JPS6024120B2 - 新規なソマスタチン同族体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なべプチド及びその製造方法に関し、さら
に詳しくは、生長ホルモン分泌抑制作用を有する新規な
ソマトスタチン同族体及びその合成法に関する。 ソマトスタチン（ｓｏｍａのｓｔａｔｉｎ）は脳下垂体
視床下部抽出物中に発見されたポリベプチドで、下記式
で示される構造を有し、生長ホルモン及びグルカゴン等
の分泌を抑制する作用をもち、末端肥大症、糖尿病等の
治療に有効であることが知られている。 本発明者らは、上記式（０）のソマトスタチンの同族体
及び合成法につき種々研究を行なっている間に、１１位
ぬフェニルァラニル基（Ｐｈｅ）をチロシル基（Ｔｙｒ
）と入れ替えたポリベプチドも同様に優れた生長ホルモ
ン、グルカゴン及び胃酸の分泌抑制作用を有しており、
しかもラジオィムノアッセイ用の標識された抗原として
適していることを見し、出し、本発明に到達したのであ
る。 かくして、本発明によれば構造式〔式中、Ｙは水素原子
、アミノ保護基又はアシル基を表わし：Ｃｙｓはシステ
ィニル基、Ｌ＄はリジル基、Ａｓｎはアスパラギニル基
、Ｐｈｅはフェニルアラニル基、Ｔｒｐはトリプトフィ
ル基、Ｔｈてはスレオニル基、Ｔｙｒはチロシル基、Ｓ
ｅｒ‘まセリル基をそれぞれ表わし；ｂは水素原子又は
Ｓ−保護基を表わし；ｐは水素原子又は側鎖Ｎ−保護基
を表わし；ｑは水素原子又はアルコール性水酸基の保護
基を表わし；ｒは水素原子又はフェノール性水酸基の保
護基を表わし；分子中の２個のＣ鱗基中のメルカプト基
は相互に結合してジスルフィド結合を形成していてもよ
く；Ｒは水素原子、樹脂支持体又はェステル結合を形成
する炭化水素基を表わす〕の新規べプチド化合物が提供
される。 上記式（１）において、「アミノ保護基」としては、ァ
ミノ基の保護基として通常使用されるものはいずれも使
用可能であり、例えばｔ−プチルオキシカルボニル基、
ｔ−アシルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジル
オキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基の如
きウレタン型の保護基；トリフェニルメチル基の如きト
リアリールメチル基；及びｏ−ニトロフェニルスルフェ
ニル基の如き置換ァリールスルフェニル基を挙げること
ができる。 また「アシル基」は有機酸の残基、特に有機力ルボン酸
残基ただし、Ｒは有機力 ルボン酸からカルボキシル基１個を除いた残員を表わし
、例えばアルキル、アルケニル等の脂肪族基、シクロア
ルキルの如き脂環式基、又はアリ−ル、ァラルキル、ア
ルキルアリール等の芳香族基が含まれ、これら基は例え
ばアミノ基、ハロゲン、等の置換基を有していてもよく
、或いは異種原子が介在していてもよい）を意味し、例
えば、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ベンゾイル
等の通常の有機カルボン酸機基；或いはＣＩｙ−、８一
Ｎａ一、ＡＩａ一Ｇ１ｙ−、ＧＩｙ一ＡＩａ一またはこ
れらのＮ−アシル誘導体の基の如きアミノ基務基が包含
される。 また、「Ｓ−保護基」としては、第三級アルキル基、例
えばｔーブチル基；及び瞳換又は未置換のペンジル基、
例えば、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基等を挙げ
ることができる。 また「側鎖Ｎ−保護基」としては、ウレタン型の保護基
が好適に使用され、例えばペンジルオキシカルボニル基
、ｏークロロベンジルオキシカルボニル基、ジィソプロ
ピルメチルオキシカルボニル基等を挙げることができ、
「アルコール性水酸基の保護基」としては、第三級アル
キル基、好適にはｔーブチル基：置換又は禾置換のペン
