PT98066B

PT98066B - Processo para a preparacao de vacinas que contem um virus de engodo (decoy virus)

Info

Publication number: PT98066B
Application number: PT98066A
Authority: PT
Inventors: Nir Kossovsky; Rointan F Bunshah
Original assignee: Univ California
Priority date: 1990-06-22
Filing date: 1991-06-21
Publication date: 1999-03-31
Also published as: DK0465081T3; US5178882A; DE69101753T2; AU638841B2; ES2055539T3; DE69101753D1; EP0465081A1; PT98066A; IE65911B1; AU7921091A; EP0465081B1; CA2045204A1; ATE104546T1; CA2045204C; IE912150A1

Description

THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFÓRNIA

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE VACINAS QUE CONTÊM UM VÍRUS DE ENGODO (DECOY' VÍRUS).

1. Campo da invenção

A presente invenção refere-se na generalidade a uma composição sintética com actividade biologica contendo um núcleo com micropartículas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a composições com actividade biologica, sint£ ticas, contendo pelo menos um péptido, proteína ou agente farmacológico com actividade biologica, ligado a uma partícula nu clear nanocristalina. A presente invenção ainda se refere a mé todos para utilizar as composições sintéticas resultantes como vacinas, agentes para imunodiagnostico ou como medicamentos, de pendendo da natureza do grupo particular que contém actividade biologica.

2. Descrição da técnica anterior

A ligaçao de proteínas, pêptidos ou agentes farmacoló gicos com actividade biologica, a varias partículas veiculares tem sido uma ãrea de investigação intensa. Estes sistemas biologicos conjugados oferecem a possibilidade de toxicidade redu zida, eficácia acrescida e menor custo dos agentes com actividade biologica. Como resultado, muitos veículos diferentes estão disponíveis presentemente, C. Varga, J. Μ. , Asato, N., em Goldberg, Ε. P. (ed.), Polymers in Eiology and Medicina, New York, Wiley, 1983, 2, 73-88. Ranney, D. F., Huffaker, Η. H., em Juliano, R. L. (ed.),

Biological Approaches to the Delivery of

Drugs, Ann. N.Y. Acad. Sei., 507 (1987), 104-119.7. Os veículos mais correntes são substratos inorgânicos micronizados ou nanocristalinos e as proteínas sao os agentes conjugados mais comuns. Por exemplo, tem sido utilizados conjugados ouro/proteí na (principalmente imunoglobulina) tao pequenos como 5 nm nas aplicações de marcações imunologicas na microscopia de transmis sao de luz electronica ou de varrimento electronico, assim como para imunocoloração. £ Faulk, W., Taylor, G., Immunochemis try,8 (1971) 1081-1083. Hainfeld, J. F., Nature, 333, (1988) 281-282 J Tem-se demonstrado uteis os conjugados de proteína de oxido de ferro silanizado (de novo também principalmente anticorpos) com dimensões compreendidas entre 500 e 1500 nm em varias aplicações in vitro, onde as propriedades paramagneticas podem ser aplicadas de uma forma vantajosa. (Research Products Catalog, Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, MA, 1988-1989). Ugelstad e outros produziram núcleos de oxido de ferro gama r&_ vestidos com uma camada fina de poliestireno. (Nustad, K., Johansen, L., Schmid, R. , Ugelstad, J., Ellengsen, T., Berge, A., Covalent coupling of proteins to monodisperse particles. Preparation of solid phase second antibody, Agents Actions, 9: 207-212 (id. n? 60) 1982). As pérolas resultantes de 4500 nm demons traram a capacidade de absorção das pérolas de lãtex-poliestire no, assim como uma melhoria relativamente nova de paramagnetismo.

Tem sido fabricados sistemas de veículos designados para aplicações in vivo a partir de núcleos inorgânicos ou orgji nicos. Por exemplo, Davis e Illum desenvolveram um sistema de 60 nm constituído por núcleos de poliestireno com os revestimen tos exteriores de bloco poloxâmero copolimerico, polioxietileno

-3· e polioxipropileno, que exibiu uma capacidade notável para desviar macrõfagos de fígado de rato e macrõfagos esplénicos. £ Da_ vis, S. S., Illum, L., Biomaterials, 9_, (1988) 111-115 7· A libertação de fârmacos destas partículas ainda nao foi demonstrada. Ranney e Huffaker descreveram um sistema diõxido de ferro/ /albumina/fármaco que deram veículos com dimensões 350-1600 nm para fármaco paramagnéticos. Z* Ranney, D.F., Huffaker, H.H., In, Juliano, R.R. (ed.), Biological approaches to the delivery of drugs, Ann. Ν. Y. Acad, Sei., 507 (1987), 104-119 7· Poznasky desenvolveu um sistema conjugado de enzima-albumina que parece diminuir a sensibilidade do produto à biodegradaçao embora dissimulando a antigenicidade aparente da enzima natural. [ Poznas. ky, M.J., Targeting enzyme albumin conjugates. Examining the magic bullet In Juliano, R.L, (ed.), Biological approaches to the delivery of drugs, Anuais New York Academy Sciences, 507 (1987) 211-219 7

Shaw e outros prepararam e caracterizaram complexos delipoproteína/fármaco. £ Shaw, J.M., Shaw, K.V., Yanovicb, S., Iwanik, Μ., Futch, W.S., Rosowsky, A., Schook, L.B., Delivery of lipophilic drugs using lipoproteins, In, Juliano, R.L. (ed.), Biological approaches to the delivery of drugs, Annals New York Academy Sciences, 507 (1987), 252-271J. Os fârmacos lipofílicos sao relativamente estáveis nestes veículos e as interacções celulares devem ocorrer embora se conheçam poucos pormenores .

Em qualquer composição biológica conjugada, e importante que a integridade conformacional e a actividade biológica das proteínas absorvidas ou de outros agentes biológicos sejam preservados sem que provoquem uma resposta imunológica indesejá

-hvel. Ê sabido que a orientação espacial e a configuração de e_s trutura desempenham um papel determinante na actividade biológica de muitos péptidos, proteínas e agentes farmacológicos. As alterações na configuração da estrutura destes compostos podem resultar numa perda parcial ou total da actividade biolõgica.

As modificações da configuração podem ser provocadas pela modi_ ficação do ambiente circundante ao composto ou agente com acti^ vidade biolõgica. Por exemplo, os agentes farmacolõgicos que e_ xibem actividade in vitro podem não exibir actividade in vivo devido ã perda da configuração molecular inicialmente determinada, em parte, pelo ambiente in vitro. Além disso, a dimensão e a capacidade associada da partícula-veículo para minimizar o aprisionamento fagocítico constitui um aspecto primário quando a composição ê utilizada in vivo. Todos estes factores devem ser considerados quando se prepara uma partícula-veículo.

Embora se tenham desenvolvido numerosas partículas veiculares existe uma necessidade permanente de se obterem par tículas veiculares para aplicação in vivo e in vitro, em que um péptido, proteína ou agente farmacologico biologicamente ac tivos possam ser ligados a partículas de modo a proporcionar a estabilização do composto com actividade biolõgica na sua configuração activa. A presente invenção refere-se a estas partículas e composições.

Sumário da invenção

De acordo com a presente invenção, péptidos, proteínas ou agentes farmacolõgicos biologicamente activos são ligados a uma partícula nuclear para proporcionar uma grande varie

-5dade dc composições com actividade biológica. Esta invenção ba. seia-se na descoberta de que a superfície de partículas ultrafinas (partículas nanocristalinas) pode ser modificada com um revestimento superficial, de forma a permitir a ligação de grxi pos com actividade biolõgica para se obterem composiçSes em que o ambiente estrutural do grupo esteja suficientemente simulado, pelo que a actividade biolõgica se mantém. 0 revestimento que permite a ligação dos grupos com actividade biolõgica ãs partjT cuias nanocristalinas, de acordo com a presente invenção, pode ser constituído por um açúcar básico ou modificado ou por um oligonucleotido. As partículas nanocristalinas de revestimento com um açúcar bãsico ou um oligonucleotido provocam alterações na energia superficial e em outras caracteristicas de superfície que tornam as partículas adequadas ã ligação com os grupos biologicamente activos.

