JPS5945882A - 酵素固定化フイルム及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素固定化フィルム及びその製造方法に関する
ものである□ 近年、医薬品工業、食品工業等に於いて、酵素反応の基
質特異性を利用した極めて有用な触媒として、酵素を工
業プロセスに応用し、益々発展を遂げつつある。従来の
酵素反応は水に溶解して反応を行なわしめ、反応終了後
の酵素と反応生成物との分離は容易でない。そのため酵
素を都度回収して再利用することは困難である。

したがって従来の工業プロセスではバッチ式を採用せざ
るをえないため酵素の利用効率は悪く、非常に不経済で
ある。そこで固定化酵素の検討がさかんに行なわれ、例
えば物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法により反
応中に酵素が溶出しないよう基材に結合させ固定化する
方法、及び多孔性ゲルの中に物理的にとじこめるか又は
高分子重合体で封入する包括法等が研究されている。

しかし例えばイオン結合法では緩衝液の種類あるいはＰ
Ｒの影響を受けやすく、反応をイオン強度の高い状態で
行うと酵素が担体から遊離することがあり、酵素の失活
に拘りなく固定化、の反応条件が限られてくる。これら
いくつかの固定化方法の中で包括法が一番多く研究され
ている。それは包括法が酵素タンパク自身が固定化担体
と化学的に結合していないので数多くの酵素に適用でき
る利点がある。

放射線や高速電子線をもちいて重合をおこしたアクリル
アミドゲル中に包括した固定化酵素は工業的にも利用さ
れている好例である。これらの放射ｍをもちいて重合を
おこし包括する方法は、しかしながら放射線が単量体層
を透過して酵素に損傷を与え、活性を低下させてしまう
　５− という欠点を有している。また、重合温度を非常な低温
に維持しなければならないし、放射線源や安全保護の観
点から施設的にも大規模な装置を備えなければならなく
、高エネルギーを要する割に効率拳経済性ともに悪い。

このような状況から、新しい技術による酵素固定化方法
が待ち望まれていた。また一方酵素の安定性は蔗糖やグ
リセリン中で安定化するように適当な化合物中に保護さ
れている時には酵素は長期間活性を持続させるというこ
とも判明している。

本発明者らは従来の欠陥を排除すべく鋭意検討研究の結
果、本発明を完成させたものである。

本発明の目的は長期間の酵素活性を持続させる新規な酵
素固定化フィルムを提供するにある。

他の目的は斯かるフィルムを工業的容易且つ安価に製造
する方法を提供するにある。

本発明は疎水性フィルムを形成する疎水性重合体にイオ
ン化ガスプラズマの存在下で親水性不飽和単量体をグラ
フト重合せしめた親水化フィルムに、該重合により得ら
れたグラフト重合　６− 体と錯体形成能を有する相補性重合体により錯体中に酵
素を包括固定化してなる酵素固定化フィルムであり、本
発明方法は疎水性フィルムを形成する疎水性重合体にイ
オン化ガスプラズマの存在下で親水性不飽和単量体をグ
ラフト重合せしめた親水化フィルムを、酵素及び該重合
により得られたグラフト重合体と錯体形成能を有する相
補性重合体を含有する水溶液に浸漬し錯体中に酵素を包
括固定化せしめることを特徴とする。

本発明に適用される疎水性フィルムとは疎水性重合体を
フィルムに形成したものであれば良いが品質面や、コス
ト面からはポリエチレン、ポリプロピレン、またはポリ
エチレンテレフタレートからなる疎水性フィルムが好ま
しい。

