JPS60208997A - ポリヌクレオチド配列検出法 - Google Patents
ポリヌクレオチド配列検出法Info
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
相補的標識付プローブに対するハロブリッド形成をする
それらの能力により特定標的ポリヌクレオチド配列を検
出することは分子生物学の重大な観点である。現在画法
く使用されている古典的な方法は、３２−Ｐ−放射線標
識付一重鎖ポリヌクレオチドプローブを用意し、ハイブ
リッド形成条件下標的配列をできるなら含有する試料を
標識付プローブと接触させ、未反応標識付プローブを除
去し、試料との関連において標識の存在または不存在を
観察することにある。
それらの能力により特定標的ポリヌクレオチド配列を検
出することは分子生物学の重大な観点である。現在画法
く使用されている古典的な方法は、３２−Ｐ−放射線標
識付一重鎖ポリヌクレオチドプローブを用意し、ハイブ
リッド形成条件下標的配列をできるなら含有する試料を
標識付プローブと接触させ、未反応標識付プローブを除
去し、試料との関連において標識の存在または不存在を
観察することにある。
未反応プローブから反応したプローブを分離することを
容易にするため、試料は通常例えばニトロセルロースフ
ィルター上に不動態化する。
容易にするため、試料は通常例えばニトロセルロースフ
ィルター上に不動態化する。
この方法の非常に多くの改変および改良か提案されてお
り、これらの中の幾つかを下記に示す。 □ジエイ・イ
ーのマンニング等はシトクロムＣ架橋を介してＲＮＡに
ビオチンを共有結合的に結合させた〔り０７ン？ （ｏ
ｈｒｏｍａｓｏｍａ ） （ベルリン）第５３巻第１０
７頁〜第１１７頁（１９７５年）参照〕。プローブとし
て化学的に変性したＲＮＡを使用した。標的に対してハ
イブリッド形成後、ビオチン標識をアビジンで被覆した
ポリメタクリレートミクロスフェアによって観察した、
このミクロスフェアは走査電子顕微鏡で見ること〃Ｓで
きた。この方法は放射性材料の使用を避ける利点を有し
ていた。しかし標識系が複雑であり、この方法は知る限
りにおいて、産業上使用されていなかった。
り、これらの中の幾つかを下記に示す。 □ジエイ・イ
ーのマンニング等はシトクロムＣ架橋を介してＲＮＡに
ビオチンを共有結合的に結合させた〔り０７ン？ （ｏ
ｈｒｏｍａｓｏｍａ ） （ベルリン）第５３巻第１０
７頁〜第１１７頁（１９７５年）参照〕。プローブとし
て化学的に変性したＲＮＡを使用した。標的に対してハ
イブリッド形成後、ビオチン標識をアビジンで被覆した
ポリメタクリレートミクロスフェアによって観察した、
このミクロスフェアは走査電子顕微鏡で見ること〃Ｓで
きた。この方法は放射性材料の使用を避ける利点を有し
ていた。しかし標識系が複雑であり、この方法は知る限
りにおいて、産業上使用されていなかった。
エム・レンツはヒストンＨ１架ｍを介して一重鎖ＤＮＡ
にビオチンを共有結合的に結合させた〔イーエムビーオ
・ジエイ （ＥＭＢＣＩ Ｊ ）第２巻第８１７頁〜第
８２２頁（１９８３年）参照）。
にビオチンを共有結合的に結合させた〔イーエムビーオ
・ジエイ （ＥＭＢＣＩ Ｊ ）第２巻第８１７頁〜第
８２２頁（１９８３年）参照）。
プ°ローブとして使用するとき、ビオチン標識はアビジ
ン−ペルオキシダーゼ複合体によって検出できた。
ン−ペルオキシダーゼ複合体によって検出できた。
インステイデューツ・パスツールでは、特定標的ポリヌ
クレオチド配列のための酵素分析の基本としてマンユン
グ法（前述した）を使用した（英国特叶第２０１９４０
８号参照）。アビジン−酵素複合体によるプローブへの
酵素標識の結合、これによるアビジンのビオチンへの結
合か記載されている。
クレオチド配列のための酵素分析の基本としてマンユン
グ法（前述した）を使用した（英国特叶第２０１９４０
８号参照）。アビジン−酵素複合体によるプローブへの
酵素標識の結合、これによるアビジンのビオチンへの結
合か記載されている。
スタンダード春オイル・カンパニイは光標識付プローブ
を用いた標的−重鎖ポリヌクレオチドのための分析を発
表しているか、プローブのｆｌ）ｉ。９い−ｒ ＋ｉ
ｓ、ｈ Ｌ−ｃい４い（ａ −ｏ ７ ／、 １特許第
７０６８７号参照）。
を用いた標的−重鎖ポリヌクレオチドのための分析を発
表しているか、プローブのｆｌ）ｉ。９い−ｒ ＋ｉ
ｓ、ｈ Ｌ−ｃい４い（ａ −ｏ ７ ／、 １特許第
７０６８７号参照）。
エール・ユニバーシティは、ビオチンをヌクレオチドに
結合しうろことを発表している（ヨーロッパ特許第６３
８７９号参照）。形成される変性ヌクレオチドは、相補