Num aspecto da presente invenção, são utilizadas pa£ tículas nanocristalinas para preparar um vírus de engodo (de^ coy vírus) em que o DNA ou o RNA nuclear do vírus estã substi. tuído por uma micropartícuia. A micropartícuia e escolhida de modo a apresentar a mesma dimensão que o núcleo do vírus, de tal forma que a conformação da proteína circundante de revesti^ mento simula exactamente o vírus natural. A partícula virai re sultante e incapaz de uma acção infecciosa embora simultaneamen te esteja totalmente apta a provocar uma resposta imunolõgica e apresentar uma biorreactividade antigenica.

Neste aspecto, uma partícula ultrafina apresentando um diâmetro inferior a cerca de 1000 nanometros e escolhida de modo a simular o núcleo de DNA ou de RNA. Os péptidos virais ligados ao revestimento do núcleo apresentam uma estrutura que

-6simula pelo menos uma parte do vxrus natural. Esta dimensão da micropartícula nuclear ê também adequada para transportar agen tes farmacológicos e outros compostos com actividade biológica dependentes da fixação que requerem uma fixação a uma partícula nanocristalina ou núcleo para manterem a sua actividade.

As partículas nanocristalinas apropriadas para aplicação na presente invenção podem ser constituídas por metais, cerâmica ou polímeros. Os exemplos de materiais apropriados in cluem crómio, rubídio, ferro, zinco, selenio, níquel, ouro, pr£ ta, platina, dióxido de silício, óxido de alumínio, óxido de ru tenio, óxido de estanho e poliestireno.

As micropartícuias com actividade biológica de acordo com a presente invenção têm grande aplicação, dependendo do t.i po de composto com actividade biológica que esta ligado ã micro^ partícula nuclear. Quando uma proteína virai se liga ã micropar. tícula nuclear, o resultado e um vírus de engodo que pode ser utilizado como uma vacina, instrumento de diagnóstico ou reagen teantigénico para o desenvolvimento de anticorpos. Podem escolher-se revestimentos de proteína não virai ou de antigénio e estruturar-se para utilização no desenvolvimento de anticorpos específicos ou de instrumentos de diagnóstico. Alem disso, as micropartícuias podem funcionar como um agente farmacológico quando compostos com actividades farmacológicas se ligam ã par tícula nuclear.

De acordo com a presente invenção, a utilização de uma micropartícuia nuclear em torno da qual se liga uma proteí na virai proporciona uma via eficaz para simular com exactidao a reactividade antigenica de um vírus natural, simultaneamente eliminando totalmente qualquer problema ou risco associado ã presença do material virai genético. Além disso, podem ligar-se outras proteínas, péptidos ou agentes farmacológicos ã partícu la nuclear para manter e/ou reforçar a actividade do composto.

A descrição anterior e muitos outros aspectos e vantagens relacionadas com a presente invenção tornar-se-ao mais compreensíveis por referencia a descrição pormenorizada seguin

te.

Descrição pormenorizada da presente invenção

A presente invenção tem grande aplicação em processos imunológicos e métodos imunológicos em que o material antigénji co ou outros grupos com actividade biológica se utilizam. Estas áreas de aplicação incluem agentes de vacinação, agentes antigénicos utilizados para provocar o aparecimento de anticorpos para utilização subsequente em diagnóstico e compostos antigéni cos utilizados como instrumentos de diagnóstico. A composição da presente invenção pode também ser utilizada em grande varie dade de outras aplicações em que é necessário fixar uma prote_í na, péptido ou agente farmacológico numa partícula nuclear com o objectivo de preservar e/ou reforçar a reactividade biológica,

As composiçoes da presente invenção incluem partículas nucleares nanocristalinas, (diâmetros inferiores a 1000 nm) que são revestidas com uma camada modificadora da energia superficial, que promove a ligação de proteínas, de péptidos ou de agentes farmacológicos ãs partículas, 0 revestimento modifji ca a energia superficial das partículas nucleares nanocris taljL nas, de tal forma que se podem ligar uma grande variedade de proteínas, péptidos e agentes farmacológicos imunogénicos ã par

-8tícula central sem perda significativa de actividade antigenica ou de desnaturação. 0 resultado ê uma composição com activi_ dade biologica que inclui um nucles inerte sob o ponto de vista biológico. A utilização final das composiçoes da presente in vençao depende da proteína, pêptido ou do agente farmacológico em particular que esta ligado ã particula nuclear revestida.

Por exemplo, podem ligar-se proteínas ou péptidos com activida. de antigenica, para se obterem composições utilizáveis como in^_ trumentos de imunodiagnostico. Podem ligar-se fragmentos virais ou revestimentos de proteínas com actividade imunogónica de for

ma a obter-se uma vacina. Também, podem ligar-se agentes farmacológicos para se obterem composições que são uteis para o tratamento de doenças.

Para a preparaçao de vírus de engodo (decoy) para se utilizarem como vacinas, preferem-se partículas com diâmetros compreendidos entre 10 e 200 nanometros, aproximadamente, uma vez que as partículas com esta dimensão simulam de forma mais correcta o diâmetro dos núcleos de DNA e de RNA que tipicamente constituem os vírus.

As partículas nucleares podem ser de grande variedade de materiais inorgânicos incluindo metais e cerâmica. Os metais preferidos incluem crómio, rubídio, ferro, zinco, selenio, níquel, ouro, prata e platina. Os materiais de cerâmica preferidos incluem dióxido de silício, dióxido de titânio, óxido de a-, lumínio, óxido de rutenio e óxido de estanho. As partículas nucleares podem ser constituídas por materiais orgânicos incluindo o carbono (diamante). Os polímeros preferidos incluem o poli estireno, o nylon e a nitrocelulose, As partículas constituídas por óxido de estanho, dióxido de titânio ou carvão (diamante)

-9sao particularmente preferidas.

Estão comercializadas partículas constituídas pelos materiais citados anteriormente tendo diâmetros inferiores a 1000 nanometros ou podem ser preparadas a partir da formação progressiva de um núcleo em solução (reacção coloidal), ou por diversos processos de deposição de vapor, químicos ou físicos, tais como deposição por pulverização (sputter) Z* Hayashi, C., J. Vac, Sei, Technol., A5 (4) (Julho/Agosto 1987) 1375-1384; Hayashi, C., Physics Today, (Dez, 1987) 44-60; MRS Bulletin, (Jan. 1990) 16-47 J. Esta comercializada uma dispersão (em ãgua) de oxido de estanho com partículas agregadas com uma dimensão de cerca de 140 nanometros, pela Vacuum Metallurgical Co. (Japão) . Estão comercializadas outras partículas com a composição e o intervalo de dimensões pretendidos, pela Advanced Refractory Technologies, Inc, (Buffalo, N,Y,).

A deposição de vapor por via química auxiliada por plasma (PACVD) e uma das numerosas técnicas que podem ser utili zadas para a preparação de micropartícuias apropriadas. A PACVD funciona sob pressões atmosféricas relativamente altas, (na ordem de um torr ou mais) e ê utilizável na geração de partículas com diâmetros ate 1000 nanometros. Por exemplo, as partículas de nitrito de alumínio com diâmetros inferiores a 1000 nanometros podem ser sintetizadas por PACVD utilizando-se trimetil alumínio e amoníaco como reagentes, 0 sistema PACVD inclui hab_i tualmente um tubo de quartzo instalado horizontalmente associado a sistemas de bombagem e de alimentação de gãs. No centro do tubo de quartzo localiza-se um susceptor aquecido por uma fon te de rãdio-frequencia de 60 KHz, As partículas de nitrito de alumínio sintetizadas sao recolhidas nas paredes do tubo de quar

tzo. Utiliza-se azoto gasoso como veículo para o trimetil-alumínio. A relaçao entre trimetil-alumínio e amoníaco na câmara de reacção ê controlada pela variação dos caudais de N^/Al (CHg)^ e NF.g gasoso na câmara. Mantém-se geralmente uma pressão constante de 10 torr da câmara de reacção para proporcionar a depo^ siçao e formaçao de partículas de nitrito de alumínio ultrafinas nanocristalinas, Pode-se utilizar PACVD para preparar uma diversidade de outras partículas nanocristalinas apropriadas.