ジル基、例えばペンジル基、ｐーニトロベンジル基等を
挙げることができ、さらに、「フェノール性水酸基の保
護基」としては、第三級アルキル基、好適にはｔ−ブチ
ル基；置換又は未置換のペンジル基、例えばペンジル基
、ｐ−ニトロベンジル基；置換ペンジルオキシカルボニ
ル基、例えばｏープロモベンジルオキシカルポニル基等
を挙げることができる。 さらに「樹脂支持体」は後述するように、固相合成法に
よって形成された樹脂結合ポリベプチドの分子を該樹脂
支持体から離脱せしめる際に、システインの末端カルボ
キシル基が−ＣＯＯ日の形で遊離し得るェステル形成性
の活性部位を有する樹脂であり、好適には式〔式中、Ｄ
はＣ比又はＣＱＣＯを表わし、■はスチレンージビニル
ベンゼン共重合体の主鎖を表わす〕で表わされるタイプ
のものである。 「ェステル結合を形成する保護基」としては、アルキル
基、例えばメチル、エチル、プロピル等；置換又は未置
換のアラールキル、例えばペンジル基、ｐーニトリロベ
ンジル基等を挙げることができる。 かくして、本発明により提供される好適な一群のポリベ
プチド化合物は、構造式Ｙ′−Ｃｙｓ一Ｌｙｓ−ＡＳｎ
−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙて−
Ｔｍ一Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−ＯＨ（１一１）〔式中、Ｙ′は
水素原子又はアシル基を表わし；Ｃ＄、Ｌ＄、Ａｓｎ、
Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＳｅｒは前述の
意味を有し；分子中の２個のＣ＄基中のメルカプト基は
相互に結合してジスルフイド結合を形成していてもよい
〕のポリベプチドである。 また、本発明により提供される他の好適な一群のポリベ
プチド化合物は、構造式〔式中、Ｙ″はアミノ保護基又
はアシル基を表わし；Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ
、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｔの及びＳｅｒは前記の意味を有し
；ｂ″は置換又は未置換のペンジル基を表わし；ｐ″は
ジイソプロピルメチルオキシカルボニル基又は置換又は
禾置換のペンジルオキシカルボニル基を表わし；ｑ″は
置換又は未置換のペンジル基を表わし；ｒ′‘ま置換又
は未置換のペンジル基又は置換又は未置換のペンジルオ
キシかレボニル基を表わし；Ｄ及び■は前述の意味を有
する〕のポリベプチド化合物である。 上記式（１−２）の化合物は、例えば後述する方法によ
り、前記式（１一１）の化合物に変えることができる。 かくして前記式（１）、または式（１−１）もし〈は（
１−２）のポリベプチド化合物の代表例を示せば次の通
りである。Ｈ‐Ｃ侭一Ｌ災−Ａｓｎ−Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ−
Ｔｒｐ一Ｌｙｓ−Ｔｈｒ一Ｔの一Ｔｈｒ−Ｓｅｒ一Ｃｙ
ｓ一ＯＨ（Ｄｅｓ一〔Ｎａｌ一ＧＩｙ２〕一〔Ｔｙｒｌ
ｌ〕−ソマトスタチン）日一ＧＩｙ一ＣｙＳ一Ｌ＄−Ａ
Ｓｎ一Ｐｈｅ一Ｐｈｅ一Ｔｒｐ一Ｌ＄一Ｔｈｒ−−ＴＭ
−Ｔｈｒ−Ｓｅて一ＣｙＳ一。 日（Ｄｅｓ−〔Ｎｄｌ〕一〔Ｔｙｒ１１〕ーソマトスタ
チン）Ｈ−Ｎａ−Ｃｙｓ−Ｌ＄−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈ
ｅ−Ｔ

〔式中、Ｒ川は前述の意味を有する〕

のトリプトフアン誘導体を結合せしめ、しかる後このＯ
Ｒ川をＱと置換することにより合成するのが好ましい。 また式（刈）のべプチドフラグメントは式〔式中、ｐ′
、ｑ′、ｒ、ｂ′及びＲ′′′は前述の意味を有する〕
のべプチドフラグメントとＮ端を保護したトリプトフア
ンのＣ様活性体とを結合せしめ、しかる後Ｎ端保護基を