的標的ポリヌクレオチド配列を検出するための標識付プ
ローブとして使用するためポリヌクレオチド鎖中に導入
できる。
結合しうろことを発表している（ヨーロッパ特許第６３
８７９号参照）。形成される変性ヌクレオチドは、相補
的標的ポリヌクレオチド配列を検出するための標識付プ
ローブとして使用するためポリヌクレオチド鎖中に導入
できる。
ヒュおよびメリックは放射性標識灯Ｍ１３プローブの製
造方法を発表している〔ジーイーエヌイー第１７巻（１
９８２年）第２７１頁〜第２７７頁参照〕。プローブ配
列を一重鎖Ｍ１３ファージ中に挿入した。相補的鎖のＤ
ＮＡ合成か放射性標識ヌクレオチドを用いて開始された
〃）、完了にまで進行しなかった。従ってプローブ配列
は一重鎖ρ）残っていた。
造方法を発表している〔ジーイーエヌイー第１７巻（１
９８２年）第２７１頁〜第２７７頁参照〕。プローブ配
列を一重鎖Ｍ１３ファージ中に挿入した。相補的鎖のＤ
ＮＡ合成か放射性標識ヌクレオチドを用いて開始された
〃）、完了にまで進行しなかった。従ってプローブ配列
は一重鎖ρ）残っていた。
オリオン・コーポレイションは、一つが不動態化され、
他か標識付された二つのプローブを使用することを含む
一重鎖標的のための分析を発表している。各プローブは
標的の異なるポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成
する。ハイブリッド形成混合物中の不動態化標識の存在
は、分析試料中の一重鎖標的の存在を示す（ヨーロッパ
特許第７９１３９号参照）っ ハンおよびバーディングはＭ１３サブクローンを同定す
るためのプローブとして１２５− Ｉ標識付−重鎖Ｍ１
３クローンの使用を発表している〔ヌクレイツク・アシ
ッド・リサーチ第１１巻第７号（１９８３年）第２０５
３頁〜第２０６４頁参照〕。
他か標識付された二つのプローブを使用することを含む
一重鎖標的のための分析を発表している。各プローブは
標的の異なるポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成
する。ハイブリッド形成混合物中の不動態化標識の存在
は、分析試料中の一重鎖標的の存在を示す（ヨーロッパ
特許第７９１３９号参照）っ ハンおよびバーディングはＭ１３サブクローンを同定す
るためのプローブとして１２５− Ｉ標識付−重鎖Ｍ１
３クローンの使用を発表している〔ヌクレイツク・アシ
ッド・リサーチ第１１巻第７号（１９８３年）第２０５
３頁〜第２０６４頁参照〕。
これらの全て先行研究者は標的配列とハイブリッド形成
させるため標識材−重鎮ポリスクレオチドプローブを使
用した。それぞれの異なる分析のための各プローブは別
々に樟識付けされなければならない。プローブの標識付
は必ず追加工製造工程を含み、これは成る場合には困難
なものである。本発明は、標的配列に対相補的でなけれ
ばならなぬことかなく、従って種々異なる標的に対する
分析に使用できる標識付二次プローブの使用によってこ
の問題を避けることを探求する。
させるため標識材−重鎮ポリスクレオチドプローブを使
用した。それぞれの異なる分析のための各プローブは別
々に樟識付けされなければならない。プローブの標識付
は必ず追加工製造工程を含み、これは成る場合には困難
なものである。本発明は、標的配列に対相補的でなけれ
ばならなぬことかなく、従って種々異なる標的に対する
分析に使用できる標識付二次プローブの使用によってこ
の問題を避けることを探求する。
原則的にポリヌクレオチド標的にハイブリッド形成させ
るための一部プローブ、およびホモポリマテーリングま
たは粘着末端テールまたはプラントエンド連結反応によ
り一部プローブに続いて結合すべき標識付二次プローブ
を提供することが可能であろう。しかしかかる方法は、
それか注意深く制御された条件の下で行なわれる複雑な
工程を必要とするため満足できるものでなく、本発明の
一部を形成しない。
るための一部プローブ、およびホモポリマテーリングま
たは粘着末端テールまたはプラントエンド連結反応によ
り一部プローブに続いて結合すべき標識付二次プローブ
を提供することが可能であろう。しかしかかる方法は、
それか注意深く制御された条件の下で行なわれる複雑な
工程を必要とするため満足できるものでなく、本発明の
一部を形成しない。
本発明は、
＜−）複合−重鎖ポリヌクレオチド配列を有する標識付
ポリヌクレオチド二次プローブ、および（ｂ）二次プロ
ーブの複合配列に対し相補的な複合−重鎮配列および標
的に対し相補的な一重鎖配列を有するポリヌクレオチド
−次プローブの使用を含む試料中の特定標的ポリヌクレ
オチド配列を検出する方法を提供し、この方法は、（１
）ハイブリッド形成条件下試料を一部プローブと接触し