As partículas nucleares são revestidas com uma substância que proporciona uma energia superficial limiar â partícula suficiente para permitir a ocorrência da ligação sem que esta seja tão forte que desnature os sítios biologicamente importantes. 0 revestimento é realizado de preferencia mediante suspensão das partículas numa solução contendo o agente modifi^ cador da superfície disperso, É necessário que o revestimento torne a superfície da partícula mais susceptível â ligação da proteína ou do péptido. As substancias de revestimento apropria das, de acordo com a presente invenção, incluem celobiose, açúcares básicos relacionados e açucares modificados, tais como a nitrocelulose. Também se podem utilizar oligonucleotidos. Os oligonucleotidos apropriados incluem poliadenosina (poli A). A celobiose é um material de investimento preferido.

A solução de revestimento na qual as partículas nuclea^ res estão suspensas contém, por exemplo, 1 a 3Q% (peso/volume) do material de revestimento. 0 soluto é de preferencia agua bidestilada. A quantidade de partículas nucleares suspensas na so luçao de revestimento varia conforme o tipo de partícula e sua dimensão. Habitualmente, as suspensões que contém Q,1 a 10% (pe so/volume) são apropriadas. Suspensões com aproximadamente 1%

(peso/volume) de partículas sao as preferidas.

As partículas nucleares sao mantidas em dispersão na solução de revestimento durante um período suficiente para pro porcionar um revestimento uniforme âs partículas. 0 método pre ferido para manter a dispersão e a sonicação. Tempos de disper são compreendidos entre 30 minutos e algumas horas, â temperatura ambiente, são normalmente suficientes para proporcionar um revestimento apropriado âs partículas. A espessura do revestimento é, de preferencia, inferior a 5 nanometros. As espessuras do revestimento podem variar desde que as partículas nucleares finais comportem o revestimento uniforme sobre substancialmente toda a superfície da partícula.

As partículas são separadas da suspensão apos revesti mento e podem ser conservadas para uso posterior ou redispersas numa solução contendo a proteína ou o peptido que se deve ligar âs partículas. Alternativamente, as partículas revestidas podem permanecer na suspensão para tratamento posterior que envolve a ligaçao da proteína ou do peptido desejados.

A proteína ou o peptido que ê aplicado âs partículas revestidas pode ser escolhido entre uma grande variedade de pro teínas ou de pêptidos. Os que exibem propriedades antigenicas sao preferidos quando se pretende obter uma vacina. A proteína pode ser o revestimento de proteína virai de um vírus seleccio. nado ou uma sua fracção com propriedades imunologicas. 0 revestimento de proteína vital e isolado de acordo com processos de separaçao convencionais para o isolamento e separaçao de protei nas virais. 0 revestimento virai e a proteína preferida porque o revestimento do vírus e o local em que se sabe estar localiza da a actividade antigenica do vírus. Tipicamente, o vírus e di-12-

gerido ou solubilizado para formar uma mistura de proteínas vi. raís. As proteínas virais são em seguida separadas por cromato grafia líquida ou por outro processo convencional, nas diversas fracções de partículas proteinicas e dializadas para eliminar as impurezas.

Entre os vírus apropriados a partir dos quais se podem separar e isolar proteínas virais, incluem-se o vírus de Epstein-Barr, vírus da imunodeficiencia humana (HIV), vírus de papiloma humano, vírus de herpes simplex e vírus da varicela (pox-vírus). As preparações de uma grande variedade de materi ais proteinícos antigénicos podem também ser adquiridos comerei almente nas Firmas fornecedoras como, por exemplo, Microgene Systems, Inc. (400 Frontage Road, West Haven, Connecticut 06516), Angen Corporation (1900 Oak Terrace Lane, Thousand Oaks, Califórnia 91320-1789) e Cetus Corporation (1400 53 rd Street, Eme ryville, Califórnia 94608). Podem ainda utilizar-se péptidos e/ou proteínas sintéticos correspondentes as partículas virais de ocorrência natural.

Podem ligar-se outras proteínas ou péptidos com acti. vidade biolõgica, incluindo enzimas, hormonas, proteínas de transporte e proteínas de protecção. São exemplos, a transferrina do soro humano, o activador do plasminogénio e factores de coagulação, além de agentes farmacológicos anfotericina e insu lina.

processo para a ligação de antigénios ou de outras proteínas no revestimento das partículas nucleares envolve a suspensão das partículas nucleares revestidas numa solução aquo sa que contém o antigénio. A presença na solução de materiais que podem ligar-se de preferencia â superfície da partícula,

-13frequentemente não e vantajosa, Por exemplo, os agentes da dis_ persão presentes na solução podem originar um revestimento inconveniente nas partículas suspensas antes da ligação â protejí na. Podem utilizar dissolventes miscíveis como a ãgua, por exem pio, metanol ou etanol.

A solução aquosa de micropartícuias revestidas pode ser suficientemente agitada para proporcionar uma suspensão uniforme das partículas. Habitualmente, a quantidade de partícu_ las na solução situa-se entre 0,5 mg por mililitros de solução e 5 mg por mililitros de solução, 0 método preferido e a sonicaçao por forma a proporcionar uma suspensão uniforme das partículas revestidas em solução.

A suspensão de partículas revestidas e de antigénios deve obedecer a certos parâmetros para que ocorra a reunião e ligação de proteína. A temperatura da solução de partículas de ve estar compreendida entre 19C e 459C. Certas proteínas e agen tes farmacêuticos podem ligar-se ãs partículas revestidas em jí gua destilada. Podem ser adicionados sais â solução para as reac ções entre as partículas revestidas e as proteínas ou outros a gentes farmacêuticos que são instáveis ou que não se dispersam facilmente em ãgua destilada. Em geral, as soluções salinas de vem ser formuladas de modo a que o equilíbrio iõnico (expresso em mM) não exceda: K=300-500; Na=30-70; Cl=40-150; Ca=0,0003-0,001 e Mg=0,0003-0,001, A tensão de oxigénio da solução e van tajosamente inferior a 10% numa solução pulverizada inicialmen te por hãlio e em seguida gasificada com helio, azoto e diõxido de carbono. 0 pH da solução situa-se, vantajosamente, na zona ligeiramente ãcida (relativamente ao sangue), com um valor de preferencia, compreendido entre 6,8 e 7,2. Uma solução exempli

-14ficativa para a dispersão de micropartículas revestidas e para ( * a ligação de proteínas ê uma solução aquosa que contém: 0,0360 mg/litro de MgSo^, 0,0609 mg de MgCl₂ θ^Ο, 0,0441 mg de CaCl₂ £^2θ’

22,823 g de K₂HP0₄, 13,609 g de KH₂P0₄, 7,455 g de KC1 -e 4,101 g de acetato de sodio. 0 pH desta solução é ajustado para 6,8.

Os núcleos de partículas revestidas com a proteína ligada podem separar-se do meio de desenvolvimento ionico e conservar-se para utilização posterior. As partículas revesti das podem ser conservadas por qualquer dos métodos convencionais habitualmente utilizados para a conservação de compostos antigénicos ou de anticorpos, Por exemplo, as partículas reves^ tidas podem ser liofilizadas ou conservadas sob uma forma de suspensão em uma solução compatível. Quando utilizadas para va. cina, as partículas revestidas com uma proteína virai revesti, da sãn injectadas ou de outro modo administradas a um indivíduo, de acordo com procedimentos convencionais. Qualquer solu çao de veículo aceitavel em farmãcia ou outro qualquer compos to podem ser utilizados na administração das partículas reves tidas ao indivíduo.

