JPS5937B2 - 菌体のアルギン酸塩による固定化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は菌体の固定化方法、更に詳細には菌体のアルギ
ン酸アルミニウムまたはアルミニウムカルシウムによる
固定化方法に関する。

各種菌体が広い範囲にわたって産業上利用されてムる。

例えば食品工業、医薬品工業において、更には産業廃水
の処理等にも利用されている。

しかしながら従来のかかる菌体を使用するいわゆる醗酵
においては、それぞれの分野に適した菌体をそのまま水
相で使用しており、このため連続法で醗酵を実施すると
、菌体は醗酵を生起させろ反応器内に留まることができ
ず、製品と共に流出してしま・ハ、流出した醗酵液を更
に処理して菌体を分離除去する必要があり、また菌体は
使い捨てにするのが通常であった。

従って菌体を水その他の液体に不溶性または非流動性の
形に固定して反応器内に滞留できるようにし、連続法で
長期間にわたり使用できろようにすることが提案されて
いる。

かかる固定化方法に種々な方法が提案されているが、そ
の一つの方法としてポリアクリルアミドからなるゲル材
料の微細格子中に菌体を包括させて固定化する方法があ
る。

また別の固定化方法として例えばキャンデイダ・トロピ
カルス（Ｃａｎｄｉ ｄａｔｒｏｐｉｃａｌｓ ）酵母
をアルギン酸アルミニウムで固定化する方法が報告され
ている（アメリカン・ケミカル・ソサイエテイ、シンポ
ジウム・シリーズＡ１０６、第１０１頁、１９７９年、
クライン等による「インモービライズド・マイクロビア
ル・セル」参照）。

この方法によればアルギン酸ナトリウムと酵母からなる
懸濁液を硫酸アルミニウムの架橋液（水溶液）に直接入
れ、アルギン酸をゲル化させることにより、その中に酵
母を包括固定化させている。

そしてかかる固定化された酵母を工業廃水中のフェノー
ルの除去に使用し、有効であることが報告されている。

しかしながらアルミニウム塩として塩化アルミニウムを
使用した場合固定化された酵母はフェノール除去活性は
ないと報告されている。

またアルコール醗酵に使用されろサツカロミセス・セル
ビジアエ（Ｓａ ｃｃｈａｒｏｒｒｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ ）を上記方法で固定化して包括体とすると
、菌体濃度とは無関係に、架橋液中の硫酸アルミニウム
により、菌体含有アルギン酸ナトリウム液のｐＨが低下
し、そのため例えば硫酸アルミニウムを１０ｆｔ／ｌの
濃度で使用した場合、上記酵母のアルコール生産活性が
なくなってしまう、またｐＨの低下を小さくするため硫
酸アルミニウムの濃度を１グ／ｌに下げると、アルコー
ル生産活性は有するが包括体の強度が不充分となり、ア
ルコール連続醗酵装置内で割れ易（なり、微細化されて
装置からの流れに随伴されて流出してしまう欠点を有す
る。

別の方法として、サツカロミセス・セルビジアエとアル
ギン酸ナトリウム水溶液からなる懸濁液を架橋液である
塩化カルシウム水溶液中に通して糸状のアルギン酸カル
シウム包括固定化酵母を作成し、これによりグルコース
を原料としてエタノールを製造しうろことが報告されて
いる（キーゼルスタンおよびデューク：バイオテクノロ
ジー・アンド・バイオエンジニアリング第１９巻第３８
７頁、１９７７年参照）。

この場合、架橋液のｐＨは４．５位に維持することがで
きるので酵母の活性がなくなることはない。

しかしながらアルギン酸カルシウムで包括した包括体の
硬度が不充分で、連続式アルコール醗酵に最適とはいい
難い。

一般にアルギン酸アルミニウム包括体の方がアルギン酸
カルシウム包括体およびポリアクリルアミド包括体に比
し、ゲル硬度が大である等、包括体の物理的性質がすぐ
れている特長を有し、このためアルコール醗酵等の連続
法においてはアルギン酸アルミニウムで固定化した包括
体の方が物理的には適している。

しかしながら上述した如く、従来法によるアルギン酸ア
ルミニウムで固定化した包括体では酵母の活性を失う欠
点がある。

このため物理的に破損し難（、かつ酵母の失活を招来す
ることなく固定化しうる方法について研究開発を行なっ
た結果次のことが明らかとなった。

アルギン酸ナトリウム、カリウムまたはアンモニウム塩
水溶液中にアルミニウムイオンおよびカルシウムイオン
を共存させたときナトリウム、カリウムまたはアンモニ
ウムイオンをイオン交換してアルギン酸カルシウムゲル
を形成する反応速度はアルギン酸アルミニウムゲルを形
成する反応速度より速い。