、 （１１）上記接触前、接触中または接触後に一部プロー
ブに対し標識付二次プローブをハイブリッド形成させ、
そして （Ｉｌｌ） Ｊ￥４的配列配列在または不存在を示すも
のとして、試料との関連において標識の存在または不存
在を観察する 工程を含む。
ポリヌクレオチド二次プローブ、および（ｂ）二次プロ
ーブの複合配列に対し相補的な複合−重鎮配列および標
的に対し相補的な一重鎖配列を有するポリヌクレオチド
−次プローブの使用を含む試料中の特定標的ポリヌクレ
オチド配列を検出する方法を提供し、この方法は、（１
）ハイブリッド形成条件下試料を一部プローブと接触し
、 （１１）上記接触前、接触中または接触後に一部プロー
ブに対し標識付二次プローブをハイブリッド形成させ、
そして （Ｉｌｌ） Ｊ￥４的配列配列在または不存在を示すも
のとして、試料との関連において標識の存在または不存
在を観察する 工程を含む。
添付図面はこの方法を実施する一つの方法を示す工程図
である。
である。
複合ポリヌクレオチド配列は、不均一な順序で配列され
た二つ以上、一般には全部で四つのヌクレオチドを含有
する配列である。全ての天然に産するＤＮＡおよびＲＮ
Ａは複合配列から作られている。ホモポリマーテールは
複合配列でない。
た二つ以上、一般には全部で四つのヌクレオチドを含有
する配列である。全ての天然に産するＤＮＡおよびＲＮ
Ａは複合配列から作られている。ホモポリマーテールは
複合配列でない。
この方法の工程（１）は、ハイブリッド形成条件丁に試
料を一部プローブと接触させることを含む。試料か特定
標的ポリヌクレオチド配列を含有するきき、これは−次
プローブの相補的−重鎖配列とハイブリッド形成をする
。標的配列はハイブリッド形成を可能にするに充分な長
さである、即ち一般に１０以上のヌクレオチドを含有し
、所望される長さであることかできる。
料を一部プローブと接触させることを含む。試料か特定
標的ポリヌクレオチド配列を含有するきき、これは−次
プローブの相補的−重鎖配列とハイブリッド形成をする
。標的配列はハイブリッド形成を可能にするに充分な長
さである、即ち一般に１０以上のヌクレオチドを含有し
、所望される長さであることかできる。
標的に対し相補的である一部プローブのための一重鎖ポ
リヌクレオチド配列を合成もしくは得るための方法は、
当業者に良く知られており、ここＣζ説明しない。得ら
れたときこの一部プローブ配列はしばしば精製し再生す
る必要かある。
リヌクレオチド配列を合成もしくは得るための方法は、
当業者に良く知られており、ここＣζ説明しない。得ら
れたときこの一部プローブ配列はしばしば精製し再生す
る必要かある。
本発明の好ましい特徴によれば、こ１′シはプローブ切
片をファージＭ１３の如き一重鎖ＤＮＡベクター中に連
結反応させ、好適な微生物中にベクターをクローニング
することによって達成できる。形成される一重鎖ＤＮＡ
ベクターは、標的に対し相補的な配列、および二次プロ
ーブに対し相補的な配列（ベクターの残余の全部諌たは
−部）を含有し、−次プローブとして変化させずに使用
できる。しかしなからベクターは制限酵素によって切片
に分割もしくは線状化できる。
片をファージＭ１３の如き一重鎖ＤＮＡベクター中に連
結反応させ、好適な微生物中にベクターをクローニング
することによって達成できる。形成される一重鎖ＤＮＡ
ベクターは、標的に対し相補的な配列、および二次プロ
ーブに対し相補的な配列（ベクターの残余の全部諌たは
−部）を含有し、−次プローブとして変化させずに使用
できる。しかしなからベクターは制限酵素によって切片
に分割もしくは線状化できる。
あるいはプローブ配列はベクターから除去でき、他の複
合ポリヌクレオチド配列中に導入できる。
合ポリヌクレオチド配列中に導入できる。
−次プローブは一重鎖であるのが好ましいか、それは部
分的にもしくは全体釣書こ二重鎖であることかできる。
分的にもしくは全体釣書こ二重鎖であることかできる。
初めに全体が二重鎖であるならば、−次プローブは、例
えば試料と接触させる前番と（熱）変性させることによ
り、−重鎮の形に変えなければならない。部分的二重鎖
−次プローブは、−重鎖配列か標的詔よび二次プローブ
に対し相補的である一重鎖配列ＩＪ）存在するならば変
性する必要はない。
えば試料と接触させる前番と（熱）変性させることによ
り、−重鎮の形に変えなければならない。部分的二重鎖
−次プローブは、−重鎖配列か標的詔よび二次プローブ
に対し相補的である一重鎖配列ＩＪ）存在するならば変
性する必要はない。
二次プローブは一部プローブの一部に対すし相補的な複
合−重鎖ポリヌクレオチド配列を含有する。−次プロー
