JPS597440B2 - ヒト白血球インタ−フエロンの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト白血球インターフェロン（以下、ＩＦとい
う）の新規な製法に関する。

さらに詳しくは、培地としてハムＦ を用いて比活性の
高い粗製ＩＦを産生ずる方法に関する。

ＩＦは抗ウイルス作用、抗腫瘍作用、免疫系に対する作
用など多くの生物学的活性を有しており、将来の画期的
な医薬として注目されている。

ＩＰの大きな特性は、ある動物（細胞）で産生されたＩ
Ｆは同種の動物（細胞）にしか効果を示さないという種
依存在を有することである。

そのため、ヒトに用いるＩＦはヒトの細胞から産生じた
ものでなければならず、したがって大量産生が困難であ
る。

従来、ヒト白血球ＩＦを大量に産生せしめるぱあい、フ
ィンランドのカンテル（ Ｃａｎｔｅｌｉ ） 博士ら
の培養法が用いられている。

すなわち、ｐＨを調整した培地に人血漿、人血清または
プラズマネート（加熱処理血清）を添加し、これに精製
されたヒト白血球を加え、えられた培地に粗製ＩＦを少
量加えてプライミングする。

プライミング後ＨＶＪウイルスを投入してインデュース
を行ないヒト白血球を培養ビ、えられた培養液を遠心分
離することによって粗製ＩＦをえている。

カンテル博士の方法に用いられうる培地としてはイーグ
ルＭＥＭとＲＰＭＩ−１６４０が知られており、平均力
価２ ０，０ ０ ０ 〜６ ０，０ ０ ０Ｕ／ｍｌ
！（Ｕ：国際単位）の粗製ＩＰを産生じている。

これら２種の培地を用いるときには、粗製ＩＦの適当な
平均力価を維持するために人血漿、人血清、アガンマセ
ラム（ ａｇａｍｍａ’ ｓｅｔｕｍ ）またはプラズ
マネートを培地の数パーセント、通常２〜５％（重量％
、以下同様）に相当する量添加しなければならない。

しかしながら、そのことが産生される粗製ＩＦ中のタン
パク質濃度を高めており（約２〜４１′ｎ９／ｍｌ！）
、その結果粗製ＩＦの比活性が低く抑えられている。

臨床試用に供するためには少なくとも１０６Ｕ ／ｍ９
ｐｒｏｔｅ ｉｎ以上の比活性が要求されているので、
従来は粗製ＩＦ培養液を百倍程度に精製しなければなら
ず、回収率が低くなる。

回収率の低下は、添加血漿中に混入している異種タンパ
ク質によっても惹起される９ ヒト白血球１Ｆの産生には叙上のごとく多くの問題が残
っており、大量産生の大きな障害となっていた。

しかるに本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、培地とし
てハムＦ を用いることにより叙上の問題を解消するこ
とができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明のヒト白血球ＩＦの製法は、人血漿が添
加されたハムＦ 培地を用い、１Ｆインデューサーの存
在下にヒト白血球を培養することを特徴とするものであ
る。

本発明の製法によるときには、産生される粗製ＩＰの力
価を低下せしめることなく人血漿の添加量を大幅に減少
することができ、したがって粗製ＩＦ中のタンパク質濃
度を抑えることができる。

すなわち、ハムＦ 培地を用いたばあい人血漿の１２ １１ 添加量を従来の添加量の一〜一程度にすること２０１０ ができ、その結果、粗製１Ｆ中のタンパク質濃度１１ をー〜一程度に抑えることができる。

したがって、８ ４ 本発明によってえられる粗製ＩＦの平均力価を従来の方
法でえられる粗製ＩＦ平均力価と同じとしたばあい（実
際は従来法より高めの値かえられているが）、比活性は
約４倍〜８倍高くなる。