また親水性不飽和単量体としては、ビニル基またはアリ
ル基を持ちしかも親水性である単量体で通常のラジカル
重合を行なうものであれば良く特に限定されない。一般
にはアクリルアミド−メタクリルアミド、Ｎ−ビニルピ
ロリドン；アクリル酸、メタクリル酸、Ｐ−スチレンス
ルホン酸、ビニルスルホン酸、２−メタアクリロイルオ
キシエチルスルホン酸、６−メタアクリロイルオキシ−
２−ヒドロキシプロピルスルホン酸、アリルスルホン酸
、メタクリルスルホン酸、並びにこれらの酸のアンモニ
ウム塩、及びアルカリ金属塩ジメチルアミノエチルアク
リレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジエ
チルアミノエチルアクリレート及びジエチルアミノエチ
ルメタクリレート、２ビニルピリジン及び４ビニルピリ
ジンの塩酸、硝酸、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸又は塩
化エチルの４級化物である。好ましい親水性不飽和単量
体としてはアクリル酸、メタクリル酸、２ヒドロキシエ
チルメタクリレート、２ヒドロキシエチルアクリレート
、アクリルアミド、メタクリルアミド、２アクリルアミ
ド−２−メチルプロパンフルホン酸、Ｎ、Ｎジメチルア
ミンエチルメタクリレート又はＮ−Ｎジエチルアミノエ
チルアクリレートが挙げられる。

また本発明におけるグラフト重合のグラフト重合率は目
的、用途に応じ自由に可変可能であるが、好ましくはフ
ィルムを形成する疎水性重合体に対し少くとも１重量％
、好ましくは１０重量％、更に好ましくは１００重量％
、特に好ましくは３００重量％である。

本発明における重合はいわゆるプラズマ開始重合である
。即ちプラズマ開始重合とは非平衡のイオン化ガスプラ
ズマを用いて重合を開始もしくは活性種を作りかつプラ
ズマの不存在下に重合の大部分を完結させるものである
。イオン化ガスプラズマの生成はプラズマを生成するた
めの公知方法のｂずれによっても行なうことが出来る。

例えばＪ、Ｒ，ホラハｙ　（Ｈｏｌｌａｈａｎ）とＡψ
Ｔペル（Ｂｅｌｌ）版′プラズマ化学の応用技術１、ワ
イリー、二凰−ヨーク１９７４およびＭ・ジエン（８ｈ
ｅｎ　）　　版′重合体のプラズマ化学′テッカー、ニ
ューヨーク、１９７６に記載されている。即ち高周波発
生器に連結された平行板電極の間にモノマーを真空下で
入れ、真　９− 空室の外部又は内部のいずれかの平行板を用いてプラズ
マを生成させることが出来る。また外部誘導コイルによ
って電場をつくらせ、イオン化ガスのプラズマを発生さ
せてもよく、また反対に荷電した電極に間隔をおいて直
接真空室に入れてプラズマを生成させてもよい。

本発明においては疎水性重合体よりなるフィルムだけを
イオン化ガスプラズマの存在下に保持した後、該プラズ
マの不存在下の親水性不飽和単量体の水溶液中で、親水
性不飽和単量体を疎水性重合体よりなるフィルムにグラ
フト重合さ一１ｔルか、または疎水性重合体よりなるフ
ィルムと親水性不飽和単量体の水溶液、または疎水性重
合体よりなるフィルムと親水性不飽和単量体のガスとを
イオン化ガスプラズマの存在下で重合を開始し、しかる
後に前記フィルムを該単量体の水溶液中に浸漬して該プ
ラズマの不存在下、前記フィルム上にグラフト重合させ
る。

イオン化ガスプラズマの不存在下親水性不飽和単量体の
水溶液で重合させる代りに、該単量１０− 体中又は該単量体の乳化液或いは有機溶媒溶液を使用し
てもよい。

本発明方法を更に詳細に説明すれば脱気を１０−１〜１
Ｏ−４）−ルで行ない疎水性重合体よねなるフィルムに
上記方法にてプラズマ照射を行なう。

好ましくは２０〜２００ワツト、更に好ましくは４０〜
１００ワツトでグロー放電をさせ疎水。

性菌合体に活性種を生成させる。照射時間は通常１〜３
６００秒、好ましくは１〜１８００秒間照射する。プラ
ズマ照射を行なった後に上記フィルムを親水性不飽和単
量体の水溶液中で該単量体を該プラズマの不存在下に重
合させると、前記フィルムの活性種より該単量体を消費
しはじめる、いわゆるグラフト重合が進行する。後重合
温度及び時間は使用する単量体種類によって異なり特に
限定されないが通常温度は１〜６０℃、時間は１〜２５
時間で十分である。単量体種類によっては６０℃を超え
ると熱重合を起こし低分子のポリマーも生成してくるこ
とがあるので注意を要する。