ブかＭ２Ｓの如き一重鎖ＤＮＡベクターを基にしている
とき、二次プローブは、例えば使用直前に変性すること
によって、−重鎖の形に変えることのできるベクターの
複製型分子から誘導するとよい。−次プローブかＲＮＡ
のものであるとき、二次プローブは相補的ＤＮＡ配列を
含むとよい。−次プローブかＤＮＡのものであるとき、
二次プローブはＲＮＡのものであるのか有利であり、Ｒ
ＮＡプローブの製造法は最近発表された〔ジャーナル・
オブ・セル、第３２巻（１９８３年）第６８１頁〜第６
９４貞、エム・アール・グリーン；ティ・マニアテイス
：デイ・ニー拳メルトン〕。
合−重鎖ポリヌクレオチド配列を含有する。−次プロー
ブかＭ２Ｓの如き一重鎖ＤＮＡベクターを基にしている
とき、二次プローブは、例えば使用直前に変性すること
によって、−重鎖の形に変えることのできるベクターの
複製型分子から誘導するとよい。−次プローブかＲＮＡ
のものであるとき、二次プローブは相補的ＤＮＡ配列を
含むとよい。−次プローブかＤＮＡのものであるとき、
二次プローブはＲＮＡのものであるのか有利であり、Ｒ
ＮＡプローブの製造法は最近発表された〔ジャーナル・
オブ・セル、第３２巻（１９８３年）第６８１頁〜第６
９４貞、エム・アール・グリーン；ティ・マニアテイス
：デイ・ニー拳メルトン〕。
二次プローブを標識付する。これによって、分析を行な
う人か、必要ならば更に処理した後二次プローブの存在
を検出するような方法で、プローブを同位体的にまたは
化学的に変性することを意味する。標識の種類に厳密な
規制はない、それは放射性原子または酵素の成分または
螢光または化学発光系、または単に化学基であることρ
）でき、これによってかかる成分を続いて加えることか
できる。ポリヌクレオチドを標識化するための方法は当
業者に良く知られており、ここに説明しない。その幾つ
かは前述した先行文献に記載されている。−次プローブ
に対し相補的である二次プローブの一重鎖配列は標識付
してもよい〃）その必要はない。二次プローブの標識付
部分は部分的にまたは全５体的に二重鎖であることかで
きる。
う人か、必要ならば更に処理した後二次プローブの存在
を検出するような方法で、プローブを同位体的にまたは
化学的に変性することを意味する。標識の種類に厳密な
規制はない、それは放射性原子または酵素の成分または
螢光または化学発光系、または単に化学基であることρ
）でき、これによってかかる成分を続いて加えることか
できる。ポリヌクレオチドを標識化するための方法は当
業者に良く知られており、ここに説明しない。その幾つ
かは前述した先行文献に記載されている。−次プローブ
に対し相補的である二次プローブの一重鎖配列は標識付
してもよい〃）その必要はない。二次プローブの標識付
部分は部分的にまたは全５体的に二重鎖であることかで
きる。
一部プローブに対して相補的である二次プローブの一重
鎖配列は、−次プローブで強力にハイブリッド形成する
のに充分な長さ、例えば少なくとも１４のヌクレオチド
であるべきであり、所望の限り長いことかよい。二次プ
ローブの標識付された部分は標識の充分な量を担持する
のに充分な長さであるべきである。二次プローブは標識
付されており、−次プローブの全長に沿って一部プロー
ブに対して相補的であるのか好ましい。
鎖配列は、−次プローブで強力にハイブリッド形成する
のに充分な長さ、例えば少なくとも１４のヌクレオチド
であるべきであり、所望の限り長いことかよい。二次プ
ローブの標識付された部分は標識の充分な量を担持する
のに充分な長さであるべきである。二次プローブは標識
付されており、−次プローブの全長に沿って一部プロー
ブに対して相補的であるのか好ましい。
標淑付された二次プローブは好適な複合−重鎖相補的配
列を有する任意の一部プローブと共に使用できる。従っ
て二次プローブはストックポリヌクレオチドを基にし、
多数の異なる標的ポリヌクレオチド配列のための分析に
おいて使用するためバルクの形で標識付できる。
列を有する任意の一部プローブと共に使用できる。従っ
て二次プローブはストックポリヌクレオチドを基にし、
多数の異なる標的ポリヌクレオチド配列のための分析に
おいて使用するためバルクの形で標識付できる。
本発明による種々の分析法を側によって下記に示す。
（−）図面を参照し、標的配列１０を含有する試料を通
常の方法で不動態化する。この状態で、それを挿入され
るプローブ配列１４ （標的配列に対し相補的である）
を有する一重鎖ベクター（例えばＭ２Ｓを基にしたもの
）とハイブリッド形成条件下接触させる。通常の方法で
、ベクター（例えばＭ２Ｓ）の二重鎖分子１６を放射能
的に（または他の形で）標識付しく椋藏は点２０で示す
）、次いで使用直前に二重鎖構造を変性して二次プロー
