JPS60226823A - 活性ｂ型肝炎表面抗原生成物を含有するワクチンおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、活性Ｂ型肝炎表面抗原生成物を含有するワク
チンおよびこのワクチンを製造する方法に関するもので
ある。

肝炎に対するワクチンは、例えばイギリス特許第１．２
８２９８４号から公知である。

本発明は、そのワクチンが市場にあるＢ型肝炎ワクチン
より１０〜１００倍以上の免疫原性である、人工的にま
たはＤＮＡ組換え技術によって調製される血ショウを含
有する人間のＢ型肝炎表面抗原（以下ＨＢｓ八ｇと称す
る）から分離されたＨＢｓＡｇを含有するワクチンを提
供する。

本発明によるワクチンは、上述されたような活性ＨＢｓ
Ａｇ生成物および抗Ｂ型肝炎表面（以下、ＨＢｓという
）抗体でないその合計プロティン含量に基づいて０．１
〜９９．５％の人間および／または動物プロティン物質
を含有し、ＨＢｓＡｇ粒子は最小で厚さ１８〜２２ナノ
メータおよび長さ３６ナノメータを有する塊りに集合さ
れるかまたはそのワクチンにおいて単一のＨＢｓＡｇ粒
子が人間または動物起源の血ショウプロティンと合成さ
れる。

このようなワクチンは人間ＨＢｓＡＨの正の血ショウを
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）水溶液により５％（
重量／容量）の最終濃度に混合することによシ調製され
ることができる。多量の感染性Ｄａｎｓ粒子を含有する
沈澱物の除去後、ＨＢｓＡｇ含有上清は該ＨＢａＡｇが
部分的に純化される純化工程に置かれる。

適切な純化方法は、 １．２時間半ないし３時間半だけ２００．０００　Ｘ　
ｇでのりサスペンデート（再懸濁）の超遠心分離によっ
て引き起されるｐＨ！１．５の６チＰＥＧによる沈澱、
２人間、動物またはモノクロナール抗ＨＢａ接合コラム
上への免疫吸着、３モルナトリウムチオシアネート（Ｎ
ａＣＮＳ）による解着およびリン酸バッファ含塩物（Ｐ
ＢＸ）に対する透析である。

かかるＨＢｓＡｇ製剤は単一の１８〜２２ｎｍ粒子を含
有し、この粒子は、多分生体内での免疫性を制限するこ
とに重大な役割を演するＨＢｓＡｇに合成された血ショ
ウプロティンの存在のため、高度に純化されたＨＢｓ　
Ａｇ粒子よりマウス効力試験の水溶液中での免疫原性の
約１０倍である。

プロティン全量に基づく０．１〜９９．５チＨＢｓＡｇ
を含有するこのようなＨＢａＡｇ　７”　目ティン混合
物は６０〜４００℃の範囲で、好ましくは８０〜１２０
℃の範囲で熱処理される。一般に、熱処理は８５〜１１
０℃の範囲の温度で行なわれる。

この加熱処置の結果として単−ＨＢ　ｓ　Ａｇ粒子は塊
りに集められかつ免疫原性は著しく増加される。

本発明による活性Ｈ１ｌ　Ａｇ生成物を含有するワクチ
ンはプロティン全量に基づいてＨＢｓ　Ａｇプロティン
を０．１〜１０重量％だけ含有しても良い。

しかしながら、また、高度に純化されたＨＢｓＡｇ粒子
に至る純化方法およびＣｓＣ１またはＫＢｒ傾度におけ
る平衡遠心分離のごとき表面抗原からの関連プロティン
の除去が回避されるならば、より多く純化されたＨＢｓ
Ａｇ生成物を上述した熱処理下に置くことができる。

実施例１ Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｓａＡｇ）を含有した人間の血シ
ョウが１時間半室温で２：１の容量比においてフレオン
１１３（スイスのデュ・ボン拳ニュムールΦインタナシ
ョナル・ニス・ニー）と混合された。遠心分離後抽出リ
ポイド物質、透明な血ショウ層およびそれらの間の沈澱
物からなる３層が形成された。透明な血ショウプロティ
ン溶液（＝　Ｖｏ）の１０部が０．１５モルリン酸バッ
ファ含塩物（Ｐ　Ｂ　８゜１）Ｈ７，４）の２５部およ
び４０重量％のポリエチレンゲリコール水溶液ＣＰＥＧ
６０００、最終濃度５％（重量／容量）の５部と混合さ
れた。４℃で１晩のインキュベーション後形成された沈
澱物が遠心分離されかつ除去されそして上清に４０重量
％のＰ　Ｅ　０６０００水溶液が６チ（重量／容量）の
最終濃度に添加された。