選択的に脱離することにより合成することが望ましい。 本発明によって提供される前記式（１−１）の新規なボ
リベプチド、特にジスルフィド結合を有するものは、下
記に述べるように優れた生物活性、免疫活性等を示し、
各種病気の予防、治療又は措置薬として、或いは診断薬
等として有用である。｛１１生物活性 ソマトスタチン及びその同族体は、ＧＨ（生長ホルモン
）放出を抑制するとともにＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン
）の放出も抑制する効果を有している。 しかしＧＨ抑制効果には用量反応関係が成立せず、定性
的にしか判定できないのでＴＳＨ抑制活性を指標として
比活性を測定するのが一般的である。〔測定法〕 測定はＢｒａｚｅａｕ、Ｐ．、ｅｔａｌ、Ｓｃｊｅｍｅ
．１７９、７７（１９７３）及びＢｒａｚｅａｕ、Ｐ．
、ｅｔ ａｌ、ＥｎｄＭｒｉｎｏｌｏ鋤、９４、１８４
（１９７４）に記載の方法に準じて行なう。 体重２００〜２２０夕のウスター系ラットを−晩絶食さ
せたものを実験に用いる。 ５０皿ｇノ１００タ体重の甲状腺刺激ホルモン放出ホル
モン（ＴＲＨ）を０．１奴‘の生理食塩水に溶解した溶
液をウレタン麻酔した上訪うットの左の頚静脈に、ツベ
ルクリンシリンジを用いて静注する。 静注終了後、直ちに供試ポリベプチドを２０ｎｇ／ｍｉ
ｎ及び２００ｎｇ／ｍｉｎの二つの割合で１０分間連続
静脈注射を行ない、注入終了後遠かに採血し、血清中の
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を二重抗体法によるラジ
オィムノアッセィにより測定する。 その結果、本発明のポリベプチドの比活性は、ソマトス
タチンを１とした場合、 〔ＴＭＩＩ〕−ソマトスタチンは１．０８６であり、ｄ
ｅｓ〔ＡＩａｌ−ＧＩｙ２〕一〔ＴＭＩＩ〕−ソマトス
タチンは０．３４であった。 また、前述の甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ
）に代えて、生長ホルモン（ＧＨ）の放出物質であるネ
ンブタールを用いて上記と同様の実験を行ない、ネンプ
タール２．５のｏ／１００タ体重の投与による生長ホル
モン（ＧＨ）の放出の抑制効果を測定した結果、〔ＴＭ
ＩＩ〕ーソマトスタチン及びｄｅｓ〔ＡＩａ１一０１〆
〕一〔Ｔｙ【１１〕ーソマトスタチンの双方共その最少
有効量は４略／ｍｉｎ以下で、これはソマトスタチンと
同様であることが認められた。 このように本発明により提供される前記式（１−１）の
ポリベプチドは、ソマトスタチンと同等乃至それ以上の
高い活性を示し、末端肥大症、巨人症などの疾患の治療
、更にはインシュリンとの併用による糖尿病の治療に有
用である。 このポリベブチドを治療に用いる場合、医薬上許容され
る通常の液体又は固体担体と混合して、好ましくは非経
口的に投与する。投与形態としては、本ポリベプチドを
凍結乾燥剤とし、その溶解液と別個にしておき、使用時
に溶液例えば注射溶液とすることが好ましい。用量は、
投与形態及び治療する人間又は動物の症状、必要性によ
り異なるが、通常体重ｌｋ９当り１〜３００仏タ、好ま
しくは５〜３０ムタの範囲である。活性持続型の投与形
態を用いることにより、長期に亘る継続的な治療も可能
であり、例えば体液に対して溶解度の低い塩の形態とす
るか、或いは放出を遅らせる保叢担体で処理して配合剤
とすることにより、目的を達することができる。 塩としては、特に亜鉛との塩が好ましい。■ 免疫活性
本発明の前記式（１一１）のポリベプチドのある種のも
のは、公知のソマトスタチンと同様に優れた免疫活性を
有し、ソマトスタチンの抗体と特異的且つ鋭敏に反応す
る標識抗原の調製用として極めて高い価値を有し、ラジ
オィムノアッセイ（ＲＩＡ）の分野で利用することがで
きる。 すなわち、公知のソマトスタチンは、放射性ヨード化に
