JPS59501045A - 新規なクロ−ニング・発現ベクタ−，このベクタ−によつて形質転換された酵母およびその応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　新規なクローニング・発現ベクター、このベクターによって形質転 換された酵母およびその応用 本発明は、酵母における新規なりローニング・発現ベクター、ならびにこれらベ クターによって形質転換された酵母、および蛋白質合成に対するこれらベクター の応用に関するものである。

クルイヴエロミセス　ラクテイスの一部の酵母菌株は、その細胞に対して１キラ ー′特性を与える線状プラスミド対を含み、この細胞は、他のいわゆる感性細胞 の生長を妨げる毒素を産出する。

感性細胞として、プラスミドを失ったに、ラクテイスの細胞、およびサツカロミ セス　セレヴイシエなどの各種の細胞が挙げられる。

これらのプラスミドは最初にＧｕｎｇｅなどによって記述され（Ｊ、Ｂａｅｔｅ ｒｉｏｌ、１４５，３８２−３９０（１９８１）、１４７，１５５−１６６（１ ９８１））。次に別個にＨ，７クハラなどによって記述された（　Ｃｕｒｒｅｎ ｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、印刷中）。

この場合、誕、（８，８１ｉｂ）およびに、（１３，４ｋｂ　）と呼ばれる２個 の線状二本鎖ＤＮＡプラスミドが問題となる。

Ｍ、ツクハラの研究所で行われた遺伝学的研究によれば、Ｓ、セレヴイシエの１ キ之−′系統が２個のＲＮＡプラスミドを含むこと以外は、このゝキラー′系統 との大きな類似性を示している。

シラスミドに１　はゝキラー′特性と毒素免疫性との発現のために必要である。

このシラスミドの喪失がこれら二つの特性の消失をもたらすからである。プラス ミドに２は細胞中にに、を保持するために必要であると思われる。

これらのＤＮＡの複製は酵母の多数の染色体遺伝子を介入させる。また毒素の発 現は核遺伝子に依存している。従って、２種のプラスミド間の相互作用とプラス ミドと核との間の相互作用がある。

ところで、プラスミドに１をクローニング・発現ベクターとして使用できること が見出された。

故に、本発明は、酵母の中における非相同遺伝子のクローニング・発揚ベクター において、少くとも、−に−ラクティスのプラスミドに１のＤＮＡの全部または 一部と、 一非相同遺伝子を含むＤＮＡ部分、および前記酵母内部における前記遺伝子の発 現を保証する配列とを含むことを特徴とするクローニング・発現ベクターを提案 するものである。

このようなりローニング・発現ベクターの利用はきわめて興味あるものである。

なぜならば、第１に酵母中において使用可能なベクターがほとんど存在しないか らである。さらに、プラスミドに、は多数のユニーフナ制限部位、特にＥｃｏＲ ｌ、Ｂａｍ　ＨＩおよびＣ１ａ　Ｉ　を有し、これは特に組換雑種の構成のため に興味あることである。

最後に、プラスミドに１　は細胞中に多数の模写として存在し、この模写の数は １００〜１５０に達することは周知である。このような条件において、４クター の中に挿入される遺伝子の増幅を期待することができる。

本発明の主旨の範囲内において最も考慮される非相同遺伝子は、工業的利益のあ るペプチドまたは蛋白質の合成のための暗号づけ遺伝子である。

もちろん、若干の場合には、このベクターは異種の非相同遺伝子を含み、その一 部のものは発現されないが一部の配列が他の１種の遺伝子の発現を保証すること ができる。

好ましくは、クローニング・発現遺伝子はユニークな制限部位の一つの中に、特 にＣ１ａ　１部位の中に挿入される。

もちろん、この技術分野において公知のように、非相同遺伝子の挿入を容易にす るため、もし望ましければ多数のユニークな制限部位を含む配列を４クターの適 当部位に（すなわち一般に、発現を保証する主要素の下流に）挿入することがで きる。

