JPS5973765A - 溶血性連鎖球菌ストレプトキナ−ゼ感作ラテツクス試薬、その製造方法およびそれを用いるストレプトキナ−ゼ抗体の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は溶血性連鎖球菌ストレプトキナーゼ感作ラテツ
クス試薬、その製造方法およびそれを用いるヒト体液中
のストレプトキナーゼ抗体の検出方法に関するものであ
る。

溶血性連鎖球菌（ｌｌｅｍｏｌｙｔｉｃ　５ｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ　：以下、溶連菌と略称ず）、殊にヒト
の主要な病原菌であるＡ群溶連菌は咽頭炎や丹毒などの
原因菌として、また続発性としてのリウマチ熱、急性糸
球腎炎、結節性紅斑の起因間として注目されている。

近年では８群溶連菌も尿路感染症、新生児の腸炎、髄膜
炎などの起因間として重要視されてきている。

溶連菌の増殖過程で代謝産物として毒素、酵素類が産生
きれ、これらの物質や菌体成分などに対する抗体が感染
個体の体液中に証明される。

臨床において血清抗体価の測定による溶連菌感染症の診
断は重要な診断指標となっている。

診断法の中でもランツランダル（Ｒａｎｔｚ　−Ｒａｎ
ｄａｌｌ）　法による抗ストレプトリジンＯ〔八ｎｔｉ
　５ｔｒｅｐｔｏ−ＬｙｓｉｎＯ（以下、ＡＳＬＯと略
称す）〕価の測定が基本的な溶連菌抗体の測定法として
広く繁用されてし）る。

しかしながら、従来よりＡＳＬＯ価の測定のみで；よ抗
体価のあがらない感染があることが知られており、また
、溶血阻止反応には、肝疾患、リポプロティンの影響、
血清の細菌による汚染などによる非特異反応を生しるこ
とも知られている。

それゆえ、診断をより確実にし、二次症の予防のために
は１００％近い検出率が望ましく、他の抗体検査法との
併用による診断が必要となる。

他の抗体検査法としては、溶連菌のＳＬＯ以外の菌体外
代謝産物ストレプトキナーゼに対する抗体を測定し、Ａ
ＳＬＯ価との両側定値から診断を行なう乙とが古くから
推められている。これを実施することにより、溶連菌感
染症を裏づける証明が確実となる。

ストレプトキナーゼは溶連菌の産生する線維素溶解酵素
賦活物質で、正常血清中のプロフィブリノリジンを活性
化する。活性化されたプロフィブリノリジンはフィブリ
ノリジンとなり、これが線維素を溶解する。この作用は
感染した場合、感染部位を限局化しようとする生体の防
御機能の１つである血液凝固を阻止する溶連菌の侵入力
として重要である。

現在のストレプトキナーゼ抗体の測定法としては、担体
に赤血球を用いたストレプトキナービ感作赤血球による
凝集反応が広く使用されている。

しかしながら、担体に赤血球を用いた測定法は、膜成分
に由来する非特異凝集がしばしば起こり、陽性と判定さ
れることもある。このため、未感作赤血球による非特異
凝集の有無を確認しなければならず、操作が煩雑である
。また、血液の非動化が必要なものもあり、さらに測定
に手がかかる。

凝Ｓ像においては、検体血清によって希釈倍数にかかわ
りなく一様、に弱い凝集を示すものもあり、陽性の真意
が疑われる。凝集像自体も終末点がはっき秒せず、判定
が困難で、判断に苦慮する場合が多い。

本発明者は、これら従来の欠点を克服すべく、鋭意研究
の結果、溶連菌より精製した溶連菌ストレプトキナーゼ
を、ラテックス粒子に感作した高感度で安定なラテック
ス試薬を製造することに成功した。また、（れを用いて
受身ラテックス凝集反応によるマイクロタイター法によ
り、非特′ｐ：凝集のない信頼性の高いストレプトキナ
ーゼの検出法を見い出し、本発明を完成した。

本発明に用いるラテックスはマイクロタイター法に使用
するので、高比重のラテックス粒子であることが望まし
い。感作抗原には、よく精製されたストレプトキナーゼ
が適しており、よく精製されたパリダーゼ（ストレプト
キナーゼとストレプトキナーゼの混合物）を用いる乙と
もできる。