従ってアルミニウム塩およびカルシウム塩を含む水溶液
中に、菌体を懸濁させた例えばアルギン酸ナトリウム水
溶液を加えると、あるいは逆に加えると、先ずアルギン
酸カルシウムが形成されて、菌体を固定化したゲル包括
体が形成される。

ここで注目すべきことは、次いでアルギン酸カルシウム
固定化包括体中のカルシウムイオンがアルミニウムイオ
ンによって交換されてアルギン酸アルミニウムが形成さ
れ、その結果形成されたゲル包括体の硬度が上昇し、そ
れと共に包括体の体積の縮小が生ずる。

アルミニウム塩を加えろと、一般に水溶液のン ｐＨは
下り、例えばｐＨ２，８と低くなり、前述した如（酵母
は失活する恐れがあったのであるが、上述した如くカル
シウム塩を同時に使用すると、アルミニウム塩によりｐ
Ｈが下っても、菌体は急速にアルギン酸カルシウムに包
括されるので、遊；離の菌体が低ｐＨ環境に置かれる期
間が短（、このため菌体失活を防止することができるこ
とが判った。

上述したことから、別法として、次の方法が更に好まし
いことが判った。

カルシウム塩単独の水２ 溶液に、菌体を懸濁したアル
ギン酸ナトリウムの水溶液を加え、またはこの逆にし、
予めアルギン酸カルシウムで菌体を固定した包括体を形
成する。

この場合水溶液のｐＨは４°５付近になるので、菌体の
失活は生じない。

次にｐＨの低いアルミニラ５ ム塩水溶液に、上記固定
化菌体包括体を入れると、カルシウムイオンの一部また
は全部がアルミニウムイオンによって交換され、硬度の
高いゲル包括体を生ずる。

この二段法の場合には遊離の状態で菌体が低いｐＨに曝
露されることがないため、菌］ 体の失活が生ぜず、製
造時に特別の注意を払う必要がなく有利であることが判
った。

アルミニウムイオンとカルシウムイオンが共存する状態
では、カルシウムイオンのアルミニウムイオンによる交
換反応は平衡状態に達するまで進５ 行する。

このため一般に包括体中にはアルギン酸カルシウムとア
ルギン酸アルミニウムを包含する。

なお上記二段法での第二工程で、アルミニウム塩水溶液
を多量に使用してその中にアルギン酸カルシウム包括体
を通すと、理論的にはアルミニウム塩 イオンによって
カルシウムイオンの全部を交換することも可能であるが
、実際問題としてカルシウムイオンの全部をアルミニウ
ムイオンで交換することは、包括体の物理的性質および
菌体の活性の点から見て不要であり、無駄である。

一般にアルミニウム塩、例えば硫酸アルミニウムを多量
に添加すると、カルシウムイオンは硫酸カルシウムとな
り、その溶解度以上となって沈澱してくる、このためア
ルギン酸アルミニウムカルシウム包括体内でのアルミニ
ウム対カルシウムの比は３０対１にまですることができ
る。

またアルミニウム対カルシウムの比が５対ｌでも包括体
の硬度は醗酵工業に充分長期間使用できる程犬である。

上述した方法で製造した包括体中に包括され固定化され
ろ菌体の量は、包括体１を蟲り、約４００７にもするこ
とができることが判った。

菌体としてパン酵母（サツカロミセス・セルビジアエ）
を使用し、コーンシュガーからエタノールを醗酵生産す
る場合を例にとると、従来のポリアクリルアミド包括体
中の菌体量１３０ ？／を以上では脆くなり、使用でき
ない。

また本発明により、４００ ｔ／ｌの酵母を含むアルギ
ン酸アルミニウムカルシウム（Ａｌ／Ｃａ＝５／１）包
括体ではｐＨを２．８に下げても活性を有し、例えばポ
リアクリルアミドで固定化した包括体のｐＨ４，５の場
合の活性の３倍も犬であることが判った。

またｐＨ２，８の醗酵溶液中に置いた場合、ポリアクリ
ルアミドで包括固定化した酵母およびアルギン酸カルシ
ウムで包括固定した酵母の活性は、ｐＨ４，５の場合の
それぞれ１０係および６０係にまで低下する。