Quando utilizadas para diagnostico in vitro, as pa£ tículas revestidas de proteína são suspensas na solução e uti lizadas do mesmo modo que os outros compostos antigénicos. Is. to é igualmente verdade para a utilização de partículas reves. tidas com proteína para desenvolvimento de anticorpos. Podem utilizar-se protocolos e processos idênticos conhecidos para a utilização de antigénios em que as partículas revestidas de proteína da presente invenção sao substituídas por compostos antigénicos utilizados babitualmente,

Os exemplos seguintes nao limitativos descrevem cer

-15tos aspectos da presente invenção com maior pormenor.

Exemplo 1

Preparação de micropartícuias de oxido de estanho nanocristalinas

Colocou-se 1,5 a 2,0 mg de põ metálico ultrafino (nanocrístalino) em um tubo roscado de microcentrífugo com a capacidade de 1,7 ml, com 1,5 ml de ãgua bidestilada. Filtrou-se a ãgua bidestilada através de um filtro esterilizante de 0,45 micron lavado ou acrodisco (Gelman Scientific). 0 po metálico era constituído por oxido de estanho com um diâmetro m_í nimo de 140 nm (por espectroscopia de correlação fotonica). Agitou-se a mistura num vortex durante 30 segundos e colocou-se em um banho de sonicaçao de ãgua durante a noite. A tempe ratura do banho de sonicaçao foi estabilizada a 609C. Apos 24 horas de sonicação, submeteram-se amostras ao vortex de novo, durante 30 segundos, clarificando-se a dispersão resultante por microcentrifugação durante 15 segundos com uma velocidade aproximada de 16 000 rpm. Realizou-se a análise das dimensões das partículas em um analisador de partículas sub-micron Coul_ ter N4MD.

Aplicou-se o revestimento ãs partículas de oxido de estanho mediante suspensão das partículas numa solução de reserva de celobiose. A solução de reserva de celobiose era uma solução 292 mM preparada por dissolução de 1,000 g de celobio se em 9,00 ml de ãgua bidestilada. A solução foi preparada a uma temperatura aproximada de 70?C, com o objectivo de conseguir uma dissolução rápida, A solução de celobiose resultante

-16foi esterilizada por filtração através de um filtro de 0,45 mi cron e o volume final ajustado para 10,00 ml.

Adicionou-se solução de reserva de celobiose suficiente a 150 microlitros de dispersão ultrafina de oxido de esta nho, de modo a obter-se uma concentração final de oxido de estanho de 1,00% (p/v) ou 29,2 mM, 0 volume típico para a preparaçao foi de 2,00 ml que foi misturado quatro ou cinco vezes com o auxílio de uma micro-pipeta, Apos a mistura, deixou-se a dispersão a equilibrar durante duas horas. A demonstração do êxito do revestimento das partículas foi obtida pela medida da mobilidade das partículas, (revestidas e não revestidas) num analisador de varrimento de luz de energia Doppler Coulter DELSA 440. As partículas de oxido de estanho revestidas exibiram uma mobilidade relativamente baixa comparadas com as partículas de oxido de estanho não revestidas. Também se efectuaram medições de várias concentrações salinas diluídas para assegurar que as observações relativas ã mobilidade nao eram artificiais. Os testes demonstraram que as partículas estavam revestidas com celobiose.

As partículas revestidas são depois utilizadas para a ligação de proteínas, péptidos ou agentes farmacêuticos anti_ génicos para se prepararem partículas bio-reactivas.

Exemplo 2

Preparação de partículas nanocristalinas de oxido de ruténio:

Procedeu-se do modo descrito no Exemplo 1, com a excepção de se substituirem as micropartículas de oxido de estanho por micropartículas de oxido de ruténio. As partículas de

-17õxido de rutenio foram adquiridas ã Vacuum Metallurgical Company (Japao).

Exemplo 3

Preparação de partículas nanocristalinas de dioxido de silício e de oxido de estanho:

Adquiriu-se ã Advanced Refractory Technologies, Inc. (Búfalo, New York) dioxido de silício nanocristalino e oxido de estanho â Vacuum Metallurgical Co. (Japão). Também se prepararam partículas de óxido de estanho por evaporações reacti vas de estanho em uma mistura de ãrgon-oxigenio e recolheram-se em substratos arrefecidos. 0 óxido de estanho nanocristalino também foi sintetizado por pulverização num Magnetron re activo de corrente contínua (cátodo invertido). Um alvo de 7,6 cm (3) de diâmetro, de estanho muito puro, foi pulverizado (sputtered) em uma mistura gasosa de alta pressão de ãrgon e oxigénio. As partículas ultrafinas formadas na fase gasosa fo ram recolhidas em tubos de cobre e arrefecidas ate 77K com uma corrente de azoto líquido. Todos os materiais foram caracteri zados por cristalografia de difracção de raios X, microscopia de transmissão electrõnica, espectros copia de correlação fot£ nica e analise de varrimento electroforetico Doppler. As amos tras de difracção de raios X foram preparadas por colocação do pó numa lamina de vidro utilizando uma fita gomada de tamanho duplo. A radiação de Cukp^ foi utilizada em um difractõmetro No relco. 0 espectro obtido foi comparado com os valores-padrao ASTM de óxido de estanho (Powder Diffraction File, Card n? 21-1250. Joint Committu ou Power Diffraction Standards, American

-18Society for Testing and Materials, Philadelphia 1976). Os espécimes para microscopia de transmissão electronica (TEM) foram recolhidos numa rede de cobre revestida com carbono de di£ metro de 3 mm, padrão, por. imersão numa dispersão de (UFP’s) em propanol-2. As amostras foram examinadas em um JEOL-STEM 100 cx com uma voltagem de aceleração de 60-80 KV.

Para criar dispersões de trabalho destes óxidos meta licos, adicionou-se 1,5 a 3,0 mg de óxido metálico em pó a 1,5 ml de água bidestilada num tubo roscado de microcentrífuga isento de pó (Sarsted) e centrifugou-se durante 30 segundos. Em seguida, sonicou-se a mistura durante 16 a 24 horas seguida de uma segunda centrifugação durante 30 segundos. A fracção de submicron foi em seguida isolada por aglomeraçao das macropar-

tículas por microcentrifugaçao a 16 000 xg durante 15 segundos. Em seguida, removeu-se aproximadamente 1,3 ml de sobrenadante e colocou-se noutro tubo de microcentrífuga isento de pó. A amostra foi preparada para análise por espectroscopia de correlação fotónica (Coulter N4MD) e varrimento por luz electroforética Doppler (Coulter DELSA 440) por remoção de 50 a 100 jil da dispersão, colocação numa tina de poliestireno diluição ate um volume final de 1,00 ml com água bidestilada. Determinou-se a estabilidade da dispersão por avaliações sequenciais durante um período de 24 horas verificando-se ser estável. A estabilidade da dispersão relativamente ã salinidade progressiva do dissolvente (conductividade crescente) foi determinada de modo similar, A estabilidade aumentou com o aumento da salinidade do dissolvente.

Reuniu-se 1,00 ml da dispersão e agitou-se com 8,00 ml de água bidestilada e 1,00 ml de solução de reserva de ce-19lobiose 29,2 mM em uma célula de agitação por ultrafiltraçao, com a capacidade de 15,0 ml (Spectra) que tinha sido equipada com uma membrana de extinção de peso molecular de 5x105, tipo F, (Spectra). A amostra foi em seguida mantida em agitação du

rante 15 minutos. Apõs agitação,-retirou-se o excesso de cel<5 biose por lavagem da camara celular com 250 ml de ãgua bidestilada, com o auxílio de uma bomba peristãltica com um caudal que não excede 10,0 ml/minuto, Apos a lavagem, concentrou-se o filtrado por meio de azoto gasoso pressurizado ate um volume de aproximadamente 1,0 ml. Caracterizou-se por remoção de 500 jil da dispersão tratada, por analise N4MD. 0 diâmetro médio da dispersão foi restabelecido neste passo. A estabilidade da dis_ persão revestida foi determinada por avaliações sequenciais du rante um período de 24 horas. A estabilidade da dispersão revestida relativamente ao aumento da salinidade do dissolvente (conductividade crescente) foi determinada de modo idêntico.