このラテックス粒子を蒸留水に溶かしたストレプトキナ
ーゼと５６℃で３０分間接触させる。

このラテックス溶液を遠心分離し、リン酸塩緩衝食塩液
等の中性の緩Ｉ！ｉ液に懸濁させ、ここにグルタールア
ルデヒドを加えて、室温で１時間撹拌する。その後、ア
ンモニア・緩衝食塩液で３回洗浄し、同緩衝液に溶かし
た牛血清アルブミン、塩化コリン、シ、＊を加えて均一
な浮遊液とする。

かくして得られた感作ラテツクス溶液は凍結乾燥により
、長期間安定に保存できる。

本発明による溶連菌ストレプトキナーゼ感作ラテツクス
試薬を用いて、溶連菌感染の診断を行うには、上記感作
ラテツクス試薬の凍結乾燥品を蒸留水で復元し、これに
患者の血清あるいはその希釈液を加えて接触させ、受身
ラテックス凝集反応による凝集像を観察する。操作はマ
イクロタイター法により行なう。

このような方法で用いられる本発明の溶連菌ストレプト
キナーゼ感作ラテツクス試薬は、非特異凝集が起こらず
、高感度で簡便であり、反応像がシャープで、反応終末
点の判定が容易である。

また、検体血清の抗体価に応じての反応像の大小が明確
であり、判定結果に信頼がもてる。

さらに本発明による感作方法は、通常のラテックス感作
に用いられる物理吸着を更に進めたもので、官能基のつ
いていないラテックス表面に物理吸着でストレプトキナ
ーゼを吸着さぜた後、ゲルタールアルデヒドにより、ス
トレプトキナーゼ自体を固定化し、安定化したものであ
る。

通常の感作法で製造したストレプトキナーゼ感作ラテツ
クス試薬の場合には、１ケ月足らずで、まったく抗原性
を失い、抗体との反応性を示さなくなったが、本発明の
方法を用いた場合、吸着したストレプトキナーゼの抗原
性は失われず、更に抗体との反応性も高かった。

また、凍結乾燥による保存においても、他の感作方法に
よるラテックス試薬では、凍結乾燥の影響で乾燥前後の
感度が異なっていたが、本発明の製造方法によるラテッ
クス試薬には何ら変化はみられず、安定した感度を維持
した。

本発明は、ストレプトキナーゼのような水溶液中で、き
わめて不安定な酵素をラテックスに感作する場合に非常
に有用性の高いものである。

以下に実施例および比較例をあげ、本発明を更に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１゜ ストレプトキナーゼ感作ラテックス試薬の調製（１）に
本発明の製造法による調製を、以下対照として（２）に
従来のラテックス感作法によるストレプトキナーゼでの
調製を、（３）には本発明の製造法の不完全実施ともい
える、グルタールアルデヒ′ドをストレプトキナーゼと
同時に加えてしまう調製を示す。　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　（（１）本発明による調製（感作） 粒径０．８〜０．９μｍ、比重１．２±０．０５のポリ
スチレンラテックスＳＤＴ、−５９（成田薬品工業ＫＫ
製）の５％懸濁液１容に５　ｍｇ　／　ｍｌのストレプ
トキナーゼ＋　４３４０　ＩＵ　／ｍｇ　シグマ社製）
１容’１ＪＩＩ工、よく混合した後、５６℃で３０分間
加熱する。

この懸濁液を遠心分離し、上清を捨てた後、ラテックス
沈渣をラテックスの最終濃度が０．１　％となるように
０．０１Ｍリン酸緩衝食塩液（ｐＨ７，２）て調製する
。

こ乙に、ゲルタールアルデヒドを最終濃度ｏ、　ｏｓ％
となるように加え、室温で１時間攪拌する。次にこの懸
濁液を遠心分離し、０．２Ｍアンモニア緩衝食塩液（ｐ
ｌ（８，２）て３回洗浄する。

その後、０．２Ｍアンモニア緩衝食塩液（ｐｌ＋　８．
２　）、塩化コリン（最終濃度５％）、ショ糖（最終濃
度５％）、牛血清アルブミン（最終濃度１％）を加え、
ラテックス濃度が最終濃度で０．１％になるように調製
する。