ブ１８を形成した。所望によって、過剰の未反応−次プ
ローブを洗浄によって除去した後、再びハイブリッド形
成条件下試料をこの欅識付二次プローブの溶液と接触さ
せる。−重鎮の幾らかは相互に貴ハイブリッド形成する
、しかしその他１８は不動態化試料に結合した一部プロ
ーブに結合する。試料に結合しなかった標識は洗浄によ
って除去する。その後、試料中の標的配列の存在または
不存在を示すものとして試料に結合した標識の存在また
は不存在を観察する。
常の方法で不動態化する。この状態で、それを挿入され
るプローブ配列１４ （標的配列に対し相補的である）
を有する一重鎖ベクター（例えばＭ２Ｓを基にしたもの
）とハイブリッド形成条件下接触させる。通常の方法で
、ベクター（例えばＭ２Ｓ）の二重鎖分子１６を放射能
的に（または他の形で）標識付しく椋藏は点２０で示す
）、次いで使用直前に二重鎖構造を変性して二次プロー
ブ１８を形成した。所望によって、過剰の未反応−次プ
ローブを洗浄によって除去した後、再びハイブリッド形
成条件下試料をこの欅識付二次プローブの溶液と接触さ
せる。−重鎮の幾らかは相互に貴ハイブリッド形成する
、しかしその他１８は不動態化試料に結合した一部プロ
ーブに結合する。試料に結合しなかった標識は洗浄によ
って除去する。その後、試料中の標的配列の存在または
不存在を示すものとして試料に結合した標識の存在また
は不存在を観察する。
（ｂ）標的は（ａ）における如くであるが、二次プロー
ブの溶液を先づハイブリッド形成条件下、−次プローブ
の溶液と混合する。
ブの溶液を先づハイブリッド形成条件下、−次プローブ
の溶液と混合する。
不動態化された試料は形成された混合物と接触させる。
ハイブリッド形成後、試料に結合しなかった過剰の未反
応標識は洗浄によって除去する。これは、標的配列に対
し一部プローブをハイブリッド形成させるのに必要な条
件ＸＪ３二次プローブから標識をロスさせないならば（
、）に対し魅力的な改変である。
応標識は洗浄によって除去する。これは、標的配列に対
し一部プローブをハイブリッド形成させるのに必要な条
件ＸＪ３二次プローブから標識をロスさせないならば（
、）に対し魅力的な改変である。
（、）−次プローブをプローブ配列を含有する二重鎖Ｄ
ＮＡベクターから誘導する。これは変性し、所望によっ
て使用直前に制限酵素の作用も受けさせる。形成される
溶液は種々の一重鎮ＤＮＡ鎖を含有し、その幾らかまた
は全部かプローブ配列を含む。ハイブリッド形成条件下
この溶液と不動態化試料を接触させたとき、プローブ配
列は標的配列に対しハイブリッド化されるようになり、
プローブの部分再ハイブリッド形成か生起し、部分的−
重鎖および部分的二重鎖である不動態化プローブを生ず
る。次に櫟職付プローブをこれらの一重鎖部分にハイブ
リッド形成させる。
ＮＡベクターから誘導する。これは変性し、所望によっ
て使用直前に制限酵素の作用も受けさせる。形成される
溶液は種々の一重鎮ＤＮＡ鎖を含有し、その幾らかまた
は全部かプローブ配列を含む。ハイブリッド形成条件下
この溶液と不動態化試料を接触させたとき、プローブ配
列は標的配列に対しハイブリッド化されるようになり、
プローブの部分再ハイブリッド形成か生起し、部分的−
重鎖および部分的二重鎖である不動態化プローブを生ず
る。次に櫟職付プローブをこれらの一重鎖部分にハイブ
リッド形成させる。
（ｄ）或いは、標識付二次プローブの溶液は、不動態化
試料と接触後よりもむしろ前に一重鎮ＤＮＡ鎖の溶液に
加えることかできる。
試料と接触後よりもむしろ前に一重鎮ＤＮＡ鎖の溶液に
加えることかできる。
（ｅ）−次プローブをプローブ配列を含有する二重鎖Ｄ
ＮＡベクターから誘導する。二次プローブを！ｓ識付し
た対応する二重鎖ＤＮＡベクターから誘導する。二つの
プローブの混合物を先づ変性し、次いでハイブリッド形
成条件下に不動態化試料に加える。−次プローブの幾ら
かは標的に対しハイブリッド化されるようになり、二次
プローブの幾らかは一部プローブにハイブリッド化され
るようになる。
ＮＡベクターから誘導する。二次プローブを！ｓ識付し
た対応する二重鎖ＤＮＡベクターから誘導する。二つの
プローブの混合物を先づ変性し、次いでハイブリッド形
成条件下に不動態化試料に加える。−次プローブの幾ら
かは標的に対しハイブリッド化されるようになり、二次
プローブの幾らかは一部プローブにハイブリッド化され
るようになる。
この配置は当然生起する再ハイブリッド形成の実質的な
量のため比較的非効率であるが、二重鎖ＤＮＡから誘導
された一部プローブおよび二次プローブを使用する利点
を有する。
量のため比較的非効率であるが、二重鎖ＤＮＡから誘導