As partículas nanocristalinas revestidas resultantes são apropriadas para ligação a varias proteínas, péptidos e £i gentes farmacêuticos.

Exemplo 4

Preparação, isolamento e adsorção superficial de proteínas de transferrina sérica humana:

Sintetizou-se oxido de estanho nanocristalino por pulverização (sputtering) Magnetron reactiva de corrente contínua (cãtodo invertido). Um alvo com o diâmetro de 7,6 cm (3) de estanho muito puro foi pulverizado (sputtered) numa mistura gasosa de alta pressão constituída por ârgon e oxigénio. As

-20partículas ultrafínas formadas na fase gasosa foram recolhidas em tubos de cobre arrefecidos atê 77 K com uma corrente de azo to líquido. Caracterizaram-se todos os materiais por cristalografia de difracção de raios X, difracção electronica de ãrea seleccionada, microscopia de transmissão electronica, espectro^ copia de correlação fotoniea e espectroscopia de raios X disv persiva de energia. As amostras de difracção de raios X foram preparadas fixando o po numa lamina de vidro com fita gomada de tamanho duplo. A radiação GuK (alfa) foi utilizada num difractõmetro Norelco. 0 espectro obtido foi comparado com dados padrão ASTM de oxido de estanho. Os espécimes para a microsco pia de transmissão de electronica e a difracção da ãrea escolhida foram recolhidos numa rede de cobre revestida com carbo no de 3 mm de diâmetro, padrão, por imersão numa dispersão de materiais- nanocristalinos em propanol-2. Examinaram-se as amos tras num JEOL-STEM 100 cx com uma voltagem de aceleraçao de 60-80 KeV. A suspensão de propanol-2 das partículas foi também caracterizada por espectroscopia de correlação fotoniea ã tem peratura de 22,59C, com um tempo de 600 segundos em um Coulter N4MD. A espectroscopia de raios X dispersiva de energia foi realizada num microscopio electronico de varrimento JEOL JSM- T330A utilizando-se software Kevex quantex V.

Para se prepararem dispersões de trabalho destes oxi. dos metálicos para a síntese de composições de acordo com a presente invenção, adicionou-se 0,5 mg de oxido metálico em põ a 1,0 ml de uma solução de cloreto de sõdio tamponada eom fosfato contendo celobiose 29,2 mM num frasco-ampola de vidro com tampa roscada isento de po e sonicou-se durante 20 minutos a uma temperatura compreendida entre 22^59 e 359C. A fracção sub micron foi em seguida isolada por aglomeração das macropartículas por microcentrifugaçao a 16 000 xg durante 30 segundos. Removeram-se, em seguida, 900 jil aproximadamente de sobrenadan te e colocaram-se num tubo de microcentrifuga com tampa roscada isento de po. Retirou-se uma alíquota para espectroscopia de correlação fotõnica (Coulter N4MD) e para analise de varri mento de luz electroforetica Doppler (Coulter DELSA 440). Tam bem se retiraram fracções alíquotas para caracterização da es_ tabilidade da dispersão revestida ao longo do tempo, e relati_ vamente ao aumento da salinidade do dissolvente (conductivida. de crescente).

Para absorver a proteína nos núcleos nanocristalinos de oxido metálico revestidos com celobiose, diluiu-se uma amos tra de núcleos ate um volume de 10,0 ml com uma solução (Gibco) de cloreto de sõdio tamponada com fosfato isenta de Ca e Mg Em seguida, adicionaram-se 40,0 jig de transferrina sêrica hunui na purificada (4 ^ig/jil) (Gibco), cuja antigenicidade fora veri_ ficada por ELISA, a uma célula de agitação de 10 ml (Spectra). Em seguida, deixou-se a amostra com agitação lenta durante 30 minutos, com grande cuidado para não haver formação de espuma.

Apõs o período de adição, juntaram-se 15 ml de solução de cio — . 2 + 2 + reto de sodio tamponada com fosfato isenta de Ca e de Mg (Gibco), lavou-se através da célula sob atmosfera de azoto ã pressão de 0,14Kg/cm (2 psi). Apõs a lavagem a amostra foi no vamente concentrada atê um volume de 1,00 ml sob atmosfera de azoto e retirou-se uma amostra de 500 jj.1 para analise por espectroscopia de correlação fotõnica, varrimento por luz electroforetica Doppler e microscopia electrõnica de transmissão, tal como se descreve em pormenor em seguida.

-22A integridade conformacional foi avaliada medindo-se a antigenicidade retida da proteína ligada. Na célula de amostra, adicionaram-se 50,0 jil de anticorpo de transferrina anti-humana policlonal de coelho (DaKo), cuja antigenicidade fora confirmada por ELISA, ao produto reaccional concentrado até um volume de 1,0 ml, â temperatura de 37,59C, sob agitação cuidadosa. Decorrido um período de incubaçao de 30 minutos, fez-se passar através da célula a lavagem de 15 ml de solução de cio· · 2 Ί* 2 t* reto de sodio tamponada com fosfato, isenta de Ca e de Mg

- - 2 (Gibco), sob atmosfera de azoto gasoso a pressão de 0,14Kg/cm (2 psi) e reduziu-se novamente o volume reaccional para 1,0 ml.

Em seguida, adicionou-se uma alíquota de 200 yjl do agente de bloqueio, albumina sérica de bovino a 1% (p/v) em so lução de cloreto de sodio isenta de iões divalentes, seguida de um período para equilíbrio de 10 minutos. Em seguida, adicionou-se anticorpo secundário, IgG policlonal anticoelho de caprino conjugada com ouro de 30 nm (Zymed) e a mistura reaccional permaneceu em incubação durante 30 minutos. Retirou-se uma amostra, introduziu-se na grelha do microscopio electrõni co de transmissão e secou-se sob vazio. De novo se lavou a mis_ tura com 15 ml de solução de cloreto de sodio isenta de iões divalentes sob pressão de azoto e, em seguida, fixou-se com glutaraldeído. Então, adícionou-se 1 ml de colagénio bovino so_ lido a 3% (Collagen Corp.) as misturas e ultracentrifugou-se o compósito a 10 xg durante 30 minutos formando-se um aglome_ rado que em seguida se processou de forma rotineira como um es pécime biologico para microscopia electrónica de transmissão. Observaram-se secções com a espessura de 10 nm num microscopio electrónico de transmissão Zeiss. As amostras controlo foram

-23preparadas do modo descrito anteriormente sem a camada de lig£ çao intermédia de celobiose.

As micrografias electronicas de transmissão mostraram que o oxido de estanho pulverizado no magnetrao de corren te contínua (D,C,) era composto de partículas individuais medindo 20 a 25 nm de diâmetro com agregados de grupos medindo 80 a 120 nm de diâmetro. Por espectros copia de correlação fotonica estas mesmas partículas, quando dispersas em ãgua destilada, produziram aglomerados medindo 154 55 nm. As partículas do oxido de estanho eram totalmente cristalinas quando observadas por difracção de raios X e electrónica. A espectros copia de raios X dispersiva de energia não mostrou outros ele^ mentos presentes como impurezas,

Por analise de varrimento de luz electroforetica de Doppler, o oxido de estanho exibiu uma mobilidade media de 2,177 0,215 ynm-cm/V-s em soluçoes aquosas de cloreto de sódio com concentrações de 10,8 a 20,3 Apos o revestimento superficial com celobiose numa solução a 1%, o oxido de estanho exibiu uma mobilidade média de 1,544 +. 0,241 yim-cm/V-s em soluções aquosas de cloreto de sodio com concentrações de 0,0 a 21,0 ^iM. 0 oxido aglomerou-se nas concentrações salinas superiores a 40,0 e em soluçoes com concentrações crescentes de celobiose.