本発明によるベクターのうち、非相同遺伝子として、酵母遺伝子ＵＲＡ６を、特 に２つのＨｉｎ　ｄ　１部位によって限定された約１．ｌｋｂのＤＮＡ部分の形 で含むベクターを挙げなければならない。

クローニングと発現のためにプラスミドに１　の全体は必要でないことが実験に よって証明された。このようにして、ＮＫ２’ノンキラー′に、ラクティスの突 然変異体から生じ分泌毒素に対して抵抗性のプラスミドに１δを（フタ−として 使用することができた。このプラスミドに、δは、プラスミドに１に対して、２ つのＨｉｎ　ｄ　）１部位の間の２，９ｋｂの欠失を示す。

本発明によるベクターはまた、細菌ＤＮＡの断片を含むことができ、特に複製起 源および／または抗生物質に対する抵抗性遺伝子を有するＨＪ菌ＤＮＡ断片を含 むことができる。これは特に、細菌菌株におけるクローンの選含むｐＢＲ３２２ の制限断片を挿入することができる。

本発明によるベクターのうち一部のものは特に興味があり、これは、シラスミド に、のＤＮＡとしてプラスミドに１　δのＣ１ａ　Ｉ制限断片を含み、そのほか に好ましくはクローン６ゾラスミドのＣ１ａ　Ｉ制限断片を含むｐＬ３などの環 状プラスミドである。

もちろん、前記の各種プラスミドを公知技術を実施して調製することができる。

また本発明は、本発明によるベクターを含む形質転換ある。

また本発明は、前記のベクターに含まれた非相同遺伝子によって暗号づけられた 蛋白質の発現に前記の形質転換酵母を応用することに関するものである。

最後に本発明は１．非相同遺伝子として蛋白質またはペプチドを暗号づける遺伝 子を含む本発明のベクターによって形質転換された酵母を栄養培地上で培養する ようにした蛋白質またはペプチドの調製方法に関するものである。

図面の簡単な説明 実施例として、下記において必要なかぎり付図を参照して、Ｓ、セレヴイシエの ｕ　ＲＡ　５　遺伝子のクローニングおよび発現について説明する。これらの付 図において一第１図はプラスミドに１とに１　δを示し、−第２図はクローン６ プラスミドを示し、−第３図はｐＬ３プラスミドを示す。

■−雑雑種シラスミド１−ＵＲＡ３の構成プラスミドに、とに１　δはすでに前 記の論文において記載されていた。

第１図には、プラスミドに、とに１　δの制限チャートを示した。

この図から明かなように、プラスミドに、は３個のユニークな制限部位Ｅｃｏ　 Ｒ１１ＢａｍＨＩ、　Ｃ１ａ　ｌを有し、また二重制限部位Ｈｉｎ　ｄ　Ｗｂを 有する。

これに対して、シラスミドに１　δは２．９ｋｂの欠失を有し、単一のユニーク 制限部位Ｃ１ａ　Ｉ　Ｌか有さないが、２つの制限部位Ｈｉｎ　ｄ　［［Ｉを保 存している。

これは、Ｃ１ａ　１部位上で遺伝子をクローニングしようとするとき、完全制限 を実施することができるが、Ｈｉｎｄｌｌｌによって制限を実施しようとすると き、部分制限のみを実施するのが適当であることを説明している。

複製に必要な区域の不活性化を防止するため、標識ＵＲＡ３かに、とに１δの相 異る部位に導入されている。

第１クローニングモード：　Ｈｉｎ　ｄ　ＩＮによるＨｉｎ　ｄ　ｉｆによって プラスミドに１とに１　δの部分制限を実施する。

クローン６　プラスミドのＨｌｎ　ｄ　Ｉｌｌによる完全制限によって遺伝子Ｕ ＲＡ３が得られる。（Ｂａｅｂら、１９７９、ＰＮＡＳ、７６．３８６−３９０ ）。

このようにして、１．１ｋｂのＤＮＡ断片によって保持された遺伝子ＵＲＡ３全 Ａ３全体れる。この断片は、このプラスミドの再環状化を防止するためアルカリ ホスファターゼによって処理される。