２）従来のラテックス感作法による調製粒径０．８〜０
．９μｍ１比重１．２±０．０５のポリスチレンラテッ
クス５ＤＬ−５９（成田薬品工業ＫｌＣ製）の５％懸Ｗ
４液１容にｓ　ｍｇ　／　ｍｌのストレプトキナーゼ水
溶液（ストレプトキナーセ：４３４０１Ｕ／ｍｇシグマ
社製）　１容を加え、よく混合した後、５６℃で３０分
間、または室温で数時間接触させる。

この懸濁液を遠心分離し、０．２Ｍアンモニア緩衝食塩
液（ｐＨ８，２）で３回洗浄する。

その後、塩化コリン（最終濃度５％）、ショ糖（最終濃
度５％）、牛血清アルブミン（最終濃度１％）を加え、
ラテックス濃度が最終濃度で０．１％になるように調製
する。

（３）ゲルタールアルデヒドを用いた感作法による調製
粒径０．８〜０．９　μｍ１比重１．２±０．０５のポ
リスチレンラテックス５ＤＬ−５９（成田薬品工業ＫＫ
製）の５％懸濁液１容にストレプトキナーセ水溶液（ス
トレプトキナーゼ：　４３４０　ＩＵ　／ｍｇシグマ社
製）１容を加え、ここに０．０１Ｍリン酸緩衝食塩液（
Ｉ）ｌ（７，２）　、ゲルタールアルデヒド（最終濃度
０．０５％）を加えて、ラテックス最終濃度が０．１％
になるように調製し、室温で１時間攪拌する。この懸濁
液を遠心分離し、沈渣ラテックスを０．２Ｍアンモニア
Ｉ！衝食塩液（ｐＨ８，２）で３回洗浄する。その後、
塩化コリン（最終濃度５％）、ショ糖（最終濃度５％）
、牛血清アルブミン（最終濃度１％）を加え、ラテック
ス濃度が最終濃度が０．１％になるように調製する。

実施例２゜ ストレプトキナ−°ゼ感作ラテックス試薬の凍結乾燥実
施例１の（１）により調製した感作ラテツクス溶液を急
速冷凍（−７０℃）してから乾燥させる。感作ラテツク
ス乾燥品は、蒸留水で乾燥以前の濃度となるように復元
する。

実施例３゜ 抗ストレプトキナーセ価の測定 Ｕ型マイクロプレート（リジットタイプ）の第１穴目に
０．０７５ｍ１、第３大目から最終穴までは、０．０２
５ｍ１の血清希釈液（１％牛血清アルブミンを含む０．
２Ｍアンモニア緩衝食塩液）を加える。

次に第１大目にダイリュータ−で検体血清０．０２５ｍ
１を加え、最終穴１つ手前まで希釈する。

実施例１の（１）で調製ルなストレプトキナーゼ感作ラ
テツクス溶液ないしは実施例２で調製したストレプトキ
ナーセ感作うテックス凍乾品復元液を、第２六目から最
終穴まて０．０２５ｍ１．ずつ加え、トレイミキサーで
よく混和する。

その後、−夜装置した後、凝集の終末点を判定し、凝集
を示す検体血清の最終希釈倍数を抗スト＊ レプトキナーゼ価とした。

判定は、判定用ピュアーまたは明るい部屋の実験机に黒
色紙を敷き、その上にプレートを置いてラテックスの反
応像を肉眼で判定した。判定は第１表および第１図に基
づいて行なった。

第１表 ＊：陽性を示す最高血清希釈倍数を以って、その検体の
抗体価とする。

＊＊：読みとは、第１図に判定例としで示す如くく判定
の基準となる凝集の程度を表わす。

結果は以下の比較例に示す如く、陽性、陰性の差が明確
で、かつ感度の優れた結果が得られた。

比較例１゜ 感作法による感度の比較 実施例１で調製した３種のラテックス試薬と市販の赤血
球試薬とを用いて、被検体として陽性血清３検体と陰性
血清４検体について各々のストレプトキナーゼ抗体価を
測定した。被検体血清は、感作赤血球に対して非特異凝
集を示さないことを確認したもｄを使用した。