これらの事実から、本発明方法によりアルギン酸アルミ
ニウムカルシウムで包括固定化した酵母菌体は、修飾さ
れて、上記従来の固定化菌体または生酵母菌体などと異
なり、ｐＨ２，８の環境においても良好な醗酵活動を維
持でき、かつ硬度等の物理的条件もすぐれている特長を
有し、連続醗酵法に使用できることが判る。

更に本発明方法で作ったアルギン酸アルミニウムカルシ
ウム包括体は、その中に含まれる菌体が失活したとき、
再生が容易であるという特長を有する。

例えば本発明方法で製造した固定化菌体包括体も、ｐＨ
２，７で３０℃で１力月以上、例えばアルコール醗酵に
使用すると、菌体の活性低下は避けられない。

かかる活性低下した包括体を再生するに当り、包括体を
単にアルミニウム塩水溶液中にｐＨ２，７付近で入れ、
更にペプトンや酵母エキスを含む基質を加えて再生せん
としても沈澱を生じ、固定化菌体を活性のある菌体とす
るには非常に長時間を要する、しかるに上記基質中にカ
ルシウム塩を加えてカルシウム含有量を多くしてやると
、アルミニウムイオンは逆洗カルシウムイオンで交換さ
れてくる。

かくすることによって包括体内のアルミニウムとカルシ
ウムの比を１：１００とするとｐＨを３．５以上にでき
るので、ペプトンや酵母エキスを加えても沈澱を生ずる
ことがなく、従って包括体内の活性の低下した菌体（古
い菌体）を池件のある新しい菌体に再生することができ
る。

かくして菌体活性の再生された包括体を前記二段法に準
じて、アルミニウム塩含有水溶液中にて処理すると、再
びｐＨ２，７付近でも活性のあるアルギン酸アルミニウ
ムカルシウムで固定化した本発明方法で製造した包括体
と同等のものにすることができる。

従って本発明方法で固定化した菌体包括体は工業的用途
に非常に有用であることが判るであろう。

本発明は菌体を耐久性を有し、かつアルコール醗酵等に
おける低ｐＨ環境でもその活性を失うことのない包括体
として固定化することにあるのであるから、使用する菌
体には特別の制限はなく固定化して使用せんとするあら
ゆる用途にそれぞれ適した任意の菌体を使用できる。

かかる菌体の例の一部を以下に示すが、これらに限定さ
れないことは明らかであろう。

サツカロミセス属の全て、例えばサツカロミセス・カー
ルスペルジエンシス（ＳａｃｃｈａｒｏｒｒＶｃｅｓｃ
ａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サツカロミセス・ホル
モセンス（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｒｌｌｙｃｅｓ ｆｏｒ
ｍｏｓｅｎｓ ｉｓ ）シゾサツカロミセス属の全て、
例えばシゾサツカロミセス・ボンベ（Ｓ ｈｉｚｏｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）クルイベロミセ
ス属の全て、例えばクルイベロミセス０ラクテイス（Ｋ
ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｅａｃｔｉｓ）カンデイダ
属の全て、例えばカンデイダ・シュードトロピカルス（
Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｓ）ザ
イモモナス属の全で、例えばザイモモナス・モビリス（
Ｚｙｎｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌ ｉｓ ）シュードモ
ナス属の全て、例えばシュードモナス・オバリス（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｖａｌｉｓ）グルコノバクタ−
属の全て、例えばグルコノバクタ−・サブオキシダンス
（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａ ｃｔｅｒｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ
） 本発明で使用する無機酸および有機酸のカルシラム塩お
よびアルミニウム塩としては、アルギン酸ナトリウム、
カリウムまたはアンモニウムと反応してアルギン酸アル
ミニウムカルシウムを形成してアルギン酸をゲル化し、
同時に菌体を包括せしめうるものを使用でき、例えば塩
化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硝酸アルミニウム
、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、
塩素酸カルシウム、ギ酸カルシウム等任意のものを使用
しうろが、特に硫酸アルミニウムおよび塩化カルシウム
が好ましい。

以下に実施例を挙げて本発明を説明する。

なお菌体としてはサツカロミセス・セルビジアエを用い
て、エタノール生産の例をとって、包括体の活性例を示
す。

実施例 １ 糖蜜を基質とし、振盪培養し、更にタンク培養した湿潤
酵母菌体（サツカロミセス・セルビジアエ：水分７５係
含有）１０１を１．５重量係のアルギン酸ナトリウム水
溶液８グ中に懸濁させた。