そのｐＨは、２．５モルの塩酸溶液の添加により３．５
に調整された。１晩のインキュベーション後、形成され
た沈澱物は遠心分離されそして上清が除去された。沈澱
物はＰＢＳ溶液（ｐＨ７，４）の添加により最初の容量
（＝ｖｏ）の１１５に懸濁された。２．５モルの水酸化
ナトリウムの添加により、ｐＨ１ｄ７．４に調整された
。３時間半＋７）　２０Ｑ　０００Ｘｇでこの溶液を超
遠心分離することにより沈澱物が得られた０小部分のみ
のＨＢＳＡｇプロティンからなりかつ残部が人間の血シ
ョウプロティンからなるこの沈澱物は最初の容量（＝Ｖ
ｏ）のリン酸バッファ含塩物（ｐＨ８）溶液（ｐＨ７，
４）の１７１０の添加により懸濁された。

このプロティン混合物は９０秒だけ閉止連続流動系内で
１０１．５〜１０４℃に加熱され、溶液は沸騰しなかっ
た。これらの状況により非耐熱血ショウプロティンが沈
澱したが、大部分のＨＢｓＡｇプロティンは溶液中に残
った。

４８、　ＯＤＯＸｇでの１時間の超遠心分離による不溶
性プロティンの除去および５０ｍｇ／ｌの最終濃度への
Ｔｖｒｅｅｎ　８０の添加後特定のＨＢＳＡｇプロティ
ンの少なくとも０．５重量％からなるワクチンのプロテ
ィン水溶液が殺菌方法でｆ過されかつｐＨ８（ｐＨ７，
４）中のリン酸アルミニウムの予め殺菌された懸濁中に
集められた。最終懸濁液はｍｌ当り３μｇのＨＢｓ　Ａ
ｇおよび２５ミリモルのリン酸アルミニウムを含有した
。

ガラスアンプルは１ｍｊｔの用量で充填された。アンプ
ルはさらに１０時間６５℃で加熱（いわゆる低温殺菌）
された。

上述したようなワクチンを、高度に純化されたＨＢａ　
Ａｇ粒子からなりかつ１０１．５〜１０４℃で加熱され
てない現在利用し得るＢ型肝炎ワクチンと比較するとき
、マウスおよび人間で試験したとき上記ワクチンは１０
〜１００倍以上の免疫原性であることが明らかになった
。

それにより、通常の免疫反応性を有する人間において上
記ワクチンは本発明によって調製されないＢ型肝炎ワク
チンより１０〜１００以下の特別な抗原用量で投与され
ることができることが判った０ 実施例２ ＨＢｓＡｇを含有した人間の血ショウの１０部が０．１
５モルのリン酸バッファ含塩物（ｐＨ８）溶液（ｐＨ７
，４）の２５部および４０重量％のポリエチレングリコ
ール水溶液（ｐ　Ｅａ　６０００．最終濃度５％（重量
／容量））の５部と混合された。４℃で１晩のインキュ
ベーション後形成された沈澱物は遠心分離されかつ除去
された。得られｆｃ５％ＰＲＧ上清は人間のポリクロナ
ールまたはモノクロナール抗ＨＢｓで接合されたコラム
とともに２〜１６時間定温放置された。国際単位にした
がって５％ＰＥＧ上ｆｆ中ノセファロース１００〜１０
００ナノグラムに接合された抗ＨＢｓがコラムとともに
定温放置された。とくに結合されてないプロティンはｐ
Ｈ８（４〜６倍コラム容量）とともにコラムから洗い落
された。とくに結合され７’ＣＨＢｓＡｇ粒子および関
連の血ショウプロティンは２〜４倍のコラム容量ＰＢ８
によって引き起されるｐＨ８（ｐＨ７，４）中の３モル
のナトリウムチオシアネ−）　（Ｎａ８ＯＮ）溶液の２
〜４倍のコラム容量を有するコラムから溶離される。

ＮａＣＮ５中のＨＢｓＡｇプロティン混合物は濃縮され
かつＮａＣＮ３はｐＨ８に対する透析によって除去され
る。

製剤中の全プロティン含量の０．５〜１０チの範囲にお
いてまた血ショウプロティン（主として人アルブミンお
よび免疫グロブリン）を含有しているこのように形成さ
れたＨＢｓＡｇ濃縮物にＴｗｅｅｎ８［１が５０ｍｇ／
ｊｔの最終濃度に添加された。

第１図は単一の１８〜２２部ｍ　ＨＢｓＡｇ粒子を見る
ことができるこのように得られた製剤の電子顕微鏡写真
図を示す。

４０〜４００μｇ　ＨＢｓＡｇを含有するこのグロテイ
ン混合物が閉止系統内で９０秒１０１．５〜１０４℃に
加熱された。これらの状況により、考え得る残部の熱弁
活性Ｄａｎｅ粒子を含んでい、る非耐熱血ショウプロテ
ィンが沈澱したが大部分のＨＢｓＡｇプロティンは溶液
に残った。４Ｂ、　０００　Ｘ　ｇで１時の間遠心分離
による不溶性物質の除去後ワクチンの浄化水溶液が薄膜
フィルタを通して殺菌方法でｆ過された０ 第２図はＨＢＳＡｇ粒子の長手方向集合を見ることがで
きる熱処理後のこのようにして得られた製剤の電子顕微
鏡写真図を示す。