された一部プローブおよび二次プローブを使用する利点
を有する。
（ｆ）溶液の形で標的配列を用いて方法を実施すること
もできる。事実これはハイブリッド形成反応の効率にお
いて有用な改良を生ぜしめつる。
もできる。事実これはハイブリッド形成反応の効率にお
いて有用な改良を生ぜしめつる。
例えば標的配列を含有する試料をハイブリッド形成条件
下−重鎖一部プローブの溶液と接触させる。溶液をヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィ理して一重鎖配列
（ハイブリッド形成してない一部プローブ）から部分的
な二重鎖配列（標的に対しハイブリッド形成された一部
プローブ）を分離する。部分的二重鎖配列を含有する溶
液を次いでハイブリッド形成条件下標識材−重鎖二次ブ
ローブの溶液と接触させる。残存−重鎖配列を８１の如
き酵素で単一ヌクレオチドに破壊し、除去する。その後
、溶液中の標的の存在または不存在を、試料中の標的配
列の存在または不存在を示すものとして観察する。
下−重鎖一部プローブの溶液と接触させる。溶液をヒド
ロキシルアパタイトクロマトグラフィ理して一重鎖配列
（ハイブリッド形成してない一部プローブ）から部分的
な二重鎖配列（標的に対しハイブリッド形成された一部
プローブ）を分離する。部分的二重鎖配列を含有する溶
液を次いでハイブリッド形成条件下標識材−重鎖二次ブ
ローブの溶液と接触させる。残存−重鎖配列を８１の如
き酵素で単一ヌクレオチドに破壊し、除去する。その後
、溶液中の標的の存在または不存在を、試料中の標的配
列の存在または不存在を示すものとして観察する。
溶液中で試験を行なうための別の方法は当業者には容易
に思いつくであろう。これらの方法には（−）〜（ｅ）
として上述した方法の改変−を含み、ヒドロキシルアパ
タイトクロマトグラフィまたは他の分離媒体および／ま
たは一重鎖ポリヌクレオチドに対し特異である他の加水
分解性酵素を基にした既知の分離法を使用してもよ（、
ＲＮＡプローブを含有してもよい。
に思いつくであろう。これらの方法には（−）〜（ｅ）
として上述した方法の改変−を含み、ヒドロキシルアパ
タイトクロマトグラフィまたは他の分離媒体および／ま
たは一重鎖ポリヌクレオチドに対し特異である他の加水
分解性酵素を基にした既知の分離法を使用してもよ（、
ＲＮＡプローブを含有してもよい。
下記実施例は本発明を示す。この方法は上記（、）に記
載した方法である。
載した方法である。
材料
標的ＤＮＡ ニブラスミドベクターｐＡＴ１５３（ｐＨ
ＰＬ）中にクローニングしたヒト胎盤性ラクターゲン（
ＨＰＬ ）。
ＰＬ）中にクローニングしたヒト胎盤性ラクターゲン（
ＨＰＬ ）。
−次プローブ：バクテリオファージＭ１３中にクローニ
ングしたＨＰＬ特定ＤＮＡ （Ｍ１３ （ＨＰＬ））ｉこれはＨＰＬおよびファージ
Ｍ１３特定配列 の両者を有する一重鎖ＤＮＡを与 える。
ングしたＨＰＬ特定ＤＮＡ （Ｍ１３ （ＨＰＬ））ｉこれはＨＰＬおよびファージ
Ｍ１３特定配列 の両者を有する一重鎖ＤＮＡを与 える。
二次プローブ二樟準エックストランスレージョン法を用
い（”Ｐ）で４１！織付した ファージＭ ｌ ３ ＤＮＡの複製（二東鎖）分子（Ｍ
１３ＲＦ）。（こ のプローブは一次プローブの Ｍ１３部分とハイブリッド形成 する） ハイブリッド形成条件：６ＸＳＳＣ（Ｉ Ｘ５ＳＣ＝
０１１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５ Ｍクエン酸ナトリウム）；５０ ｐ９／ｍｅの牛胸腺ＤＮＡ （音波処 理および変処理した）；０．１ ％ドデシル硫酸ナトリウム（ ｓｎｓ）；５Ｘデンハーツ溶液 （０，１％フィコール、０．１％ 牛血清アルブミン、０．１％ポ リビニルピロリドン）；１０ ％デキストランサルフェート。
い（”Ｐ）で４１！織付した ファージＭ ｌ ３ ＤＮＡの複製（二東鎖）分子（Ｍ
１３ＲＦ）。（こ のプローブは一次プローブの Ｍ１３部分とハイブリッド形成 する） ハイブリッド形成条件：６ＸＳＳＣ（Ｉ Ｘ５ＳＣ＝
０１１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５ Ｍクエン酸ナトリウム）；５０ ｐ９／ｍｅの牛胸腺ＤＮＡ （音波処 理および変処理した）；０．１ ％ドデシル硫酸ナトリウム（ ｓｎｓ）；５Ｘデンハーツ溶液 （０，１％フィコール、０．１％ 牛血清アルブミン、０．１％ポ リビニルピロリドン）；１０ ％デキストランサルフェート。
方法
４０ｐｇのＨＰＬ （即ちヒトゲノムＤＮＡ １０声ｑ
中のＨＰＬ ＤＮＡの濃度に等しい）をアガロースゲル
上に通し、標準法を用いてニトロセルロースに転移させ