必要なチロシン又はヒスチジン残基をもたず、そのまま
ではＲＩＡに利用することが不可能なため、従来はソマ
トスタチンのＮ端にチロシンを導入したり或は１−位の
アラニンをチロシンに置換したものを用いてＲＩＡを行
なっていた。 しかしこれらの改変はソマトスタチン分子に非常に大き
な変化をもたらすものであり、その結果として免疫反応
の特異性が低下し、ひいては測定精度にも大きく影響す
ることが指摘できる。これに対し、本発明で提供される
〔Ｔｙｒｌｌ〕ーソマトスタチンは、ソマトスタチンの
１１位のフェニルアラニンがチロシンで置換された構造
のもの、すなわちソマトスタチンの１１位のフェニルア
ラニンのベンゼン環に水酸基が一箇加わっただけの極め
て小さい改変がなされたものであり、上述した悪影響は
全く無視できる。 しかも、本ポリベプチドは放射注ヨード化も容易である
等の利点がある。かくして、本発明に従えば、構造式 のポリベプチド（〔ＴＭＩＩ〕ーソマトスタチン）を放
射性ヨードで標識することから成る構造式＊〔式中、Ｔ
；ｙｒは放射性ヨードで標識されたチロシン基を表わす
〕の標識されたポリベプチドの製造方法が提供される。 放射性ヨードでの標識はそれ自体公知の方法で行なうこ
とができ、例えばＷ、Ｍ．Ｈ側にｒ、Ｆ．Ｃ．Ｇｒｅｅ
ｎｗｏｏａ、 Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．１９４、 ｐ４
９５（１９６２）に記載された方法に従って行なうこと
ができる。 例えば、上記式（Ｘｍ）のポリベプチドを水中に溶解せ
しめ、酸化剤例えばクロラミンＴを加え、アルカリ金属
の放射性ョゥ化物の水溶液で処理することにより、上言
己式（ＸＷ）の標識されたポリベプチドが得られる。反
応は室温で速やかに進行し、通常２〜３秒で終了する。
使用し得るアルカリ金属の放射性ョウ化物としては、Ｎ
ａｌ濁１、ＫＩる１、Ｎａ１３１１、Ｋ１３１１等が使
用される。実に実施例により本発明をさらに説明する。 実施例 １Ｄｅｓ−〔ＡＩａ１一ＧＩｙ２〕一〔ＴＹＩ
Ｉ〕ーソマトスタチン‘ａ｝ クロルメチル樹脂（前記
式（ｍ）においてＸ＝ＣＩのもの）〔ＣＩ含量１．３４
肌Ｍｏｌ′夕〕３夕、Ｎ一８Ｘ−Ｓ−ｐーメトキシベン
ジルシステイン１．３０夕、トリェチルアミン（Ｅｔ３
Ｎ）０．５の【及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３
０の‘を振濠式反応容器に入れ、３５ｑ０の定温にて４
加時間おだやかにふりまぜる。 反応後樹脂をＤＭＦ、エタノール（ＥｔＯＨ）「Ｃ比Ｃ
Ｉ２の順で洗浄する。樹脂に導入された保護システィン
の量は０．５４ｍＭｏｌ／夕であった。この樹脂を前述
の容器中で下記表１に示す一般操作に従って反応を進め
、保護アミノ酸を所定の順序に従い順次導入した。反応
中温度は２３℃に保った。表１ ＊Ｉ Ｔｒｐ 導入後はェタンソチオールを１％含有さ
せる。 ＊２ Ｃｙｓ に対し２．５当量使用する。ＦＦＡ＝ト
リフルォロ酢酸ＤＣＣ＝ンソクロヘキシルカルボジイミ
ドＡＣ２０＝無水酢酸 ただし、公ｎの導入に際しては活性ェステル（パラニト
ロフェニルェステル）法を用いたが、この場合の一般操
作は上記表１のＮｏ．８以後を表ロのように変更したも
のである。 かくして保護ドデカベプチド樹脂（前記式（Ｗ）におい
てＹ＝Ｂｏｃのもの）６．１２夕（収率６７．５％）を
得た。 本化合物が生成したことの確認は以下の操作によった。
｛ｂー 上記保護ドデカベプチド樹脂３００の９、アニ
ソール０．３叫、ェタンジオ−ル０．１の【及び無水フ
ッ化水素７の‘の混合物を０℃にて６０分かきまぜたの
ちＨＦを溜去し、残る樹脂をエーテルにて洗い、ついで
樹脂を２Ｍ酢酸２０叫で抽出する。 抽出液を直ちに分子ふるい（Ｐｈａｎｈａｃｉａ社、Ｓ
ｅｐ舷ｄｅｘＧ一２５）の力ラム（１．８×９５の）に
負荷して同じ溶媒で溶出し、ＯＤ２８０の仏の主ピーク