その結果を第２表に示す。　（表中、本発明による試薬
は実施例１の（１）の本発明による感作法による試薬、
従来法による試薬は実施例１の（２）の従来のラテック
ス感作法による試薬、ＧＡ法による試薬は、実施例１の
（３）のグルクールアルデヒドを用いた感作法による試
薬を表す。）第２表より、本発明による試薬と市販赤血
球試薬による測定結果は、陽性と陰性の差が明確であっ
た。これに対し、５６℃、３０分間でインキュベーショ
ンする従来法による試薬では、陽性、陰性の差はほとん
どつかなかった。

また、本発明による感作法の途中段階といえるゲルター
ルアルデヒドを用いた感作法；こよる試薬では、やや差
がついているが、同し抗体価の陽性血清と陰性血清もあ
り区別が明確ではなかった。

以上の結果から、本発明による感作法は、官能基を有し
ないラテックス粒子にストレプトキナーゼを感作するの
に最も適した方法であるといえる。

第２表 （＄　ＡＳＫ価；抗ストレプトキナーゼ価）比較例２゜ 感作法による安定性の比較 比較例１で使用した各試薬（市販赤血球試薬を除く）に
ついて、製造時と３７℃で２ケ月間保存した後での被検
血清の抗体価を測定し、その変化を測定したものである
。

その結果を第３表に示す。（表中、１管とは被検血清の
希釈倍数２ｎの２１を意味し、１管」−昇とＣよ、抗体
価が２倍上がることを示ず。）第３表より、従来法によ
る試薬では２ケ月後、まったく反応性を示さなくなり、
凝集像（よ全て陰性であった。ＧＡ法による試薬では反
応性は残っていｔ：が、２管から４管の感度の低下がみ
られた。

本発明による試薬は２ケ月後においてもほと）しど変化
はなく、やや感度の上昇がみられた。

以上の結果より、３種の試薬の内で、経時変化に対して
最も安定性に優れているのは、本発明による試薬てあっ
ｔ二。

第３・表 比較例３゜ 凍結乾燥における感度の比較 比較例２で使用した各試薬について、凍結乾燥前と凍結
乾燥後の抗体価を測定した。その結果を第４表に示す。

第４表より、従来法にとよる試薬では凍結乾燥後、かな
りの感度低下がみられ、凍結乾燥には適していないこと
がわかる。

ＧＡ法による試薬と本発明による試薬では、はとんど凍
結乾燥による影響は受けていない。しかし血清に対する
特異性（感度）を考えれば、本発明２こよる試薬の凍結
乾燥のほうがほれている。

第４表 比較例４゜ 凝集像の程度の比較 本発明Ｃζよる試薬、ＧＡ法による試薬および市販赤血
球試薬の各々について、抗体価が１：　　１２８０であ
る血清を用いて、その凝集像の程度（読み）を第１図に
示した判定例を基準にして、１：４０から観察した。な
お市販の赤血球試薬を用いた凝集の程度は添付の使用説
明書に従った。

その結果を第５表に示す。

ＧＡ法による試薬と市販赤血球試薬ては、１：４０から
ｌ・】２８０まて連続して１で、非常に判定がしにくい
。それに対して本発明による試薬は、凝集像の強さが、
それぞれの希釈倍数により、はっきりしており、また終
末点の判定も答易であった。

第５表 比較例５゜ 阻止反応により、本発明による試薬の特異的凝集を市販
赤血球試薬との比較によりｔｉ認した。

市販赤血球試薬の未感作赤血球て陽性を示したＡＳＫ価
陽性血清３検体について、ストレプトキナーゼを加え、
抗体を中和した後、その血清の抗体価を以下の測定法に
より判定した。

上記の検体血清１容に、１０００〜２０００１１のスト
レプトキナーゼ水溶液１容を加え、３０分間室温で反応
させる。Ｕ型マイクロプレート（リジットタイプ）の第
１大目にば０，１ｍｌ、第２六目から最終穴までは０．
０２５ｍ１の血清希釈液を加える。

次に、２倍に希釈した前記のＡＳＫ価陽性血清をグイリ
ュータ−で０．０２５ｍ１第１穴目に加え、最終穴１つ
手前まで希釈する。

ストレプトキナーゼ感作ラテックス溶液（本発明による
試薬）ないしは、感作血球溶ｗｌ＜市販赤血球試薬）を
加え、トレイミキサーてよく混和する。−夜装置した後
、凝集の終末点を判定しその抗体価を測定する。測定の
結果を第６表に示す。