ちなみに、本発明によってえられる粗製ＩＰの平均力価
は４ ６，０ ０ ０ Ｕ ／ｍｌであり、添加血漿濃
度が０．３％のばあい粗製ＩＦ液のタンパク質濃度は約
０． ５ １ｎ９／ｍｌであるから、比活性は０．９
Ｘ １ ｏ５ｕ７■ｐｒｏｔｅｉｎとなり、また添加血
漿濃度が０．１％のばあい１．５ Ｘ １ ０５Ｕ／■
ｐｒｏｔｅｉｎとなり、いずれにしても粗製ＩＰの比活
性としてはきわめて高いものである。

臨床試用に供する際のＩＦの比活性の基準を現在一般的
な１０６Ｕ／■ｐｒｏｔｅ ｉｎとするとき、あと約１
０倍程度の精製で充分である。

本発明に用いる培地は、１９６５年にリチャード・ジー
．ハム（ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇ− ＨＡＭ ）がＰｒｏ
ｃ．Ｎａｔ＝Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．・Ｓ． Ａ．
， ５ ３ ： ２ ８ ８ 〜２９３頁に開示し、
さらにＩＮ ＶＩＴＲＯ，Ｖｏｌ．６，／４６２．１
９７０の１０３〜１０５頁に紹介されているいわゆるハ
ムＦ 培地であり、不飽和脂肪酸およびポリアミンを含
有していることやカリウム、ナトリウム、カルシウム、
銅、亜鉛、鉄、マグネシウムなどの金属の塩類を豊富に
含有していることを特徴とする培地である。

このハムＦ 培地は、もっぱらチャイニーズハムスター
の細胞の培養に用いられており、ヒト白血球インターフ
ェロンの産生用に用いられた例は知らない。

人血漿は健康人の血液からの全血を３．０ ０ ０ｒｌ
）Ｉｌｌで３０分間低速遠心分離して血球成分を取り除
くことによってえられるもので充分であり、特別な処理
を施さなくてもよい。

本発明に用いるヒト白血球は、従来と同様にパフイーコ
ートから精製されたものでよい。

その精製法としては、たとえば健康人から採血された血
液からえられたバフイーコートに塩化アンモニウム溶液
による溶血操作と遠心分離を繰り返して施す方法や、フ
ァイコールコンレイ液への重層操作と遠心分離を繰り返
す方法が採用される。

インターフェロンインデューサーとしては、ＨＶＪウイ
ルスが好ましい。

本発明における培地は、たとえばつぎのように調整され
る。

粉末状のハムＦ１。

培地約５〜２０ｇ、好ましくは１０．６ｇを蒸留水１ｌ
に加えたものに人血漿を培地全重量の０．０５〜５％、
好ましくは０．１〜１％となるように添加してヒト白血
球培養用の培地を調整する。

培地のｐＨはＮ．ａＨＣＯ３およびＮａＯＨにより約６
．９〜７．５、好ましくは７．２前後に調整する。

えられた培地に精製ヒト白血球を１×１０６〜１×１０
８イＶＴＬｌ，好ましくは約１×１０７個／ｍｌとなる
ように浮遊させ、ついでプライミング用の粗製ＩＦを５
０〜２ ０ ０ Ｕ／ＴＬｌ，好ましくは１００Ｕ／７
７Ｉ．ｌ加えて撹拌培養する。

この段階の培養は３５〜３７゜Ｃで２時間程度行なう。

プライミング後、ＨＶＪウイルスなどのＩＦインデュー
サーを５０〜２００ＨＡＵ／ゴ、好ましくは１ ０ ０
ＨＡ Ｕ ／ｒｒｔｌ添加してさらに培養をつづける
。

ＨＶＪウイルスは未精製の漿尿液をそのまま用いてもよ
いが、精製したものの方が好ましい。

このインデュース段階の培養における培養条件は、プラ
イミング段階と同様の条件でよく、約２０時間行なう。

インデュース段階の培養終了後、培養液をたとえば遠心
分離機などで分離し、その液体部分として粗製ヒト白血
球ＩＦをうる。

本発明の製法によってえられる粗製ヒト白血球ＩＦ中の
タンパク質濃度は約０．３〜０．８〜／ｍｌで１１ あり、従来法によるときの一〜一程度である。

し８４ たがって、濃縮操作を加え精製出発点でのタンパク質濃
度を従来のものにそろえたぱあい、一度の精製で従来の
４〜８倍量のものを処理することができるため、精製に
要する試薬、時間、労力などが大幅に節約できる。

