JPS6013140B2 - 生細胞膜の弾性および誘電特性の測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物の個々の生細胞の膜あるいは生理的液に
浮いているかあるいは連結状に層として存在している生
物細胞の膜の弾性および誘電特性の決定方法に関する。

動物もしくは植物の細胞あるいは微生物の細胞などの細
胞において経過する推移例えば物質が細胞の膜へあるい
は細胞膜を通して細胞内へ達する推移において、細胞膜
の状態は種々の役割を為す。それ故膜の状態を決定する
のに種々の努力が払われている。生物の体に導びかれる
異物のこのような細胞の腰への作用の評価に対しても、
これらの細胞の膜の特性が非常に重要である。このよう
な検査は例えば生物細胞の膜に対する薬物媒体の作用あ
るいは細胞に調和しない濃度の叢あるいは他の物質の作
用または病気の影響を決定するのに重要である。細胞中
で経過する推移に対する生細胞の膜の機能能力は細胞膜
の弾性および誘電特性により決定されそしてこの特性が
変化すると細胞中における経過する推移について細胞特
性の変化が確定し得ることは知られている。しかし努力
にも拘わらず、簡単な方法により細胞膜の弾性および誘
電特・性したがって前記過程に対する細胞の機能能力を
明確にすることはできなかった。むしろ今までは生物の
生細胞膜の構造を検査するのに、経済的な方法で採用で
きない技術的に非常に高価な方法が使用されていた。例
えば膜の厚さは「細胞がレントゲン線を照射されること
によりあるいは細胞中で電子顕微鏡で調べることにより
測定されていた。生物の生細胞膜における分子の局所規
則度は分子の核スピンの磁気励起により検査されるかあ
るいは膜に入れられた基の自由電子の電子共鳴信号が測
定される。したがって陰構造の変化に対する告知も可能
になる。生細砲膜の弾性特性は、しかしこの方法では検
出できない。本発明の課題は、生物の個々の生細胞膜生
理的液に浮いた状態に在るかあるいは結合した層として
在る生物の生細胞の膜の弾性および誘電特性を決定する
ためのものであって、細胞の膜に作用する影響を知るた
めに生物の生細８包の膜の組織上の変化を確認すること
を技術的に簡単で経済的な方法で可能にする方法を創造
することである。この課題の解決のために、本発明は、
膜が電界にさらさされている細胞の浸透度は所定の電圧
（以下ブレイクダウン電圧と称する）で高められると云
う確認を基にしている。通常状態で実際上非導電性であ
る生細胞の膜がこの際導電性になる。特性の変化はＬ膜
を流れる電流を測定可能に高めることにより検出できる
。さらに浸透度が高まるブレイクダウン電圧の大きさは
「本質的に細胞膜の誘電特性、弾性特性ならびに厚さに
依存すると云う認識に基づいており、次のような依存性
に在る。（ブレイクダウン電圧値）２ ０．３６７９・６。

・ｙご・ど○ ｙ ：表面に垂直な膜の弾性 ６。

三亀界にさらされる前の腰厚ご ：膜に対する誘電定数 ｚｏ：真空に対する誘電定数 ブレイクダウン値は細胞の膜のこの特定の特性に対する
測定数を示す。

この課題は、本発明によれば「単独の細胞より多くのあ
るいは多数の単独の細胞あるいは１つもしくは多層の細
胞が、ｏｏ 〜４０℃の温度であって導電性の〜電解液
を形成する生理的液に与えられそして１つもしくは複数
の細胞あるいは細胞層は両電極間に与えられた電界の電
気力線が電解溶液を形成する生理的液に与えられる１つ
もしくは複数の細胞あるいは層の膜を貫通するように両
電極間に配置され、電極に１仏 ｓ〜他ｈｓの一定のパ
ルス期間を有する一列の電圧パルスが与えられそして電
圧パルスの振幅は、細胞のブレイクダウン電圧に達し、
電極に結合する電流装置により測定可能な結果としての
電流パルスが大きく上昇するまで１０仇ｈＶ〜５Ｖの範
囲で上昇させられ、電極間の１つの細胞、電極間の複数
の細胞あるいは電極間の細胞の層の両側に配置された２
つの電流を流して無い状態の測定電極において測定され
るようにする。