この懸濁液をノズルを通して第一の架橋液である１６．
７重量係の塩化カルシウム水溶液中に滴下した。

この時ノズル先端には無菌空気または滅菌酸素を吹きつ
けた。

また上記塩化カルシウム水溶液は約４Ｃに保持し、攪拌
した。

かくして直径１〜２ｒｆｔ！ｒＬのアルギン酸カルシウ
ムで固定化した菌体を含む包括体粒子を形成させた。

次にこのアルギン酸カルシウム固定化粒子を取り出し、
生理食塩水で洗浄後、下記に示す第二の架橋液０．５１
に入れ、４℃で２日間保存した。

Ａｌ ２ （ＳＯ４） ３・１６〜１８Ｈρ １０ｆ
／１ＫＨ２ＰＯ４１ｏＯカｔ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２，０たＩ グルコース １３．０たｔ上記架橋液
にアルギン酸カルシウム固定化粒子を入れる前、上記第
二架橋液のｐＨは２．７〜２．８であるが、導入後カル
シウムがアルミニウムによりイオン交換されるに従って
ｐＨけ次第に上昇して最終的には３．４を示した。

形成されたアルギン酸アルミニウムカルシウムで固定化
された包括体粒子は球状であり、アルミニウム対カルシ
ウムの比は約５対１であった。

上記本発明による二段法で製造した粒子を生体触媒とし
て糖よりエタノールの生産に使用した。

上下円錐型ユニットを垂直に三段積重ねた全容積１ｔの
バイオリアクター（％開昭５４−２６９７２号および特
願昭５５−２７７２４号参照）の下部に取り付けた焼結
ガス分散板より炭酸ガスを０．３Ｎｔ１分、および下記
組成供給液０．４７ ｔｙｚＺ分を上昇流として送入し
た。

グルコース ２１６むｔＡ１２（Ｓ
０４）３・１６〜１８Ｈ２０２，Ｏｆ／２ＭｇＳＯ４・
７Ｈ２０２，０シｔ ＫＨ２ＰＯ４０，２Ｖｔ ＣａＣ１・２ＨＯ２，８５ｆ／Ａ これに上記の固定化粒子０．３０ｔを懸濁させて醗酵さ
せた結果バイオリアクター内反応温度３０℃、ｐＨ２，
６〜２．８で送出液は７９ ｆ／ｌのエタノールを含有
し、９日間連続運転できた。

実施例 ２ 市販の圧縮パン酵母菌体（サツカロミセス・セルビジア
エ：水分７０％）１４を、１．５重量係のアルギン酸ナ
トリウム水溶液１１中に懸濁させた。

この懸濁液を実施例１で用いたノズルを通して、同様に
下記アルミニウムおよびカルシウムを同時に含む架橋液
０．５１−中に滴下し、そのまま４℃で１日間保存した
。

Ａ １２ （ＳＯ４） ３・１６〜１８Ｈ２０５−０シ
１ＫＨ２ＰＯ２１，０た１ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２グ／１ ＣａＣ１２・２Ｈ２０１４，３Ｓｉ’／Ｚグルコース
１０．０グ／を上記架橋液のｐＨ
は２．８より３．４に上昇した。

形成きれたアルギン酸アルミニウムカルシウムで固定化
された菌体包括体粒子中のアルミニウム対カルシウムの
比は約３対１であった。

実施例１と同様にして、上記包括体粒子を用いてエタノ
ール生産を行なった。

その操作条件および結果を下記に示す。

バイオリアクター容積 １．１６菌体固定化包
括体粒子 ０．１８ を導入窒素ガス（実施例
１の ＣＯ２の代りに使用） ０．３Ｎへ〆外供
給液■ ０．３１−〆分反応温度
３０Ｃ 反応液ｐＧ ２．６〜２．９■
供給液の組成 グルコース １８０ｆ／／！。

Ａ ｌ ２（Ｓｏ ４）・１６〜１８Ｈ２０１０危Ｍｇ
ＳＯ４・７Ｈ２０２，０た１ ＫＨ２ＰＯ４１，０たｌ 送出液はエタノール６５ ｆ／Ａを含有シ、１０日間連
続運転できた。

実施例 ３ 実施例１と同じ方法で、架橋液中の硫酸マグネＥ井シウ
ム以外の各基の組成を変えて作ったアルギン酸塩で固定
化した酵母包括体粒子を用い、それぞれについて実施例
１と同じ装置および操作でエタノール生産を行った結果
を実施例１のエタノール生産成績・を１００％として相
対値で下表１に示す。

なお第一架橋液は実施例１と同じである。

実験ＪＦｙ、 １０は実験＆２の第二架橋液を５回新し
い架橋液で取り換えて作ったものである。

また表中の菌体生存率（イ）はエタノール生産前および
終了後の各試料をとり、それぞれ０．０２重量係のメチ
レンブルー溶液３ｍ／！および燐酸塩緩衝液５ｒｒｌｌ
中ですりつぶし、これをヘマトメーターを用い６００倍
顕微鏡で計数した相対比である。