なおその際の濃縮操作は分？篩により容易にかつ無菌的
に数十ｌの規模で行なうことができる。

濃縮の際の力価およびタンパク質の回収率はほぼ１００
％であり、数時間で１０倍程度の濃縮が可能である。

つぎに本発明の製法を実施例および比較例をあげて説明
するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない
。

実施例 １ （培地の調製） ハムＦ１培地（日水製薬■製）１０６．９に２回以上蒸
留した水を加えて全量を１０ｌとした。

これにカナマイシン０．６ｇ、ＨＥＰＥＳ４０ｇおよび
重曹１．５ ｇを加え、さらにＩＮ−ＮａＯＨを適当量
加えてｐＨを７．２に調整したのち、室温で戸過滅菌し
た。

えられた溶液を撹拌機を備えた培養器に入れ、これに健
康人から採血した血液より通常の方法でえた人血漿を培
地全容積の０．１％添加してヒト白血球培養用の培地を
調整した。

（プライミング） 前記のごとく調整した培地に精製されたヒト白血球を１
×１０７個／ｄとなるように浮遊させ、ついで粗製ヒト
白血球ＩＦをＩＯＯＵ／ｒＩｌｌとなるように加えた。

ついで温度を３７℃に保ちながら、撹拌下に２時間培養
した。

（インデュース） えられた培養液に精製ＨＶＪウイルスを１００ＨＡＵ／
１１Ｌｌとなるように加え、温度を・３７℃に保ちなが
ら撹拌下に２０時間培養した。

（ハーベスト） えられた培養物を遠心分離機により回転数３．４００ｒ
ｌＭｎで３０分間遠心分離をして、粗製ヒト白血球ＩＰ
をえた。

えられた粗製ヒト白血球ＩＦの力価をプラーク半減法に
より測定したところ、４０，０００Ｕ／１ｎｌであった
。

またこの粗製ＩＦ中のタンパク質濃度゛は０． ３ ４
ｙｎ９／ｙｒｔｌであった。

したがって、えられた粗製ＩＦの比活性は１．２ Ｘ
１ ０５Ｕ／１７１ｐｐｒｏｔｅｉｎであり、きわめて
高いものであった。

実施例 ２〜４ 血漿の添加量を第１表に示すように変えたほかは実施例
１と同様に培地を調整し、プライミング、インデュース
およびハーベストを行ない、粗製ヒ？白血球韮Ｆをえた
。

実施例２〜４でえられた粗製ＩＰの力価、タンパク質濃
度および比活性を第１表に示す。

比較例 １ 人血漿を添加しなかったほかは実施例１と同様にして粗
製ヒト白血球ＩＰをえた。

えられた粗製ＩＦの力価、タンパク質濃度および比活性
を第１表に示す。

比較例 ２および３ ハムＦ１培地に代えてイーグルＭＥＭ培地（日水製薬■
製）を用い、培地９４ｇに再蒸留水を加えて１０ｌとし
た。

これにトリシン３０ｇおよび適当量の重曹を加えてｐＨ
を７．２に調整したのち、グルタミン３ｇを加えて室温
で炉過滅菌した。

人血漿をえられた培地全容積の０．１％および０．５％
添加してヒト白血球培養用の培地を調整し゛た。

この培地を用いたほかは実施例１と同様にして、プライ
ミング、インデュースおよびハーベストを行ない、粗製
ヒト白血球ＩＰをえた。

添加血漿濃度が０．１％のばあい（比較例２）、えられ
た粗製ＩＰの力価は８，０ ０ ０ Ｕ／ｒＩｌｌ，タ
ンパク質濃度は０．３５■／ｄであり、比活性は２．３
Ｘ １ ０’Ｕ／７ｎ９ｐｒｏｔｅｉｎであった。