Apos a ligação com a transferrina, os conjugados nao purificados de oxido de estanho/celobiose/proteína mediram 350 +. 84 nm, por espectroscopia de correlação fotonica e microsco pia electrónica de transmissão. As gotas das amostras secas sob vazio com baixa concentração de anticorpo-ouro mediram 35-50 nm. Sem a camada de ligação de celobiose, as secções secas sob va

-24zio mediram 400 a ^1000 nm. Notou-se ocasionalmente ligação com o anticorpo. Apos a marcação com imuno-ouro de elevada concentração e filtração, os espécimes tratados com celobiose de secção fina mediram 50 a 100 nm. A ligação de ouro positiva foi identificada em aproximadamente 20% das amostras reves tidas apropriadamente, embora os controlos negativos (prepara^ dos do modo descrito anteriormente, mas isentos de anticorpo primário de coelho), exibiram uma ligaçao nao específica de ãi proximadamente 1%.

Pode concluir-se dos exemplos anteriores que a acti vidade biologica de proteína absorvida na superfície de parti cuias de oxido metálico nanocristalinas tratadas com hidrato de carbono é preservada.

Exemplo 5

Preparação e caracterização de vírus de Epstein-Barr de engodo

As partículas de oxido de estanho nanocristalinas fo ram sintetizadas por pulverização num Magnetrão reactivo D.C., do modo descrito anteriormente no Exemplo 1.

vírus de Epstein-Barr (EBV) purificado por eluição com gradiente de sacarose proveniente da linha de células B95-8 foi adquirido a Advanced Biotechnologies, Inc., Columbia MD. Cada alíquota virai continha aproximadamente 5,00 x 10^θ partículas de vírus/ml de suspensão em tampa o TRIS 10 mM-NaCl 150 mM de pH 7,5 (aproximadamente 0,94 mg/ml de proteína). Os viriões foram solubilizados em Triton x 100 a 0,75% (v/v) e em seguida ultracentrifugados a 150 000 xg durante 60 minutos formando-se um aglomerado de DNA nuclear, utilizando uma modificação do mê

-25todo descrito por Wells £ Wells, A,, Koide N., Klein G. , Two large virion envelope glycoproteins mediate EBV binding to re ceptor-posítive cells, J. Virology, 41 (1982) 286-297 £. Apos a diãlise, o sobrenadante do extracto de vírus de Epsteín-Barr foi caracterizado por SDS-PAGE (desnaturado) £Biorad Mini Gel II, gel gradiente de 4-20%, 200V x 45 minutos e corado com pra taJ e HPLC de exclusão de tamanhos (não desnaturado) Z^Waters 620 system com um auto-injector WISP e um detector de foto-iodo 720, 0,5ml/minuto sobre uma coluna Waters SW300 para cromatografia de fase gasosa, utilizando uma fase movei de gradiente de NaCl 100 mM/TRIS 20 mM, de pH 9,4 £.

As proteínas de controlo (não EBV) foram extraídas de alíquotas de vírus de fago lambda virai £ Pharmacia, Milwaukee, WI £ utilizando métodos anteriormente descritos.

Inicialmente suspenderam-se alíquotas de oxido de es_ tanho em po com peso aproximado de 1,5 mg em 3,0 ml de solução de celobiose 29,2 mM num frasco-ampola de vidro isento de po por agitaçao em vortex £ Vortex Genie, Scientific Industries, Bohemia, NY 7· A suspensão turva acastanhada resultante foi de pois sonicada a 175 W durante 10 minutos com uma frequência aproximada de 20 KHz ã temperatura de 259C £ Bransoh 2 Cup Horn, Branson Ultrasonics Corp., Danbury CT J. Clarificou-se a disç persao por microcentrifugaçao a 16 000 xg durante 15 segundos.

aglomerado remanescente foi depois rejeitado em favor do sobrenadante. A celobiose não absorvida foi removida por ultrafiltraçao contra 20 ml de tampao de reacção de fosfato 25 mM

2— (pH 7,40, HP0₄ /H₂PO₄ 25 mM) numa célula de agitaçao filtrada para um peso molecular nominal de 10 KD (Pharmacia) sob atmosfera de azoto gasoso a pressão de 0,53Kg/cm (7,5 psi) a tem-26peratura de 37,59C. Caracterizaram-se alíquotas do produto in termédio por espectroscopia de correlação fotonica e apos a diãlise, como descrito em seguida, por analise de varrimento de luz electroforética Soppler.

processo de absorçao da proteína virai foi inicia do pela remoção do tensióactivo de triton moderado de alíquotas de 250 jil de extracto de vírus de Epstein-Barr por ultrafiltrai ção contra 25 ml de tampão de reacção de fosfato ã temperatura de 49C numa célula de agitação de peso molecular nominal de 10 KD e, em seguida, ajustado para uma concentração de 1,0 jtg/ /jil ou aproximadamente 1,0 ml do volume final. Em seguida, adi. cionaram-se rapidamente 5Q0 jil do extracto de vírus de Epstein· -Barr isento de triton a uma célula de agitação de peso molecu lar nominal MD com 2,0 ml de sobrenadante tratado com uma dispersão de oxido de estanho previamente aquecida até ã temperatura de 37,59C. Em seguida, agitou-se a mistura lentamente, en quanto se incubava ã temperatura de 37,5<?C durante 2 horas.

Apos a incubação removeu-se o extracto de vírus de Epstein-Barr nao absorvido, por ultrafiltraçao contra 25 ml de tampão de reacção de fosfato.

Os engodos controlos (não EBV) preparados com extractos de proteína virai de fago lambda foram sintetizados utilizando o processo descrito anteriormente.

Caracterizaram-se os componentes intermédios, os ví rus de engodo reunidos no final e os virioes totais de Epstein-Barr por analise de varrimento de luz electroforética de Doppler F DELSA 440, Coulter Electronics Inc., Hialeak, FL J para determinar a sua mobilidade electroforética (carga super ficial) numa fase fluída. Prepararam-se nove soluçoes-tampao

-27de fosfato tendo, â temperatura de 259C, valores de pH compr<e endidos entre 4,59 e 9,06 e condutividades correspondentes com preendidas entre 2,290 e 4,720 mS/cm. Dialisaram-se aliquotas de oxido de estanho matéria-prima, oxido de estanho coberto com celobiose modificado superficialmente, vírus de Epstein-Barr de engodo sintetizado e vírus de Epstein-Barr completos, cada um contra as nove soluções e mediram-se então as mo bilidades das partículas em dispersão com forças de campo de 4,0, 5,5, 5,5 e 8,0 mA, respectivamente. Calcularam-se as médias dos valores da mobilidade alcançados simultaneamente pelos 4 detectores em angulo do instrumento foram e registaram-se as médias de 3 determinações por dispersão.

Os engodos de vírus de Epstein-Barr sintetizados e os de controlo foram caracterizados por espectroscopia de correlação fotõnica de imunoaglutinação para determinar a reactividade dos anticorpos nas suas superfícies. A reactividade positiva foi avaliada por incubação do vírus de Epstein-Barr de engodo durante 60 minutos â temperatura de 37,59C com uma mistura de anticorpos monoclonais murinos anti-EBV [ 1 ^ig cada de anti -EBV-VCA; anti-EBV EA-R, anti-EBV MA e anti-EBV EA-D) em lactose a 15%, cloreto de sõdio a 0,9%, tampao HEPES 10 mM e NaNg a 0,2% (DuPont, Wilmington, DE) £. A reactividade de ba se foi avaliada por incubação do vírus de Epstein-Barr simula do com IgG^ murina irrelevante. A especificidade foi avaliada pela reacção do fago lambda de engodo com anticorpos murinos anti-EBV monoclonais. A aglutinação foi medida por espectrosco pia de correlação fotõnica num angulo de 909 /” N4MD, Coulter _7 ·

A intensidade da afinidade dos anticorpos foi avalia^ da por microscopia electronica de transmissão de imuno-ouro

utilizando as partículas e os anticorpos anteriormente referi dos e adicionando-se depois anticorpos marcados com ouro 30 nm anti-murinos secundários £. Faulk W, Taylor G., Immunocolloid method for electron microscopy, Immunochemi s try, 8. (1971) 1081-1083 _7 .