菌体生存率が１０係以上あるものけ一般に未だ活性を有
する。

実施例 ４ 実施例２と同じ方法で架橋液中の硫酸マグネシウム以外
の各基の組成を変えて作ったアルギン酸塩で、固定化し
た酵母包括体を用い、実施例２と同じ装置および操作で
エタノールの生産を行なった結果を実施例２のエタノー
ル生産成績を１００（４）として相対値で下表２に示す
。

実施例 ５ 本実施ｆｌｉでは上記各実施例で使用した包括体粒子の
ものとは異なり、８００メツシユ不銹鋼製金網を骨組と
した直径８．５ｃｒｒ１高さ２ｃｍの円盤の形に包括体
を成形した場合の例を示す。

内径９ｃｒｒ１、高さ１Ｏｃｒｒ１の成形用容器に実施
例２で使用したのと同じ組成のアルギン酸す） ＩＪウ
ムと酵母の混合物２５ｒＩｌｌを入れた。

次に８１メツシユの不銹鋼製金網を直径８．５ ｃｍの
円形に切り取り、この上に同じ直径で高さ２ｃｍの円形
枠を置いた。

上記成形器を外部より氷冷しながら、１５．７重量％の
塩化カルシウム水溶液５〇−を上記円形枠内に静かに入
れた。

５時間抜上澄液を除去した後、実施例１と同じ第二架橋
液中に全体を浸漬して４℃で２日間保存した。

かくして作った円盤型包括体１０枚を回転軸に０．８Ｃ
ｒｒ１の間隔で取り付け、下部３分の１が実施例１と同
じ供給液に浸漬し、残部３分の２が窒素ガス雰囲気中に
あるように保ったバイオリアクターでエタノールの連続
生産を行なった。

各条件は次のとおりであった。

バイオリアクターの大きさ 直径１０ｚ長さ１２
６ｃＷ１ アルギン酸固定化酵母包括体円盤 （全容積）０．２４１ 回転数 ７２ｒｐｍ供給液速
度 ０．４１分供給Ｎ２ガス速度
帆ＩＮｌ、％供給液組成（ｐＨ２・８〜
３・０） グルコース ９０附ｔ Ａｌ ２（ＳＯ４） ３・１６〜１８Ｈ２０５，０１β
ＣａＣ１２・２Ｈ２０２，８５ＶＩ ＫＨ２ＰＯ４１、Ｏｔ／１ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０１μ 送出される液中のエタノール濃度は４０〜４５ｆ／ｌで
、１０日間連続運転できた。

参考例 １ 実施例１で作ったアルギン酸アルミニウムカルシウムで
固定化した酵母菌体包括体粒子を使用して、アルコール
醗酵を行ない、活性の低下したものを出発物質として、
これの再生を行なった。

上記包括体粒子１０Ｆを下記組成の水溶液中に入れた。

ＣａＣ１２” ２Ｈ２０２８？／ｌ サッカロース １０９／１Ｍｇ８０４・
７Ｈ２０２グ／を 酵母エキス ５１／１ＫＨ２Ｐ０４
０．１ｆ／ｌこの間液を３０℃に保ち
、ｌｖ／ｖ分の滅菌空気を通じながら２４時間処理した
。

次に粒子を液中より取り出し、生理食塩水で良く洗浄し
、実施例１の第二架橋液０．５ を中に４℃で２日間保
存すると、そのエタノール生産活性はもとに戻ったこと
が判った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 菌体およびアルギン酸ナトリウム、カリウムまたは
   アンモニウム塩を含む水溶液または懸濁液を、無機酸ま
   たは有機酸のカルシウム塩およびアルミニウム塩の両者
   を含む架橋液で処理するか、または上記水溶液または懸
   濁液を、上記カルシウム塩を含む架橋液で処理し、次い
   で上記アルミニウム塩を含む架橋液で処理することを特
   徴とする菌体の固定化方法。 ２ 上記水溶液または懸濁液を、上記カルシウム塩およ
   びアルミニウム塩を同時に含む架橋液に加える特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３ 上記カルシウム塩およびアルミニウム塩を同時に含
   む架橋液を、上記水溶液または懸濁液に加える特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ４ 固定化された包括体中のアルミニウム対カルシウム
   の原子比が０．２：１〜３０：１である特許請求の範囲
   第１項〜第３項の何れかに一つに記載の方法。