下記の結合を実施する。

１　）　Ｈｉｎ　ｄ　Ｉｆｆによって切断されたｋ　１＋　Ｍｉｎ　ｄ　ｌｉに よって切断されたクローン６． ２　）　Ｈｉｎ　ｄ　Ｉによって切断されたに１　δ＋Ｈｉｎ　ｄ　ｌ　ｆＣよ って切断されたクローン６゜ 使用された２つのプラスミド、ｋ１δとクローン６において、Ｃ１ｍ　１部位は 単一であるから、これら２つのプラスミドの完全制限を実施することができる。

下記の結合が実施される。

１　）　Ｃ１ｍ　ｌによって切断されたに１　δ十Ｃ１ａ　ｌによって切断され たクローン６゜ これらの結合混合物全体は一定割合の雑種プラスミドを含有している。

遺伝子ＵＲＡ　のクローニングと発現を明らかにするため、Ｋ、ラクティスの突 然変異菌株ｕｒａＡ−を準備することが適当である。また、本発明のベクターの 保持を保証するため、このレセプター菌株もプラスミドに２を保有することが望 ましい。

菌株ＣＢ　Ｓ　２３６０　からＵＶ変異誘発によって得られたＯＭＰデカーゼ活 性を有さないに、ラクティスＣＢ５２３６０−６　ｕｒａＡ−菌株から出発した 。

突然変異の復帰率は１・１０−８細胞以下である。

この菌株は１キラー′であって、毒素に対して抵抗性である。この菌株は２つの プラスミドに１　とに２　を有し、（ｋ１＋、ｋ２＋）と表記される。

変異誘発によって分離され、ｋ、０、ｋ２＋特性を有する菌株ＶＭ２　’ノンキ ラー′との交雑によって、前記の菌株からプラスミドに、を除去した。

下記の交雑が ２３６０−６　ａ　ｕｒａ””　Ｘ　ＶＭ２　α　１ｙｓ−（ｋ、＋、ｋ２＋） 　（ｋ、０、ｋ２＋）有糸分裂分離によってに、を失い１ノンキラー’　ト成っ た約１％の二倍体細胞を生せしめる。

これらの二倍体菌株の胞子形成ののち、′ノンキラー′ｕｒａ’−−缶体菌株が 得られ、そのＤＮＡを抽出することによって、この菌株かに１を失っても依然に ２を保持していることを確証することができる。

このようにして、ｕｒａＡ　’ノンキラー′菌株（ｋ。

０、ｋ２＋）が得られ、これが本発明によるベクター上にクローニングされた遺 伝子の発現を明らかにするために使用される。

１−に、ラクテイスの形質転換 前記のように構成されたレセプター菌株は、ウラシルが補給された最少培地（Ｙ ＮＢＯ−６７％、グルコース２チ）上で、１〜２・１０８細胞／ｍｌの濃度まで 培養される。

これらの細胞を二重洗滌したのち、プロトシラスト形ａｇ衝液（ＫＣＩ　０−６ Ｍ、ｐＨ５）（Ｄ中に、１０９ｉ胞／　ｍ　ｌ濃度で懸濁させる。

チモリアーゼ５０００　（０，５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３４℃で５〜１０分間 でプロトプラストを得る。