た、８０℃で２時間ｐＨＰＬ ＤＮＡを含有する二つの
同じニトロセルロースフィルターを焼いた後、それらを
２ＸＳＳＣ中に浸漬し、次いで６５℃で２時間ハイブリ
ッド化溶液中に置いた。次にフィルター（−）を再封止
バッグ中の新しいハイブリッド化溶液５ ｍｅに置き、
フィルター（ｂ）は同様に新しいハイブリッド化溶液５
ｍｅと２ｆｉりのＭ ｌ ３ （ＨＰＬ） ＤＮＡを
含有するバッグ中に封入した。両バッグを更に２時間６
５℃で部首した。次いで両フィルターを０．１％のＳＤ
Ｓを含有する５Ｑｍｅの２ Ｘ ＳＳＣ中で６５℃で１
５分間２回洗浄した。それらを次いで、５ｓｐ（比放射
能的１ ＋ １０’ ｏｐｍ ／ｐ））で標識材した熱
変性Ｍ１３ＲＦ１００声りを直前に加えたハイブリッド
形成−溶液２５ｒｎｅ中で６５℃で１６時間温部首た。
中のＨＰＬ ＤＮＡの濃度に等しい）をアガロースゲル
上に通し、標準法を用いてニトロセルロースに転移させ
た、８０℃で２時間ｐＨＰＬ ＤＮＡを含有する二つの
同じニトロセルロースフィルターを焼いた後、それらを
２ＸＳＳＣ中に浸漬し、次いで６５℃で２時間ハイブリ
ッド化溶液中に置いた。次にフィルター（−）を再封止
バッグ中の新しいハイブリッド化溶液５ ｍｅに置き、
フィルター（ｂ）は同様に新しいハイブリッド化溶液５
ｍｅと２ｆｉりのＭ ｌ ３ （ＨＰＬ） ＤＮＡを
含有するバッグ中に封入した。両バッグを更に２時間６
５℃で部首した。次いで両フィルターを０．１％のＳＤ
Ｓを含有する５Ｑｍｅの２ Ｘ ＳＳＣ中で６５℃で１
５分間２回洗浄した。それらを次いで、５ｓｐ（比放射
能的１ ＋ １０’ ｏｐｍ ／ｐ））で標識材した熱
変性Ｍ１３ＲＦ１００声りを直前に加えたハイブリッド
形成−溶液２５ｒｎｅ中で６５℃で１６時間温部首た。
両フィルターを次いで２ Ｘ ！９ＳＣに０．１％ＳＤ
Ｓを加えたものの中で３０分間６５℃で洗浄しく３０分
づつ２回洗浄）、次いで０． Ｉ Ｘ ＳＳＣに０．１
％ＳＤＳを加えたもので洗浄（３０分づつ２回洗浄）し
た。次いでそれらを乾燥してオートラジオグラフィした
。オートラジオグラフしたフィルムを現像したとき、ｐ
ＨＰＬ ＤＮＡの位置に相当するフィルター（ｂ）上に
〔しかしフィルター（−）上ではない〕にバンドが観票
された。
Ｓを加えたものの中で３０分間６５℃で洗浄しく３０分
づつ２回洗浄）、次いで０． Ｉ Ｘ ＳＳＣに０．１
％ＳＤＳを加えたもので洗浄（３０分づつ２回洗浄）し
た。次いでそれらを乾燥してオートラジオグラフィした
。オートラジオグラフしたフィルムを現像したとき、ｐ
ＨＰＬ ＤＮＡの位置に相当するフィルター（ｂ）上に
〔しかしフィルター（−）上ではない〕にバンドが観票
された。
これは、ｐＨＰＬ ＤＮＡが一次および二次プローブの
複合体によって検出されていることを証明している。
複合体によって検出されていることを証明している。
図面は本発明方法の工程図である。
図面の浄書（内容に変更なし）
手続補正書
昭和７６年７月９ 日
特許庁士官 志賀学 殿
ηで９ヌ２し尤チドい乙刈孝彰之）入
３、補正をする者
事件との関係 許ミ”１ｔＡ々人
４、代理人
Ｚ木村ｔゆｌ＝ｌ殊
１〉狽（：１Ｍ−Ａ）り、滑入９イ主すＦ「口ν゛４℃
（閂１透玖４ｉ繁 １とンｌ【【４こ１〜゛（↑ミ九へ
） １ 迦４月目勺（けｉ（も６） １邑
（閂１透玖４ｉ繁 １とンｌ【【４こ１〜゛（↑ミ九へ
） １ 迦４月目勺（けｉ（も６） １邑
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）複合−重鎮ポリヌクレオチド配列を有する標
識材ポリスクレオチド二次プローブおよび （ｂ） ｍ的に対し相補的な一重鎮配列および二次プロ
ーブの複合配列に対し相補的な複合−重鎖配列を有する
ポリヌクレオチド−次プローブを使用することからなる
試料中の特定標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法
であって、（１）−次プローブとハイブリッド形成条件
下試料をｆ！ｊ触させ、 （１）上記接触前、接触中または接触後、標的付二次プ
ローブを一次プローブに対しハイブリッド形；戊させ、 （Ｉｌｌ） ｍ ＩｒＪ配列のイＩ在または不存社を示
すものとして、試料との関連において標識の存在または
不存在を観察する 工程を特徴とする方法。 ２、 試料か固体支持体上に不動態化されている特許請
求の範囲第１項記載の方法。 ３、 試料を最初に一次プローブと、続いて二次プロー
ブと接触させる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、 二次プローブの溶液を最初ハイブリッド形成条件
下−次プローブの溶液と混合し、不動態化された試料を