部分を分取し、凍結乾燥して粗べプチド３５Ｍを得た。
この粗べプチド３０の９を０．０１Ｍ酢酸アンモニウム
（ｐＨ＝７．４）３００のとに溶かし、開放容器中で２
０℃に数日間放置して空気酸化する。 ＳＨ基の定量値が最初の５％以下になったら、反応液を
凍結乾燥し、銭澄を分子ふるい（Ｓｅｐ舷ｄｅｘＧ−２
５）のカラム（１．８×１１５仇）に負荷して、０．２
Ｍ酢酸で溶出し、ＯＤ２８０の山の主ピーク部分を凍結
乾燥して、目的とする環状ドデカベプチド、Ｄｅｓ−〔
ＡＩａ１一ＧＩ〆〕−〔Ｔｙｒｌｌ〕−ソマトスタチン
の純品１３６雌を得た。〔Ｑ〕色４−４３．３０（Ｃ二
１、１％ＡｃＯＨ）アミノ酸分析（１％フェノール含有
州ＨＣ１、１１００、２水ｒ加水分解）（Ｐｈｅ土 ・‐００） 本品は高速液体クロマトグラフィー〔装置：日立６３隻
型：担体：東洋ソーダ３００にＷ（０．８×６比１）：
溶媒：１５％酢酸水溶液（９０の【／ｈｒ）；ＲＴ：２
０．８ｍｉｎ〕により完全に単一であることが確認され
た。 実施例 ２ 〔Ｔｙｒ，．〕−ソマトスタチン ‘ａ｝ 実施例１｛ａ｝で得た保護ドデカベプチド樹脂
１．０夕を振顔式反応容器中に入れ、前記表１に示した
一般操作に作って、別に合成した保護ジべプチド、Ｂ比
・山ａ・ＧＩｙ・ＯＨを一段階で導入した。 かくして保護テトラデカベプチド樹脂（前記式（肌）に
おいてＹ＝Ｂ比・Ｎａ・０１ｙのもの）１．１夕を得た
。本化合物が生成したことの確認は以下の操作によった
。【ｂ｝ 上記保護テトラデカベプチド樹脂３００の９
、アニソール０．３Ｍ、ェタンジオール０．１舵【及び
無水フツ化水素５の‘の混合物を、実施例１と全く同様
に反応処理して粗テトラデカベプチド６１のｏを得た。 この粗べプチドを実施例１‘ｂーと同様に空気酸化して
塚化せしめ、分子ふるい（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５）
のゲル炉週で精製した。 この精製した〔Ｔｙｒ１１〕ソマトスタチンを更に分配
クロマトグラフィ‐で純化した。すなわち、ｎ・ＢのＨ
−ＡｃＯＨ−日２０（４：１：５）の下層を固定相とし
て分子ふるい（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５）のカラム（
１．５×８比九）を平衡化し、ベプチド３物９を負荷し
たのち、上層を移動相として溶出する。ＯＤ２８０ｍ〃
の主ピーク部分を凍結乾燥し目的とする純粋な〔Ｔの１
１〕ーソマトスタチン１９の９を得た。 〔Ｑ〕容一３６．１（ｃ＝０．５０１％ＡｃＯＨ）アミ
ノ酸分析（１％フェノール含有州一日ＣＩ、１１００、
２４ｒｓ加水分解）（ＧＩｙＦ １‐００） 本品は実施例１と同一条件の高速液体クロマトグラフィ
ー〔ＲＴ：１８．５ｍｉｎ〕により完全に単一であるこ
とが確認された。 実施例 ３ 〔Ｔｙｒ１１〕ーソマトスタチン１０ムタを１０仏〆の
０．１規定酢酸に溶解し、０．９Ｍのリン酸綾衡液２５
ムクを加えてｐＨを７．４に調整する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 構造式 Ｙ′″−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔ
   ｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｙ
   ｓ−ＯＨ〔式中、Ｙ′″は水素原子又はＡｌａ−Ｇｌｙ
   −基を表わし、Ｃｙｓはシステイニル基、Ｌｙｓはリジ
   ル基、Ａｓｎはアスパラギニル基、Ｐｈｅはフエニルア
   ラニル基、Ｔｒｐはトリプトフイル基、Ｔｈｒはスレオ
   ニル基、Ｔｙｒは放射性ヨードで標識されていてもよい
   チロシル基、Ｓｅｒはセリル基をそれぞれ表わし、分子
   中の２個のＣｙｓ基中のメルカプト基は相互に結合して
   ジスルフイド結合を形成していてもよい〕のポリペプチ
   ド化合物。