第６表より、本発明による試薬では、まったく抗体価が
０で、特異的な反応に基づいていたことがわかる。

これに対し、市販赤血球試薬は、中和された血清でも＆
ｆｍを示し、特異的なストレプトキナーゼ由来の抗原抗
体反応だけでない、非特異凝集も起きていたことがわか
っｔこ。

以下余白 第６表

【図面の簡単な説明】

第１図は、抗ストレプトキナーゼ価の測定に際し、判定
の基型となる凝集の程度を表す判定例を示す。なお、敬
値は第１表に示される読みを表す。 以上 手続補正書（自　発） 昭和５８年２月１日 特許庁長官　　若杉　和犬　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１８３７０９　号 ２、発明の名称 溶血性連鎖球菌ストレプトキナービ感作うテツスス試薬
、その製造方法およびそれを用いるストレプトキナーゼ
抗体の検出方法 ３、補正をずろ者 事件との関係　特許出願人 ４、補正の対象 明細書全文 ６、補正の内容 別紙の通り黒色により鮮明に記載した明細書全文（内容
に変更なし）に補正する。 手続補正書く自発） 昭和５８年２月１日 特許庁長官　　若杉　和犬　　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許＠ｆｆｉ　１８３７０９号２、発明の名
称 溶血性連鎖球菌ストレプトキナーゼ感作ラテツクス試薬
、その製造方法およびそれを用いろストレプトキナ−セ
抗体の検出方法 ３、ＭＩ正をする者 事件との関係　特許出願人 ５、補正の対象 明細書中「発明の詳細な説明」の欄 ６、補正の内容 １）明細書第１９頁第１行目に［第５図−１とあるを「
第５表」と訂正する。 ２）　明細書第２１頁第１行目に１第６図」とあるを１
第６表Ｊと訂正する。 以Ｆ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ラテックス粒子な溶血性連鎖球菌ストレプトキナー
   ゼで感作して成る溶血性連鎖球菌ストレプトキナーゼ感
   作ラテックス！！！ｒ！４液を主成分とする溶血性連鎖
   球菌ストレプトキナ−ｖ感作ラテックス粒子 ２）溶血性連鎖球菌ストレプトキナーレ゛感作うデノク
   ス懸濁液にショ糖、牛面清アルブミンおよび塩化コリン
   を含有して成る特許請求の範囲第１項記載の溶血性連鎖
   球菌ストレプトキナーゼ感作ラテツクス試薬 ３）ａ）官能基を有しない直径０．１μｍ−Ｌｌ、０μ
   ｍのラテックス粒子１ｍｇに対して６０ＩＴ１ｇ〜１４
   ０ｍｇの溶血性ｉ！！鎖球菌ストレプトキナーセを接触
   さセる工程、 ｂ）その後、遠心分離したラテックス粒子に緩衝液およ
   びゲルタールアルデヒドを最終濃度が０．０１％〜１．
   ０％になるように添加する工程、 Ｃ）室温で撹拌後、緩衝液で洗浄する工程、の各工程か
   ら成ることを特徴とする溶血性連鎖球菌ストレプトキナ
   ーゼ感作ラテツクス試薬の製造方法 ４）ショ糖、牛血清アルブミンおよび塩化コリンを添加
   し、最終ラテックス濃度を０．０５％〜１．０％となる
   ように緩衝液で調製する工程を、更に施すことを特徴と
   する特許請求の範囲第３項記載の溶血性連鎖球菌ストレ
   プトキナーゼ感作ラテツクス試薬の製造方法 ５）凍結乾燥により安定化せしめる工程を、更に施すこ
   とを特徴とする特許請求の１ＩＩｉ１１１ｎ第４項記載
   の溶血性連鎖球菌ストレプトキナーゼ感作ラテツクス試
   薬の製造方法 ６）ラテックス粒子を溶血性連鎖球菌ストレプトキナー
   ゼで感作して成る溶血性連鎖球菌ストレプトキナーゼ感
   作ラテツクス試薬をヒトの体液、もしくはその希釈液と
   接触させ、凝集像を観察することを特徴とするストレプ
   トキナーゼ抗体の検出方法