電圧が１つまたは複数の細胞にパルス状に与えられるこ
とにより、一定電圧の印加による加熱で細胞が破壊する
のが回避される。

大きな藻細胞、神経軸素あるし・は卵細胞のように１０
０山ｍおよび腕あるいは仇間の直径を有する個々の細胞
を調べる場合に対しては、本発明による方法の変形によ
り、電解液を形成する生理的液に与えられた細胞に微少
電極として形成されその尖頭が調べられる細胞の大きさ
により０．１〜２０山ｍの直径を有する電圧−および電
流パルスを授受する２つの電極を挿入して行うと合目的
である。電圧パルスは微小電極と液体へ突込まれた第２
電極間へ加えられる。ブレイクダウン電圧を測定するた
めに微少電極を使用する本発明による方法の変形は、小
さな細胞について例えば約３仏ｍの直径を有する赤血球
にも使用可能である。

しかし、次の本発明による別形は特に有利である。即ち
生理的液に与えられる１つの細胞が「電圧−および電流
パルスの授受のために設けられた電極ならびに測定電極
を電気的に互に分離する壁におけるせいぜい細胞の直径
寸法を有する開ロに吸入されるかあるいは生理的液に与
えられた複数の細胞が、電圧一および電流パルスの授受
をする電極ならびに測定電極を電気的に互に絶縁する壁
におけるせいぜい細胞の直径と同じ複数の開口に吸入さ
れて、電圧−および電流パルスを授受する両電極に電圧
を印加すると、そのようにして発生された電界の１つま
たは複数の閉口を貫通する電気力線が同時に１つの関口
に吸入された１つの細胞の１つの膜あるいは複数の開〇
に吸入された複数の細胞の複数の細胞を貫通する。壁の
閉口の直径は、吸入された細胞が開〇を塞ぐような寸法
にする。多数の細胞を調べる場合、電極間の壁として、
孔の開□が大きくても細胞の直径の大きさを有する溶融
ガラスあるいはフィル夕を使用する。

本発明による方法を実施するに際し、生理的液に浮いて
いる細胞が溶融ガラスの関口を有する壁の側あるいはフ
ィル夕へ吸入され、この際溶融ガラスあるいはフィルタ
ーの孔の関口が塞がれる。孔閉口を塞ぐことは、１つに
はシステムに接続した圧力計により測定可能である液体
に対する流れ抵抗を高めることになり、他方では吸入さ
れた１つの細胞あるいは複数の細胞の電気絶縁として働
く膜のために、電極に接続する装置により測定可能な電
極間の電気抵抗を高めることになる。これに続いて本発
明による方法により細胞膜用のブレイクダウン電圧が測
定され、この際同時に多数の細胞を測定する本発明によ
る方法の変形においてブレイクダウン電圧の統計的な平
均値が得られる。ブレイクダウン電圧に達した際に起る
細胞膜の浸透度の高まりは、電極に電圧パルスが加えら
れない間の１秒〜２．３分間の細胞の種類に応じた種々
の時間に再び回復するので、本発明による方法は同じ細
胞で比較的短い時間にくり返しができる。単に僅かの細
胞を調べる場合あるいは個々の細胞の膜特性を調べねば
ならない検査においては、電極を絶縁的に互に分離する
壁として単に関口あるいは開□の代りに毛細管を有する
ようなものを使用する。

この際その直径は大きくても検査さるべき細胞の直径と
同じ大きさである。本発明による方法は多数の細胞に対
するブレイクダウン電圧の測定に類似なように行われる
。単独あるいは多数の細胞が壁の１つあるいは多数の関
口に吸入される本発明による方法の変形は、例えば血の
赤血球あるいは白血球あるいは栄養媒体における微生物
のような自然の状態で生理的液に懸濁されているかまた
は相応の方法の使用により生理的液に懸濁可能でありそ
して個々の細胞として液体に浮いて保持されている生物
の全細胞に対して使用可能である。

これは例えば種蕩の場合あるいは洗浄剤あるいは例えば
エチルヂアミン四酢酸のような酢塩形成物も使用するこ
とにより細胞の結合から溶解可能な植物性組織の細胞の
場合もそうである。２０層までの細胞例えば植物の葵あ
るいは器官からの細胞組織の断片から成り得る層におけ
る細胞膜のブレイクダウン電圧の測定をするための本発
明による方法が採用される場合に対しては、細胞の層を
合目的な方法で電極を電気的に絶縁して互に分離する壁
における１つの閉口あるいは複数の関口に貼付けあるい
はゴムリングによる神圧により固定する。