二重の洗浄ののち、２・ｌｏ８の細胞と１〜１０μｇの結合混合物ＤＮＡとを合 体させる。

２ｍｌの４０％ＰＥＧ５ＣａＣｌ２１０ｍＭを添加し、常温で２０分間放置する 。

ＰＥＧの除去ののち、浸透的に栓をした完全培地中で１時間インキュベートする 。プロトプラストを過融解ゲロース中に包含させ、ＫＣ１最少培地上で展開させ る。

Ｉ　Ｊ間、３０℃でインキュベートしたのちにコロニーが現れ、これらのコロニ ーは小サイズであって、最少培地上に移植したのちに余り成長しない。

形質転換効率はＤＮＡμｇあたり１形質転換体であり、プロトプラストの再生率 は約１０％である。

観察結果を下表に示す。

表■に表わされているすべての形質転換体は、ウラシルを含まぬ最少培地上で成 長するのでＵＰＡ＋である。

ｕｒａＡ−を補足することを示している。

このようにして得られた形質転換体は下記のように可変的安定性を有する。

一ウラシルを含まない最少培地において培養したとき、１５世代の間に４０〜９ ９チのｕｒａ−を分離する。

−最少培地＋ウシシル上で同数世代間培養すると、９４〜９９チのｎｒａ〜　を 分離する。

しかし、最少培地上に連続移植させることによりＵＲＡ＋特性を安定化させるこ とが可能である。

ｋｌおよび異種ＤＮＡ例えばｐＢＲ３２２あるいはＵＲＡ３を保有するプラスミ ドの存在は、ゲル上または正常部位での雑種形成の結果から確認された。

三種の放射性ゾンデ、ｋｌ、ｐＢＲ３２５およびＵＲＡ５の使用は、 Ｌ４が、ｋ、の一部と遺伝子ＵＲＡ３とを含有するゲル上で可視の４．４ｋｂの 遊離シラスミドを保持すること、 Ｌ３は、ｋ１δの一部とｐＢＲ３２２のＤＮＡの一部とを含有する９ｋｂの遊離 プラスミドを保持することを示している。

形質転換体Ｌ２およびＬ３のＤＮＡ全部を抽出し、このＤＮＡを大腸菌ｐｙｒ　 Ｆ菌株の形質転換に使用した（Ｓ、セレヴイシエの遺伝子Ｕ　ＲＡ３による相補 性突然変異）。次に形質転換体ＵＲＡ＋とＡｍｐｒを適崩培地上で選択し、本発 明によるプラスミドを組み入れた形質転換体をうる。

Ｌ３のＤＮＡによって形質転換された大腸菌菌株からのプラスミドの抽出は、付 図に表示のようなプラスミドが問題であることを示し、これらのプラスミドをＰ ｂ３と命名する。これは、Ｃ１ａ　Ｉによっ℃切断されたに１　δの末端を有す る７、３ｋｂのオーダのサイズを有する環状プラスミドである。

この付図は、分析によって決定されることのできたシラスミドｐＬ３の制限チャ ートを示している。

このプラスミドは、ｐＢＲ３２２プラスミド起源の細菌断片と、Ｓ、セレビシェ 酵母の遺伝子ＵＲＡ　３＋に対応すＨｉｎ　ｄ　ＩＩＩ制限断片と（これら二種 のＤＮＡ断片はクローン６ゾラスミドのＣ１ａ　Ｉによる制限から生じる）、最 後この付図に示されているようにＰｂ０においては、部位Ｃ１ａ　Ｉの一方が遺 伝子ＵＲＡ５のＤＮＡの近傍においい消失していることに注意しよう。

これらの条件のもとに、プラスミドｐＬ６は多数のユニーク制限部位、すなわち Ｃ１ａ　Ｉ、　Ｅｃｏ　Ｒｌ、　ＢａｍＨＩ中の遺伝子のクローニング（フタ− として適当となる。

またこのシラスミドは、大腸菌の中で増幅され、また容易に抽出されるという大 きな利点を有し、それ故にこのプラスミドはきわめて入手容易なプラスミＰであ る。

最後に、大腸菌から抽出されたプラスミドｐＬ、は、主特許に記載のような結合 混合物による効率の１０倍の効率でもって、酵母に、ラクテイスｕｒａ−をｕｒ ＆＋特性に形質転換する。

下記の操作モードは本発明によるベクターの詳細な調製法を示すためのものであ るが、本発明はこれに限定されるものではない。

る。

十 一野生型菌株ＣＢ　Ｓ　２３６０ａ　（ｋ４、ｋ２）　、およびＵＶ誘発によっ て得られＯＭＰデカーゼ活性を有さない突然変異体ＣＢ　Ｓ　２３６０　ａ　ｕ ｒａＡ−１−菌株ＣＢ　Ｓ　２３５９から誘導された菌株ｖＭ２α１ｙ＋５−（ ｋｌｏ、ｋ２）。