A marcação do vírus de Epstein-Barr de engodo (re acção positiva) foi realizada por incubação de uma mistura de jil de anticorpos monoclonais murinos ΖΓ 1 jig anti-EBV-VCA e jjg-EBV EA-R em 15% de lactose, 0,9% de NaCl, tampão HEPES mM e 0,2% de NaN^ (DuPont) J com uma amostra recente de 0,5 ml de vírus de engodo de Epstein-Barr a temperatura de 37,59C durante 30 minutos numa célula de agitaçao de peso molecular nominal de 300 KD. 0 anticorpo não ligado foi em seguida reti^ rado por ultrafiltração contra 20 ml de tampão de reacção de ~ 2 fosfato e sob uma pressão de azoto de 0,35 Kg/cm (5,0 psi). Apõs a lavagem, incubaram-se 50 jil de anticorpo anti-murino de caprino ligado por covalencia a esferas de ouro de 30 nm / 10 partículas/ml (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) J com 200 ^il das partículas marcadas em uma célula de agitaçao de p£ so molecular nominal 1M, ã temperatura de 37,59C durante 30 mi nutos. Um anticorpo secundário não ligado foi removido por ul^ trafiltração contra 10 ml de tampão de reacção de fosfato.

A marcação de vírus, de Epstein-Barr de engodo (re acção negativa) foi realizada por incubação de 2,5 jil de IgGl não específica policlonal murina [ 1-yig/yil em NaCl 15mM, pH 7,4 (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) J com uma amostra recen te de 0,5 ml de vírus de Epstein-Barr de engodo, como descri, to anteriormente, seguida da mesma lavagem e passos de marcação com ouro. A marcação do fago lambda de controlo de engo-29-

do (reacção negativa) foi realizada por incubação de uma mis. tura de 20 jil de anticorpos anti-EBV monoclonais murinos com o fago lambda de vírus de engodo revestido utilizando o pro. cesso anteriormente descrito em pormenor.

Prepararam-se partículas imunomarcadas em dois dias, para microscopia electrõnica. Utilizou-se uma técnica de imer são directa em que se mergulhou na amostra durante cerca de 5 segundos uma grelha de observação em cobre revestida com carbono (Ted Pella Inc., Redding, CA) e em seguida se fixou com glutaraldeído a 5% durante 1 minuto, para todas as reacções co mo uma técnica de rastreio rãpida. Um outro método envolve a adiçao de glutaraldeído directamente â solução reaccional e em seguida a aglomeração do produto a 16 000 xg durante 5 minutos em 0,5 ml de uma preparaçao de agar mole £ 0,7% de agarose (Sea Kem, Temecula, CA) em água„7, Em seguida os cilindros (plugs) de agar resultantes foram embebidos em plástico e divididos em lâminas de 0,1 yim para observação.

A análise dos controlos positivos e negativos realizou-se por exame por microscopia electrõnica de transmissão das amostras aglomeradas dos produtos da reacção marcados. A inten sidade relativa da ligação com o anticorpo foi determinada me diante contagem do numero de partículas a base de oxido de es tanho que se verificou estarem ligadas âs esferas de ouro (per centagem positiva), registando-se em seguida o numero de esfe ras de ouro ligadas a uma dada partícula (intensidade, numero/ /evento).

As partículas de oxido de estanho ultrafinas mediam 20 a 25 nm de diâmetro e formaram agregados com 80 a 120 nm de diâmetro, por microscopia electrõnica de transmissão. Por es-30-

pectroscopia de correlação fotonica, estas mesmas partículas quando dispersas em agua destilada produziram aglomerados com 154 + 55 nm. As partículas de oxido de estanho eram totalmente cristalinas quando observadas por difracçao de raios X e por difracçao electrónica. A espectroscopia de raios X dispersiva de energia nao evidenciou a presença de outros elementos como impurezas.

A caracterização das proteínas de vírus de Epstein-Barr por SDS-PAGE evidenciou duas bandas de proteínas distin tas. A primeira, com um diâmetro que sugeria glicosilação variável, exibiu um peso molecular aproximado de 350 Kd, o que é consistente com a glicoproteína do invólucro de vírus de Eps_ tein-Barr predominante, A segunda exibiu um peso molecular aproximado de 67 Kd consistente com a albumina sérica que aparentemente se adsorve avidamente ã superfície virai. A HPLC confirmou a presença de duas bandas distintas que exibiram mã ximos de absorção espectrofotometrica a 280 nm, consistentes com proteínas. 0 pico predominante teve um tempo de retenção cromatografico de 10,30 minutos e podia ser suprimido em 90% por anticorpos monoclonais anti VCA, 0 segundo pico, e relativamente menor, exibiu um tempo de retenção cromatografico de 15,75 minutos idêntico, similar aos padrões de albumina serica bovina.

Os estudos de mobilidade electroforética Doppler an teriarmente descritos efectuados a valores de pH compreendidos entre 4,5 e 9,0 demonstraram 3 esquemas distintos. No primeiro, os vírus de Epstein-Barr natural e de engodo, retiveram mobilidades virtualmente idênticas aproximadamente a -1,4 jim-cm/V-s através do intervalo de pH, No segundo, o oxido de es

tanho nao tratado exibiu uma mobilidade aproximada de -1,0 ^um-cm/V-s a um pH de 4,5 que em seguida aumentou rapidamente pa. ra -3,0 pm-cm/V-s para valores de pH de 5,0 ou maiores. No te£ ceiro,o oxido de estanho modificado superficialmente, tratado com celobiose, manteve uma mobilidade aproximada de -1,5 yim-cm/ /V-s atê aumentar rapidamente para -2,5 ^im-cm/V-s a um pH de 7,5.

A espectroscopia de correlação fotonica descrita an teriormente demonstrou que o vírus de Epstein-Barr natural me dia aproximadamente 102+/-32nm e o vírus de Epstein-Barr sintético de engodo mediu aproximadamente 154+/-52nm. 0 vírus de Epstein-Barr sintetizado de engodo, quando reagiu com a mistura de anticorpos monoclonais anti-EBV, aglutinou-se para formar massas de 1534+/-394nm, 0 vírus de Epstein-Barr sintetizado de engodo, quando reagiu com IgG de murino não específico, apenas aumentou ligeiramente de dimensão com diâmetros de aglutinação de 230+/-76nm. 0 fago lambda de engodo, quan do reagiu com a mistura monoclonal anti-EBV, apenas aumentou lígeiramente de dimensão com diâmetros de aglutinação de 170+/ /-35 nm.

A microscopia electronica de transmissão descrita an teriormente, de partículas de vírus de Epstein-Barr de engo⁴do marcado com anticorpo anti-EBV revelou uma frequência de coloraçao por ouro positiva de 23,51% + /-5,53 com uma intensidade de coloração média de 7,41 marcações de ouro por evento.

exame de partículas do vírus de Epstein-Barr de engodo mar cadas com anticorpo IgG murino não específico revelou uma fre. quencia de coloração de ouro positiva de 5,53%+/-2,04 com uma intensidade de coloração média de 1,00 marcações de ouro por

-32evento. 0 exame de partículas de fago lambda de engodo das com o anticorpo anti-EBV revelou uma frequência de co çao de ouro positiva de 7,21%+/-1,26 com uma intensidade loração media de marcações de ouro de 1,06 por evento.

Exemplo 6

Desafio in vivo de anticorpos por vírus de Epstein-Barr engodo (Decoy):

Prepararam-se quatro soluções de sensibilização e ad. ministrou-se uma por cada semana por injecção intramuscular em tres alíquotas de 250 jil a coelhos da Nova Zelandia com uma idade aproximada de 8 semanas. Os primeiros quatro animais rece beram aproximadamente 10^ viriões de vírus de Epstein-Barr com pleto (aproximadamente 32 jig de gp 350 por injecção avaliado por integração da curva de absorção espectrofotometrica a 280 nm QiB.ntra um padrão de albumina de soro bovino de 25 ^tg) dispersos em tampões de reacção de fosfato. Os segundos quatro animais receberam 32 jig de gp 350 por injecção, isolado e purifi. cado utilizando o mesmo protocolo de injecção. 0 terceiro gru po recebeu vírus de Epstein-Barr de engodo (Exemplo 5) sintetizados a partir de uma alíquota de 32^ig de gp 350 por inje£ çao. 0 ultimo grupo recebeu celobiose revestida com oxido de estanho disperso em tampao de reacçao de fosfato. As injecções estavam isentas de adjuvantes. Foi retirado o sangue total uti lizando técnicas assépticas por punção cardíaca, 2 semanas após cada uma das tres injecções e os animais foram sacrificados por punção cardíaca seguida de sedação letal ãs 6 semanas. 0 soro foi extraído por microcentrifugação a 16 Kg de sangue to

tal durante 1 minuto e depois conservado e liofilizado â temperatura de -709C, a aguardar analise.