関口の寸法はこの場合細胞の層の大きさに適合すると好
都合である。本発明による方法は、病気あるいは異物あ
るいは細胞に調和しない濃度の物質により行われる生物
の細胞膜の変化の検出に有利に使用し得る。

例えば鎌状細胞貧血に浸された赤血球あるいは癌に侵さ
れた組織、種場等におけるように病気に侵された生物細
胞の膜構造の変化は、本発明による方法を使用して簡単
な方法で検出できる。同様にしてさらに異物例えば毒素
あるいはさもなくば環境により規定された有毒物あるい
は薬剤によっても惹起される生物の細胞の膜構造の変化
も検出できる。本発明による方法は、それ故例えば生物
細胞の膜の病的変化の早期検出のように、この種の細胞
の膜を変化させる影響の認識に採用されると有利である
。生物の細胞の膜の変化を検出する本発明による方法を
有利に使用すると、真水一あるいは海水藻の細胞膜の変
化の検出にも及ぼされ、海洋の生態学への環境により規
定された有毒物の影響も確認できる。この方法はさらに
例えば微生物あるいは酵母の微生物においても有利な方
法で可能になる。そこで例えばバクテリアの死のために
与えられる手段の必要な配合も簡単な方法で設定できる
。本発明による方法を実施するための有利な方法は次に
在る。

即ち中間壁により２つの室に分割され、かつガラス等の
非導電材より成る容器には、室にそれぞれ配置された電
圧一および電流パルスを授受するための電極、前記室の
それぞれ配置されたブレイクダウン電圧を測定するため
の測定電極、生理的電解溶液の導入ならびに前記室部の
１つへ１つの細胞、複数の細胞あるいは細胞層を与える
ための少くとも１つの関口あるいは導入端が設けられ、
１つより多くあるいは多数の細胞が容器の１つの室へ与
えられる場合に対しては、中間壁における大きくても１
つの細胞に相当する寸法を有し、かつ細胞数に相当する
数の開〇および他の室に突出した電解液を吸入する導入
端が設けられ、細胞の層が容器に与えられる場合に対し
ては、細胞の層用の支持壁として設けられた中間壁に細
胞の層の大きさに適合した１つあるいはより多くの開口
が設けられ「電圧−および電流パルスを与えるために設
けられた２つの両極は、約５Ｖまでの可変振幅ならびに
約１山ｓ〜１皿ｓの可変のパルス期間の電圧パルスを発
生する装置および電極に与えられた電圧パルスにより発
生する電流パルスの振幅を測定するための装置へそして
ブレイクダウン電圧を測定するために設けられた２つの
測定電極は電圧の増幅および測定をする装置へ結合して
いるようにする。

次に本発明による装置を図面に従い説明する。

第１および２図から分るように容器１は中間壁２を有し
、容器１を室３および４に分割している。室３および４
において、それぞれ電圧−および電流パルスを与えるた
ために設けられた電極５および中間壁２の両側に在る電
圧の電位差を測定するために設けられたそれぞれ測定電
極６が設けられている。測定電極は微小吸上管に配置さ
れた塩素処理された銀線より成り、微小吸上管は州−Ｋ
ＣＩ−溶液で満され、これは商品名寒天で知られた凝固
剤で凝固されている。室３は、生物の１つまたは複数の
細胞が浮んだ生理的液を導入する端子７を有している。
室４は、同時に細胞を中間壁２へ吸収するための吸収装
置（図示せず）の伝達端子として役立つ電解液を導入す
るための端子８を有する。個々の細胞のブレイクダウン
電圧を測定するために設けられている第１図の容器１に
おける中間壁２は、毛細管として形成された関口９を有
する。多数の細胞のブレイクダウン電圧を測定するため
に設けられた第２図の容器１の中間壁２は、多数の関口
９を有する膿フィル夕より成り、フィル夕は膜フィルタ
用の支持壁として設けられた筋板１０に教導されそして
ゴムリング１１を介して緒付け装置（図示せず）により
押圧される。両第１および２図において、検査さるべき
細胞１２が、中間壁へ吸収されているのに応じて位燈し
ている。図から分るようにそれらは関口９をふさぎ、電
極蚕間に在る電界の関口９を貫通する鰭気力線が同時に
吸収された１つあるいは複数の膜を貫通する。細胞の層
を検査せねばならない場合、層が第２図の腰フィル夕の
代りもこ筋板亀０へゴムリング１８を介して当てられる
。

