A1 (en) | 2009-06-09 | 2010-12-16 | Haydale Limited | Methods and apparatus for particle processing with plasma |
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