Os anticorpos imuno-específicos contra viriões de v_í rus de Epstein-Barr total (ABI) foram analisados por ELISA. A proximadamente 10 viriões/ml em tampão de reacção de fosfato foram diluídos a 1:10 em tampao de revestimento e em seguida permaneceram para adsorção durante a noite ã temperatura de 49C em placas de ensaio de policarbonato (Falcon). A afinidade de soro de coelho para os viriões de EBV ligados foi determinada por reacção colorimétrica de fosfatase alcalina de IgG anti- . -coelho de caprino (Sigma) desenvolvida com fosfato de para-nitrofenilo. A concentração de IgG imuno-específica foi dete£ minada por comparação com uma curva de calibração utilizando IgG de coelho nao específico como antigénio adsorvido e subtraindo os valores de base registados nas cavidades que continham soro de coelho estimulados apenas com oxido de estanho.

Recolheu-se o soro de 4 coelhos sensibilizados com 5 xido de estanho que não demonstrou aumento de actividade anti-EBV sobre o soro previamente imunizado em qualquer dos três intervalos de amostragem de duas semanas. Os 3 grupos restantes mostraram um aumento progressivo na concentração de IgG especí_ fico anti-EBV durante um período de 6 semanas. Os animais sensibilizados com proteínas de EBV purificadas apenas mostraram um máximo aproximado de 0,05 jig/^il de IgG anti-EBV ãs seis semanas. Em contraste, os animais sensibilizados com vírus de Eps tein-Barr completo ou com vírus de Epstein-Barr de engodo exibiram uma resposta quatro vezes superior estatisticamente significativa, com aproximadamente 0,20 jig/^il de IgG anti-EBV ãs seis semanas. As respostas imuno-específicas a EBV de engodo

-34e a EBV completo foram virtualmente idênticas.

Como se conclui a partir dos Exemplos 5 e 6, o vírus de Epstein-Barr de engodo sintetizado de acordo com a presen te invenção possui a mesma carga superficial que o vírus natural, e reconhecido específica e avidamente por anticorpos mon£ clonais e provoca anticorpos imuno-específicos com a mesma efi cãcia do vírus completo. Utilizando a espectros copia de correlação fotõnica, calculou-se o numero de partículas que se aglti tínaram nas três condições reaccionais, a partir dos diâmetros medidos dos agregados. Estes cálculos indicaram que os anticoj: pos anti-EBV monoclonais produzem massas aglutinadas constituí das em media por 988,0 partículas EBV de engodo. Os anticorpos IgG de murino não específicos produzem massas aglutinadas constituídas em media por 3,33 partículas EBV de engodo, enquanto os anticorpos monoclonais anti-EBV produzem massas agiu tinadas constituídas em média por 1,35 partículas de fago lambda de controlo de engodo. Estes resultados obtidos demonstram que o potencial de aglutinação determinado de EBV de engodo, de acordo com a presente invenção, é pelo menos tres or dens de grandeza superior ao dos controlos. A microscopia ele£ trõnica de transmissão de imuno-ouro demonstrou que os anticojr pos marcados com ouro de EBV marcado anti-EBV de engodo é 25 a 30 vezes superior ao dos controlos. A analise por ELISA da imuno-especificidade da IgG anti-EBV provocada nos coelhos por EBV'de engodo é idêntica â da resposta provocada por vírus natural e ê 4 vezes superior ã resposta provocada por proteínas purificadas e isoladas,

Os conteúdos totais de todas as referências citadas anteriormente são aqui incorporados por referência.

-35Tendo-se descrito aspectos exemplifícativos da presen te invenção, deve notar-se que estas descrições são apenas exem plificativas e podendo varias outras alternativas, adaptações e modificações ser realizadas no âmbito da presente invenção. Deste modo, a presente invenção não ê limitada aos aspectos es pecíficos aqui descritos, sendo apenas limitada pelas reivindi_ cações seguintes.

Claims

1.- Processo.para a preparação de vacinas utilizadas no tratamento de animais para provocar uma resposta.imunitária que contêm um vírus.de engodo (decoy virus), caracterizado pelo facto

- de se prepararem partículas centrais (núcleos) com um diâmetro compreendido entre, aproximadamente, 10 e 20 nanometros ;

- de se revestir, pelo menos, uma parte da superfície dos núcleos resultantes, com uma .substância que proporciona uma energia superficial limiar suficiente para fixar péptidos ou pro teínas activas sob o ponto de vista imunológico sem provocar a desnaturação desses péptidos e dessas proteínas;

- de se fixarem sobre o núcleo revestido resultante, pelo menos, um peptido ou uma proteína virai reactiva sob o pon to de vista imunológico para se obterem os vírus de engodo pretendidos 7 e

- de se dispersarem os vírus de engodo assim prepara dos em um veículo aceitável em farmácia.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como substância de revesti mento em açúcar básico_r .um açúcar modificado ou um oligonucleotido.

3. - -.Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de .se utilizar como substância de revestimen to a celobiose.

4. - Processo de acordo com a reivindica.ção 1, caracterizado pelo facto de se utilizarem partículas centrais (núcleos) constituídas por.um metal, uma espécie mineral ou um polímero .

5.- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se utilizar um metal escolhido entre crómio, rubídio, ferro, zinco, selenio, níguel, ouro, prata e plati na.

6.- Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se utilizar uma espécie mineral escolhida entre sílica, óxido de alumínio, óxido de ruténio, carvão e óxido de estanho.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se utilizar como polímero o poli(estireno) .

8. - Processo de acordo com a reivindicação 1,.caracterizado pelo facto.de se utilizar um peptido ou uma proteína vi ral isolada do vírus de Epstein-Barr, do vírus da ..imunodeficiência humana, dos'-vírus dos papilomas humanos, do vírus do .herpes no homem ou . do poxvírus.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de se utilizar um peptido ou uma proteína vi ral isolada do vírus de Epstein-Barr.

10. - Processo de acordo com a reivindicação 6, carac terizado pelo facto de se utilizarem partículas centrais (núcleos) constituídas, essencialmente, por óxido de estanho.

11. - Processo de acordo com a reivindicação 6, carac terizado pelo facto de se utilizarem partículas centrais (nú-39- cleos) constituídas, essencialmente, por carbono puro (diamante) .

12. - Processo de acordo com a reivindicação 10, carac terizado pelo facto de se utilizar como substância de revestimento a celobiose.

13. - Processo de acordo com a reivindicação 12, carac terizado pelo facto de se utilizar peptido ou uma proteína virai isolada do vírus de Epstein-Barr.

14. - Método de vacinação de animais. para desencadear a produção de anticorpos contra um agente infeccioso virai, carac terizado pelo facto de se administrar a esse animal uma quantidade suficiente para provocar uma resposta imunitária capaz de desencadear a produção de anticorpos contra o agente infeccioso virai em causa, do vírus de engodo (decoy virus) preparado pelo processo de acordo com-a reivindicação 1.

15, - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de se escolher o agente infeccioso virai entre o vírus de Eptein-Barr, o vírus da imunodeficiencia humana, os vírus dos papilomas humanos, o vírus do herpes no homem ou o poxvírus.

16.- Método de acordo com a reivindicação 15, carace>

terizado pelo facto do agente infeccioso virai ser o vírus de

Epstein-Barr.