１、ｌｋｂのＳ、セレヴイシエの断片ＵＲＡ５を有するクローン６プラスミドを 含む大腸菌ＨＢ１０１ＡｐＲＴ　ｅ　ｔ　５　Ｒの菌株。

培地 酵母は最少培地で培養される（グルコース２％、アミノ酸が除去されたディフコ １イースト屋素ベースｌ０１６７％、ディ７コ寒天２チ）。この培地にウラシル （５０ｍｇ／ｌ）または溶解素（４０ｍｇ／ｌ　）を補給することができる。こ の培地ＹＰＧはグルコース２％、酵母抽出物１チ、ノ々クトペプトン１チを含有 する。交雑／胞子形成培地は、麦芽抽出物５チとディフコ寒天２チとから成るＭ Ｅ培地である。′キラー′テストは、ＧＡＬ培地ニガラクトース２チ、ノζクト ペプトン１チ、酵母抽出物１チ、ＫＨ２ＰＯ４０，０５Ｍ１寒天２％について実 施される。

細菌シラスミド　クローン６の抽出はゲリーなど、１９７３　（Ｊ、Ｂａｅｔ、 １１６．１０６４　１０６６　）に従って実施される。

Ｋ、ラクテイスのプラスミドの抽出と精、製はＭ、ウエソロフスキ、Ｐ、デュマ ザートおよびＨ，ツクハラ、１９８２、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（ 印刷中）によって実施された。

指数増殖期の末期において２００ｍ１のＹＰＧの培養物の細胞を一回、水洗し、 秤量し、チモリアーゼ６００００　（０，５ｍｇ／ｇ細胞）と共にソルビトール ＩＭ（２ｍ　１７　ｇ細胞）の中に懸濁させる。

細胞を３０℃で４５分間インキュベートしたのち、遠心分離し、ＮａＣ１０，１ ５Ｍ、ＥＤＴＡＯ，１０Ｍ溶液（２ｍｌ／ｇ細胞）の中に懸濁させる。０．５ｍ ｇ／ｇ細胞のゾロナーゼと最終ＳＤＳ　１　％とを添加する。

３７℃で１時間のインキュベートおよび５０℃で１時間のインキュベートののち 、全体を冷却し、最終酢酸カリウム０．５Ｍを添加する。少くとも１／２時間、 放置゛冷却する。

遠心分離ののち、上澄みを３７℃で１／２時間、すＩヌクレアーゼでもって処理 する。セパーグ抽出（クロロホルム：イソアミルアルコール、２４：１、体積／ 体積）に続いて、エタノール沈殿（１，２容）を実施する。

パスツールピペットに捕集したＤＮＡファイノ々をＴＥ（トリス１０ｍＭ、ＥＤ ＴＡ　１ｍＭ、ｐＨ８）の中に溶解させる。ＤＮＡファイバを０．５６容の再蒸 留インプロパツールでもって再沈殿させ、これをＴＥ中に再溶解する。着色剤（ ブロモフェノール青）を添加したこの浴液を０．６チアガロースゲル上に配置す る。

１８時間の６０Ｖ泳動ののち、各プラスミドに対応して出現した臭化エチジウム のバンドを切除する。これらを、−晩、１００ｍＡで電気溶離する。

次にＤＮＡをＤＥＡＥ−セルロースカラムに通し、０．３ＭＮａＣ１で洗浄し、 ２　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ１で溶離する。次に’Ｄ　Ｎ　ＡをＣｇＣｌの勾配で遠心分 離し、透析し、エタノール沈殿させる。

制限、結合 ＤＮＡは、谷酵素に対応する緩衝液の中で、３７℃で１時間、制限酵素によって 制限される。部分的制限は、３７℃で５〜１０分間、限定世の酵素によって実施 される。