かくして得られた疎水性フィルムへの親水性不飽和単量
体のグラフト重合化物は該フィルムの表面に重合度の著
大な直鎖の親水性重合体がグラフト重合しているので該
フィルム表面ノ性質が改良され例えば本発明方法にてポ
リエチレンにアクリル酸ｆ２４重景％グラフトしたもの
の水の接触角は未処理ポリエチレン１０１０に対し５６
°と著しく向上していることが判る。

本発明に適用されるグラフト重合体の相補性重合体とは
グラフ）・重合体と高分子間錯体を形成する重合体であ
る。例えばグラフト重合体がアクリル酸、メタクリル酸
、無水マレイン酸などのカルボン酸基を有する単量体か
らなる重合体では、その相補性重合体としてはポリエチ
レングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリキシリル
ビオローゲン、ポリエチレンイミン及びポリビニルピリ
ジニウムクロライドなどが挙げられる。またクラフト重
合体が、アクリルアミド、メタクリルアミド、ビニルピ
リジン、Ｎ１Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート
又はＮ％Ｎ−ジメチルアミンエチルアクリレートなどの
塩基性単量体からなる重合体ではその相補性重合体とし
てはポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ２−アク
リルアミド−２メチルプロパンスルホ／酸、ホｌＪスチ
レンスルホン酸、ポリビニルスルホン酸及びこれらのア
ルカリ金属、アルカリ土類金属の塩が挙げられ、フィル
ムと相補性重合体を水溶液中に所定時間浸漬すれば高分
子間錯体を形成する。

また相補性重合体の閂は一般にフィルムへのグラフト重
合体の量によって支配され、例えばグラフト重合体量が
多い場合は相補性重合体も多く必要とする。従って相補
性重合体の量はグラフト化した高分子に対し繰り返し単
位で等モル以上である。即ちグラフト重合体と錯体を形
成する量だけフィルムに何着するのであるから相補性重
合体の大過剰の水溶液中で錯体を形成させればよい。水
溶液中の相補性重合体及び酵素の量は特に限定されない
が通常夫々０．０１〜１モル％、０１〜６０重ｆ％程度
である。水溶液の温度は室温乃至それ以下が好ましく、
フィルムの浸漬は通常１５分乃至１時間程度攪拌下に行
なう０又該水溶液には食塩等の無機化合物を添加して、
イオン強度を上げることもできる。

水溶液のＰ）１は相補性重合体の種類により錯体を形成
し易すい様に調整する。浸漬後、必要に応じ水洗し乾燥
するが、乾燥は通常常温で必要に応じ減圧下で行左う。

本発明に使用できる酵素の種類は特に限定されないが、
例えばインベルターゼ、ウレアーゼ、グルコースインメ
ラーゼ、グルコースオキシターゼ、プロテアーゼ、ウリ
カーゼ、アシラーゼ、αアミラーゼ、βアミラーゼ、コ
ラゲナーゼ、アルギナーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカ
リ性プロテアーゼ、Ｌ−グルタミン酸脱炭酸酵素、ＩＪ
　／＜−ゼ、Ｄ−アミノ酸、オキシターゼ、βグルコシ
ターゼ、グルコアミラーゼなト挙ケルことができる。酵
素の含有量は固定化酵素フィルムに対して０１〜３０重
蓋％が好ましい。

本発明では酵素を相補性重合体との水溶液中に分散せし
め親水化（グラフト化）フィルムとの高分子間錯体形成
と同時に酵素を包括固定化する。即ち酵素を包括固定化
するのに放射線や、重合熱やプラズマさえも照射されず
そのため本発明では酵素に損傷を与えたり活性を低下さ
せたりすることは一切ないばかりか高分子間錯体に固定
化さノ１．た酵素は酵素阻害剤やＰＨ，温度などに対し
高分子間錯体が優れた保護作用を示すため、非常に安定
して長期間活性を持続する。