最後に、ワクチン水溶液はワクチンを２５ミリモルのリ
ン酸アルミニウムに結合前または結合後６５℃で１０時
間低温殺菌される。

実施例２によって得られたワクチンの水溶液の比較後、
熱処理後のワクチンは残りの血ショウプロティン（アル
ブミンおよび免疫グロブリン）が４０時間２ｏｏ、　ｏ
ｏｏ　ｘ　ｇ　でＣｓＣ１傾度遠心分離によって除去さ
れた高度に純化されたＨＢＩｌｌＡｇの水溶液より１０
〜１００倍大きい免疫原性因子であることがマウス効力
試験において判った。

【図面の簡単な説明】

第１図は熱処理前のＨＢｓＡｇ粒子を示す電子顕微鏡写
真図、 第２図は１０１．５〜１０４℃で９０秒の熱処理により
塊りに集合されたＨＢｓＡｇ粒子を示す電子顕微鏡写真
図である。 代理人　弁理士　佐　々　木　清　隆 （外３名） 図面の浄書（内容に変ｙ贋、） ｆＧ２ 第１頁の続き ０発　明　者　ベーター・ニコラス・　オランダ国、レ
リー ［相］発明者　ビエンゼ・トーツス・　オランダ国、ヴ
イ七′− アムステルダム、プレスマンラーン　１２５アムステル
ダム、プレスマンラーン　１２５手続補正書 昭和６０年５月２日 特許庁長官殿 （特許庁審査官　殿） １　事件の表示 昭和６０年特許願第　０７０１７７　号３　補正をする
者 事件との関係　特許出願人 昭和　年　月　日（発送日：昭和　年　月　日）６　補
正により増加する発明の数　０ ７　補正の対象 適正々図面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）人工的にまたはＤＮＡ組換え技術によって製造さ
   れた血ショウを含有しかつ抗Ｂ型肝炎表面抗体が付加さ
   れてないワクチン中のプロティン物質の全量に基づいて
   人間および／または動物起原の０．１〜９９．５％の他
   のプロティンを含有する人間Ｂ型肝炎表面抗原から最初
   に分離される活性Ｂ型肝炎表面抗原生成物を含有するワ
   クチンにおいて、前記Ｂ型肝炎表面抗原粒子が最小で厚
   さ１８〜２２ナノメータおよび長さ３６ナノメータを有
   する塊りに集合されるかまたはそのワクチンにおいて単
   一のＢ型肝炎表面抗原粒子が人間または動物起原の血シ
   ョウプロティンと合成されることを特徴とする活性Ｂ型
   肝炎表面抗原生成物番含有するワクチン。 （２）Ｂ型肝炎表面抗原を含有する人間面ショウが５％
   （重量／容量）のポリエチレングリコールの濃度にポリ
   エチレングリコール水溶液と混合され、そして形成され
   た沈澱物の除去後、上清に存するＢ型肝炎表面抗原が６
   ０〜４００℃の範囲のかつＴｗｅθｎ８０が５０ｍｇ／
   ｌ、の最終濃度に加えられる温度で部分的に熱処理され
   ることを特徴とする活性Ｂ型肝炎表面抗原生成物を含有
   するワクチン製造方法。 （８）熱処理を受けたＢ型肝炎表面抗原生成物がワクチ
   ン中のプロティンの全量に基づいて０．１〜１０チのＢ
   型肝炎表面抗原を含有することを特徴とする特許請求の
   範囲第２項に記載の活性Ｂ型肝炎表面抗原生成物を含有
   するワクチン製造方法。 （４）前記熱処理が８０〜１２０℃の範囲の温度で行な
   われることを特徴とする特許請求の範囲第２項または第
   ３項に記載の活性Ｂ型肝炎表面抗原生成物を含有するワ
   クチン製造方法。 （６）前記熱処理が９５〜１１０℃の範囲の温度で行な
   われることを特徴とする特許請求の範囲第２項、第６項
   または第４項に記載の活性Ｂ型肝炎表面抗原生成物を含
   有するワクチン製造方法。 （６）Ｂ型肝炎表面抗原血ショウを５％（重量／容量）
   ポリエチレングリコール溶液と混合後形成される上清を
   含有するＢ型肝炎表面抗原はさらに、人間抗Ｂ型肝炎表
   面、動物抗Ｂ型肝炎表面またはモノクロナール抗Ｂ型肝
   炎表面接合コラムへのＢ型肝炎表面抗原粒子の免疫吸着
   および３モルナトリウムチオシアネートによるＢ型肝炎
   表面抗原粒子の解着により純化されることを特徴とする
   特許請求の範囲第２項、第３項、第４項または第５項に
   記載の活性Ｂ型肝炎表面抗原生成物を含有するワクチン
   製造方法。