脱リン酸化は、アルカリ性細菌ホスファターゼによって、ｌ／２時間、６０℃で 実施される。

結合は、フェノールによるＤＮＡ精製とアルコールによる沈殿ののち、１０℃で １晩、Ｔ４のリガーゼの存在において実施される。

９２９−１９３３および・クエルゼ、フールニエ、プラン、ニーグル、エスロ、 ゲリノ（１９７９）Ｇｅｎｅ　５゜２３３−２５３の研究からヒントを得た。最 少培地＋ウラシルの中において指数増殖期（１−２・１０８７ｍ１）まで培養し た細胞を蒸留水で一回洗浄し、次にプロトプラスト化緩衝液（ＫＣＩ　Ｏ，６Ｍ 　ｐＨ５）で−回洗浄する細胞を０．５ｍｇ／ｍｌ　のチモリアーゼ５０００と 共にこの緩衝液の中に、１０９細胞／　ｍ　ｌの割合で再懸濁させ、短時間（５ 〜１０分間）３４℃でインキュベートする。

９０％以上のプロトプラストが得られた。

細胞を１８００ｇで５分間遠心分離し慎重に再懸濁させることによって、トリス ＨＣ１，ｐＨ７，５、ＫＣｌ０，６Ｍ、ＣａＣｌ２１０ｍＭ緩衝液でもってプロ トプラストを二重洗浄する。プロトツブストは前記の緩衝液の中に１０　細胞／ 　ｍ　ｌで濃縮される。０．２ｍｌの細胞（２・１０　細胞）に対して１〜１０ μｇの結合混合物を添加し、よく混合する。

常温で１５分間インキュベートしたのち、３０％（重量／体積）ＰＥＧ　４００ ０　２ｍｌ　を添加し、１５分間、常温に放置する。

６分間、１８００ｇで遠心分離したのち、ＫＣｌ０．６Ｍ１グルコ一ス６ｇ／Ｉ ｓバクトペプトン６ｇ／ｌ、酵母抽出物４　ｇ／ｌの２ｍｌ　中に再懸濁させ、 １時間、３０℃で静かに攪拌する。

次に細胞を遠心分離し、０．２ｍｌのプロトプラスト化緩衝液の中に再懸濁させ る。４６℃の過融解状態のゲロース５ｍｌ　（ＫＣＩ　０．６Ｍ、グルコース２ ％、ディフロ１無アミノ酸’ＹＮＢ　０．６７％、′精製′品位のディフロ寒天 ３０　ｇ／ｌ　）　を添加する。前記ゲロースと同一組成を有するが標準品位の ディフロ寒天を含有する培地を収容し５５℃に予熱したゼツクスの上に前記の混 合物を１）コロニー上の雑種形成フィルタの調製（本来の場所に）、（グリュン ステインＭ、およびホグネスＤ、Ｓ　。

（１９７５）ＰＮＡＳ　７２．３９６１−３９６５）。

Ｗ上で成長するコロニーを、Ｗ１３２ツクス上に配置され２日間、３０℃でイン キュベートされたシュライビアー／ジュールのフィルタＢＡ８５の上で複製する 。

プロトプラスト化は、ＫＣＩ　０．６Ｍ　含有のテモリアーゼ６００００　（１ ｍｇ／ｍｌ）でもって３０℃で１ｌ２時間実施する。フィルタをワットマン紙上 で乾燥したのち、下記のものが含浸されたワットマン紙上に順次転移させる。

−ＮａＯＨ０、５Ｎ　（５分） −トリスＨｅｌ　ｐＨ７，５１Ｍ（２ｌ２分）ＮａＣ１１，５Ｍ％　）リスＨＣ １０−５Ｍ　ｐＨ７，５（２×５分） これらのフィルタを減圧下、８０℃で３時間、乾燥する。