添加血漿濃度が０．５％のはあい（比較例３）、えられ
た粗製ＩＦの力価は３ ２，０ ０ ０ Ｕ／１ｒＬｌ
，タンパク質濃度はＯ．’ ８ ０ ｙｎ９／ｙｎｌで
あり、比活性は４．Ｏ Ｘ １ ０’Ｕ／ηｐｒｏｔｅ
ｉｎであった。

比較例 ４および５ ハムＦ１培地に代えてＲＰＭＩ−１６４０培地（日水製
薬■製）を用い、培地１０４ｇに再蒸留水を加えて全量
を１０ｌとしたのちカナマイシン０．６，９，へペス４
０ｇおよび重曹３０ｇを加え、ＩＮ−ＮａＯＨでｐＨを
７．′２に調整して室温テ炉過滅菌した。

つぎに人血漿を培地全容積の０．１％（比較例４）およ
び０．５％（比較例５）添加してヒト白血球培養用の培
地を調整したほかは実施例１と同様にしてプライミング
、インデュースおよびハーベストを行ない、粗製ヒト白
血球ＩＦをえた。

添加血漿濃度が０．１％のときは、えられた粗製ＩＦの
力価は１ ０， Ｏ Ｏ Ｏ Ｕ ／ｍｌ，タンパク質
濃度は０．３５ｍＩ？／−であり、比活性は２．９ ｘ
１ ０’ Ｕ／／′ｖｐｒｏｔｅｉｎであった。

添加血漿濃度が０．５％のときは、えられた粗製ＩＦの
力価は６ ５，０ ０ ０Ｕ／ｍｌ，タンパク質濃度は
０．８２■／ｍｌであり、比活性は７．９ Ｘ １ ０
’Ｕ／７ｎ９ｐｒｏｔｅｉｎであった。

精製例 実施例１でえられた粗製ヒト白血球ＩＦ２０Ａ！をラボ
モジュール（商品名、旭化成■製分子篩）を用いて８倍
に濃縮し、この濃縮液を用いて、カンテル法の変法によ
る精製を試みた。

ＫＳＣＮを最終的に０．５ＭまたはＩＭになるように濃
縮液中に加え、２Ｎ−ＨＣｌで溶液のｐＨを３．５まで
徐々に下げていった。

えられた沈殿部分を低速遠心（ ３，４ ０ ０ｒ障Ｘ
３ ０分）で集めたのち、−３０°Ｇに冷却した９４
％エタノール８００ｍｌを加えてホモジネートし、その
上澄を低速遠心で集めた。

えられた上澄に０．ＩＮ−ＮａＯＨを加えてｐＨを５．
５まで徐々に上げ、沈殿部分を遠心分離して除いたのち
、再び０．ＩＮ−ＮａＯＨを用いて上澄のｐＨを８．０
まで上げた。

低速遠心で沈殿を集め、５０ＴＬｌのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に溶解させたのちＰＢＳ（−）５６に対して
２時間ずつ２回透析し、えられた透析液を超遠心分離（
１ ８，０００ｒｐＩｎＸ６０分）にかけ上澄を集め
た。

その結果、最終的に、回収率５６％で比活性１．５ Ｘ
１ ０６Ｕ／ｍ９ｐｒｏｔｅｉｎの臨床試用のヒト白
血球ＩＦをえた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 人血漿が添加されたハムＦ 培地を用い、インター
   フェロンインデューサーの存在下にヒト白血球を培養す
   ることを特徴とするヒト白血球インターフェロンの製法
   。