そればかりか疎水性フィルムを担体としているので機械
的強度も極めて優れているなど、従来法では得られない
画期的なものである。

以下実施例により本発明を説明する。なお実施例中グラ
フト率、水の接触角、酵素の活性保持率は次の方法にて
測定した。

ａｌ　　グラフト率 グラフト重合したグラフトフィルムを良溶媒にて２日間
攪拌洗浄を行ない未反応単量一体及びホモ重合体を完全
に除き乾燥後Ｒ量によってグラフト率を計算 初期フィルム１址 す、水の接触角 協和科学■実接触角形０Ａ−Ｐ型を用いて測定した。

Ｃ，活性保持率（至）−努。×１００ 酵素固定化フィルムを充分洗浄し、次いで１回目に酵素
活性を測定した時の酵素活性をｖｏとし、しかる後緩衝
液に該フィルムを１０日間浸慣しておいた後の酵素活性
を７とした。父、実施例中の空孔率はｎ、１μ以上の孔
径を有する空孔の含有率（ｄ／ｇ）を表わし、酵素活性
は基質の分解速度で表わした。

実施例１ 厚さ５０μ〃ｌ−辺１５ｊｌＪ１の正方形をしたポリエ
チレンフィルムラ１０−’）−ルで内１３５ｍのセパラ
ブルフラスコの器壁に設置し１３＋５６ＭＨ２の高周波
発生装置に連結させた２枚の鋪電極板間に挿入し１００
Ｗの出力でプラズマを９０秒間発生、照射させ、その後
ｊＯ”−３）−ル中の５０重量％のアクリル酸水溶液を
加えて２５℃で１２時間後重合させた。得られたグラフ
トフィルムをジメチルホルムアミドにて２日間攪拌洗浄
、脱溶媒、乾燥して試料とし、水の接触角を測定したと
ころもとのポリエチレンフィルムは１０１０に比較して
５６°と著しく親水化されており、またグラフト率は２
４％であった。

該フィルムをインベルターゼ（活性ニジｉｉ　糖４，９
／　ｍＱ、２０℃×３０分　ＰＨ４）　１０重量％及び
１モル％のＮａｃｌ　　を含む重合度５００のポリエチ
レングリコールの１０％水溶液中に浸漬してインベルタ
ーゼを該フィルムとポリエチレングリコールとの高分子
間錯体中に包括固定化した固定化ｗ素フィルムを得た。

該固定化酵素フィルムを充分水洗した後、１０重量％の
ショ糖を含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｗ４．６）ＩＤｖｒ
Ｑに浸漬し２５℃で９０分間加水分解反応を行ない、加
水分解率を比施光度により定量し求めた。又酵素固定化
繊維の安定性を調べる為、この値に対し上記緩衝液に酵
素固定化繊維を１０日間ａｄしておいた後の酵素活性の
比を活性保持率として計算したところ０．０４　Ｍｏ１
７４ｉｎ、、ｌｉｌ　　の速度でンヨ糖を加水分解する
酵素活性を示し、９０％の活性保持率であった。

実施例２ 実施例１と同様のフィルム、装置及び実験条件を用い一
以下に示すようなグラフト重合体及びその相補性重合体
との間の錯形成をおこなうことによってインベルターゼ
の固定化をおこなった。得られた固定化酵素フィルムを
実施例１と同様の条件で固定化インベルターゼの活性を
測定したところ、下記の表のような酵素活性を−１８−
′ 第　　１　　表 相補性ポリマー＝　［１１モル％水溶液５０ｖｒＱ（ａ
形成　　　＝　ｓｏ仕分間き４ぜ゛ながら浸漬（室温）
ポリビニルピロリドンのみ １モル九　Ｎａｃｌが存在 実施例６ 実施例１と同様の方法、装置を用いてポリエチレンフィ
ルム（１５ｍｘ　１５ｗｈ　）に、アクリル酸−２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭｐ
ｓ）ｅ等モル含む５０を量％水溶液を１０　ｍｌ用いて
グラフトさせたところ、グラフト化率２４０％のポリエ
チレンフィルムが得られた。