第８図において「電圧パルスを授受する顔極５′が、低
出力抵抗を有するパルス発生器竃３へ結合している。

パルス発生器１３は「１〆ｓ〜１仇ｈｓのパルス期間の
一定の電圧パルス列を発生する。電極５およびパルス発
生器１３間の両結合導体の１つに抵抗器亀亀が配置され
ている。これは電極５を通して流れる電流を抵抗器１４
の両端における電圧タップより検出するのに役立つ。抵
抗器１＆で測定された電圧降下は、蓄積オッシログラフ
として形成されている陰極線オッシログラフ１５に表示
するように与えられる。１つまたは複数の細胞の膜のブ
レイクダウン電圧を測定する２つの測定電極Ｓは「高い
入力インピーダンスを有する差敷増幅器１６に結合する
。

増幅器１６で増幅された電圧値は、同様にオツシログラ
フ１５へ与えられそして電圧降下として抵抗器翼４を通
して測定された電流パルスと共に陰極線オッシログラフ
の表示スクリーンに表示される。パルス列をロックする
ためにパルス発生器１３から出る電圧パルス−したがっ
て結果としての亀流パルスならびに測定電極６を通して
測定される電位値のパルス−を逐次表示するためのオッ
シログラフ１５に直結しそして制御装置１８を介してパ
ルス発生器１３と結合するパルス発生器１７が設けられ
ている。即ち、制御装置１８１ま、パルス発生器１７か
らのパルスを入力として、パルス発生器１３から出力さ
れる電圧パルス、つまり結果としての電流パルス及び測
定されるパルスが表示スクリーン上で逐次遅延して表示
されるように、パルス発生器１３を制御する。また、制
御装置１９は、パルス発生器１７からのパルスを入力と
して予め与えられた規則性でパルス発生器１３からの出
力パルスの振幅が高められるようにパルス発生器１３を
制御する。実施例 １ １叫の赤血球を１３９ｈＭ／その食塩ならびに１５ｈＭ
／その燐酸ソーダを含み、温度が約２０ｏ でｐＨ値が
７．４の１００の【の生理的溶液に与える。

赤血球が浮いているそのように形成された懸濁液を１０
のほぼ等しい部分量に分割し、そのうち９の部分量は、
それぞれ表１の最初の欄に指示する種々のペンジルアル
コール量と混合する。第２および３図による装置でブレ
イクダウン電圧を測定するために、種々のペンジルアル
コール量を有する１０の部分量をそれぞれ分離して、中
間壁が２Ｋｍの孔直径を有する膜フィル夕より成る第２
図による容器１の室３へ与える。

これに続いて、室４へ０．６気圧の減圧をフィル夕の孔
が赤血球でふさがれるまで与える。このことは吸上管に
接続する圧力計により設定される。それから電極５へ約
２秋ｓのパルス期間の電圧を全てで３の砂加え、この際
電圧パルスの振幅をその都度３０仇ｈＶづつ高くする。
この方法によってはブレイクダウン電圧の高さは第１の
測定で粗く得られる。細胞を再びいやす約５分の待ち時
間後に行われる第２の測定に於ては電圧パルスの振幅は
、ブレイクダウン電圧の高さの領域で５０〜１０仇ｈＶ
づつだけ高められる。この際「ベンジルアルコールの種
々の濃度を含む部分溶液に在る細胞の膜に対して、表１
の第２欄に示すブレイクダウン電圧が測定された。第３
欄において、表１の１行に指示された溶液に対して測定
された値に関し、測定されたブレイクダウン電圧の％変
化に対する対応値が示されている。表 １ 実施例 ２ 実施例１におけると類似の方法で、コレステリン成分に
より異る赤血球の膜のブレイクダウン電圧が測られた。

生物化学の分析により得られた細胞の膜のコレステリン
成分は、表２の第１の欄において第１行で示す通常のコ
レステリン成分を有する赤血球の部分量に対する定性的
な変化として示す。測定されれたブレイクダウン電圧は
、表２の第２欄にボルトで表わす。表２の第３欄は、第
１の溶解液に対し測定されたブレイクダウン電圧に対す
るブレイクダウン電圧の％変化を示す。表 ２実施例
３ ３仇ｈＭ。