２）ゲル上雑種形成はサザンＥ、Ｍ、（１９７５）Ｊ。

３）フィルタを各種の浴中で６５℃で処理する。

・ｆＡ雑種形成は、３　Ｘ５ｓｃ　（２０ｘＳＳＣ＝　３ＭＮａＣ１０，３Ｍク エン酸ナトリウム）の中で３０分間、３Ｘ８ＳＣ，ＩＯＸデンハルト緩衝液（デ ンハルト＝フイコル４００　０．２％、牛の血清アルジミン０　、２　％、ポリ ビニールピロリドン０．２％）中で３時間、最後に、５０μｇ／ｍｌの拮抗ＤＮ Ａと、０．１％のＳＤＳと、０．１　ＭのＮａＨ２ＰＯ４ｐＨ５，６と、１０Ｌ ％の硫酸デキストランとを添加した同一緩衝液の中で２時間実施する。

・ニック翻訳により３２　ｐにマークされた放射性ゾンデによるフィルタの雑種 形成のため、変性ゾンデな前雑種形成の最後の浴に添加し、１晩６５℃でインキ ュベートした。ニック翻訳は、カメロンら、１９７９、Ｃｅ１ｌ、１６．７３９ −７５１．　およびアマーシアム放射化学センターのデータによって記述されて いる。

・フィルタの最初の六回の洗浄は３ＸＳＳＣ，ＩＯＸデンハルト、０．１％　Ｓ ＤＳ　（第一回洗浄の場合のみ拮抗ＤＮＡ５０μｇ　７ｍ　１を含有）の中で実 施し、最後の二重の洗浄は１×ＳＳＣの中で実施した。フィルタを乾録し、コダ ックフイルムで現像する。

ＡＶａ　Ｉ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酵母中の非相同遺伝子のクローニングおよび発現キクターにおいて、少くと も 一りルイヴエロミセス　ラクテイスのシラスミＰｋ１のＤＮＡの全部まだは一部 と、 −非相同遺伝子を含むＤＮＡセグメントおよび前記酵母中において前記遺伝子の 発現を保証する配列とを含むことを特徴とするクローニング・発現ベクター。 ２、非相同遺伝子のＤＮＡセグメントはサツカロミセスセルヴイシエのＵＲＡ６ 遺伝子のＤＮＡセグメントである、請求の範囲第１項記載のベクター。 ３、ＵＲＡ３遺伝子のＤＮＡセグメントは、二つの制限部位Ｈ１ｎ　ｄ　ＩＩに よって制限された約１．１ｋｂＯＤＮＡセグメントである、請求の範囲第２項に 記載のベクター。 ４、非相同遺伝子のＤＮＡセグメントはプラスミドｋ。 のユニーク部位の一つ、ＥｃｏＲｌｌＢａｍＨｌまたはＣ１ａ　Ｉの中に挿入さ れる、請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一項に記載のベクター。 ５、非相同遺伝子のＤＮＡセグメントは、プラスミドに、のＨｉｎ　ｄ　１部位 の一つの中に挿入される、請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一項に記載の ４クタ６、プラスミドに１δのＤＮＡに対応するプラスミドに、０ＤＮＡ部分の みを含む、請求の範囲第１項乃至第５項のいずれか一項に記載の４クター。 ７、に、ラクテイスのシラスミドに、のＤＮＡとしてプラスミドに、δのＣ１ｍ 　ｌ制限断片を含む環状シラスミドに関する、請求の範囲第１項乃至第６項のい ずれか一項に記載のクローニング・発現ベクター。 ８、クローン６プラスミドのＣ１ａ　１制限部片を含む、請求の範囲第７項に記 載のベクター。 ９．９Ｌ、プラスミドに関する、請求の範囲第７項または第８項のいずれかに記 載のベクター。 １０、請求の範囲第１項乃至第９項のいずれか一項に記載のベクターを組み込ん だ形質転換酵母。 １１、クルイヴエロミセスの菌株に関する、請求の範囲第１０項に記載の酵母。 １２、クルイヴエロ　ラクテイス菌株に関する、請求の範囲第１１項に記載の酵 母。 １３、ベクターの保有する非相同遺伝子によって暗号づけされた蛋白質の調製へ の、請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれか一項に記載の酵母の応用。