グラフトしたこのポリエチレンフィルムをポリ（ビニル
トリメチルアンモニウムクロライド）１０、ｔ−ＩＩｋ
％水溶液２５ｒｎＱ、　　とアミラーゼ５１量％水溶液
１０ｎｒＱ　　との混合水溶液に室温下で３０分間浸漬
し、高分子間錯形成と同時にアミラーゼを固定化した。

この固定化酵素フィルムをデンプン１．　ｏ　ｉ量２含
有する水溶液に浸漬させ酵素活性を施光度変化より求め
たところ、このフィルムはａｘｉｏ−４ｍｏｌ／ｎ１ｉ
ｎ−Ｊｉ＋の速度でデンプンを加水分Ｊ！イする能力を
有することが判明した。

　１９− 手　　続　　補　　正　　書 １、事件の表示 昭和５７年特許願第１５６２２５号 ２、発明の名称 酵素固定化フィルム及びその製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　　　東京都墨田区墨田五丁目１７番４号鐘紡株式
会社特許部 ２０− 明細書の「特許請求の範囲」の欄及び「発明の詳細な説
明」の欄 ６、輔工功ｎ容 （１）　　明細書の特許請求の範囲の項の記載を別紙の
通〕補正する。

（２）　　明細書の記載を次の通シ補正する。

　２− （３）　　明細書第１３頁第６〜７行の「及びこれらの
アルカリ金属、アルカリ土類金属の塩」の記載を削除す
る。

（４）　　明細書第１６頁第１０〜１１行の「実施例中
の空孔率はａ１μ以上の孔径を有する空孔の含有率（ｄ
／ｄ）を表わし、」の記載を削除する。

別　　　紙 特許請求の範囲 〔１）　　疎水性フィルムを形成する疎水性重合体にズ
マの不存在下で親水性不飽和単量体をグラフト重合せし
めた親水化フィルムに、該重合によシ得られたグラフト
重合体と錯体形成能を有する相補性重合体とによシ錯体
中に酵素を包括固定化してなる酵素固定化フィルム。

（２）　　疎水性重合体がポリエチレン、ポリプロピレ
ン又はポリエチレンテレフタレートである特許請求の範
囲第１項記載のフィルム。

（５）　　親水性不飽和単量体がアクリル酸、メタクリ
ル酸、２ヒドロキシエチルメタクリレート、２ヒドロキ
シエチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルア
ミド、２アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン
酸、Ｎ％Ｎジメチルアミノエチルメタクリレート又はＮ
１Ｎジメチルアミノエチルアクリレートである特許請求
の範囲第１項記載のフィルム。

（４）　　グラフト重合のグラフト率がフィルムを形成
する疎水性重合体に対し少なくとも１重量％である特許
請求の範囲第１項記載のフィルム。

（５）　　相補性重合体がポリエチレングリコール、ポ
リアクリル酸、ポリキシリルビオローゲン又はポリエチ
レンイミンである特許請求の範囲第１項記載のフィルム
。

（６）　　相補性重合体の量がグラフト化した高分子に
対し繰シ返し単位で等モル以上である特許請求の範囲第
１項記載のフィルム。

（７）　　酵素の含有量が０．１〜５０重量係である特
許請求の範囲第１項記載のフィルム。

（８）　　疎水性フィルムを形成する疎水性重合体にイ
オン化ガスプラズマを照射した後、該プラズマの不存在
下で親水性不飽和単量体をグラフト重合せしめた親水化
フィルムを、酵素及び該重合によル得られたグラフト重
合体と錯体形成能を有する相補性重合体を含有する水溶
液に浸漬し錯体中に酵素を包括固定化せしめることを特
徴とする酵素固定化フィルムの製造方法。

（９）　　疎水性重合体がポリエチレン、ポリプロピレ
ン又はポリエチレンテレフタレートである特許請求の範
囲第８項記載の方法。

（１０）親水性不飽和単量体がアクリル酸、メタクリル
酸、２ヒドロキシエチルメタクリレート、２ヒドロキシ
エチルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミ
ド、２アクリルアミ）”−２−メチルプロパンスルホン
酸、Ｎ％Ｎジメチルアミノエチルメタクリレート又はＮ
１Ｎジメチルアミノエチルアクリレートである特許請求
の範囲第８項記載の方法。