そ／そＫＣ１、ｌｍＭ。そ／クＭＱそ２ 、９仇Ｍｏメ
ノ 〆Ｎａ２Ｈｐｏ４、３０ｈＭｏそ ／クＮａ比ｐ
ｏ４、１５ｈＭｏ夕／そ（ＮＡ）２Ｓ０４、０．５％グ
ルコースならびにそれぞれ１０皿ｇ／クとヒステジンお
よびロイシンを含む約２０℃の生理学的液に、ェシユリ
ケア（ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ＣｏｌｉＢ １６３の
バクテリア種を与えた。約６時間後、この時点でバクテ
リアが対数状の増加が行われた前記のように形成された
溶液から部分量を取出しそれから実施例１におけると類
似の方法でこの部分量に在るバクテリアの細胞の膜のブ
レイクダウン電圧が決定される。使用した膜−フィル夕
の孔の直径は０．４私ｍであった。測定されたブレイク
ダウン電圧は、１，０６Ｖであった。さらに１筋時間後
に熔解液の別の部分量を取出した、この時点でバクテリ
アは定常的増加をしていた。この部分量に在るバクテリ
アの細胞の膜のブレイクダウン電圧は１．２９Ｖであっ
た。実施例 ４ 平均的な海水の２８ｏｏの槽に在る藻種バロニアウトリ
クララス（Ｖａｌｏｎｉａｕ的ｋ山ａｍｓ）の直径約０
．５伽の藻細砲へ「尖頭が１必ｍの直径および麹が約５
〆斑の直径を有する白金−イリジウムから成る微少電極
として形成された電極を〜直径が５〜７仏ｍのガラスか
ら成る予め藻細胸へ挿入された徴少吸上器へ搬入するこ
とにより挿入した。

細胞の外に、海水浸液にニッケルから成る別の電極を配
置した。この両電極を通して１仏ｓのパルス期間の電圧
パルスを約５秒の時間間隔で与え、この際電圧パルスの
振幅はその都度１０仇ｈＶづっ高めた。ブレイクダウン
電圧は、測定電極として形成された「 ２Ｎ〜ＫＣｉ−
溶液を充満されたガラスより成る２つの徴少吸上器によ
り測定され、その内の１つは藻細砲に挿入し、他方は直
接海水溶液に突込んだ。電圧パルスを授受するために設
けられた電極ならびに測定電極を第３図による装置に結
合させた。藻のブレイクダウン電圧は０．８５Ｖであつ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は唯一の毛細管として形成された開口を有する中
間壁を有する容器の縦断図「第２図は多数の閉口を有す
る中間壁を有する容器の縦断図、および第３図は電圧パ
ルスを発生させそして結果としての電流パルスの振幅を
測定する側装ならびにブレイクダウン電圧を測定する測
定を示す。 富：容器、２：中間壁、３３ ４：室．裏；電極、亀き
測定電極〜 ？， 葱；連結部、９：閉口、亀蟹；鮪板
、包畳：ゴムリング〜 亀２：細胞、畳３；パルス発生
器〜 竃母三抵抗器、Ｉ裏三陰極線オツシログラフ、亀
６：増幅器、亀ｙ：パルス発生器も１蟹夢制御装置。丹
後・汐 ‘７Ｇ２ Ｇ７Ｇ３

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 生物の個々の生細胞の膜あるいは生理的液に浮いて
   いるかあるいは連結状に層として存在している生物細胞
   の膜の弾性および誘電特性の測定方法において、 単独
   の細胞、より多くのあるいは多数の単独の細胞あるいは
   １つもしくは多層の細胞が、０°〜４０℃の温度であつ
   て導電性の電解液を形成する容器内の生理的液に与えら
   れそしてこの液が前記容器を２個の室に分割する壁の開
   口へ吸引され、ここで前記開口は大きくても細胞の大き
   さの寸法を有しそして前記壁の両側には電圧及び電流パ
   ルスを授受するために設けられた２個の電流電極並びに
   ２個の測定電極がそれぞれ両側へ分離して配置され、
   前記２個の電流電極間に１μｓ〜１０ｍｓの一定のパル
   ス期間を有する一列の電圧パルスが与えられて電気力線
   が細胞の膜を貫通し、そして電圧パルスの振幅は、細胞
   のブレイクダウン電圧に達して前記２個の電流電極に結
   合する電流装置により測定される電流パルスが大きく上
   昇するまで１００ｍＶから５Ｖの範囲で上昇させられ、
   前記ブレイクダウン電圧が前記２個の測定電極により
   無電流で測定されることを特徴とする測定方法。