形成さｉｔた混合物と接触させる特許請求の範囲＄２項
記載の方法。 ５、−次プローブ〃）、使用直前に変性されるプローブ
配列を含有する二重鎖ＤＮＡベクターから誘導される特
許請求の範囲第３ｊＪ！記載の方法。 ６、−次プローブか使用直前に皺性されるプローブ配列
を含有する二ｆｉ［ＤＮＡベクターから誘導される特許
請求の範囲第４項記載の方法。 ７、−次プローブ〃）プローブ配列を含イ］する二重ｆ
ｊｉｌ ＤＮＡベクターから誘導され、二次プローブか
標識材された対応する二重＠ ＤＮＡベクターから誘導
され、二つのプローブの混合物を先づ弯性し、次いでハ
イブリッド形成条件手不動態化試料に加える特許請求の
範囲第２項記載の方塊８． 試料の溶液をハイブリッド
形成条件下−重鎮一次プローブの溶液と接触させ、部分
的に二重鎖配列を含有するか一重鎖配列を含有しない溶
液を回収し、ハイブリッド形成条件下標識材−重鎖二次
プローブの溶液と接触させ、残存−重鎖配列を除去し、
試料中の標的配列の存在または不存在を示すものとして
試料との関連において標的の存在または不存在を観察す
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、−次プローブか一重鎖プラスミドまたはバクテリオ
ファージを基にし、二次プローブがバクテリオファージ
の複製型二重鎖分子から誘導される特許請求の範囲第１
項〜第８項の何れか一つに記載の方法。 １〇 −次プローブかＤＮＡのものであり、二次プロー
ブかＲＮＡ０ものである特ｆ＋−請求の範囲第１項〜第
９項の何れか一つに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8405437 | 1984-03-01 | ||
| GB848405437A GB8405437D0 (en) | 1984-03-01 | 1984-03-01 | Detecting polynucleotide sequences |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60208997A true JPS60208997A (ja) | 1985-10-21 |
Family
ID=10557437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60040272A Pending JPS60208997A (ja) | 1984-03-01 | 1985-02-28 | ポリヌクレオチド配列検出法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4716106A (ja) |
| EP (1) | EP0153873A3 (ja) |
| JP (1) | JPS60208997A (ja) |
| GB (1) | GB8405437D0 (ja) |
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1985
- 1985-02-28 US US06/706,747 patent/US4716106A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-02-28 EP EP85301399A patent/EP0153873A3/en not_active Withdrawn
- 1985-02-28 JP JP60040272A patent/JPS60208997A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62188970A (ja) * | 1985-12-11 | 1987-08-18 | カイロン コーポレイション | 液相核酸サンドイツチアツセイおよびそこで有用なポリヌクレオチドプロ−ブ |
| JP2009017882A (ja) * | 1999-01-15 | 2009-01-29 | Applera Corp | 標的ハイブリダイゼーション検出のための、プローブおよびクランプのバイナリー組成物ならびに方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0153873A3 (en) | 1987-10-07 |
| EP0153873A2 (en) | 1985-09-04 |
| US4716106A (en) | 1987-12-29 |
| GB8405437D0 (en) | 1984-04-04 |
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