（１１）　　グラフト重合のグラフト率がフィルムを形
成する疎水性重合体に対し少なくとも１重量％である特
許請求の範囲第８項記載の方法。

（１２）相補性重合体がポリエチレングリコール。

ポリアクリル酸、ポリキシリルビオローゲン又ハポリエ
チレンイミンである特許請求の範囲第８項記載の方法。

（１３）相補性重合体の量がクラフト化した高分子に対
し繰）返し単位で等モル以上である特許請求の範囲第８
項記載の方法。

（１４）酵素の含有量が０．１〜３０重量％である特許
請求の範囲第８項記載の方法。

　４−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　疎水性フィルムを形成する疎水性重合体くイ
   オン化ガスプラズマの存在下で親水性不飽和単量体をグ
   ラフト重合せしめた親水化フィルムに、該重合により得
   られたグラフト重合体と錯体形成能を有する相補性重合
   体とにより錯体中に酵素を包括固定化してなる酵素固定
   化フィルム。 （２）　　疎水性重合体がポリエチレン、ポリプロピレ
   ン又はポリエチレンテレフタレートである特許請求の範
   囲第１項記載のフィルム。 （３）　　親水性不飽和単量体がアクリル酸、メタクｌ
   Ｊル１３１．２ヒドロキシエチルメタクリレート、２ヒ
   ドロキシエチル了クリレート、アクリルアミド、メタク
   リルアミド、２アクリルアミド−２−メチルプロパンフ
   ルホン酸、Ｎ、　Ｎジメチルアミノエチルメタクリレー
   ト又はＮ、Ｎジメチルアミンエチルアクリレートである
   特許請求の範囲第１項記載のフィルム。 （４）　　クラフト重合のグラフト率がフィルムを形成
   する疎水性重合体に対し少なくとも敞１重量％である特
   許請求の範囲第１項記載のフィルム。 （５）　　相補性重合体がポリエチレングリコール、ポ
   リアクリル酸、ポリキシリルビオローゲン又はポリエチ
   レンイミンである特許請求の範囲第１項記載のフィルム
   。 （６）　　相補性重合体の徽がグラフト化した高分子に
   対し繰り返し単位で等モル以上である特許請求の範囲第
   １項記載のフィルム。 （７）　　酵素の含有量が１１〜６０重量％である特許
   請求の範囲第１項記載のフィルム。 （８）　　疎水性フィルムを形成する疎水性重合体にイ
   オン化ガスプラズマの存在下で親水性不飽和単量体をグ
   ラフト重合せしめた親水化フィルムを、酵素及び該重合
   によｈ得られたグラフト重合体と錯体形成能を有する相
   補性重合体を含有する水溶液に浸漬し錯体中に酵素を包
   括固定化せしめることを特徴とする酵素固定化フィルム
   の製造方法。 （９）　　疎水性重合体がポリエチレン、ポリノロピレ
   ン又はポリエチレンテレフタレートである特許請求の範
   囲第８項記載の方法１６７−　、。 （旬　親水性不飽和単量体がアクリル酸、メタクリル酸
   、２ヒドロキシエチルメタクリレート−２ヒドロキシエ
   チルアクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド
   、２アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、
   Ｎ、　Ｎジメチルアミノエチルメタクリレート又はＮ。 Ｎジメチルアミノエチルアクリレートである特許請求の
   範囲第８項記載の方法 （１１）　　グラフト重合のグラフト率がフィルムを形
   成する疎水性重合体に対し少なくともｖ１重址あである
   特許請求の範囲第８項記載の方法。 （１２）相補性重合体がポリエチレングリコール、ポリ
   アクリル酸、ポリキシリルビオローゲン又はポリエチレ
   ンイミンである特許請求の範囲第８項記載の方法。 （ｉ３）　　相補性重合体の量がグラフト化した高分子
   に対し繰り返し単位で等モル以上である特許請求の範囲
   第８項記載の方法。 （ｉ４）酵素の含有前が０１〜３０重量％である特許請
   求の範囲第８項記載の方法。